es : | jaa) as aS ‘ Es |S a |S a | . . Z | s e RN 1S) aS NY SS NS 5B oe O 2TOM STRACHAN - ANDREW P. READ Oe ec era et ee Te expansién. BI libro est’ construido cn torno a la explicacién de la estructura, la funci6n y la na humano, tal como lo esta revelando el Proyecto Genoma Humano. nes bisicas sobre la estructura y funcién del DNA y de los Rnteeno eet aor ny neuentra material eae eee est Pree econ es Con seeciones sobre: ee ee en eee eee cc ere Fundamentos sobre clonacién del DNA y Ia hi en H as del genoma humano Caracteristicas esenciales del libra: i eee ee en eee ee ed Po pom Pe en ren ce ee ene eee RC ene Perce Seer een crc fy mn todo ef texto Meebo ke mnen nuy Pe eR cre oe Tenney ee ee ene ee ee ere eRe oe ee RSet en ene eR eee ee ee EDICIONES OMEGA, S.A. Lee une akenr iClonacion y andlisis del DNA mediante PCR Principios en los que se basa la PCR La PCR es un método de clonacién de DNA en un sistema libre de células Reaccién de PCR estandar La PCR (acrénimo inglés de Polymerase Chain Renction, reaccién en cadena de la polimerasa) es un método rapido y versétil de amplificaci6n in vitro de secuencias de DNA especificas dentro de una muestra. Habitualmente la reaccidn se disefia para permitir la amplificacién selectiow de una © varias secuencias diana de DNA presentes en una mezcla compleja de secuencias (por ejemplo, DNA genémico total © una poblacién compleja de cDNA). Para que la amplificacién selectiva sea posi ble es absolutamente necesario disponer de un minimo de informacién sobre la se~ cuencia de la diana. Esta informacién permite la construccién de dos oligonuclesti- dos, habitualmente de 15 a 30 nuclestidos de longitud, que actiian como cebadores (iniciadores, en inglés primers) en la reaccién. Estos oligos reciben también el bre de amplimeros. Cuando se mezclan con DNA gendmico desnaturalizado los amplimeros se unen espectficamente a las secuencias complementarias, que se sitian inmediatamente adyacentes a la regién genémica que se quiere amplificar. Los amplimeros estén disetados para que puedan iniciar la reaccién de sintesis de DNA en presencia de una DNA polimerasa termoestable adecuada y de los precursores de DNA (los cuatro desoxinuclestidos trifosfato, dATP, dCTP, dGTP y dTTP). Cada amplimero Serviré para iniciar la sintesis de una hebra de DNA complementaria a una de las hebras del segmento de la diana, y las dos hebras de nueva sintesis serén comple- ‘mentarias entre si (Figura 6.1). La PCR es una reaccién en cadena porque las hebras de DNA de nueva sintesis sir- ven a su vez de molde para reacciones de sintesis en ciclos posteriores. Tras unos 30 ciclos, la PCR habré generado unas 10° copias de la secuencia diana especifica, cantidad que puede ser fécilmente detectada tras electroforesis en gel como una banda discreta de un tamano especifico. Se utiliza una DNA polimerasa termoesta~ ble debido a que la reaccién pasa por ciclos en los que se cambia la temperatura Cada uno de estos ciclos consta de los tres pasos que se indican en la pagina 141 Capitulo 6 139140 Capitulo 6 ny © 4 ONAGiana a emplcar — @ ¢ Desnaturatzacion © } Domai Hebras nuevas co a 7 < ottamoe 3 hes porta B00 cabadores anackios 3 oa 5 1 L gr r o's ° oo wi 8 50 i 5 i er) T * 30 3) 4, Sintesis de DNA 20 Hebras nuevas con t , I / = a Tamato 3 = aeeE enna Sich : ae 5 a v SSeS | =S=S——— 3 = 5 } 29 cico = ———swr Ss —————es va SF haba res — ey y— a - 5 t 301? et0 aes) ~10° copias del producto a} ae CaaS > ~"30 copia do productos constonce§ aralos — a 3. DNA 5 orginal Figura 6.1: La POR es un mét ‘como cebadores (inciadores) de pliicacion de secuencias de OI la reaccién. A jn vitro, que ulliza oligonuclestides de secuencia defnida de DNA situadas on hebras opuestas y a ambos