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    Lehninger Capitulo 6

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    ENZIMAS 6.1 Introduccién alos enzimas 191 6.2 gCémo funcionan los enzimas? 193 6.3 La cinética enzimética como método para comprender el mecanismo 202 6.4 Ejemplos de reacciones enziméticas 213 6.5 Enzimas reguladores 225 Esta condicién podria cumplirse si, cuando las moléculas ‘se combinaran con un enzima, se encontraran a una distancia un poco mayor (que aquella a la que se encuentran cuando estdn unidas covalentemente), pero més cerca que su distancia de equilibrio cuando se encuentran libres... Usando el simil de Fisher de la llave y la cerradura, la lave no encaja perfectamente en la cerradura sino que ejerce una cierta tensiGn sobre ella. ~J.B. S. Haldane, Enzymes, 1930 La catilisis de puede describir formalmente como la estabilizacién del estado de transicién mediante fa unin fuerte del catalizador. —Wiiam P Jencks, artculo en Advances in Enzymology, 1975 jones fundamentales para la vida, Una, la entidad viva ha de poder autorreplicarse (un tema consi- derado en la Parte III de este libro); dos, el organismo ha de Poder catalizar reacciones quimicas eficiente y selectiva- ‘mente, La importancia central de Ia catdlisis puede sorprender ‘algunos estudiantes principiantes en el estudio de la biogut ‘ica, pero es facil de ilustrar. Como se ha descrito en el Capi- tulo 1, los sistemas vivos utilizan la energia de su entorno, Muchos de nosotros, por ejemplo, consumimos cantidades sustanciales de sacarosa ~azticar de mesa comiin- como un tipo de combustible, ya sea en forma de alimentos y bebidas dulces 0 como aziicar propiamente dicho. La conversién de la capitulo sacarosa en CO, y H,O en presencia de oxigeno es un proceso altamente exergénico, que libera energia libre que podemos utilizar para pensar, movernos, saborear y ver. Sin embargo, se puede almacenar una bolsa de azicar durante afios sin que s1- fra ninguna transformacién obvia a CO; y H:0. Siendo este proceso quimico termodinamicamente favorable, es, sin em. bargo, jmuy lento! Aun asf, cuando un ser humano (0 casi cual- uier otro organismo) consume sacarosa, la energia quimica se libera en segundos. La diferencia esta en la catiliss, Sin catali- sis, las reacciones quimicas que, como la de la oxidacién de la sacarosa, son necesarias para mantener la vida, no podrian darse en una escala de tiempo conveniente. En este capitulo dirigimos nuestra atencién hacia los ea- talizadores de las reacciones en los sistemas biolégicos: los enzimas, las protesnas mas extraordinarias y de mayor especia- lizaci6n, Los enzimas tienen un gran poder catalitico, a menudo ‘muy superior al de los catalizadores sintéticos 0 inonganicos Poseen un elevado grado de especificidad respecto a sus sus tratos, aceleran espectacularmente las reacciones quimicas es ecificas y funcionan en soluciones acuosas en condiciones ‘muy suaves de temperatura y pH. Hay pocos catalizadores no Diolégicos que tengan todas estas propiedades. Los erzimnas esti en el centro de todos las proceso biogu- micos. Actuando en secuencias organizadas catalizan clentos de reacciones consecutivas en las que se degradan moléculas de nutrientes, se conserva y transforma la energia quimica y se fabrican las macromoléculas biol6gicas a partir de precursores sencillos. A través de la accién de los enzimas reguladores los sistemas enzimaticos se coordinan de un modo muy eficaz, per- ‘mitiendo una integracién armoniosa de la multitud de activida- des metablicas diferentes que son necesarias para la vida. El estudio de los enimas también tiene una importancia préctica inmensa. En algunas enfermedades, especialmente en ls que son genéticamente heredables, puede haber tuna defi- ciencia, 0 incluso una ausencia total, de uno 0 ms enzimas, ‘También se pueden producir situaciones anormales por la ac- tividad excesiva de un enzima especifico. La medicién de la actividad enzimatica en el plasma sanguineo, eritrocitos 0 uestras de tejido son importantes en el diagnéstico de entfer- Siniieien ‘Waive Menenrin ohare: ain afterten Ghiiidinas 0 ‘través de la interaccién con enzimas. Las enzimas se han con- vertido en herramientas practieas importantes, no s6lo en me dicina sino también en la industria quimica, en el tratamiento de los alimentos y en la agricultura El capitulo empieza con la deseripcién de las propiedades de los enzimas y los prineipios fundamentales cle su poder ca- talitico. Sigue una introducciOn a la cinética enzimtica, disci- plina que proporciona gran parte del marco necesario para ‘cualquier discusién sobre los enzimas. Se dan seguidamente algunos ejemplos de mecanismos enziméticos que itustran los principios introducidos previamente en el capitulo. Acabarnos ‘con una discusién sobre los erwamas reguladores 6.1 Introduccidn a los enzimas Gran parte de la historia de la bioquimica es la historia de la investigacién sobre los entzimas. Los catalizadores biolégicos ‘se reconocieron y fueron deseritos por primera vez a finales del siglo xvi, en estucios sobre la digestion de la carne por se cereciones del estomago; la investigacién continu a principios del siglo xx examinando la conversion del almidén en aztiear por la saliva y diversos extractos vegetales. Hacia 1850 Louis Pasteur llegé ala conclusién de que la fermentacién del azticar alcohol por la levadura estaba catalizada por “fermentos”, Postulé que tales fermentos son inseparables de Ia estructura de las células de levadura vivas; este punto de vista, denom: nado vitalismo, se mantuvo durante décadas, El deseubr miento de Eduard Buchner en 1897 de que los extractos de levadura pueden fermentar el azicar a alcohol demostro que Jas molécuilas que intervienen en la fermentacién pueden o tinuar funeionando cuando se separan de la estructura de las células vivas. Frederick W. Kithne denominé estas moléculas fenzimas. Al rechazarse las nociones vitalistas de la vid aislamiento de nuevos enzimas y la investigacién de sus pro: piedades permitié el avance de la ciencia bioquimica. El aislamiento y eristalizacién de la ureasa por James ‘Sumner en 1926 proporcioné un gran impulso a los primeros studios sobre los envzimas, Sumner hallé que los cristales de ureasa consistian exclusivamente en proteina y postulé que todos los enzimas son proteinas. A falta de otros ejemplos esta ‘dea fue discutida durante algiin tiempo. La conclusion de Sumner sélo se acepto ampliamente cuando mas tarde, en la década de 1930, Jon Nor op y Moses Kunitz cristalizaron la pepsina, la tripsina y otros enzimas digestivas y hallaron que también eran proteinas. Durante este pe- riodlo, J. B. 8, Haklane eseribié un tratado de- nominado “Enzimas”. Aunque ain no estaba clara ta naturaleza molecular de los enzimas, este libro contenfa la notable sugerencia de ‘que las interacciones por enlaces débiles entre el enzima y su sustrato podrian ser utilizadas para catalizar la reace’én. Esta brillante idea esta en e] centro de nuestro conocimiento ae- tual sobre la catilisis enzimatica, Eduard Buehner, 1860-1917 6.1 Introduccion a tos enzimas 191 La investigacién sobre los enzimas ha sido muy intensa desde la altima parte del siglo xx. Esto ha conducido a la pu rificacién de millares de enzimas, a la elucidacién de la es: tructura y mecanismo quimico de muchos de ellos y a un Cconocimiento general sobre su modo de aecién, La mayoria de enzimas son proteina: Con la excepeisn de un pequetio grupo de moléculas de RNA atalitico (Capitulo 26), todos los enzimas son proteinas, ividad catalitica depende de la integridad de su conforma dn proteica nativa. Si se desnaturaliza o disocia un eraima en sus subunidades, se sucle perder la actividad catalitca. $i se descompone un enzima en sus aminodcidos constituyentes, siempre se destruye su actividad catalitica, Asi las estructuras primaria, secundaria, terciaria y cuateraria de las proteinas ‘ewimaticas son esenciales para su actividad catalitica, Los enimas, al igual que otras proteinas, tienen masas ‘moleculares relativas que van desde unos 12.000 hasta mas de 1 mullon. Algunos envzimas no requleren para su actividad mas ‘grupos quimicos que sus residuos aminoscidos. Otros requie- ren un componente quimico adicional Hamado eofaetor, EL cofactor puede ser uno 0 varios fones inorginicos tales como Fe®*, Mg?! Mui®* 0 Zn®* (Tabla 6-1) o una molécula organica TABLA 6-1 Algunos elementos inorgénicos ‘que actian como cofactores por enzimaticos ot Gitocromo oxidasa Fe?" oFa°* Citocromo oxidasa, catalasa, peroxidasa iy Pirwvato quinasa Mee Hexoquinasa, gucosa 6fosfatasa, pirwvato quinasa Ma? ‘Arginasa,rbonucledtide reductasa Mo Dinitrogenesa NPt Ureasa Se Giutation peroxidase at Carbénico anhidrasa, alcohol deshidrogenasa, carboxipeptidasas. AyB 4 James Sumner 1887-1955, 1.8.5, Haldane, 1892-1968 Capitulo 6 Enzimas TABLA 6-2 Algunos coenzimas que actéian como portador res transitorios de dtomos o grupos funcionales Coenzima Ejemplos de grupos quimicos transfeidos Precursor en la deta para los mamiferos Bioctina 00, Biotina Coenzima A Grupos acilo Acido pantoténico y otras mokéculas 5'-Desoxiadenosicobalamina Atomo de H y gupas alquilo Vitamin By» (coenzima B;2) Flevina adenina dinuclestido Brectones Riboflavina (vtamina B>) Lipoato Eectrones y gupas aclo No se equiere em la dieta Nicotinamida adenina dinucledtido fon hidruro cH”) Acido nicotiico(riacina) Piridoalfosfato Grupos amino Pridoxna (itamina Be) Tetrahidrofoato