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  • Extracción y Purificacion ADN - Teoría y Fundamentos

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    y A VAR) P fy ANGEL HERRAEZ ASG ilustrado e interactivo de © Biologia molecular € ingenieria genética 2.° edicién Conceptos, técnicas y aplicaciones en ciencias de la salud coll \ \f MS ace ek ae Biologia molecular e ingenier‘a genética fee ea eee eee a ee La segunda edicién del Texto ilustrado e interactivo de biologia molecular e ingenieria genética Conceptos, técnicas y aplicaciones en ciencias de la salud recoge el conocimiento, en el area de la biologia molecular, de las técnicas de la ingenieria genética y sus aplicaciones, que se ha de- sarrollado ampliamente desde la publicacién de la primera. Integrando conceptos, técnicas y aplicaciones practicas, se proporcionan los fundamentos estructurados y razonados sobre los en Rg es oe eat eee cea CT ee ae re hae eer permite una perfecta ilustracion y una mejor captacién del contenido. Ademds, el cardcter interactivo del material electrénico permite al lector protagonizar el descubrimiento y la cons- truccién de su conocimiento. De los novedosos contenidos digitales destacan: + Modelos moleculares tridimensionales e interactivos para percibir la estructura de Oe a ee ecu sen ey acetates See NR pee hea ane ery Rene Recs Oo ae ces cet matic iar Cu ed El Texto ilustrado e interactivo de biologia molecular e ingenieria genética no se dirige solo a estu- diantes de ciencias de la salud y de la vida, sino a los profesionales que en su practica diaria se et eh eae ones St ei is Autores de la primera edicién: José Luque y Angel Herraez PASH CeCe STT LA 84-8086-64 lit 8480 86! 07 oe re N q 3S oe wy | c ? ese eed oe 09d © 00 f s oe 4 CO aC x Roto oa Pe ao ' j eee ta ey eae ea ag ie i * edicién ar 134 | ESTRUCTURA FUNCION DEL MATERIAL Geng 0 + Sintesis de DNA: incorporacién de radi actividad, u otro tipo de marca, al DNA formado dui de las células ante el euliy n presencia de nuclestidos marcados. Refleja el concepto mas exigente de Viabilidag.\° capacidad de crecimiento o, mas estrictamente, prolif i craci6n celular. Es comiin el uso de timidina tritigy de bromodesoxiuridina. = 5 Web 10.5, Fundamento del uso de timidina witiada y bromodesoxiuridina en ensayos de proiferacion 10.5 LISIS DE LAS CELULAS Esta etapa supone el punto deconexi Acido nucleico; comienza, Gn entre la preparacién de la muestra celular y la de muestras de penomay or tanto, la fase analitica, que comprende el fraccionamiento subcelular ty fatraccién directa o el fraccionamiento de los écidos nucleicos y la fragmentacién del DNA. En algunos casos {a liss es simultdnea con la preparacién de la muestra (por ejemplo, la homogene’zacién). : Para la posterior purificacion de dcidos nucleicos es imprescindible, obviamente, liber nido celular, de mado que sea posible separar las distintas biomoléculas en disoluciéa. La lise celal requiere 4a ruptura dela membrana, que suele conseguirse empleando un medio hipot6nico. Es tambien habitael aiiadir etergentes para solubilizar los ipidos. De cara a preservar la integridad de los dcidos nuclerees que luego se han de purificar es, asimismo, frecuente incluir en el medio de isis algtin inhibidor de nuclearest Pues éstag ~particularmente las RNasas- estan a menudo presentes como componentes de las células. Talisisse puede aplicartantoa célulasen suspensiéncomoa lasadheridasa placasdecultivo, Ena células sanguineases frecuente la aplicacién de reactivos de lisisdiferencial (es tipos celulares). Asi para el recuento y estudio de leucocitos sls liquido de Tiirk, con acido acético y violeta de gencian: primero el conte. preparacionde sdecir, que afectan sdloa determinados an los eritrocitos con un medio écido (por ejemplo, 1) con una disolucién de cloruro aménico. 