lados las hebras acaban siendo Incorporades a las hebras de nueva uedan fliados por la posicion de los cebadores y sus 106 oligonucledtidos cebadores A y B son complementarios a s ‘agin que se quiere amplficar. Los cebadores que se asocian sintesi. El primer ciclo genera dos nuevas hebras de DNA, cextremos 3" son variables los extremos 3" estan “aldos" (ragged) 10s posterior las hebras de nueva sintes's actin a su vez como mode para la sintesis de hebras complementarias dol tamario desoado (los extremos 5° quedan detinidos por el cebador y los extremos 3° quedan fos ya que la sintesis no puede ir mas all del extremo reconocido por el otro cebador). Tras unos pocos Ciclos, el producto de tamario daseado fjo comienza a ser predaminantesonacion y andlisis del DNA mediante PCR 15°C para el DNA jesnaturalizaci6n: tipicamente calentando la muestra a gendmico humano i) Reasociacién: a temperaturas que varian entre 50 y 70°C, dependiendo de la O" ‘F, (ver pagina 124) del duiplex esperado (la temperatura de reasociacién se fija habitualmente 5°C por debajo de la T., calculada para los hibridos amp mero/DNA); ) Sintesis de DNA: tipicamente a 70-75°C Algunos microorganismos cuyo habitat natural son las fuentes hidrotermales han servido como base para la purificacién de DNA polimerasas. termoestables. “or ejemplo, la Tay polimerasa, ampliamente utilizada, proviene de Thermus agi ficus. Esta enzima es estable hasta 94°C, y su temperatura de trabajo éptima es de 80°C Diseito de cebadores y especificidad de la amplificacion 1 especificidad de la amplificacién depende necesariamente de la especificidad de reconocimiento de la sectiencia especifica respecto de otras presentes en la muestra por parte de los oligonuclestidos cebadores. Para muestras complejas como el DNA genémico total de una célula de mamifero, a menudo basta con disefiar dos stidos de longitud. En estas condiciones la pro. que no cebadores que tengan unos 20 mucl babilidad de una correspondencia accidental perfecta con otras secuencia sean la buscada, que ademas estén en la orientacién y a la distancia adecuada, es muy pei iar de las precauciones que se toman para que s6lo sean estables los duiplex entre diana y cebador con un elevado grado de homo: logia, a veces también ocurren amplificaciones esptireas. Esto puede suceder si uno ‘© ambos cebaclores elegidos conticnen parte de una secuencia repetitiva. Por ello, en el disefio de los cebadores se tienen en cuenta las secuencias repetitivas conoci- Jas, y también se tiene la precauci6n de evitar largas tiras de un mismo nuclestido ueha. Sin embargo, a p El apareamiento fortuito det extremo 3’ del cebador es critico, ya que aporta el ex tremo 3’ OH libre para el inicio de la sintesis por parte de la DNA polimerasa: se pueden obtener productos esptireos de hibridos eebador-diana que no tengan una homologia importante si el extremo 3’ del cebador es exactamente complementario ala secuencia de la diana. Una forma de minimizar el problema de la amplificacién de productos esptireos es el empleo de cebadores encajados (nested primers). Los productos de la amplificacién inicial se diluyen y son utilizados como DNA diana Para una segunda reaccidn en la que se utiliza un juego de cebadores diferente, cu yas secuencias estan situadas préximas a los cebadores anteriores, en una zona in tera del fragmento teéricamente amplificado en primer lugar. Habitualmente unos 20 nt para secuencias diana presentes en DNA mmplejo; puede ser mucho menor si el DNA diana es —— Composicién las dos bases de los extremos 3’ de los cebadores: Exemos 3 | sean complementarias entre si. De lo contrario podrian producir | dimeros de cebadores que reducirian la eficiencia de ta ampliicacion Figura 6.2: Disefio de cebadores para PCR, m1Capitulo 6 Las principales ventajas de la PCR como método de clonacién son su rapidez, su sensibilidad y su robustez La PCR es una técnica popular gracias a su sencillez; su amplio rango de aplicacio- nes tiene su base en las tres principales ventajas del método, Rapidez y sencillez de uso de la PCR La PCR permite clonar DNA en pocas horas, utilizando equipos relativamente poco sofisticados. Una reaccién de PCR tipica consiste en 30 ciclos de desnaturali- zacion, sintesis y reasociacién. Cada ciclo dura tipicamente 3-5 minutos y se util un termociclador automatizado para cambiar las temperaturas correspondientes cada paso del ciclo. Esto supera ampliamente el tiempo requerido para la clonacién en células, que suele ser de semanas, 0 incluso meses. Por supuesto, el disco y sin- tesis de los oligonuclestidos cebadores también lleva tiempo, pero este proceso ha sido simplificado gracias a la aparicién de programas informaticos para el disefio de los cebadores, y a la proliferacién de casas comerciales especializadas en la sin tesis de oligonuclestidos por encargo. Una vez que se pone a punto, la reaccién puede ser repetida de forma sencilla Sensibilidad de la reaccién de PCR La PCR puede amplificar secuencias a partir de cantidades infimas de DNA diana, incluso a partir del DNA contenido en una sola célula. Esta elevada sensibilidad ha permitido el desarrollo de nuevos métodos para el estudio de la patogénesis mole- cular y la aparicién de numerosas aplicaciones en ciencia forense, en diagnéstico (pagina 464), en el andlisis del ligamiento genético utilizando la tipificacién de es- permatozoides individuales (pagina 356) y en estudios de paleontologia molecular, donde las muestras pueden contener muy pocas células. Sin embargo, el hecho de que el método tenga una sensibilidad tan elevada significa también que se deben extremar las precauciones para evitar la contaminacién de la muestra con DNA ex- trafios, por ejemplo a partir de células desprendidas del propio operador, Robustez del método La PCR permite la amplificacién de secuencias especificas de material que contione DNA muy degradado, o incluido en un medio que hace problemética su purifica cin convencional. Esto hace que el método resulte muy adecuado para estudios de antropologia y paleontologia molecular, por ejemplo para el andlisis de DNA recuperado de individuos momificados y para intentar identificar DNA de mues- tras fosiles que contienen poquisimas células de criaturas extintas hace ya mucho tiempo. El método se ha empleado con éxito también para la amplificacién de DNA de muestras de tejidos fijadas con formol, lo cual ha tenido importantes apli- caciones en patologia molecular y, en algunos casos, en estudios de ligamiento genético. Las principales desventajas de la PCR son la necesidad de disponer de informaci6n sobre la secuencia, el tamajio corto de los productos que genera y la infidelidad de la replicacién del DNA A pesar de su tremenda popularidad, la PCR, como método para la clonacién se lectiva de secuencias de DNA especificas, tiene ciertas limitaciones. Necesidad de disponer de informacién sobre la secuencia del DNA diana Para poder construir oligonucledtidos especificos que actien como cebadores para ctiva de una secuencia particular de DNA se necesita disponer de alguna informacién previa sobre la propia secuencia a amplificar. Esto implica, potClonacién y andlisis del DNA mediante PCR 143 regla general, que la regiGn de interés ya ha sido parcialmente caracterizada, a me- judo mediante la aplicacién de métodos de clonacién basadlos en sistemas celula- res. Sin embargo, existen varias técnicas desarrolladas recientemente que reducen ¢ incluso hacen