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UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA DE TECNOLOGÍA MÉDICA

CAMBIOS EN LA EXPRESIÓN DE HEPCIDINA,

FERROPORTINA Y FERRITINA EN EL
PREACONDICIONAMIENTO HEPÁTICO CON
HIERRO FRENTE A LA ISQUEMIA-REPERFUSIÓN
HEPÁTICA.

TESIS PROFESIONAL PARA OPTAR AL TÍTULO DE TECNÓLOGO MÉDICO CON

MENCIÓN EN BIOANÁLISIS CLÍNICO, HEMATOLOGÍA Y BANCO DE SANGRE

AUTOR: Ángela Novoa Arce

TUTORES: Virginia Fernández A.

Luis Videla C.

Financiado por FONDECYT 1110006

2014
 2

Índice

Tema Página

I-. Resumen 3-4

II-. Introducción 5-6

III-. Marco Teórico:

- Isquemia reperfusión 6-9
- Preacondicionamiento hepático 9-10
- Preacondicionamiento hepático con Hierro 10-12
- Expresión hepática de hepcidina, ferroportina y ferritina 12-15
IV-. Hipótesis 16

V-. Objetivo general 16

VI-. Objetivos específicos 16

VII-. Materiales y Métodos

- Animales 17
- Suplementación con fierro 17
- Modelo de Isquemia-Reperfusión hepática 17-18
18
- Obtención de muestras
19
- Obtención de cDNA 19
- Evaluación de la expresión de la Hepcidina 19
- Evaluación de la expresión de Ferroportina y Ferritina 20
- Determinación de la actividad de transaminasas séricas 20
- Análisis estadístico
VIII-. Resultados
- Niveles séricos de GOT y GPT 21-22
- Niveles de RNAm de Hepcidina 23-24
- Niveles de Ferritina 24-26
- Niveles de Ferroportina 26-28

IX-. Discusión 29-31

X-. Referencias Bibliográficas 32-35
XI-. Anexos 36
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I-. Resumen

El daño por isquemia-reperfusión (IR) es el que se produce luego de la interrupción del

flujo sanguíneo a un órgano seguido del restablecimiento de éste, lo cual puede producir la

muerte del hepatocito y de las células endoteliales. Se han estudiado diferentes estrategias

de preacondicionamiento (PC) hepático para proteger al hígado del daño causado por IR.

Dentro de los mecanismos estudiados está el preacondicionamiento inducido por hierro

(Fe), molécula que establece una condición de estrés oxidativo transitorio que no desarrolla

hepatotoxicidad. La homeostasis del Fe está regulada por la hepcidina, proteína de fase

aguda sintetizada en el hígado, la cual en condiciones de exceso de Fe se encarga de

proteolizar a la ferroportina con el fin de dejar internalizado al Fe dentro de la célula,

aumentando la síntesis de ferritina y disminuyendo la ferremia. Por tal motivo se evaluó

cambios en su expresión frente al PC hepático inducido por Fe, como también cambios en

la expresión de ferroportina y ferritina, proteínas que regulan la ferremia. Se observó un

aumento significativo en la expresión de hepcidina, inducido por la administración de Fe,

como también un efecto inductor ejercido por la IR tanto en el grupo no P como en el P con

Fe, sin diferencias significativas inducidas por la IR en la expresión de esta proteína en

animales con o sin P. En concomitancia, se observó que el P con Fe incrementa

significativamente la expresión de ferritina en el grupo sometido a IR. La expresión de

ferroportina es también incrementada por el Fe, efecto que no se observa en el grupo

sometido a IR. El incremento en la ferremia, gatillado por la administración de Fe,

determinaría una mayor expresión de proteínas que participan en el metabolismo de este

micronutriente, a fin de alcanzar la normalización de este parámetro sanguíneo. El aumento

de ferritina, proteína que almacena Fe intracelular, disminuirá el pool de Fe lábil limitando

 4

su toxicidad, y además, su actividad antioxidante asociada a su cadena pesada, contribuiría

a la hepatoprotección gatillada por el P con Fe. Por otro lado, el exceso de Fe regula la

expresión de la ferroportina, que actúa como exportador de Fe. La inducción de hepcidina

por el protocolo de P con Fe, conlleva a la degradación (proteólisis) de ferroportina a fin de

internalizar al Fe, el cual induce la síntesis de ferritina para disminuir la ferremia. Este

estudio adicional muestra además que el efecto inductor ejercido por la IR sobre la

expresión de hepcidina es exacerbado por la administración de Fe.

 5

II-. Introducción

En las cirugías hepáticas, uno de los grandes problemas es que los cirujanos se ven

obligados a obstruir en forma parcial la circulación sanguínea durante la operación con el

objeto de minimizar hemorragias. Este proceso, en el cual se produce la isquemia (I)

hepática seguido del restablecimiento de la irrigación sanguínea o reperfusión (R), provoca

daño celular asociado a inflamación y a estrés oxidativo, produciendo una injuria en dicho