Grupos monocarbonados Folato Tiamina pirofostato Aidehidos Tiamina (vitamina B;) Nota earcura y made de ssn ets coearas cesta Fane eet te, ‘© metaloorganica compleja denominada eoenzima (Tabla 6-2) Algunos enzimas requieren tanto un eoenzima como uno 0 mas ones metalicos para su actividad. Un coenzima o ion metalico unido covalentemente o de manera muy fuerte a la proteina erzimética se denomina grupe prostétieo, Un enzima com- pleto cataliticamente activo junto con su coenzima y/o iones ‘metalicos se denomina holoenzima. La parte proteica de tal enzima se denomira apoenzima 0 apoproteina. Los coenzi- ‘mas actiian como transportadores transitorios de grupos fun- cionales especificos. La mayoria de ellos son derivados de las vitaminas, nutrientes orgiinicos requeridos en pequefias canti- ddades en la dieta. Los coenzimas se considerarén més detalla- damente a medida que se encuentren en la discusién de las rutas metabolicas en la Parte Il de este Libro. Finalmente, algu- ‘nos enzimas son modificados covalentemente por fosforilacion, «glucosilacion y otros procesos. Gran parte de estas alteraciones, intervienen en la regulacién de fa actividad ercimsitica, Los enzimas se clasifican segiin las reacciones que catalizan Muchos enzimas se han bautizado afiadiendo el sufijo “asa” al nombre de su sustrato 0 a una palabra o frase que describe su actividad. Asi, la ureasa cataliza la hidrdlisis de la urea y la DNA polimerasa cataliza la polimerizacién de nucleétidas en la sin- TABLA 6-3 Clasificacién internacional de los enzimas tesis del DNA. Otros ergimas recibieron nombres muy genera- les, antes de que se supiera cual era su reaccion especifica, Por ejemplo, un enzima que actuaba en la digestion de la co: ‘ida se a6 pepsina, del griego pepsis, “digestion”, y el liso- zima recibié su nombre por su capacidad de lisar las paredes ccelulares bacterianas. Otros recibieron el nombre en virtud de su origen o el modo como se obtuvieron: la tripsina, que reci- bio su nombre del griego tryein, *desgastar”, se obtuvo fro- tando tejido pancredtico con glicerina. A veces el mismo cerzima tiene dos o més nombres, o das enzimas diferentes tie- nen el mismo nombre. Debido a tales ambigiedades y al ni: ‘mero constantemente creciente de enzimas descubiertos, se ‘ha adoptado por acuerdo internacional un sistema de nomen- clatura y clasificacion de los enzimas. Este sistema distribuye Jos enzimas en seis clases principales, cada una de ellas con di ferentes subclases, segun el tipo de reaccién catalizada (Tabla 6-3). A cada enzima se le asigna un nimero clasificatorio de ‘cuatro apartados y un nombre sistematico que identifica la re- accién catalizada. Por ejemplo, el nombre sistemdtico formal del enzima que cataliza la reacci6n ATP + p-glucosa—+ ADP + -glucosa 6-fosfato sla ATP:glucosa fosfotransferasa, lo que indica que cataliza Ja transferencia de un grupo fosfato del ATP a la gucosa, Elm mero de clasificacion de este envzima (niimero E.C., por Enzyme wi Clase Tipo de reaccién catalizada 1 Oxidorreductasas Transferencia de electrones (iones hidruro 0 dtomos de H) 2 Transterasas Reacciones de transferencia de grupos 3 Hidrolasas Reacciones de hidrdlsis(transferencia de grupos funcionales al agua) 4 iasas Adicién de grupos @ dobles enlaces, 0 formacién de dobles enlaces por eliminacién de grupos io Isomerasas Transferencia de grupos dentro de moléculas dando formas isoméricas 6 igasas Formacién de enlaces CC, C—S, C—O y C—N mediante reacciones de condensacién ‘acopladas a la rotura de ATP Commission) es 2.7.1.1. Bl primer digito (2) denota el nombre de la clase (transferasa); el segundo digito (7), la subelase (losfotransferasa); el tercer digito (1), una fosfotransferasa ‘con un grupo hidroxilo como aceptor, vel euarto digito (1), b- lucosa como aceptor del grupo fosfato. En muchos casos se utiliza un nombre sencillo de uso mas comtin (en este caso ‘hexoquinasa). La lista y la descripei6n completa de los miles de enzimas eonocides se mantienen actualizadas por el Comité de Nomenclatura de la International Union of Biochemistry and Molecular Biology (yww.chem.qmmulac.uk/iubmmbyenzyme). Este capitulo se dedica mayoritariamente a los prineipios y propiedades comunes a todos los eraimas. RESUMEN 6.1 introduccién a los enzimas '@ La vida depende de Ia existencia de catalizadores, poderosos y especificos: los enzimas. Practicamente todas las reacciones bioquimicas son catalizadas por @ Con la excepeién de una pocas moléculas de RNA catalitico, todos los enzimas conocides son proteins. Muchos necesitan coenaimas no proteicos 0 ccofactores para desempefiar su accion catalitica, ‘© Los enzimas se clasifican de acuerdo con el tipo de reaccién que catalizan, Todos los enimas tienen ‘iimeros y nombres formales del sistema E.C. y la ‘mayorfa tienen también nombres sencillos 6.2 ,Cémo funcionan los enzimas? La catilisis erimdtica de las reacciones es esencial para los sistemas vivos. En condiciones biologicas, las reacciones no ccatalizadas tienden a ser lentas. La mayoria de moléculas bio- lgicas son muy estables al pH neutro, ls temperatura suave y el ambiente acuoso presente en el interior de las cétulas. Ademas, muchas reacciones bioguimicas comunes implican process quimicos que son desfavorables o poco probables en el ambiente celular, tales como la formacion transitoria de intermediarios cargados inestables o la colisin ce dos © mas ‘moléculas con la orientacion precisa requerida para la reac- cién. Las reacciones necesarias para digerir los alimentos, e -viar senales nerviosas o contraer el miiscuilo no se dan a una ‘velocidad ttl sin cats, {Un enzima soluciona estos problemas al proporcionar un ambiente especifico dentro del cual una reacei6n determinada puede transcurrir a mayor velocidad, El rasgo distintivo de luna reaccién catalizada enzimaticamente es que tiene lugar dentro de los confines de una bolsa del ervaima denominada si- tio aetive (Fig. 6-1). La molécula fjada en el sitio activo y sobre la que actta el enima se denomina sustrato. La super- ficie del sitio activo del enzima esta revestida con residuos aminodeidos cuyos grupos sustituyentes se unen al sustrato y ccatalizan la transformacion quimlea. A menudo, el sitio activo ‘cubre al sustrato y lo secuestra completamente de la solucién, El complejo enzima-sustrato, cuya existencla fue propuesta 62 4Como funcionan los enzimas? 193 FIGURA 6-1. Fijacin de un sustrato al sitio activo de un enzima. Se ‘muestra el enzima quimotipsina unido a un sustata en rojo (PDB 1D 7GCH), Algunos aminoscidos clave del sitio activo se muestan coma ‘una mancha tojaen la supericie del enzimna. por primera vez. por Charles-Adolphe Wurtz en 1880, esd portancia central en la accién de los enzimas. Es también el punto de partida de los tratamientas matematices que definen el comportamiento einético de las reacciones catalizadas por enzimas, asf como de las descripciones Ledricas de los meca- nismos enziméticos, Los enzimas alteran las velocidades de reaccién pero no los equilibrios Se puede escribir una reaccion engimética sencilla como E+S==ES—=EP==E+P 61) en donde E, 8 y P representan el entzima, el sustrato y el pro- ducto, respectivamente, ES y EP son complejos transitorios del enzima con el sustrato y con el producto, respectivamente. Para entender la catélisis, hemos de apreciar en primer ugar Ia importante distineién entre equilibrios de reaceién y vvelocidades de reaccién. La funcidn de un catalizador es au mentar la velocidad de una reaccién. Los catalizadores no rmodifican los equilibrios de reaecién. Cualquier reacciin, por ejemplo $= P, se puede describir mediante un diagrama de la coordenada de reaccién (Fig, 6-2), una descripcién de los cambios energéticos durante la reaccién, Tal como se fa exp cado en el Capitulo 1, la energia de los sistemas bioldgiens se describe en funcién de la energia libre, G. En el diagrama de la ‘coordenada, se representa la energia ibre del sistema frente al progreso de la reaccidn (coordenada de la reaccién). El punto ‘de partida tanto para la reaccién hacia la derecha como hacia la izquierda se denornina estado basal, que es la contribucién la energia libre del sistema de una molécula promedio (S 0 ) bajo un conjunto de condiciones dadas. Para deseribir las variaciones de enengfa libre de las reacciones, los quimicos defi Enorgia libre, G FIGURA 6-2. Diagrama de la coordenada de reaccién de una reac ‘in quimica, Se representa la energia libre del sistema frente al pro _greso de la reaccién S -» P. Un diagrama de este tipo constituye una descripcidn de los cambios energéticos durante la reaccién y el ee horizontal (coordenada de reaccién) refleja los cambios quimicos progresivos(p.e),rotura © formacién de enlaces) a medida que S se ‘convierte en P. Se indican las energias de actvacin, AG", para las reac- clones S—+ Py P+ S, AG' es la variacién de energia libre estindar slobal en la direccién $+ P ‘nen un conjunto estandar de condiciones (temperatura 298 K; resin parcial de cada gas 1 atm 0 101,3 kPa; concentracion de todos los solutos igual a 1 1) y expresan la variacién de cenergia libre de este sistema reaccionante como AG®, la varin- cidn de energia libre esténdar. Dado que en los sistemas bioguimicos participa normalmente el H* en concentraciones ‘muy Iejanas de 1 i, los bioguiimicos definen la variaetén de la energia libre esténdard bioquimica, AG”, como la varia ion de energia libre estandar a pH 7,0; emplearemos esta de- {inicién