desaparecer esta necesidad de disponer de informacién previa sobre Ja secuencia del DNA diana, en casos en los que se deben cumplir ciertos objetivos. Por ejemplo, es posible clonar secuencias de DNA no caracterizadas que pertene- cena una familia génica o a una familia de secuencias repetitivas de las que se dis- ponga informacién de alguno de sus miembros, utilizando oligonuclestidos dege- nerados (pégina 548). En algunos casos, la PCR puede utilizarse también en ausencia de informacién sobre la secuencia del DNA diana, de manera que se per mite la amplificacién indiscriminada de secuencias de DNA cuando en la muestra el DNA es extremadamente escaso (pagina 150). Pese a que la PCR se puede aplicar para asegurar la amplificacién de todo el genoma, carece de la ventaja de los siste- mas celutlares de clonacién, que ofrecen un método para individualizar los clones de DNA que componen una biblioteca de DNA genémico. ‘Tamafto corto de los productos de la PCR Una desventaja clara de la PCR como método de clonacién de DNA ha sido el ta- maio de las secuencias de DNA que permite clonar. A diferencia de la clonacién de DNA en sistemas celulares, donde pueden clonarse secuencias de hasta 2 Mb (pagina 111), la informacién de que se dispone sobre secuencias clonadas por PCR sitia el tamafio de los fragmentos clonados entre 0 y 5 kb, tendiendo hacia el extre mo inferior. Los fragmentos pequefios se amplifican muy facilmente, pero confor: ‘me aumenta su tamafio se hace més dificil obtener una amplificacién eficiente. Sin embargo, recientemente se han puesto a punto unas condiciones de reaccion en las que se pueden llegar a amplificar fragmentos largos, incluyendo un fragmento de 42 kb derivado del genoma del bacteri6fago 2 (véase Cheng et al, 1994). Las condi ciones para la PCR de largo aleance (long range PCR) se basan en la combinacién de las condiciones esténdar con un sistema de dos polimerasas, de forma que se obtienen unos niveles éptimos de actividades DNA polimerasa y 3’ -> 5’ exonucle asa. Esta tltima actividad sirve para que funcione el mecanismo corrector de lectu- ra de pruebas (ver el Recuadro 6.1) Recuadro 6.1: Lectura de pruebas gracias a la actividad 3’ — 5’ exonucleasa asociada a la DNA polimerasa La fidelidad de la replicacién del DNA in vivo es extremadamente elevada: durante la replicacién de los genomas de mamiferos, por ejemplo, s6lo una de cada 3 x 10? bases es copiada de manera incorrecta. La incorporacién ‘equiivocada tiene lugar con una frecuencia baja, dependiendo de las energias libres de las bases apareadas de for- ma correcta o incorrecta. Cambios muy pequefios en la geometria ce la hélice pueden estabilizar pares G-T (con dos puentes de hidrégeno; recuérdese la presencia frecuente de pares G-U en el RNA, pagina 7). El proceso de copiado in vivo exhibe una frecuencia de error mucho menor que la que se desprenderfa de las meras limitaciones termodinémicas, Esto ocurre gracias a Ja existencia de mecanismos correctores de lectura de pruebas (proofreading), uno de los cuales es una propiedad comiin de las DNA polimerasas. A diferencia de las RNA poli- merasas, las DNA polimerasas tienen un requerimiento absoluto de un extremo 3° hidroxilo libre de una hebra apareada que actie de cebadora para poder iniciar la extensién de ia cadena. Ademés, Ia presencia de un nucle6- tido mal apareado en el extremo 3’ de la hebra cebadora hace que esta hebra no sirva para iniciar o continuar la sintesis del DNA. Muchas DNA polimerasas, incluyendo la de E. col, presentan una actividad 3" > 5’ exonuclea- sa integrada. Cuando se inserta una base incorrecta durante la sintesis del DNA el proceso se detiene. En lugar de seguir la sintesis, la actividad 3’ -» 5’ exonucleasa