órgano, la cual puede llegar a ser irreversible, determinando el éxito o fracaso del

procedimiento (1). Por esta razón se han diseñado procedimientos que permiten reducir el

daño celular que sufre el hígado al ser sometido a cirugías bajo oclusión vascular, los que

constituyen diferentes estrategias de preacondicionamiento hepático, proceso biológico

endógeno que se manifiesta al exponer al hígado a una situación citotóxica que le otorgue

protección frente a una futura lesión (1). En nuestro laboratorio se han evaluado estrategias

preacondicionantes con potencial aplicación clínica, tales como la administración de

hormona tiroídea, ácidos grasos poli-insaturados omega-3, y recientemente la

administración subcrónica de hierro (Fe) (2). En este último caso, el protocolo de Fe usado

gatilla estrés oxidativo hepático transiente, con activación de vías reguladas por factores de

transcripción redox-sensibles, las que provocan hepatoprotección frente a la IR, con

supresión de las respuestas pro-inflamatoria y pro-oxidante inducidas (3, 4). El

preacondicionamiento con Fe incrementa la expresión de haptoglobina, proteína de

respuesta de fase aguda hepática (3). En este sentido, se ha descrito que tanto la IR

hepática como la administración aguda o dietaria de Fe aumentan significativamente la

respuesta de fase aguda a través de la inducción de hepcidina, proteína antimicrobiana que

 6

junto a ferroportina y ferritina regula la homeostasis del Fe, modulando su absorción

almacenamiento y distribución tisular (5, 6). En el presente trabajo se evalúa el

preacondicionamiento hepático con Fe frente a la IR, en relación a cambios en la expresión

de hepcidina y de ferroportina y ferritina, proteínas asociadas a la función de hepcidina en

la regulación de la homeostasis del Fe.

III-. Marco Teórico

Isquemia-Reperfusión hepática.

La isquemia es un fenómeno que se produce al obstruir total o parcialmente la

circulación sanguínea de un órgano o tejido, disminuyendo la entrega de oxígeno y

nutrientes, pudiendo causar muerte celular, daño que se acentúa cuando se restablece el

flujo de O2 durante la reperfusión, conformando así el daño por isquemia-reperfusión (IR)

(1). En el hígado el daño por IR está asociado a eventos tales como la resección quirúrgica

bajo exclusión vascular, el trauma y el trasplante (1,7)

Al someter un órgano a una condición de isquemia, la hipoxia cambia el

metabolismo celular de aerobio a anaerobio, disminuyendo la fosforilación oxidativa

mitocondrial, la síntesis de ATP y la actividad de bombas de membranas dependientes de

ATP, provocando la entrada de sodio, agua y calcio a la célula (8). El incremento de la

concentración de Ca2+ citosólico activa diferentes sistemas enzimáticos hidrolíticos que

dependen de este catión, como fosfolipasas, nucleasas y proteasas, los cuales participarán

en la respuesta inflamatoria que se desarrollará posteriormente (7). Durante la IR se

generan especies reactivas del oxígeno (EROS), vía (i) la transformaciónpor proteasas
 7

Ca+2-dependiente de xantina deshidrogenasa en xantina oxidasa, que utiliza O 2 y genera

anión superóxido (O2·–) y peróxido de hidrógeno (H2O2) al oxidar hipoxantina derivada del

catabolismo del ATP a ácido úrico y (ii) la actividad NADPH oxidasa de los macrófagos

hepáticos, las células de Kupffer (1).

En el daño hepático secundario a IR se pueden caracterizar dos etapas. La primera,

es la fase temprana, la cual se extiende desde el inicio de la reperfusión hasta 4 horas

aproximadamente. En esta fase se observa la activación de las células de Kupffer con

producción de EROS y de citoquinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral

α(TNF-α), interleuquina (IL)-6 e IL-1. Además, habrá activación de los factores del

complemento, así como reclutamiento y activación de linfocitos residentes (Figura 1) (1,9).

La segunda etapa es la fase tardía, que dura mucho más que la temprana y abarca desde la

sexta hasta las 24 horas posteriores a la reperfusión. Esta fase se caracteriza por la llegada,

infiltración y activación de leucocitos polimorfonucleares neutrófilos (PMN), lo cual

permite mantener y amplificar el daño causado en la reperfusión temprana. Los

responsables del reclutamiento de PMN son las citoquinas proinflamatorias, quimioquinas

y factores de crecimiento que se liberaron previamente (Figura 2). Si el daño endotelial es

severo, la migración transendotelial de los PMN se ve facilitada, sin embargo si el daño no

es grave dicha migración requiere de la participación de moléculas de adhesión como

ICAM-1, cuya expresión aumenta en los hepatocitos en respuesta al TNF-α, IL-1 e

interferón-γ (INF-γ) (1,9).

 8

Figura 1. Fase temprana del daño por

isquemia-reperfusión mediada
principalmente por las células de Kupffer.
[Extraído de (1)]

Abreviaturas:
- CE: células endoteliales
- TNF-α: factor de necrosis tumoral-α
- IL: Interleuquina
- CXC: quimioquinas
- PAF: Factor activador de plaquetas.

Figura 2. Fase tardía del daño por

isquemia-reperfusión mediada
principalmente por la llegada,
activación e infiltración de neutrófilos.
[Extraído de (1)]

PMN: polimorfonucleares
ICAM: Molécula de adhesión
intercelular
VCAM: Molécula de adhesión celular
vascular

Existen dos tipos de isquemia hepática, isquemia caliente e isquemia fría. (i)La

isquemia caliente, en la cual la temperatura del hígado se mantiene similar a la temperatura

corporal ocurre en cirugías hepáticas bajo oclusión, trauma hepático, y shock hipovolémico,

determina muerte de los hepatocitos y de las células endoteliales sinusoidales (SEC) (2,9).