a to largo de todo el libro. En el Capitulo 13 se dard una definicién més completa de AG’ Bl equilibrio entre S y P refleja la diferencia en energia li bre de sus estados basales. En el ejemplo que se muestra en la Figura 6-2, la energia libre del estado basal dle P es inferior a la del de S, por lo que la AG’® de la reaccién es negativa y el cequilibrio favorece a P. La posicidn y la direccién de este equi- brio no se ven afectadas por ningiin catalizador. Un equilibrio favorable no indica que la conversion S—+ P sea répida, La velocidad de reaccién es dependiente de un p rametro totalmente diferente, Existe una barrera energética entre § y P que representa la energia requerida para el ali- neamiento de los grupos reactivos, la formacién de cargas inestables transitorias, los reordenamientos de enlaces y otras transformaciones que se requieren para que la reaeci6n tenga lugar en cualquiera de las os direcciones. Esto viene repre- sentado por la “colina” energética de las Figuras 6-2 y 6-3. Para {que haya reaceién las moléculas han de superar esta barrera, 1por lo que se deben llevar a un nivel energético superior. En la ‘cumbre de la colina energética existe un punto en el que la ca- {ca hacia el estado 8 0 P es igualmente probable (en cualquier caso, el camino es de bajada). Bs lo que se denomina estado de transteién. El estado de transicién no es una especie qui- ‘mica con estabilidad significativa, por lo que no se ha de con- fundir con un intermediario de reaccién. Bs, simplemente, un momento molecular fomex en. el cue acontecimionice tales ‘como rotura de enlaces, formacién de enlaces y desarrollo de cargas han llegado al instante preciso en el que el colapso ha- cia sustrato o hacia producto es igualmente probable, La dife- rencia entre los niveles de energia del estado basal y del estado de transicin se denomina energia de activacién, ‘AG*. La velocidad de una reaccién refleja esta energia de acti- vacién: a una energia de activacién mas elevada corresponde luna reaccién mas lenta, Las velocidades de reaceién pueden ‘aumentarse incrementando la temperatura, medliante lo que se aumenta el nimero de moléculas con energia suficiente para superar la barrera energética. De modo alternativo, es po: sible disminuir la energia de activacién afadiendo un catali- zador (Fig. 6-3). La catdlisis aumenta las velocidades de reaceion disminuyendo las energias de activacién. Los enzimas no constituyen una excepci6n a la regla de ue los catalizadores no modifican el equilibrio de reaccién. Las fechas bidireccionales de la Ecuncién 6-1 ilustran este punto: cualquier enzima que catalice la reaccién $ —> P tam- bin cataliza la reaccién P— 8, Su tinica misién es acelerar la interconversion de 8 y P. No se gasta enzima en el proceso y el punto de equilibrio no queda afectado. No obstante, la reac: ign alcanza el equilibrio de una manera mucho més répida ‘cuando se halla presente el enzima adecuado ya que se incre: ‘menta la velocicad de la reaceién, ‘Se puede ilustrar este principlo general considerando la reaccién de la sacarosa con el oxigeno para formar di6xido de ccarbono y agua: CyaHex0y; +1202 —> 1200, + 1H,0 Esta transformacién, que se realiza a través de una serie de reacciones separadas, tiene una AG"* muy grande y negativa por Jo que la cantidad de sacarosa presente en el equilibrio es despreciable. No obstante, la sacarosa es un compuesto establle ‘ya que la barrera de activacidn energética que debe superar an- tes de reaccionar con el oxigeno es muy alta, La sacarosa puede almacenarse en un recipiente en presencia de oxigeno de ma- Coordenada de reaceion FIGURA 6-3. Diagrama de la coordenada de reaccién donde se com- ‘param las reacciones caalizadla por enzima y sin catalizar. Ela eac- ‘i6n S —+P, los intermediaris ES y EP ocupan minimos en la curva de rogreso energético de ta reaccidn cataizada enzimiticamente. Los téemin0s AGiocu ¥ AGL corresponden a las energias de activacién de las reacciones sin catalizary catalizada,respectivamente, La ener- sia de activacién del proceso global es menor cuando e! enzima cata- tae teenie nera ca indefinida sn reaccionar Sin embargo, en as célas, Ia sacarosa es degradada a OO, y HzO a través de una serie de reaccionescatalizada por enzmas. Estos enzimas no slo acee- ran las reacciones sino que las onganizan y contolan etal ma ‘nera que gran parte de la energia liberada en este proceso se recupera en otras formas asequibles a la célula para que realice us funciones La ruta de reacciones mediante las que la saca- rosa (y otros azticares) se degradan es la ruta primaria de for- macién de energia para las células y los enzimas de esta ruta permiten que la secuercia de reaciones tenga hugar en ura es- ala de tempo itl para as eels Cualquier reaccion puede consistir en varias etapas que suponen la formacién y desintegracion de especies quimicas transitorasdenominadas intermediarios de reaction.” (in intermediario de reaccién es cualquier especie producida en el transcurso de la reaccin que tenga un tiempo de vida quimico finito (y mayor que el de una vibracién molecular, equivalente a 10~'* segundos). Cuando la reaccién S = P esti catalizada ‘por un enzima, los complejos ES y EP pueden ser considera- os intermediarios a pesar de que Sy P sean especies quimi- ‘cas estables (Ec. 6-1); los complejos ES y EP ocupan valles en el diagrama de la coordenada de reaccién (Fig. 6-3). En el ‘curso de una reacidn catalizada enzimaticamente sueten exis tirotros intermediaries quimicasadicionales y menos estables, La interconversin de dos intermediarins de reaccin secaen ciales constizuye por tanto tun paso de la reaccion. Cuando en luna accion exsten varios pasos, la velocidad lobal viene de terminada por el paso (o pasos) caya energia de activacton es Ja mas elevada; este paso se denomina paso limitante de ve- Jocidad, En un caso sencillo, el paso limitante de velocidad es el punto de energia més elevado en el diagrama de intercon- version de S y P. En la practica, e! paso limitante de velocidad puede cambiar con las condiciones de reacciony en cl caso de muchos enzimas puede haber varios pasos con energis de ac- tivaciGn similares, lo que significa que todos ellos son parcial- ‘mente lmitantes de fa velocidad, Las energias de activacign son barreras energéticas para las reacciones quimicas. Estas barreras son crucials para la propia vida, La velocidad ala que uns moléeula se transforma fen una reacckin quimica determinada desciende al aumentar Ia barrera de activacidn de esta reaccin. Sin estas bareeras ‘energstcas, las macromoléculas complojas revertirian espon téneamente a formas moleculares mucho més sencillas y no podrian existr ni las estructuras complejasv altamente or- ‘enadas ni los procesos metabolicos que tienen lugar en las élulas. Los enzimas han evolucionado para disminuir select: tramente las enenias de ativacin de las reacciones necesa- ‘ias para la supervivencia celular. ‘adviértase que en ese capitulo la tdeminos peso @intermediario se refieren a especies quinicas que se originan en una iia reacein ca talizada enzimaticamente, En el contexto de las rutas metobsicas en Jas que participan muchos enzimas (Parte Il de este Ibeo), estos tér- ‘minos se utlizan de manera algo diferente. Una reaccion enimstica ‘completa recbe a menudo el nombre de "paso" de una ruta yal pro- sdacto dela reaccin de un encima (qve es el sustrato para el siguiente fenzima de la ruta) se lo suele denomiar “itermedtiario". 62 4Cémo funcionan los enzimas? 195 Las velocidades de reaccién y los equilibrios tienen definiciones termodindmicas precisas Los equilibrios de reaccién estan asociados inextricable- mente a la variacidn de energia libre estandar de la reaccién, AG”*, mientras que las velocidades de reacciGn estan asocia- das a la energia de activacién, AG. Una introduccién bésica a estas relaciones termodinamicas constituye el préximo paso para saber cémo funcionan los enimas. Un equilibrio tal como S = P viene descrito por una constante de equilibrio, Kyq, 0 K (p. 26). Bn las condicio- ‘es estndar utilizadas para comparar los procesos bioguim- cos, una constante de equilibrio se denota por K’zq (0.K"): gol oe Dela termini, ode eee ac cn y 4G” mediante la expresion AG" = -RT In Bg 6-3) donde R es la constante de los gases (8,315 J/mol - K) y Tes la ‘temperatura absoluta, 298 K (25°C). La Ecuacion 6-3 se de- sarrollard y tratard detalladamente en el Capitulo 13. Aqui et punto importante es que la constante de equilbrio es un re- fejp directo de la variacion de energia libre estindar global de Ja reaccién (Tabla 6-4), Un valor negativo grande de AG’* re- fleja un equilibrio de reaccién favorable aunque, tal como se hha comentado antes, no signifique que la reaccién transcurra ‘con una velocidad elevada. La velocidad de una reaccién cualquiera viene determi- ‘nada por la concentracién de reactivo (0 reactivos) y por una constante de velocidad usualimente representada por el simbolo k. Para la reaccién unimolecular $ —+ P, la velocidad de la reaceidn, V, que representa la cantidad de S que ha reac- ‘cionado por unidad de tiempo, viene expresada por una eeua- ign de la velocidad: v= xls} 64) Enesta reacci6n, la velocidad s6lo depende de la concentracion de 8. Es lo que se denomina una reaccién de primer orden. TABLA 6-4 Relacién entre Keg y AG’? Kea AG"* (ki/mol) 10 342 10-* 285 10-* 28 10" aa 107? ud 10°" 57 1 00 10° 57 10° 114 10° =A No: kn eco parr Ge AG" = An Ki 63) 196 