10.6 PREPARACION DE FRACCIONES SUBCELULARES El procedimiento ¢ mediante homogen se separ: ico general parte del sobrenadante que resulta de la disociacion m: izaci6n en un medio isotdnico y posterior isis celular. Mediant ran sucesivamente niicleos, orgdnulos y otras estructuras subcelul cénica de un tejido centrifugacién diferencial Dans err cin nam eee sere sii orp eae yan | ; |e: ro ana ces aunque se basen en principios generales que si son interpretables en funcién de las propiedades fisicoquimicas ya descritas. La dificultad es mayor, si cabe, con los métodos directos, de mds reciente aparici6n, cuyos fundamentos estan a menudo ocultos tras los, intereses comerciales y las patentes. Se intenta por ello en este texto proporcionar una visién generalista de los principios y herramientas comunes, sin pretender tipificar los procedimientos descritos como los tinicos ables. El primer factor que debe considerarse, al igual que en cualquier proceso de purificacién, es la necesidad de separar y eliminar las demds biomoléculas presentes en la muestra. Para ello, deben considerarse las propie dads fisicoquimicas de DNA, RNA, proteinas y resto de componentes celulares. De acuerdo con ellas, algunas de las herramientas clave en un proceso de purificacién de 4cidos nucleicos son las siguient * El.uso oportuno de enzimas que degradan especificamente un solo tipo de molécula: proteasas, DNasas y RNasas (pag. 212), o bien de inhibidores para evitar su acci6n * Eluso de detergentes para la desnaturalizacién de las proteinas, lo que facta su posterior insolubilizacién y retirada, sin afectar a la estructura de los Acidos nucleicos. De modo similar, compuestos con actividad caotr6pica, que desnaturalizan las proteinas; destacan entre ellos, por su aplicacién, urea, cloruro de guanidinio y tiocianato de guanidinio, + La accién diferencial del medio alcalino sobre DNA y RINA (pag. 32), de tal modo que el primero sélo se desnaturaliza (un proceso que, aparte de mantener su integridad, puede ser reversible, pag. 164), mientras que el segundo se hidroliza rindiendo oligonucledtidos y nucleétidos libres (cuyas propiedades son muy diferentes a las de sus macromoléculas originarias, los dcidos nucleicos y permiten, pues, separarios con facilidad). + El ajuste de la fuerza iénica (concentracién de sales), que permite controlar la solubilidad diferencial de DNA, RNA y protefnas (en particular si éstas se han desnaturalizado previamente). + La escasa solubilidad de los dcidos nucleicos (y también de las protefnas) en alcoholes. Practicamente todos los métodos de purificacién incluyen, al menos, una precipitacién alcohdlica. 135 10.8.1.1 Precipitacién con alcoholes Como se ver a con elevada, tanto DNA como RNA se hacen insolub pre al ser menos polares que ella ~ licho con mas pres favorecen la unién de los cationes a los grupos fosfato, que pueden agcegarse y precipitar, La precipitacidn alcohélica esa menudo la etapa final, en la que se consi ‘completar la purificacién y, ademds, concentrar el material, 10.8.1.2 Extraccién del DNA mediante fases inmiscibles 136 1 ESTRUCTURA Y FUNCION DEL MATERIAL GENETIcg rence acoholes se ulizan en précticamente todos los métodos de purificacién sreos nucleic. Si la concentracin de alcohol (habitalimente etanal 0 isoproneecy cy sutficienteme, les y pueden precipitarse mediante centrifugacion, Fae eon atic la presencia de sales. Los alcoholes retiran el agua que