(ii) La isquemia fría, condición que se observa en un trasplante de hígado, se desarrolla con

el órgano fuera del organismo, a 4 °C con el objetivo de enlentecer el metabolismo del

 9

órgano al máximo antes de ser implantado (7). Este tipo de isquemia también conduce a la

muerte de las SEC (9).

Preacondicionamiento hepático

El preacondicionamiento (PC), proceso biológico endógeno que tiene como objetivo

aumentar la tolerancia de un órgano frente a una futura lesión, se manifiesta al exponer al

hígado a una situación citotóxicamoderada que le otorgue protección frente a una condición

deletérea posterior, como la IR (1, 9).

El primer estudio de PC, realizado por Murry en corazón, consistente en aplicar

breves y repetitivos períodos de isquemia, seguidos de reperfusión,breves períodos de

isquemia, seguidos de reperfusión previo a una IR prolongada (10). Luego se constató que

este mecanismo de PC isquémico se podía aplicar a otros órganos, dentro de ellos, el

hígado. La protección que otorga el PC isquémico varía según el órgano en el cual se

aplique. En el hígado la protección se obtiene luego de aplicar un ciclo de 10 minutos de

isquemia seguido de 10 minutos de reperfusión, sin que la adición de nuevos períodos de

IR proporcione mayor protección (11).

Dentro de las nuevas estrategias de PC evaluadas en modelos experimentales de

lesión hepática por IR se encuentran, (i) la terapia génica, dirigida a la regulación de

proteínas que participan en la producción de EROS, en la apoptosis, en la activación del

factor nuclear κ-B (NF-κB) o en la regulación de moléculas como ICAM-1 y P-selectinas

que reducen el reclutamiento de neutrófilos, y (ii) el uso de agentes farmacológicos que

inhiben mecanismos deletéreos o reducen el estrés oxidativo, iniciando una vía de defensa

celular (2, 9, 12).

 10

Las estrategias farmacológicas no se han utilizado en clínica debido a la aparición

de efectos adversos y/o por no lograr dosis adecuadas para conseguir la protección (12).

Aunque el PC fue útil en resecciones y trasplantes de hígado humano, el uso de este método

aún es controversial. Por todas esas razones, se ha hecho necesaria la búsqueda de nuevas

estrategias de PC hepático aplicables en la clínica. Por tal motivo, en nuestro laboratorio se

se han realizado procedimientos experimentales en ratas para evaluar estrategias

preacondicionantes con potencial aplicación clínica, tales como la administración de

hormona tiroídea, ácidos grasos poli-insaturados omega-3, y recientemente la

administración subcrónica de hierro (Fe), todos los cuales inducen hepatoprotección

asociada a la inducción de estrés oxidativo moderado (2, 13).

Preacondicionamiento hepático con Hierro

El Fe es un micronutriente esencial en todos los organismos vivientes. En

soluciones acuosas puede estar en estado ferroso (Fe 2+) o férrico (Fe3+), propiedad que le

permite participar en procesos de óxido-reducción (14), tales como los que controlan el

flujo de electrones o en vías bioenergéticas, la síntesis de DNA y el aporte de oxígeno a los

tejidos (2, 3). Entre las hemoproteínas que utilizan Fe como cofactor se encuentran las que

participan en el metabolismo del oxígeno (oxidasas, peroxidasas, catalasas e hidroxilasas),

en la transferencia de electrones (citocromos) y en el transporte de oxígeno (hemoglobina)

(14).

El potencial redox elevado y su capacidad para generar radicales hidroxilo (HO•)

que pueden causar peroxidación de las membranas lipídicas y otros constituyentes

celulares, convierten al Fe en una molécula altamente tóxica en elevadas concentraciones.

Por otro lado, el déficit de este metal produce anemia (15). Esta propiedad es denominada
 11

efecto hormético, lo que quiere decir que su efecto varía según su concentración (3). El Fe

cataliza la conversión del O2-• y H2O2 en HO• mediante las reacciones de Fenton y Haber

Weiss, lo que produce un aumento del estrés oxidativo (EOx) celular (16). El hierro en el

organismo forma parte de dos compartimientos, uno funcional en el cual encontramos

diversos compuestos, como la hemoglobina, la mioglobina, la transferrina y las enzimas

que utilizan Fe como cofactor o grupo prostético, y el compartimiento de depósito, en el

cual encontramos a la ferritina y a la hemosiderina, que forman las reservas corporales de

éste metal (14,15).

El Fe es transportado por transferrina (Tf), proteína plasmática que facilita el

intercambio del metal entre los compartimientos intra y extracelular (14). Aunque el Fe

intracelular está fuertemente unido a ferritina y otras proteínas, una fracción menor es unido

y quelado débilmente a moléculas de bajo peso molecular, para poder pasar con facilidad a

través de la célula, constituyendo el pool de Fe lábil (LIP) el cual puede promover la

generación de EROS y así desarrollar EOx intracelular (2, 3). El pool de hierro lábil debe

estar en equilibrio con el Fe proveniente de la dieta, con el hierro de exportación, con la

incorporación reversible de Fe a proteínas hemínicas y no hemínicas y con los depósitos de

ferritina (2).