Capitulo 6 Enzimas, EL factor k es una constante de proporcionalidad que refleja la probabilidad de reaccién bajo un conjunto de condiciones (pH, temperatura, ete.). Aquf, k es una constante de velocidad de primer orden y sus unidades son tiempos inversos, como por ejemplo s~*. Si una reaccién de primer orden tiene una cons- tante de velocidad k de 0,03 s~' se puede interpretar (cualitati ‘vamente) que el 3% de sustrato asequible sera convertido en P en 1s, Una reaocién con una constante de velocidad de 2000 s~* estara lista en una pequefa fraceiin de segundo, Si la velo- cidad de reaccién depencle de la concentracién de dos com- puestos diferentes, 0 si reaccionan dos molkeulas del mismo compuesto, la reaccidn es de segunclo orden y k es una cons: tante de velocidad de segundo orden (con unidades w~'s. ‘La ecuacién de la velocidad tiene entonces la forma V= «IS IS2) 6-5) Aplicando ta teoria del estado de transicién se puede deducir una expresién que relaciona la magnitud de la constante de velocidad con la energia de activacion: nat ater o® en donde k es la constante de Boltzmann y h es la constante de Planck. El punto importante es que esta relacién entre la cconstante de velocidad k y la energia de activacién AG* es in- versa y exponencial. En forma simplificada ésta es la base de wafirmacion de que una energia de activacién menor significa luna velocidad de reaceién mayor. A continuacién pasamos de lo que hacen los enzimas a cémo lo hacen. Unos pocos principios explican el poder catalitico y la especificidad de los enzimas Los envzimas son catalizadores extraordinarios. Los aumentos de velocidad conseguicos por los enzimas son de 5a 17 érdenes de magnitud (Tabla 6-5). Los enzimas son también muy espect- ficos, discriminando fécilmente entre sustratos con estructuras ‘muy similares, ;Cémo se pueden explicar estos incrementos enormes y altamente selectivos en su velocidad? {De donde viene la enengia que proporciona un descenso espectacular de las energias de activacion de reacciones especificas? La respuesta a estas preguntas tiene dos partes distintas pero relacionadas. La primera se basa en las reordenaciones de los enlaces covalentes durante la reaceion ca‘alizada por el enzima, Entre sustratos y grupos funcionales de los enzimas (Cadenas laterales especificas de aminoscidos, iones metalioos ¥ coeraimas) tienen lugar reacciones quimieas de muchos ti- pos. Los grupos funcionales cataliticos de los enimas pueden formar enlaces covalentes transitorios con un sustrato, acti- vrvlolo para la reaccin, o bien puede transferirse transitoria- ‘mente un grupo funcional del sustrato al enzima, En muchos casos, estas reacciones sélo tienen Iugar en el sitio active del enzima. Las interacciones covalentes entre enzimas y sustra- tos reducen la energia de activacién (acelerando, por tanto, la reaccién), proporcionando una via de reaecién altemativa y de menor energia. En la Secci6n 6.4 se deseriben diversos tipos especificos de reestructuraciones en reacciones enzimaticas. La segunda parte de la explicacién se basa en las inter- acciones no covalentes entre el enzima y el sustrato, Gran parte de la energia requerida para disminuir la energia de ac- tivacién proviene generalmente de interacciones débiles no covalentes entre el sustrato y el enzima. Bl factor que di- {erencia realmente a los enzimas de la mayoria de cataliza- dores no enzimiticos es la formacién de un complejo ES especifico, La interaccidn entre enzima y sustrato en este complejo esta canalizada por las mismas fuerzas que estabi- lizan la estructura proteica, incluyendo puentes de hidro- geno e interacciones idnicas e hidrof6bicas (Capitulo 4). El establecimiento de cada interaccién ébil en el complejo ES viene acompaiiado por la liberacién de una pequefia can- tidad de energia libre que proporciona un cierto grado de estabilidad a la interaccidn. La energia proveniente de la in- teraccién enzima-sustrato se denomina energia de fija- eign, AGp. Su significado se extiende mas allé del de una simple estabilizacién de Ia interaccion enzima-sustrato. La energia de fijacién os la principal fuente de energia li- bre wtilizada por los enzimas para disminuir la energia de activacién de tas reacciones. Hay dos principios funda- ‘mentales que estan interrelacionados y que proporcionan ‘una explicacién general de eémo aprovechan Jos enzimas la cenergia de unidn no covalente. 4. Lamayor parte del poder catalitico de los enzimas proviene en titimo término de la energia libre emitida al formarse los milliples enlaces débiles¢ interaccioness centre el enzima y su sustrato, Esta energia de fijacién ccontribuye tanto a la especificidad como a la cataisis. 2. Lasiinteracciones débiles estn optimizadasen el estado de transicion de la reacci6n; los sitios actives de los ‘enzimas son complementarios no a los sustratos per se, sino a los estados de transiciin a través de los que pasan Jos sustratos al ser convertidos en productos durante una. reaccidn enzimatica. Estos temas son vitales para el conocimientos de los enzimas y Las interacciones débiles entre enzima y sustrato ‘son éptimas en el estado de transicién {Como utiiza un enzima la energia de jackin para disminuir Ja energfa de activacién de la reaccién? La formacién del com- plejo ES no es por sf misma la explicacién, aunque algunas de las primeras consideraciones sobre los mecanismos de reac- ci6n empezaron con esta idea. Estudios sobre Ia especificidad enzimética llevados a cabo por Emil Fischer le condujeron a proponer, en 1894, que los enzimas eran estructuralmente com- plementarios a sus sustratos, de forma que se acoplaban del mismo modo que una lave y una cerradura (Fig, 6-4). Esta ele- sgante idea de que una interaccidn especifica (y exclusiva) entre FFIGURA 6-4 Formas complementarias de un sustrato y su sitio de f- jacién sobre un enzima. Se muestra el enzima dibidofolato reductase ‘Gon Su sustrato NADP* (oj), sin fijar (artiba)y ijado (abajo). Tam- bin es visible ovo sustiato, el totrahidrofolato (amarillo) (PDB ID "YRA2). El NADP* se fja 2 una bolsa que es complementara en forma 'y propiedades idnicas. En realidad, la complementariedad entre La ina y o ligand (en este caso el sutato)raras veces es pefecta, ‘como hemos visto en e! Capitulo 5, La interaccin de una proteina tn ligando da lugar a menudo a cambios de conformacién en .0 en ambas moléculas, un proceso denominado encaje inducido. falta de complementariesiad perfecta entre el enzima y su sus que no es evident en la figura) es importante para la catalisis 62 4Cémo funcionan los enzimas? 197 dos moléculas bioldgicas esté facilitada por superficies molecu- Jares con formas complementarias ha infiuida profundamente en el desarrollo de la bioguimica y se halla en el centro ce rm: chos procesos bioquimicos. No obstante, la hipstesis de la “lave vy cerradura” puede ser engafiosa cuando se apica a la catalisis enzinditica, Un enzima totalmente complementario a su sustrato seria un enzima muy deficiente, como podremos demostrar. Consideremos una reaccién imaginaria, la rotura de una vara metdlica magnética, La reaccién no catalizada se muestra en la Figura 6-5a. Examinaremos ahora dos enzimas imagi- narios (dos “varasas”) que pudieran catalizar esta reaecién, ‘utilizande fuerzas magnéticas como ejemplo de la energia de ‘jacion real utilizada por los enzimas. Diseftaremos en primer lugar un enzima perfectamente complementario al sustrato (Gig. 6-5b). El sitio activo de esta varasa es una bolsa forrada con imanes. Para que se dé a reaccién (rotura), la vara debe alcangar el estado de transicién de la reaccidn, pero se fija de ‘una manera tan fuerte al sitio activo que no puede doblarse, ya que la curvatura de la vara eliminaria algunas de las interac- nes magnéticas entre la vara y el enaima. Un encima asi im. ‘pide la reaceién ya que estabiiza el sustrato, En un diagrama de la coordenada de reaccicn (Fig. 6-5b), este tipo de com- plejo ES corresponcieria a un pozo energético del que le seria ‘muy dificil salir al sustrato, Tal enzima no seria ut La noci6n moderna de la catilisis enzimética, propuesta por primera vez por Michael Polanyi (1921) y por Haldane en. 1930 y después elaborada por Linus Pauling en 1946 dice: para {que un enzima catalice una reaceién ha de ser compiementa- rio al estado de transicién de la reaccién. Ello significa que las interacciones 6ptimas entre sustrato y erzima sélo pueden ‘tener lugar en el estado de transicion. La Figura 6-5¢ demues- tra de qué modo puede actuar un enzima de este tipo. La vara de metal se fja ala varasa, pero sélo se utiizan unas cuantas Interaceiones para formar el complejo ES. El sustrato ligado aan ha de experimentar el aumento de energia libre necesario ‘para alcanzar el estado de transicién. Ahora, sin embargo, el itcremento de energia libre requerido para llevar la vara a una conformacién curva y parcialmente partida queda nivelado, 0 es “pagado”, por las interacciones magnéticas (enengia de fj. cin) que se forman entre el enzima y el sustrato en el estado de transicién, Muchas de estas interacciones se dan en partes de la vara distantes del punto de rotura; asi, las interacciones centre el enzima y partes no reactivas del sustrato proporcio- nan una cierta cantidad de la energia necesaria para catalizar su rotura. Esta “factura enengética” se traduce en una energia de aetivacion neta inferior y una mayor velocidad de reaccién. Los enzimas reales funcionan segtin un principio andlogo. En el complejo ES se forman algunas interacciones débiles, pero el complermento total de las interacciontes débiles pasibles centre sustrato y enzima solo se forma cuando el sustrato al- ‘carua el estado de transicion. La energia libre (enengia de fja- i6n) liberada por la formacion de esas interaceiones equilibra parcialmente la energia requerida para Uegar a la cima de la colina energética. La suma de la energia de activacién desfavo- rable (positiva) AG" y la energia de fjaciin AGy favorable (ne- gativa) da como resultado una energia de activacién neta 198 Capitulo 6 Enzimas () Sin enszima sy ¢ £ Eatado de transcéa Products (vara mein) ‘vara dblada) (vara pata) (b) Enzima complementario al sustrato as- (©) Enzima complementario al estado de transicién “OO, Aa FIGURA 6-5 Enzima imaginario (arasa) disehiado para catalizar la rotura de uma vara metiica (a) Para que se romp la vara en preciso doblara en primer lugar (estado de tansici). En ambos ejemplo de “vara, las interacciones magnéticas ocupan ef lgar de las interac ones por enlaces débies ene erzima y susrato.