hidrata los detdes ne 08 y, in, son disolventes con una menor constante dieléctrica_ convirtiendo a los dcidos nucleicos en moléculas 1 de nte gue Fi protocolo tradicional bésico consiste en el tratamiento del homogenado con cloroformo, cuyo papel es doble: disolver los ipidos y desnaturalizar las proteinas, M bye asimismo a la desnaturalizacién de las protefnas. P a debe tener un pH neuteo o ligeramente alcalino, chos métodos emplean, ademas, fenol, que contr: | 'ara una extracciGn eficaz del DNA hacia la fase acuosa, ‘muestra (acuosa) Procedimientos alterativos ‘muestra (acuosa) = + ‘enol cloroformo + + Cloroformo, ‘alcofo! isoamitico mezcla por agitaciin ‘mezela por agitacion + + centritugacién, ccentrfugacién | ames) ‘heen cst eye los protenas, esnaraeacas pr ef clatarmo yt eo, Se'san ena eras nines inca Ahlen, ms ens) queda sce demerit 2 Pusticacién por Drecipitacion 1 centaccén tanya ino of DNA, ‘te va quatende 4 ge} | TT fase aca ett | Saar | ‘ue ef ‘aan doe | saa proteinas, esate por ‘lotto, se tan ena tae VOL de tana atl ode oop! Icon ata sat) po jo, Preparacin de muestras,extracién y anlisis de deidos nuceicos 10.8.1.3 Extraccién del RNA sextraccién del RNA se realiza de manera similar, salvo dos modificaciones, En primer lugat; suele prepa a cl homogenado inicial en presencia de una alta concentracin de ticianato de guanidinio (4 M), Este es rafuerte cadtropo que desnaturaliza las proteinas de modo que, ademas de facilitar después su retirada, ut gota la inactivacion de las RNasas, esencial para poder obtener el RNA integro, Por otra parte, la extraccion rFeloroformo y fenol se hacea un pH acido (entre 4 y 5), condiciones en las que el DNA ya no se mantiene en fo fase acuosa, sino que se distribuye hacia la fase organica ola interfase, al igual que las protefnas, EI RNA, por tt contrario, queda disuelto en la fase acuosa y puede recuperarse mediante precipitacién con etanol 0 iso sropanol. En algunos métodos el cloroformo se sustituye por 1-bromo-3-cloropropano (BCP), menos téxi aie) mas eficaz en la retirada del DNA. ‘ros métodos prescinden de la extraccién con fenol y cloroforme, y utilizan cloruro de lito entre 0,5 y 2,5 M), que precipita selectivamente el RNA por neutralizacién de su carga Finalmente, se toma la precaucién ya mencionada de inactivar las posibles RNasas tratando tanto material como el agua de todos los reactivos con dietilpirocarbonato (DEPC, inhibidor covalente de las ribonucleasas). Ademas, en ocasiones se incluye en las etapas finales una DNasa para asegurar la ausencia fotal de contaminacién pot DNA. 10.8.1.4 Purificacién de écidos nucleicos por precipitacién salina diferencial Se trata de un procedimiento alternativo a los anteriores, basado en las diferencias de solubilidad de DNA y RNA en funcién de la concentraci6n de sales: tanto DNA como RNA son solubles en disolucién salina concentrada, mientras que a baja concentracién de sales s6lo es soluble el RINA. eidos s . rucieoos = aa iS disolucion = | Ss a salina a 3 ‘concentrada | reaptanias) | ‘tare ros, fuera nica \ pwiaas 1 a ONASe 1 71 sera ea hace nscito proteinas DNA RN Para esta precipitacién salina se suele utilizar NaCl, pero puede también emplearse acetato s6dico saturado, en combinaci6n con alcoholes orgénicos, que conduce a resultados incluso mejores que con fenol y cloroformo, sobre todo para cantidades pequefias de DNA. 10.8.2 Extrac n directa de acidos nucleicos Los métodos de extraccién descritos, basados en solubilidad y particularmente en disolventes inmiscibles, son los clasicos, suponen la norma de referencia y se acude a ellos cuando se desea obtener una gran cantidad