Estudios previos en hígado de rata señalan que la administración subcrónica de Fe

(6 dosis de 50 mg/kg, en días alternados) preacondiciona al hígado frente a la IR, mediante

efectos anti-oxidantes y anti-inflamatorios, gatillados por la activación del NF-κB e

incremento en la expresión de haptoglobina, proteína de respuesta de fase aguda hepática

(3,4). Dicho estudio mostró además incrementos en el contenido total de Fe y en el LIP

hepático, con la consiguiente sobrerregulación del contenido de ferritina, debido a la

 12

sobrecarga de Fe administrado, lo cual establece una condición de EOx transiente que no

desarrolla hepatotoxicidad (2,3). El EOx transiente, gatillado por Fe, puede incluir

participación de las células de Kupffer, macrófagos residentes del hígado, cuya activación

conlleva a la liberación de ROS que en presencia de Fe pueden desencadenar reacciones de

Fenton y Haber Weiss, con posibles cambios en la expresión génica a través de la

modulación de la actividad de NF-κB, y liberación de TNF-α seguido de la activación de

señales citoprotectoras en hepatocitos con efectos hepatoprotectores frente a la IR (2,17).

Además de la activación de la vía regulada por NF-κB, en nuestro laboratorio se ha descrito

la activación temprana del factor de transcripción Nrf2 e incrementos en el contenido

hepático de hemoxigenasa-1, eventos que podrían contribuir a la respuesta hepatoprotectora

gatillada por Fe (18).

Expresión hepática de hepcidina, ferroportina y ferritina

(i) Hepcidina: Es un péptido catiónico con 25 aminoácidos, rico en cisteína, y con 4

puentes disúlfuros que unen 8 residuos de cisteína, importante para su acción

antimicrobiana. Es una proteína de fase aguda hepática que participa en la homeostasis del

Fe controlando su absorción intestinal, almacenamiento y distribución tisular (5). Para

cumplir su función reguladora frente a una sobrecarga de Fe, la hepcidina interactúa con

ferroportina (FNP1), un exportador de Fe, provocando la internalización y proteólisis de

este transportador, secuestrando al Fe en hepatocitos, enterocitos y macrófagos,

disminuyendo el Fe plasmático (5). La expresión de hepcidina está regulada por el nivel de

Fe hepático y plasmático y por la demanda eritropoiética de Fe (Figura 3), observándose

una correlación significativa entre los niveles de hepcidina y los de ferritina sérica, los

cuales descienden al aumentar los niveles de hepcidina (5).

 13

La síntesis de la hepcidina está inducida por la sobrecarga plasmática de Fe, por la

infección y por la inflamación, y su síntesis disminuye en anemia e hipoxia (19). La

regulación de la expresión de hepcidina por inflamación está dada por diferentes citoquinas

inflamatorias. La IL-6 estimula la expresión de hepcidina vía STAT3, factor de

transcripción redox sensible que interactúa con un elemento de unión de STAT3 en el

promotor de la hepcidina, siendo la señalización de IL-6/STAT3 un efector clave de la

expresión de la hepcidina en las enfermedades inflamatorias crónicas. Otras citoquinas y

los efectos directos de moléculas microbianas en hepatocitos también pueden contribuir a la

estimulación de esta proteína (19).

Figura 3. Interacción de la hepcidina con

la ferroportina controlando los flujos de
hierro plasmático.
El flujo y el reservorio de Fe se
encuentran en azul; el hierro en la
hemoglobina en rojo y la hepcidina y su
efecto en naranjo. [Tomado de (5)]
RBC: glóbulos rojos
Fpn: Ferroportina

(ii) Ferroportina y Ferritina: La expresión de proteínas que participan en el

metabolismo de Fe se regula traduccionalmente por el sistema IRP/IRE. Este sistema de

regulación está compuesto por los elementos reguladores de hierro (IRE, “Iron Responsive

Elements”) y por las proteínas reguladas por hierro (IRP, “Iron Regulatory Proteins”) (20).

Los IRE son estructuras lazo-tallo que se localizan en las regiones 5' o 3' no traducidas de
 14

los RNAm que codifican para las proteínas que intervienen en el metabolismo del Fe (21).

Las IRP trabajan en conjunto con los IRE para monitorear y responder a los cambios en la

cantidad de Fe en el LIP (Figura 4).

Figura 4: Representación esquemática

de la regulación del metabolismo del
hierro. [Extraído de (15)]
IRE: elemento de respuesta al hierro;
IRP: proteína reguladora de hierro; RTf :
receptor de transferrina : DMT 1:
Transportador de metales divalentes 1.

Cuando disminuye la cantidad de Fe en el LIP, las IRPs se unen a los elementos

IREs, impidiendo la traducción de ferritina y ferroportina y se estabilizan los RNAm del

receptor de transferrina y del DMT1, lo que se traduce en un aumento de captación de Fe

(20).

La ferroportina (FNP1) también es conocida como Ireg1 (“Iron-Regulated

Transporter 1” ) y MTP1 (“Metal Transporter Protein”), es la única proteína exportadora de

Fe en mamíferos (22). La localización de este transportador de Fe es consecuente con su

función de exportación de Fe desde la célula (20), ya que se expresa principalmente en los

enterocitos duodenales, células de Kupffer y macrófagos esplénicos (22). FNP1 se localiza

en la membrana basolateral de los enterocitos duodenales y en el compartimiento

 15

citoplasmático de células del sistema retículo endotelial (SER), donde tiene una

distribución predominantemente basolateral (23). No obstante, puede encontrarse en el

citoplasma basal y apical de estas células (21). En condiciones de sobrecarga de Fe, se

sintetiza hepcidina, la cual se dirige al intestino delgado para unirse a la FNP1 y provocar

su internalización y posterior proteólisis, dejando al Fe atrapado dentro del enterocito

duodenal (19). Dentro de uno o dos días, los enterocitos senescentes se desprenden,

eliminando así Fe del organismo (23).