(b) Una varasa ‘con una bola forrada con imanes complementaria en su estructura a {a vara (susrato) la extabiliza. El dablamientoestaré impedide porta alvaccién magnéticaente la vara yl varasa (€) Un enzima con ana ‘olsa complementaria al estado de tansicién de la eaceién ayudaré a desestabilizar la vara dando lugar a la catlss de la reaccién, Las interacciones magndicas proporcionan energia de fiacién que com- ‘menor (Fig. 66). El estado de transicién tampoco es una espe- ccie estable en el enzima, sino que representa un punto breve ‘en el tiempo que pasa un sustrato en la cima de la colina ener- _gética, Sin embargo, la reaccién catalizada por el encima es r= ‘cho més répida que el proceso sin catalizar, porque la colina es ‘mucho més baja. El principio importante subyacente es que las interacciones de fijacién débiles entro ol enzima y el sus: {rato proporcionan ta fuerza impulsora principal de ta ca- talisis enzimatica. Los grupos del sustrato que intervienen en estas interacciones débiles pueden estar situados a cierta dis- tancia de los enlaces que se rompen o modifican. Las interac- ciones débiles formadas tinicamente en el estado de transicién son las que contribuyen primordialmente a la catalisis. La necesidad de multiples interacciones débiles para im- pulsar la catdlisis es una de las razones de que los enzimas sean tan grandes. El enzima ha de aportar grupos funcionales pare interaccicmen idairan enlaces de hideimenn ~ clean iter. Energia libre, @ Energia libre, Gey? pensa el incremento de energia libre requerida para doblar la vara. os diagramas de la coordenada de reaccién (derecha) muestran las “consecuencias energéticas de la complementariedad con el sustato frente a la complementaridad con el estado de transicién (se han ‘omitido fos complejos EP). El término AGy la diferencia entre las cenergias de! estado de transicién de las reacciones no catalizada y catalizada, procede de la interacciones magnéticas entre la vara y la varasa. Cuando el enzima es complementario al sustrato (b), el com- plejo ES es ms estable y tiene menos energia libre en el estado basal ‘que el sustrato solo. El resultado es un incremento de la energia de sctivacin, acciones y ha de posicionar estos grupos de forma precisa para que se pueda optimizar la energia de fijacién en el estado de transicion. Se obvendra una correcta fijacién si el sustrato se ubica en una cavidad (el sitio activo) alejada del agua. Et ‘amano de las protefnas refleja la necesidad de superestructu- ‘ras que permitan mantener la interaccién de grupos correcta- ‘mente posicionados y mantengan inalterable la cavidad det sitio activo, Los enzimas utilizan la energia de fijacién para proporcionar especificidad de reaccién y catalisis ¢Pueden explicarse cuantitativamente las enormes aceleracio- nes de velocidad conseguidas por los enzimas sélo por la ener- -ia de fijacién? $i. La Ecuacién 6-6 nos permite calcular que AG" debe disminuir unos 5,7 ki/mol para acelerar wna reaccién de timer oxcian cen tan fertanw de diem. on ten eamaiiciomen cata, Bnergia libre, G Coordenada de reaccién FIGURA 6-6 Papel de la energia de fijacién en la catiliss. Para dis- rminuir Ia energia de activacin de una reaccin el sistema ha de ad- ‘uirir una cantidad de energia equivalente a la cantidad en que disminuye AG*. Gran parte de esta energia proviene dela eneypia de fjacion (Gp) conseguida en la formacién de ineracciones no cova- lentes dabites entre susrato y enzima en el estado de transicién, papel de SG» es andlogo al de AGiy en la Figura 65, se encuentran normalmente en ia eéluas. La energia dispo- nible a partir de la formacién de una sola interaccién débil ‘suele calcularse entre 4 y 30 ki/mol. La energia global dis- ponible a partir de varias interscciones de este tipo es, por tanto, suficiente para disminuit ls energias de activacion los {60 a 100 ilmol requeridos para explicar los grandes aumen- tos de velocidad observados en muchos erwtnas La misma energia de fijacién que aporta energia para la ca- tilisis también hace que el enaima sea especiio, La especif- ‘idad se refiere ala capacidad de un enaima de diserminar ‘entre un sustrato y una molécula competitiva. La catalisis y la ‘especificidad son faciles de distinguir conceptualmente, pero ‘mucho ms dificles de diferencia experimentalmente porque ‘susen del mismo fensmeno. Sie sti activo de un enim te- ‘Re grupos funcionales ordenados de manera éptima para formar ‘nteraccionesdbiles con un sustrato determinado en el estado de transicin, el enzima no podra interaceionar tan bien eon ‘ina otra moléeula, Ast, si el sustrato tiene un grupo hideo- ‘ilo que forma un puente de hidrégeno especifico con un resi- duo de Ghu del encima, cualquier molécula que carezca de este _srupo hidrosilo sera un peor sustrato para el enzima, Ademis, ier molécula con un grupo funcional extra para el que el ‘erima no contiene una bolo sitio de fjacidn sera muy proba- ite exchido del enaima. En general, la especificidad pro- de a formucir. de mitiples interacciones dies entre eL ima y su molécula de sustrato espectic. Es posible demostrar la importancia de la energia de fla- enla catdlisis, Por ejemplo, el enzima glucoitco triosa ‘somerasa cataliza la interconversién entre el licela 8-fosfatoy la dhidroxiacetona fosfato 62 4Céme funcionan los enzimas? 199 En esta reaccién se reordenan los grupos carbonilo ¢ hie roxilo de los carbonos 1 y 2. Sin embargo, se ha observado ‘que mas del 80% de la aceleracién de la velocidad de reaccién que tiene lugar procede de las interacciones enzima-sustrato ce las que interviene el carbono 3 del sustrato, Se llegé a esta conclusién mediante una cuidadosa comparacién de las reac- clones catalizadas enzimaticamente sobre gliceraldehide 3-fos- fato y sobre gliceraldehido (sin grupo fosfato en la posicién 3) como sustratos. Los principios generales antes esbozadios se pueden ilus- trar mediante diversos mecanismos cataliticos reconocidos. Bstos mecanismos no son mutuamente excluyentes, por lo {que un enzima determinado puede incorporar varios en su me- ceanismo de accién completo. Es a menudo dificil cuantificar la contribucién de cada mecanismo catalitico a la velocidad y/o especificidad de una reaccién catalizada por un enima. Como hemos visto, la energia de fjacién contribuye de modo importante, y a veces dominante, ala catdlisis. Conside- remos lo que se necesita para que una reaccién tenga lugar. Entre los factores fisicos y termodinémnicos que contribuyen. de forma prominente al valor de AG", la barrera de una reac- ‘ién, se podrfa incluir (1) una reduceién de la entropia, en forma de reduccién en la libertad de movimiento de dos molé- culls en solucién; (2) la capa de solvatacién del agua unida por puentes de hidrégeno que rodea y estabiliza muchas bioro- Jéculas en disolucion acuosa; (3) la distorsion de los sustratos que ha de tener lugar en muchas reacciones y (4) la necesidad de conseguir un alineamiento adecuado de los grupos funcio- rales cataliticos en el enzima. Se puede utilizar la energia de fijacién para superar todas estas barreras. En primer lugar, una gran disminuciin en Jos movimientos relativos de los dos sustratos que han de reaccionar, 0 redwe- ién de entropfa, es uno de los benelicios obvios de su fijacion al enzima. La energia de fijacién mantiene los gustratos en la orientacién correcta para reaccionar, lo que es una contribucién, _muy importante a la catalisis, ya que las colisiones productivas ‘entre moléculas en solucidn pueden ser exiremadamente raras. Los sustratos se pueden alinear sobre el enzima de forma pre- cisa, generando un gran riimero de interacciones détiles entre ellos y grupos localizados de manera estratégica en el enzima, lo ‘que mantiene las moléculas de sustrato en las posieiones ade- ‘cuadas. Algunos estuios han demostrado que la restriceion del ‘movimiento de dos reactivos puede producir incrementos de ‘velocidad de muchos rdenes de magnitud (Fig. 6-7). En segundo lugar, la formacién de enlaces debiles entre ‘enzima y sustrato también da lugar a la desolvatacién del sustrato, Interacciones enzitma-sustrato reemplazan la mayo- ria de, o todos, los enlaces de hidrogeno que puedan existir ‘en disolucién entre el sustrato y el agua. En tercer lugar, la cenergia de fijacion de las interacciones débiles formadas \ini- camente durante el estado de transicién de la reaccién ayuda compensar