de Acido nucleico © cuando es importante un grado elevado de pureza; por otra parte, resultan laboriosos (la exteaccién a menudo debe repetirse varias veces) y utilizan reactivos t6xicos. A veces no es posible emplear los procedimientos descritos, dado el bajo contenido en DNA de algunas muestras, pero, sin embargo, pucde estudiarse el DNA de la muestra sin necesidad de manipulacién alguna, salvo la lisis de las células, Este es el caso de la amplificacién y deteccién del DNA mediante la técnica de PCR (wv. Capitulo 14). Por otra parte, en muchas ocasiones el tamaiio de la muestra es pequeiio, la pureza no es un requisito esencial, prima la rapidez en el procesado simultdneo de muestras numerosas, en resumen, otros métodos mas simples y rapidos pueden ser una solucién adecuada. Se han desarrollado més recientemente numerosos El |. ESTRUCTURA FUNCION DEL MATERIAL GENETICg métodos de extraccién que cumplen estos requisitos. Se habla de extra 0 ibn directa del DNA pues no se requiere la manipulacién previa de la mu estraY, en poco ms de una etapa, permiten obtener su DNA 0 RNA’ £1 fundamento de estos métodos direetos no es tan claro, La mayoria se basan en la adsorcidn selectins dei acido nucleico, por ejemplo sobre soportes derivados de silice o membranas porosas especialmente for muladas, Un procedimiento tipico puede describirse asi: + Lisisy pretratamiento: la muestra (sangre, homogenado de te accién de un tampén de |i proteinas g , células cultivadas, etc.) se somete a ly Este puede incluir detergentes, proteasas o agentes desnaturalizantes de + Se aplica el lisado sobre una pequeiia colamna que contiene la membrana o material adsorbente. + Etapa de adsorcién: se fuerza el paso del liquido a través dela columna, bien mediante presion o bien por fetutagacion, De ese modo, irén saliendo de la colurana los componentes que no s¢ han adsorbate habitualmente esa fraccidn comprende todo excepto cl DNA o el RNA (dependiendo del diseao del mater, adsorbente y de los medios liquidos empleados). ‘+ Etapa de lavado: se aftade mas tampon para despl * Etapa de elucion: nucleico al soporte, zar por completo todos los componentes no fijados, ralmente, se afiade un tampén o disolvente diferente que desestabilice la unién del éeido Web 10.11. Ejemplo de extraccién directa del DNA. pmo una aplicacién particular, se ha extendido el uso para pruebas de identidad de las tarjetas FTA®, Papel especialmente tratado que permite absorber una muestra (gota de sangre) sar sus células, decnsturalioa, Sus profeinas y proteger el DNA, que queda intacto fijado en el papel. Estas tarjetas pueden conservarse sin especiales precauciones durante varios afios, a temperatura ambiente, enviarse por correo posta, ete anppiee se emplean con frecuencia las microesferas magnéticas, analogas a las utilizadas para separacion de células (pag. 130), sobre cuya superficie se fijan los acidos nucleicos, bien por adsorcién dlrcets'e trong través de otras moléculas con afinidad por ellos. Se consiguen asi métodos dle extraccién simples que se pueden aplicar a una amplia variedad de muestras Tracoin directa 2 DNA ‘Biracaon Tac increta de DNA eo gi mm ocean ‘‘ Ee oi, / ncaa aa ours aso | —= om oO A alta 10, Preparacién de muestras, extraccién y anilisis de dcidos nucleicos —I a Web 10.12. Aplicacién de microesferas magnéticas para la purificacién de dcidos nucleicos FIRNA mensajero cucaridtico, gracias a la singularidad de su cola de poli(A) (pag. 302), puede putificarse ficilmente sobre soportes de afinidad. Por ejemplo, microesferas magnéticas con cadenas oligo(

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