El Fe que excede la formación de hemo proteínas (hemoglobina, mioglobina, entre

otras), o proteínas con grupos Fe-S implicadas en la cadena respiratoria mitocondrial, es

depositado o almacenado intracelularmente en ferritina o hemosiderina (agregados

micelares de ferritina) en el SRE del hígado, bazo y médula ósea (24). Cada molécula de

ferritina puede contener hasta 4.500 átomos de Fe, aunque normalmente tiene alrededor de

2.500 (15). Además de su función de almacenamiento, la ferritina ha sido identificada como

mediador esencial de las acciones antioxidantes y de protección de NF-κB (25). El efecto

antioxidante y citoprotector de NF-κB sería mediado por la cadena pesada de ferritina,

proteína regulada en su expresión por dicho factor de transcripción (26).

Debido a la función de hepcidina, ferroportina y ferritina en la homeostasis del Fe,

es importante evaluar su expresión en el preacondicionamiento hepático con Fe, frente a la

IR, esperándose un aumento en estas proteínas hepáticas.

 16

IV-. Hipótesis

El preacondicionamiento hepático con hierro frente ala isquemia-reperfusión

incrementa la expresión de hepcidina, junto a la de ferritina y ferroportina, proteínas

asociadas a la función de hepcidinacon efectos citoprotectores.

V-. Objetivo general

Evaluar la expresión de hepcidina, ferroportina y ferritina en el

preacondicionamiento hepático con hierro frente a la isquemia-reperfusión.

VI-. Objetivos específicos

- Evaluar parámetros de daño hepático mediante la determinación de niveles séricos

de transaminasas en animales sometidos a preacondicionamiento hepático con

hierro y en animales no sometidos a esta condición.

- Cuantificar la expresión de la hepcidina hepática mediante qPCR.

- Evaluar la expresión de la ferroportina hepática mediante RT-PCR.

- Evaluar la expresión de la ferritina hepática mediante RT-PCR.

 17

.VII-. Materiales y Métodos

Animales

Se utilizaron ratas machos de la cepa Sprague-Dawley con un peso de 140-160

gramos (Bioterio Central, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile). Los

animales usados en este estudio recibieron una dieta balanceada para roedores con niveles

normales de hierro y agua ad libitum.

Los protocolos experimentales en animales y los procedimientos de los animales

cumplieron con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, los cuáles

fueron aprobados por el Comité de Bioética de la facultad de Medicina, Universidad de

Chile (Protocolo No. CBA 0381 FMUCH).

Suplementación con Fe

En el tiempo cero, los animales recibieron 6 dosis intraperitoneales (ip) de 50 mg de

Fe-dextrano/kg, disuelto en solución salina, o volúmenes equivalentes de solución salina

(controles). Fe-dextrano y vehículo fueron administradas cada dos días durante un lapsus de

10 días.

Modelo de IR hepática

A las 72 horas después del tratamiento con Fe, las ratas se anestesiaron vía ip con 1

ml/kg de Zoletil (Zoletil 50; Virbac S/A, Carros, France) el cual está compuesto por

clorhidrato de zolazepam (25 mg/ml) y clorhidrato de tiletamina (25 mg/ml).

 18

La IR parcial (1 h de isquemia seguido por 20 h de reperfusión) se indujo mediante

la oclusión temporal del suministro de flujo sanguíneo a los lóbulos medial y lateral

izquierdo del hígado a través de un clip de Schwartz. El grupo de ratas que se utilizó como

Sham(control) fueron sometidas a anestesia y laparotomía simulada.

Los grupos experimentales fueron ratas tratadas con solución salina y ratas tratadas

con Fe, sometidas a una laparotomía simulada o bien a IR, constituyendo cuatro grupos

experimentales:

- Salino-Sham

- Salino-IR

- Fe- Sham

- Fe-IR

Obtención de muestras

Las muestras de hígado se tomaron de los lóbulos medios al final del período de

reperfusión y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido para luego almacenarse

en un refrigerador a -80°C.

Las muestras de sangre se obtuvieron mediante punción cardiaca. Las muestras

sanguíneas fueron centrifugadas para obtener el suero, el cual se utilizó para evaluar

transaminasas séricas.
 19

Obtención de cDNA

El total de RNA fue extraído del tejido hepático mediante RNeasy lipid tissue mini

kit de Qiagen, utilizando 40 mg de tejido hepático. Este kit nos permitió extraer y además

purificar el RNA. El RNA obtenido fue almacenado a -80°C. A partir del RNA extraído se

realizó la síntesis de cDNA mediante un PCR utilizando el sistema de ThermoScript RT.

El cDNA resultante se almacenó a -20°C el cual fue utilizado para realizar los ensayos

posteriores.

Evaluación de la expresión de Hepcidina mediante qPCR

Se utilizaron primers específicos para la Hepcidina. Su cDNA será amplificado por

PCR según las condiciones que van a ser estandarizadas en un equipo de qPCR Stratagene.