termodinamicamente cualquier distorsién, prin- cipalmente en forma de redistribucién electronica, que deba ‘experimentar el sustrato para reaccionar. Finalmente, el propio enzima puede sufrir un cambio de ‘conformacion cuando se fija el sustrato, el cual también se en- 200 Capitulo Enzimas © 9 ° f on A AL 0h jomes ‘o by A FIGURA 6-7. Aumento de la velocidad por reduccién de a entropia. ‘Se muestran las reacciones de un éster con un grupo carboxilato para formar un anhiérido. E grupo R es ef mismo en todos los 20s. fa) Pa ‘acesta reaccién bimolecular la constante de eeaccién k es de segundo ‘orden y tiene como unidades ms, (b) Cuando los dos grupos reac- ionantes forman parte de la misma molécula, la reacci6n es mucho ‘as répida, Para esta reaccién unimolecular k tiene como unidades 5~'. Dividiendo la constante de velocidad de (b) por la constante de velocidad de (a se obtiene un incremento de velocidad de aproxima- ‘damente 10° w. (£1 incremento tiene unidades de molaridad debido a {ue estamos comparando una reaccién unimolecular con una bimo- lecular.) En otras palabras, si el reactivo en (b) estuviera presente a tuna concentracin 1 s, los grupos reactivos se comportarian como si estuvieran presentes a una concentracion 10° w. Obsérvese que el 1e- activo en ¢b) tiene libertad de rotacién alrededor de tres enlaces (mostrados con flechas curvadas), pero esto todavia representa una reduccidn sustancial de la entropia en relacin con (a). Si los enlaces «que rotan en (b) estén restringidos como en (©, la entropia disminuye todavia mas y lareaccién muestra un incremento de velocidad de 10" sen relacién con (a), cuentra inducido por multiples interacciones débiles con el sustrato. Esta situacidn se conoce como encaje inducido, ‘mecanismo postulado por Daniel Koshland en el aflo 1958, El ‘encaje inducido puede servir para disponer grapos especificos funcionales del envzima en la orientaci6n adecuada para catali- zar la reaccién. El cambio conformacional también permite la formacion de interacciones débiles adicionales en el estado de transicion. En cualquier caso, la nueva conformacién del en- ima ha incrementado sus propiedades cataliticas. Como ya se ha tratado con anterioridad (véase Capitulo 6), el encaje in- ducido es una caracterfstica habitual en la unién reversible de los ligandos a las proteinas. El encaje inducido también de- Grupos cataliticos especificos contribuyen ala catalisis En la mayoria de enzimas, la energia de fijaci6n utilizada para formar el complejo ES es tan sélo una de las diversas contri- buciones al mecanismo catalitico general. Una vez unido el sustrato al enzima, grupos funcionales cataliticos situados ade- cuadamente colaboran en la rotura o formacién de enlaces mediante una variedad de mecanismos, entre los que se en- ccuentran la catalisisdcido-base general, la catélisis covalente y Ja catélisis por iones métalicos. Estos mecanismos son diferen- tes a los basados en la energia de fjjacién porque generalmente suponen una interaccién covalente transitoria con un sustrato ola transferencia de grupos desde 0 hacia un sustrato. Catélisisscido-base general Muchas reacciones bioquimicas su. ponen Ia formacién de intermediarios cargados inestables que tienden a descomponerse rapidamente en sus especies reac- tivas constituyentes no pudiendo, de este modo, reaccionar (Fig. 6-8). Los intermediarios cargados a menudo se pueden cestabilizar transfiriendo protones a o desde el sustrato o inter- ‘mediario para formar una especie que se descompone en pro- ductos mas ficilmente que en reactivos. En las reacciones no ‘enzimaticas, las transferencias de protones pueden utilizar s6lo los constituyentes de! agua u otros dadores o aceptores débiles de protones. La catalisis que sélo utiliza los iones H* ig0") u OH presentes en el agua se denomina catélisis cida o basica especifica. Si la transferencia de protones entre el intermediario y el agua es més ripida que la descom- posicidn del intermediario en reactivos, el intermediario se estabilizard de manera efectiva cada vez que se forme. En este caso no se produciré catélisis adicional facilitada por otros aceptores 0 dadores de protones. No obstante, en muchos casos, el agua no es suficiente, El término eatalisis écido-base ge- neral se refiere a transferencias de protones facilitadas por otras clases de moléculas. En reacciones no enzimaticas en so- Jucion acuosa, esto se observa solamente cuando la velocidad, de descomposicion del intermediario inestable en reactivos es ‘mayor que la de transferencia de protones a o desde el agua, ‘Muchos dcidos orginicos débiles pueden suplementar al agua ‘como dadores de protones en esta situacién, al igual que bases orginicas débiles pueden servir como aceptores de protones. ‘Varias cadenas laterales de aminodcidos pueden actuar de ‘modo similar como dadores y aceptores de protones en el sitio activo de un enzima (Fig. 6-8). Estos grupos se pueden posicio- nar de forma precisa en el sitio activo de un enzima para permi- tir la transferencia de protones, generando incrementos de velocidad del orden de 10* a 10%. Este tipo de catdlisis tiene lu- ‘gar en la gran mayorfa de enzimas. De hecho, las transferencias de protones son las reacciones bioquimicas més habituales. Catélsis cowlente Er la catdlisis covalente ge forma un enlace covalente transitorio entre el enzima y el sustrato. Consicere- ‘mos la hidrdlisis de un enlace entre los grupos A y B: En presencia de un catalizador covalente (un enzima con un ‘grupo nucleofiico X:) la reaccién se transforma en. 6-8 Modo en que un eatalizador supra la formacién desfa- ble de carga durante la rotura de una amida. Hichdlisis de un en= aida, la misma reaccién que cataizan la quimoripsina y otras La formacién de carga resulta destavorable y se puede evi- ‘por la donacién de un proton por pare de HO” (catlisis Scida es fica) 0 HA (catiliss cida genera), donde HA es cualquier sido De modo parecido se puede neutralizar la carga por captacién det por parte de OH (cass bisica especifica) 0B: (catlisis bi ‘eenerali, donde 8: es cuatouier hase, 62 {C6mo funcionan los enzimas? 201 Esto altera la ruta de la reacciGn y sélo produce catéliss si Ja nueva ruta tiene una energia de activacién inferior ala de la ruta no eatalizada. Los dos nuevos pasos han de ser mis rap dos que la reaccién no catalizada. Diversas cadlenas laterales de aminoscidos (entre ellas todas las de la Fig, 6-9), asi como Jos grupos funcionales de algunos cofactores enzimaticos, sir- ‘yen como nucledfilos en algunos enzimas para la formacién de enlaces covalentes con los sustratos. Estos complejos covalen- tes siempre experimentan ura reaccién adicional con el fin de regenerar el erzima libre. El enlace covalente formacdo entre el eraima y el sustrato puede activar un sustrato para una nueva reaccion de una forma que es normalmente especifica para el ‘grupo o coenzima implicado, Catalisis por iones metalicas Los motales, tanto si estan fuerte ‘mente unidos al enzima como si son captados de la solucién Junto con el sustrato, pueden participar de diferentes maneras en la catélisis. Interacciones inicas entre un metal fijado al enzima y el sustrato pueden ayudar a orientar un sustrato para que reaccione o estabilizar estados de transicién de la reaccién, que estén cargados. Esta utilizacién de interacciones de fja- ci6n débiles entre el metal y el sustrato es similar a algunos de Jos usos de la energia de fjacion erima-sustrato descrita an- teriormente, Los metales también pueden facilitar reacciones de oxidacion-reduccién mediante cambios reversibles en el es- {ado de oxidacién del ion metalico. Casi una tercera parte de Jos enzimas conocidos requieren uno 0 mas iones metalicos para su actividad catalttica La mayoria de enzimas utilizan una combinacién de varias estrategias cataliticas para conseguir un incremento de veloct- dad. Un buen ejemplo de ta utiizaicion de la catalisis covalente FIGURA 6-9 Aminoscidos implicados en la catilisis Scido-base ge- eral. Muchas reacciones organicas estan favorecidas por dadores aicidos generales) 0 aceptores de protones (bases nenerales). Los si: tos activos de algunos enzimas contienen grupos funcionales de ami- ‘novicidas, tales como los que aqut se muestan, que pueden participar ot oll meneame conaiilivn enaum diniinmen o, phaneumee dn eentonen. 