El primer de sentido directo a que se utilizó fue (5’- TTCCCCATATGCCTCTTCTG-3’)

mientras que el primer de reversa fue (5’– ACAAGGCTCTTGGCTCTCTATG -3’).

Evaluación de la expresión de Ferroportina y Ferritina mediante RT-PCR

Para la Ferroportina se utilizaron los siguientes primers: primer de sentido directo

(5’ – CCTGACCTCAGCAAAATTCC-3’) y el primer de reversa fue (5’-

ACACTGCAAAGTGCCACATC-3’). Mientras que los primers para Ferritina fueron:

primer de sentido directo (5’-CGTCAGAATTATTCCACCGAAG- 3’) y primer en sentido

inverso fue (5’- CTGACGAATCTGAGAGGTCATAG -3’). El programa usado en el

termociclador fue:
-94°C por 4 minutos
-94°C por 30 segundos
-55,8°C por 30 segundos
-72°C por 1 minuto
-72°C por 10 minutos
-4°C ∞
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Determinación de la actividad de transaminasas séricas

Se evaluó la actividad sérica de transaminasa glutámica-oxaloacética (GOT) y transaminasa

glutámica-pirúvica(GPT), las cuales se utilizarán como marcador de daño hepático,

mediante el kit los kitsEnzyline® ALAT/GPT 20 Monoréactif IVD y Enzyline®

ASAT/GOT 20 Monoréactif IVD (Biomerieux® 69280 Marcy l´Etoile. France).

Análisis estadístico

Los resultados se expresan como promedios ± error estándar de la media (SEM).

Las diferencias entre los grupos experimentales se estimarán mediante ANOVA

unifactorial, seguido de test de Newman-Keuls o t de Student, con un p<0,05 como

diferencia significativa.

El tamaño muestral (n=3) se calculó mediante la siguiente fórmula:

n= 2x(Za+Zb)2 x (DS2)
|d|2

Donde: - n: Tamaño muestral

- Za y Zb: Coeficientes de riesgo
- DS: Desviación estándar
- d: cambio del promedio
 21

VIII-.Resultados

Niveles séricos de GOT y GPT

De las muestras de sangre obtenidas de los diferentes grupos experimentales, se obtuvo

suero para la determinación de los niveles de transaminasas séricas, las cuales se utilizan

como marcador de daño hepático.Los resultados obtenidos para la actividad sérica de las

transaminasas se observan en la Figura 5 para GOT y 6 para GPT. Los resultados muestran

que las ratas cometidas a IR, sin previo preacondicionamiento hepático con Fe, produce una

elevación en la actividad de transaminasas séricas GOT y GPT, alza que es significativa al

compararla con los animales sometidos al control de operación simulada (salino-sham). El

aumento significativo es de 7,2 y 12,9 veces (p<0,05) en las actividades séricas de GOT

(fig. 5A) y GPT (fig. 5B), respectivamente, en relación al grupo salino-sham, lo cual indica

que la IR gatilla daño hepático. Los valores séricos de ambas transaminasas obtenidas de

ratas tratadas con Fe y sometidas a laparotomía simulada son similares a los obtenidos del

grupo salino-sham. Los valores séricos de GOT y GPT de los animales sometidos a

preacondicionamiento con Fe y luego a IR, son semejantes a los de los animales de los

grupos salino-sham y Fe-sham, lo cual indica que el Fe como tratamiento

preacondicionante inhibe el daño hepático, generando la hepatoprotección, ya que en las

ratas preacondicionadas con Fe los niveles de GOT y GPT disminuyen en forma

significativa (p<0,05).
 22

Figura 5: Actividad de la transaminasa sérica GOT. La actividad se expresa en unidades internacionales/ litro
(IU/l). La significancia de las diferencias entre los valores promedio de ratas control y sometidas a isquemia fue
determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls y se indican por las
letras que identifican a cada grupo experimental. Figura 5A: Muestra los niveles de GOT obtenidos en los
grupos salino-sham, salino-IR, Fe-sham, Fe-IR. Figura 5B: Muestra las diferencias en los niveles de GOT entre los
grupos salino-sham/salino-IR (b-a) y Fe-sham/Fe-IR (d-c) con una significancia de p<0,05.

Figura 6: Actividad de la transaminasa sérica GPT. La actividad se expresa en unidades internacionales por litro
(IU/l). La significancia de las diferencias entre los valores promedio de ratas control y sometidas a isquemia fue
determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls y se indican por las
letras que identifican a cada grupo experimental. Figura 6A: Muestra los niveles de GPT obtenidos en los
grupos salino-sham, salino-IR, Fe-sham, Fe-IR. Figura 6B: Muestra las diferencias en los niveles de GPT entre los
grupos salino-sham/salino-IR (b-a) y Fe-sham/Fe-IR (d-c) con una significancia de p<0,05.
 23

Niveles de RNAm de Hepcidina

La expresión de Hepcidina se cuantificó a través de la medición de los niveles de

RNA mediante la técnica Q-PCR utilizando el programa MxPro.

Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 7. En las muestras hepáticas de

las ratas controles (salino-sham) se observó expresión constitutiva de RNAm de Hepcidina.

Se puede apreciar que existe un aumento del nivel de RNAm de dicha proteína en todos los

grupos (Fe-sham, Fe-IR y salino-IR) en comparación con los niveles obtenidos en las ratas

control, siendo las ratas tratadas con preacondicionamiento con Fe y luego sometidas a IR

las que obtuvieron un mayor aumento de los niveles de RNAm de Hepcidina en

comparación al grupo salino-sham, con un incremento estadísticamente significativo

(p<0,05) de 7,9 veces (fig. 7).

Se realizó el test ANOVA unifactorial seguido del test de Newman-Keuls que

permite comparar los 4 grupos en estudio. Los grupos salino-IR y Fe-IR mostraron

aumentos significativos (p<0,05) de la expresión del RNAm de la hepcidina en

comparación al grupo que no fue preacondicionado ni sometido a laparotomía simulada,

pero no hubo una diferencia significativa (p>0,05) con el grupo Fe-Sham. Por otro lado,

también se observa un incremento significativo en el grupo Fe-IR en comparación al Fe-

Sham. No se observó diferencias significativas entre los siguientes grupos: Salino-Sham vs

Fe-Sham, Fe-Sham vs Salino IR y entre Salino-IR vs Fe-IR. Todos estos datos nos indican

que el aumento se produce en condiciones de IR y aumentan aún más cuando dicha

condición se acompaña de un preacondicionamiento hepático con Fe, pero el Fe por sí solo

no es causal de que los niveles de RNAm de hepcidina se eleven.

 24

Hepcidina
Niveles de RNAm de Hepcidina
Figura 7. Niveles de expresión de
10 1,3
1) Salino-Sham Hepcidina. Se muestran los niveles
(Relativo a RPS23)

8 2) Salino-IR de RNAm de Hepcidina en hígado

1
3) Fe-Sham de ratas, relativo a RPS23 (Proteína
6 4) Fe-IR ribosomal S23), determinados
4
mediante la técnica de Q-PCR. Los
4 valores muestran los promedios ±
2,4 SEM (n=3-4); p<0,05 indicado
2
por los números que identifican a
0 cada grupo experimental.
1

Niveles de Ferritina

La expresión de Ferritina se determinó por medio de la medición de los niveles de

RNA a través de la técnica de RT-PCR (fig. 8A).

Los valores obtenidos se muestran en la Figura 8A y 8B. Se realizó el test de

ANOVA unifactorial seguido del test de Newman Keuls, el cual nos permite comparar los

cuatro grupos en estudio. Las ratas tratadas con Fe como tratamiento preacondicionante

seguido de IR y las ratas que también fueron tratadas con Fe pero que fueron sometidas a

laparotomía simulada obtuvieron aumentos estadísticamente significativos (p<0,05) en los

niveles de expresión de RNA de Ferritina de 5,3 veces y 5.0 veces, respectivamente, en

comparación al grupo control (salino-sham), sin embargo no se observó diferencias

significativas entre los niveles de ferritina del grupo salino-sham y salino-IR (fig. 8B).
 25

Por otro lado, los valores de los niveles de expresión de RNA de ferritina de los

grupos tratados con Fe, tanto el que luego fue sometido a IR (100%) como el que solo fue

sometido a cirugía simulada (98%) obtuvieron un incremento significativo (p<0,05) de en

comparación con el grupo salino-IR (60%) (fig.8B). Estos antecedentes indican que el

preacondicionamiento hepático con Fe es el causante del incremento en los valores de los

niveles de expresión de RNA de ferritina.

Figura 8A. RT-PCR del análisis de

RNAm de los niveles de Ferritina.
Los niveles fueron determinados
en forma semicuantitativa
mediante RT-PCR. La imagen de
arriba corresponde a un gel de
agarosa representativo de los
productos de la electroforesis de
ferritina (primer de 150 pb).

La imagen de abajo corresponde a

un gel de agarosa representativo a
los productos de la electroforesis
con 18s (primer de 324 pb).
 26

Ferritina
Niveles de RNAm de Ferritina 1,2 1,2
2.0
1) Salino-Sham
2) Salino-IR
(Relativo a 18s)

1.5
3,4 3) Fe-Sham
4) Fe-IR
1.0 3,4

0.5

0.0
1

4
Figura 8B. Niveles de expresión de Ferritina. Se muestran los niveles de expresión de
RNAm de Ferritina obtenidos en hígado de ratas mediante RT-PCR. Los geles de
agarosa fueron fotografiados y digitalizados. Las densidades ópticas de las bandas de
RNAm de Ferritina fueron normalizadas usando la densidad óptica de las bandas de
RNAm de 18S. Los valores muestran los promedios ± SEM (n=3-4). p<0,05
indicado por los números que identifican a cada grupo experimental.

Niveles de Ferroportina

Los niveles de expresión de ferroportina fueron determinados mediante la medición

de RNA mediante la técnica de RT-PCR (fig. 9A).

Los resultados obtenidos se muestran en las figuras 9A y 9B. Se puede observar que

el grupo control presenta un alto nivel de de RNAm de ferroportina, lo cual nos habla de

una expresión hepática constitutiva de dicha proteína.Se realizó el test de ANOVA

unifactorial seguido del testde Newman-Keuls para comparar los 4 grupos en estudio. Los

resultados indican que hay un aumento significativo en el valor de RNA de ferroportina de

 27

las ratas sometidas a Fe como tratamiento preacondicionante y sin realizarle IR posterior

(Fe-sham), en comparación con los grupos salino-sham (25%), salino-IR (28%) o Fe-IR

(22%).