202 Capitulo6 Enzimas 2 seo < A BA HO’ “si Ne i I 4), Ay alot o Pe owe, NH, FIGURA 6-10 Catlins Scidocbase general y covalent, El primer ps dela eacincatalizad por a quimotisna es el paso de ach lacén. El grupo hidroilo de la Ser" ese nucesilo en una eac- cl6n en la que colabora Ia cats bisica general (a base es la Cadena lateral dela Hi". lo proprciona ura nueva via pata ahi dislsis del enlace peptidico. La cats solamente se produce 5 cada etapa dela rweva via es mis pia que la reaccién no ctl 2ada a eaccin del quimotpsina se describe con mayor detalle en la Figura 621, Re junto con la catélisis écido-base general se ca en Ia reaccién catalizada por la quimotripsina. El primer paso es la rovura de un enlace peptidico, acompafiada por la formacién de una unin covalente entre un residuo de Ser en el enzima y luna parte del sustrato; esta reaceién es facilitada por catélisis| basica general a cargo de otros grupos cataliticos del enzima (Fig. 6-10). La reaccién de la quimotripsina se describe con ‘mayor detalle en la Seccién 6.4. RESUMEN 6.2 {Como funcionan los enzimas? @ Los enzimas son catalizadores muy eficientes, capaces le aumentar las velocidades de reaccion en ‘un factor de entre 10° y 10", ‘© Las reacciones catalizadas por enaimas se carac- terizan por la formacién de un complejo entre el sustrato y el enzima (complejo ES). La fijacién del sustrato se produce en una bolsa del enima lamada sitio activo, @ La funcién de los enimas y de otros catalizadores consiste en disminuir la energia de activacién, AG*, dde una reaccién con el fin de inerementar sti velocidad. El equilibrio de una reaccién no es afectado por el enzima. © Una parte significativa de la energia utilizada para elincremento de la velocidad de las reacciones ‘enzimaticas procede de interacciones debiles (enlaces de hidrogeno, interacciones hidrofébicas e interacciones iénicas) entre enzima y sustrato, El sitio activo del enzima tiene una estructura tal que hace ‘que algunas de estas interacciones débiles tengan ugar de modo preferente en el estado de transicién. de la reaccién, con lo que lo estabilizan, Una de las necesidad de que existan multiples interacciones, La energia de fijacion, AGy, puede utilizarse para disminuir la entropfa del sustrato 0 para producir lun cambio conformacional en el enzima (encaje inducido). La energia de fijacién es tambien la responsable de la exquisita especificidad de los. fenzimas por sus sustratos. 1@ Entre los mecanismos cataliticos adicionales empleados por los enzimas se cuentan la catalisis, 4écido-base general, la catalisis covalente y la catalisis| por jones metilicos. La catélisis suele implicar la existencia de interacciones covalentes transitorias ‘entre el sustrato y el enzima o transferencias de grupos desde o al enzima, con el fin de adoptar una ruta de reaccién nueva y de menor energia 6.3 La cinética enzimatica como método para comprender el mecanismo Los bioquimicos utilizan normalmente diversos métodos para estudiar el mecanismo de accién de enzimas purificados. El conocimiento de la estructura tridimensional de la proteina proporciona informacién importante y el valor de la informa- cidn estructural aumenta en gran manera con la quimica de proteias clisica y con los modernos métodos de la mutagéne- sis dirigida (el cambio de la secuencia de aminosicidos de una proteina mediante ingenieria genética; véase Fig. 9-12). Estas teenologias permiten a los enzimélogos examinar el papel de aminodcidos concretos en la estructura y en la accion del en- zima, No obstante, el método principal para estudiar el meca- rismo de una reaccién catalizada enziméticamente consiste en Ja determinacion de la velocidad de la reaccién y del modo ‘en que ésta cambia en respuesta a cambios en los pardmetros ‘experimentales, una disciplina conocida como einétiea enzi- matiea, Este es el método mas antiguo para conocer el me- canismo enzimético y continita siendo el mis importante. A ccontinuacién se expone una introduccién bésica a la cinética de las reacciones catalizadas por erzimas. Se pueden encon- tar tratamientos més avanzados en los textos y articulos que se citan al final de este capftulo. La concentracién de! sustrato afecta a la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas ‘Uno de los factores clave que afectan ala velocidad de una reac- ci6n catalizada por un enzima es la concentracién de sustrato presente, [S]. Sin embargo, el estudio de los efectos de la con- centracién de sustrato es complicado debido al hecho de que (S} cambia durante el transcurso de una reaccién a medida que el sustrato se convierte en producto. Una aproximacién simplificadora en los experimentos cinéticos consiste en medit Ja velocidad inicial, lamacda Vo, cuando [S] es mucho mayor {que la concentracién de erzimna, (E]. En una reaccién tipica, ¢1 ‘enima puede estar presente en concentraciones del orden na- nomolar, mientras que [S) puede ser cinco o seis érdenes de 6.3 La cinética enzimatica como método para comprender el mecanismo 203 ‘Velocidad inicil, V, (usin) Concentracién de sustrato, [SI (ma) FIGURA 6-11. Ffecto de la concentracin de sustrato sobre la veloci- dda inicial de una reaccién catalizada por un enzima. fn una grtiea de este tipo solo se puede obtener una aproximacién de Vax Por ex trapolacion debido a que Vo se acercaré pero nunca aleanzara Vis: La concentracidn de sustato ala que Vp esta mitad de la maxima es ‘ye la Constante de Michaels. En un experimento de este tipo Ia con ceentracién de enzima Es generalmente tan baja que {S| >> Elin cluso cuando |S] se describe como baja 0 relativamente baja. Las Lunidades reseRiadas son tpicas de las teacchones catalizadas por en mas y slo se muestran aqui para ayuelarailutarel significado de Vo YISI-(Obsérvese que la curva describe parte de una hipérbola rectan- {ular con una asintota ef Via. Si $e continuase la curva por debajo de [S| = Ose aproximaria a una asntota vertical a [SI = ~ Key) i6n (a menudlo 60 segundos o menos), los cambios en [8] se li- ‘mitan a un pequefio porcentaje y puede considerarse que la cconcentracin permanece constant. En esta situacién puede explorarse el valor de Vo en funcion de [S}, valor que es ajus- taulo por el investigador. El efecto de la variacion de [S] sobre Vj cuando se mantiene constante la concentracién de erima ‘se muestra en la Figura 6-11. A concentraciones de sustrato re- lativamente bajas, Vp aumenta casi linealmente con el incre mento de [S}. A mayores concentraciones de sustrato, Vo umenta a incrementos cada vez menores en respuesta a incre ‘mentos de [S]. Finalmente, se alcanza un punto més allé del ‘cual se dan incrementos pequefiisimas de V9 can el ineremento de [S| Esta meseta se denomina velocidad maxima, Vines El complejo ES constituye la clave para entender este con portamiento cinético, del miamo modo que representé un punto Maud Menten, 1879-1960 dd partida para la discusiGn de la eatAlisis. El patron cinético de Ja Figura 6-11 hizo que Victor Henri, siguiendo una sugerencia de Wurtz, propusiese en 1903 que la combinacién de un enwima ‘con su molécula de sustrato para formar el complejo ES es un paso necesario en la catlisis enzimatica. Esta idea fue ampliada para dar lugar a una teoria general de la accion enzim: particular a cargo de Leonor Michaelis y Mand Menten en. quienes postularon que el enzima se combina en primer lugar de forma reversible con su sustrato formando un complejo en- ‘zima-sustrato en un paso reversible relativamente répic: A E+S <> ES on El complejo ES se descompone seguidamente en un segundo paso mas lento dandlo el envima libre y el producto de la reac: ‘i6n P: be ESS E4P 68) La segunda reaccién (Ee. 6-8) es més lenta y limita, por tanto, Ja velocidad de la reaceién global. De ahi se desprende que la velocidad global de la reaceidn catalizada envimaticamente ha de ser proporcional ala concentracién de la especie que reac- ciona en el segundo paso, es decir, ES, En cualquier momento de una reaceién catalizada por un enaima, éste existe en dos formas, la forma libre o sin combinar ya forma combinada ES. A baja [S], la mayor parte del en- ima estard en la forma sin combinar E. Aqut la velocidad ser proporcional a [S] porque el equilibrio de la Ecuacién 6-7 seri cempujado hacia la formacién de més ES a medida que (S] au- rmenta. La velocidad inicial maxima de la reaccién catalizada (Via) 8¢ observard cuando virtualmente todo el enzima esté en forma de complejo ES y la concentracién de E sea extrema damente pequefia. En estas condiciones, el enzima esté “satu ado” con su sustrato de modo que e! aumento adicional de [S} no tendré efecto sobre la velocidad. Esta condicion se produ- ira cuancio [5] sea Io suficientemente alta como para que todo el enzima libre se haya convertido en la forma ES. Cuando el ‘complejo ES se descompone dando el producto P, el enzima ‘queda libre para catalizar la otra reaceidn de otra molécula de sustrato. El efecto de saturacién es una caracteristica distintiva de la catilisis enzimitica y es el responsable de la meseta ob: servada en la Figura 6-11. El modelo seguido en la Figura 6-11 rrecibe en ocasiones el nombre de cinética de saturacién, ‘Cuando el enzima se mezcla inicialmente con un gran ex: ‘ceso de sustrato, existe un periodo inicial, denominado estado pre-estacionario, durante el cual aumenta la concentracién del complejo ES. Normalmente el estado pre-estacionario es demasiado corto para que sea observado ficilmente y dura tan ‘s6lo unos microsegundos. La reaccién alcarwa ripidamente unt estado estacionario en el que [BS] (¥ la concentracion de otros intermediarios) permanece aproximadamente cons- tante con el tiempo. El concepto de estado estacionario fue presentado por G.E. Briggs y Haldane en 1925. La Vy medida refleja generalmente el estado estacionario, aun cuando Vy 8e limite a los primeros instantes dle la reaccién, y el analisis de 204 Capitulo6 Enzimas. las velocidades iniciales se conoce como elnética del estado estacionario. La relacién entre concentracién de sustrato y velocidad de reaccién se puede expresar ‘de manera cuantitativa La curva que representa la relacién entre [Sf y Vy (Fig. 6-11) tiene la misma forma general para la mayoria de erzimas (se acerca a una hipérbola rectangular) y se puede expresar alge- braicamente mediante la eeuacidn de Michaelis Menten. Estos investigndores desujeron esta ecuacion a partir de su hipote- sis bésica de que el paso limitante de velocidad en las reaccio- nes enzimaticas s la descomposicisn del complejo ES para formar el producto y el eraima libre. La ecuacién es Vans (81 Vo Kes (ST 6 