Por el contrario, no se observó cambios significativos estadísticamente en los

siguientes grupos: salino-IR vs Fe-IR, salino-IR vs Fe-sham y salino-sham vs Fe-IR. Estos

resultados apuntan a que el aumento en la expresión de los niveles de RNAm de

ferroportina son producidos por la administración deFe.

Figura 9A. RT-PCR del análisis de RNAm de los niveles de Ferropotina. Los niveles fueron determinados en
forma semicuantitativa mediante RT-PCR. La imagen de la izquierda corresponde a un gel de agarosa
representativo de los productos de la electroforesis deferroportina (primer de 150 pb).La imagen de la
derecha corresponde a un gel de agarosa representativo a los productos de la electroforesis con 18s
(primer de 324 pb)
 28

Figura 9B. Niveles de expresión de Ferroportina. Se muestran los niveles de expresión de RNAm de Ferropotina
obtenidos en hígado de ratas mediante RT-PCR. Los geles de agarosa fueron fotografiados y digitalizados. Las
densidades ópticas de las bandas de RNAm de Ferroportina fueron normalizadas usando la densidad óptica de
las bandas de RNAm de 18S. Los valores muestran los promedios ± SEM (n=3-4). p<0,05 indicado por los
números que identifican a cada grupo experimental.
 29

IX-. Discusión

En el hígado el daño causado por IR constituye un problema clínico que afecta los

resultados de las cirugías que se realizan bajo exclusión vascular y el pronóstico del

trasplante del órgano. En este estudio se analizó el preacondicionamiento hepático con Fe

frente a la isquemia-reperfusión (IR) y su efecto sobre diferentes preteínas relacionadas con

el metabolismo del Fe: Hepcidina, Ferritina y Ferroportina. Para ello se utilizaron los

siguientes grupos de experimentación: Salino-Sham, Salino-IR, Fe-Sham y Fe-IR. Se

determinaron los niveles de actividad de las transaminasas séricas, GOT y GPT como

marcador de daño hepático, además de determinar los niveles de RNAm de Hepcidina,

Ferritina y Ferroportina en cada uno de los grupos nombrados.

Se observó que el preacondicionamiento con Fe otorga hepatoprotección contra la

lesión hepática producida por IR, lo cual fue demostrado al medir los niveles de

transaminasas (GOT y GPT) séricas, siendo el grupo sometido a IR sin previo tratamiento

con Fe el que obtuvo alzas considerables, demostrando la existencia de daño hepático

(4).Además, al hacer la misma medición en el grupo de ratas que fue sometido a

preacondicionamiento con Fe seguido de una cirugía simulada (Fe-sham), se obtuvo que los

niveles de la actividad de las transaminasas séricassimilares a los del grupo control (salino-

sham). La ausencia de efecto de la IR sobre las transaminasas séricas en ratas pretratadas

con Fe comparado con los controles sugiere que el Fe como tratamiento preacondicionante

inhibe el daño hepático, generando hepatoprotección, ya que en las ratas preacondicionadas

con Fe los niveles de GOT y GPT disminuyen en forma significativa (p<0,05) en relación

al grupo salino-IR.
 30

Al administrar Fe como mecanismo preacondicionante contra la IR, el organismo

responde con alzas de las proteínas que participan en el metabolismo del Fe para así poder

regular el aumento transitorio de la ferremia. Es así como encontramos valores aumentados

de la expresión de RNAm de ferritina en las ratas tratadas con Fe como preacondicionante

hepático. La ferritina es la proteína encargada de almacenar el Fe intracelularmente con el

fin de disminuir la ferremia, y su aumento contribuiría a disminuir la lesión hepática que

causa la IR. Además, la cadena pesada de la ferritina fue identificada como un mediador

antioxidante y de protección contra la acción tóxica de NF-κB, como se evaluó en los

cultivos celulares de NIN-3T3 (26). La inducción de la ferritina es un mecanismo de

regulación post-traduccional, que involucra la interacción de los IRP e IRE aumentando los

niveles de RNAm de ferritina, por lo tanto aumentando su síntesis para así secuestrar el

exceso de Fe evitando la citotoxicidad.La hepcidina, proteína de fase aguda sintetizada en

el hígado, en condiciones de exceso de Fe se encarga de proteolizar a la ferroportina con el

fin de dejar internalizado al Fe dentro de la célula, aumentando la síntesis de ferritina y

disminuyendo la ferremia. Los valores obtenidos en el laboratorio indican que los niveles

de RNAm de hepcidina aumentan en condiciones de IR y que dicho aumento podría

contribuir a la hepatoprotección observada en ratas son sometidas a tratamiento

preacondicionante con Fe por mayor inactivación de ferroportina. De acuerdo con estos

datos, los niveles de ferroportina inducidos por Fe en el grupo Fe-sham disminuyen a

niveles controles en ratas preacondicionadas con Fe y sometidas a IR.

Se concluye que el Fe utilizado como método preacondicionante hepático inhibe el

daño hepático durante la IR, provocando el aumento de la expresión RNAm hepcidina y

 31

ferritina, y disminuye el de la ferroportina, todas proteínas relacionadas con el metabolismo

del Fe.
 32

X-. Referencias bibliográficas

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