6-9) Los términos importantes son [S}, Vo, Vue ¥ una constante lla- mada constante de Michaelis 0 Kp. Todos estos términas se pueden medir fécilmente de manera experimental. ‘Aqui desarrollaremos la Wégica bisica y los pasos algebrai- ‘cos en una deduccién moderna de la ecuacion de Michaclis- Menten, la cual incluye la suposicidn del estado estacionario {introducida por Briggs y Haldane, La deduccién se inicia con Jas dos reacciones bisicas que intervienen en la formacién y descomposicion de ES (Bes, 6-7 y 6-8). En los primeros mo- ‘mentos de la reaccién, la concentracién del producto [P] es despreciable y se hace la suposicion simplificadora de que puede ignorarse la reaccién inversa P — $ (descrita por k2). Esta suposicién no es critica y simplifica nuestra tarea. La reaccién global se reduce a est e+so=es esp (610) Vo se determina por la descomposicién de ES para dar pro- ducto, la que viene fjada por {ES}: Vo = kafBS) ean Dado que [ES] de la Ecuacién 6-11 no se puede medir expe mentalmente con facilidad, hemos de empezar por encontrar ‘una expresién alternativa para este término. En primer lugar introduciremos el término [E,), que representa la concentra cién total de enzima (la suma de enzima libre y erzima unido al sustrato), £1 enzima libre, o no fijado, se puede representar, por tanto, como [Ey] ~ [ES]. Adems, debido a que [S| es nor- ‘malmente mucho mayor que [Ey la cantidad de sustrato fijada por el enzima en cualquier momento de la reaccién es despre- ciable comparada con la [S] total. Con estas consideraciones, los pasos siguientes nos conduciran a una expresién de Vy en funcion de parimetros que se miden fécilmente, Paso 1 Las velocidades de formaciin y descomposicién de BS vienen determinadas por las constantes de velocidad ky (Cormacién) y k_,+ ky (descomposicién), segsa las expresio- nes siguientes: Velocidad de formacién de ES = k,((E) ~ [ES))IS) (6-12) Velocidad de descomposicidn de ES = k_,[ES} + ks[ES) 6-13) Paso 2 Suponemos ahora una importante consideracién: que la velocidad inicial de reaccién refleja un estado estacionario en el que [ES} es constante, es decir, la velocidad de formacivin de BS es igual a la velocidad de descomposicién. A esto se lo denomina hipétesis del estado estacionario. Las expresio- nes de las Ecuaciones 6-12 y 6-13 pueden igualarse en el es: tado estacionario dando: (8) ~ 1ES))IS) = (ES) + [ES] Paso 3 Se realiza una serie de pasos algebraicos para resol: ver la Ecuacidn 6-14 en funeién de [BS]. Se resuelve el primer iembro y se saca factor comin en el segundo (6-14) ‘Ae {E,IIS) — ky {ESNS) = (ke + &ES) (6-15) ‘Sumando el término k,{ESi[S] a ambos lados de la ecuacién y simplificando da AyIEIS) = (18)-+ 4-5 +491B8) (6-26) Despejando [ES] se obtiene: esl = pg oan Esta expresién atin se puede simplificar més, combinando to- ‘das las constantes de velocidad en una expresién: Es) (eis) “STF the + av aoe) El término (ky + &_,)/e; se define como la constante de Mi- chaclis-Menten, Ky. Sustituyéndola ahora en la Ecuacién 6-18 la expresidn se simplifica a w= 8 6-19) Paso 4 Ahora podemos expresar Vy en funcién de [ES]. Sus tituyendo [ES] por el segundo miembro de la Ecuacién 6-19 en Ja Ecuacion 6-11, obtenemos keolEIS) V0" Ke + IST 6-20) Esta ecuacién atin se puede simplificar més, Dado que la velo- cidad maxima se obtendra cuando el encima est4 saturado (es decir, cuando [ES] = (Ey), Vinus 9€ puede definir como kell) Sustituyenclo esto en la Ecuacién 6 20 da la Ecuacion 6-9: _ Yeas 18) Ke Yo Esta es la eeuaci6n de Michaelis-Menten, la ecuacién de velocidad de una reaccién catalizada enaimaticamente con lun sustrato. Es una definicién de la relacién cuantitativa entre Ja velocidad inicial Vp, la velocidad méxima Viyye ¥ a concen: tracién inicial de sustrato (8), todos ellos relacionados a través 63. La cinética enzimatica como método para comprender el mecanismo 205, Vo= Vin Vo (uw/min) {S) (a) FIGURA 6-12 Dependencia de la velocidad inicial com respecto a la ‘concentracién de sustrato. En el grico se muestran los parimettos inéticos que definen los limites de la curva a |S} ala y baja. A baja ISI, Ky >> ISI por lo que el téeming S| det denominador de Ia ecu Cdn de Michaelis-Menten (Ec. 6:9) es insignificant; Ia ecuacién se slmpliica 2 Vj = Vis [SV por lo que Vo tiene una dependencia Ii real con respecto a [5] tal como se observa. A ISI alta, en donde IS] >> Kg el término Kiy del denominador de la ecuacin de Mi- chaclis-Menten es insignificant, simpliicindose la reaccin a V Vas €80 coincide con la meseta que se observa a [S| elevada, La fecuacién de Michaelis-Menten es, pues, congruente con la depen dencia observada de Vp con respacto a [Sly [a forma de la curva esti P) en la que hay una sola ‘molécula de sustrato, No obstante, en rmuchas reacciones en- Zimaticas, se jan al enzima dos (0 incluso més) moléculas de sustrato diferentes que participan en la reaccidn. Por ejemplo, ‘en la reacci6n catalizada por la hexoquinasa, el ATP y la glu ‘cosa son las moléculas de sustrato y el ADP y la glucosa 6-fos- {ato los proctuctos: ATP + glucosa —+ ADP + glucosa 6-fosfato TABLA 6-8 _ Enzimas para los que keu/Km est préxima al limite controlado por difusién (10% a 10° w"s~*) ew Ko Kear/Kry Enzima Sustrato s') ) (wis?) Acetilcolinesterasa Acetitcotina 1,4 x 108 9x 107° 1,6 x 10° Corbénico anhidrasa CO, 1x 108 1,2 x 107? 8,3 x 107 HOS, 4x 10° 2,6 x 107 1,5 x 107 Catalasa 1202 4x10" 1,1 x 10° 4x10" Crotonasa Crotonil-CoA 5,7 x 10° 2x 107° 2,8 x 10° Fumarasa Fumarato 8x 10? 5x 10° 1,6 x 10° Malato 9 x 10? 2,5 x 10-> 3,6 x 107 P-lactamasa Bencilpenicilina 2,0 x 10° 2x10°° 1x 10° Sian: Punta, A. (1008) Seuntew and Meshanton & fvetehs Sateen 9. 108, 0 i, Peaman une Campany tenet. 208 Capitulo Enzimas (a) Reaccién enzimatica con formacién de un complejo ternario. Orden estadistico ZB E ES\S; —+>E+P,+P, Nves,7 Ordensdo S E+S; == ES; = ESS, ——> E+ P, +P (b) Reaccién enzimatica en la que no se forma un complejo ternario Ro & E+8, = 16, = 27, — 2 28, — B+ R Las velocidades de tales reacciones bisustrato se pueden analizar segtin el método de Michaelis-Menten. La hexoqui- nasa tiene una Ky, caracteristica para cada uno de sus sustra- tos (Tabla 6-6), Las reacciones enzimaticas en las que hay dos sustratos implican normalmente la transferencia de un tomo o un ‘grupo funcional de un sustrato al otro, Tales reacciones trans- ‘curren por una o varias rutas diferentes. En algunos casos, ‘ambos sustratos estan fjados al enzima al mismo tiempo, for- ‘mando en algin momento de la reaccién un complejo terario zo covalente (Fig. 6-182); los sustratos pueden fjarse en una secuencia al azar 0 en un orden especifico. En otros easos no ‘se forma complejo ternario cuando el primer sustrato se con- vierte en producto y se disocia antes ce que se una el segundo sustrato. Uin ejemplo de esto es el mecanismo ping-pong o de doble desplazamiento (Fig, 6-13b). La cinética del estado es- tacionario puede ayudar a menudo a distinguir entre estas po- sibilidades (Fig. 6-14). La cinética en el estado pre-estacionario puede aportar pruebas sobre pasos especificos de la reacclén Hemos considerado la cinética como el método principal para el estudio de los pasos de una reaccién enzimatica y hemos subrayado tambien las limitaciones de los parémetros ciné- ticos mas comunes para poder proporcionar esta informa- cidn. Los dos parémetros experimentales més importantes aportados por la cinética en el estado estacionario 801 Kea ¥ ou. / Bp. La variacion de estos pardmetros con los cambios de Ho temperatura puede proporcionar en ocasiones informa- ci6n adicional sobre las etapas de una ruta de reaceién. En el ‘caso de las reacciones bisustrato, la cinética del estado esta. cionario puede ayudar a determinar si se forma © no un com: plejo ternario durante la reaccién (Fig, 6-14). Una visin mis completa requiere generalmente métodos cinéticos mas sofis- icados que estén fuera del alcance de un texto introductorio, Aqui, introduciremos de manera breve uno de los métodos. cinéticos mas importantes para estudiar los mecanismos de reaccién: Ia cinética en el estado pre-estacionario. La deseripeién completa de una reaccién eatalizada por sdien tesla: tiicediereas inte tiie Eten Bn tocreeiin lids Bt FIGURA 6-13 Mecanismos frecuentes para las reacciones Disustrato catalizadas enzimaticamente a) El enzina y ambos sutras se unen formando un complejo termaro. En la icin ‘ordenada,e susrato 1 debe uniese ates de que el sustrato 256 ‘pueda unir de manera produetiva. En la unidn estadsica 0 al 2k la urn de los sustratos se pede dar en cualquier orden, En () se forma un complejo enzima-sustato, un producto abandona el complejo, el enzima modiicado forma un segundo complejo con otra mokécula de sustato y sale el segundo producto, egenerardo el enzima El sustaw 1 pede taser ‘un grupo funcional a enzima formand €* moditicado covaleniemente) que es posterormentetranserdo al sustrato 2. Este es un mecanismno ping pong 0 de doble desplazamvento, pasos de reacci6n individuales, por ejemplo la medicién de ta asociacién de enzima y sustrato para formar el complejo ES. Es durante e! estado pre-estacionario cuando se pueden medir cde manera independiente las velocidades de muchos pasos de la reaccién. Las condiciones de la reaccidn se ajustan para fa- + cilitar la medida de los acontecimientos que tienen Iugar du- FIGURA 6-14 Anslisis cindtico en el estado estacionario de las reac-

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