elimina un nucledtido por vez a partir del extremo 3’ hidroxilo, hasta que Mega a un par de bases terminal correctamente apareado. Esto permite que se reinicie la sintesis de DNA. Por lo tanto, las DNA polimerasas son capaces, por regla general, de autocorregirse, eliminando los errores introducidos por la actividad DNA polimerasa durante la sintesis del DNA.144 Aplicaciones de la PCR Capitulo 6 Infidelidad en la replicacién del DNA La clonacién del DNA en sistemas celulares pasa por la replicacién del DNA in vivo, proceso asociado a una elevada fidelidad de copiado debido a la existencia de meca rismos de lectura de pruebas y de correccidn (ver Recuadro 6.1). Sin embargo, cuando el DNA se replica in vitro la tasa de errores cometidos durante el copiado se dispara, DNA polimerasa termoestable més utilizada en PCR es la Tag, obtenida de T. ticus. Esta polimerasa carece de Ia actividad ¥ > 5’ exonucleasa que permite a otras polimerasas comprobar que los nuclesticos aftadidos son los correctos (lectura © verificacién de pruebas, en inglés proofreading). Esto hace que la tasa de errores co- metidos durante la repl lizada por esta enzima sea bastante elevada: para tuna secuencia de 1 kb que pasa por 20 ciclos de amplificacién, aproximadamente el 40% de las nuevas hebras de DNA sintetizadas por PCR contendra al menos tun ru- cle6tido incorrecto como consecuencia de un error de eopiado. Fsto implica que, in- cluso cuando se usa como molde una tinica secuencia de DNA, el producto final de tuna reaccién de PCR es una mezcla de secuencias extremadamente parecidas, aun- ue no idénticas. Pese a ello, si se secuencia el DNA de todo el producto obtenido Por PCR se obliene la secuencia correcta. Esto se debe a que las variaciones indivi duales se producen esencialmente al azar, por lo que para cada posiciin las bases co. 's superan con mucho a las bases incorrectas. Sin embargo, esto significa que cualquier analisis posterior del producto puede ser dificil. Por ejemplo, para los estu dios de tipo funcional se suele necesitar que el fragmento que se estudie sea clonado en un vector de expresién adecuado. Al clonar los productos de PCR en un celular se tiene el problema de que la transformacién selecciona a partir de una sola molécula, y los clones celulares seleccionados para ser amplificados contendran mo- Jculas idénticas, detivadas de un solo representante de las motéculas de la muestra original, que bien podria ser portacior de un error de copia introducide durante la amplificacién por PCR. En consecuencia, cuando se hace un experimento de este tipo se deben aislar varios clones y secuenciar los insertos, a fin de determinar la secten- cia correcta (la secuencia consenso) antes de seleccionar los que contengan la secuen- cia auténtica para ser analizada en experimentos posteriores, Recientemente se ha reducido considerablemente el problema de la infidelidad de la replicacién del DNA durante la reacci6n de PCR gracias al empleo de DNA polime- rasas alternativas que sf presentan la actividad 3° > 5° exonucleasa que permite la lectura de pruebas. Un ejemplo es la DNA polimerasa de Pyrococcus furiosus. El pro- ducto de PCR resultante tiene muchas menos mutaciones debidas a errores de copia: ara un segmento de 1 kb de DNA que ha pasado por 20 ciclos efes cin, aproximadamente el 3,5% de las hebras de DNA son portadoras de una base mal incorporada, A pesar de que la PCR se desarrollé con éxito hace sélo 10 affos, su simplicidad y versatilidad han hecho que se cuente entre los métodos mas ubicuos de la genética molecular, con una amplia gama de aplicaciones generales (Figura 6.3). La PCR se utiliza frecuentemente para detectar polimorfismos y mutaciones patogénicas Ensayos de polimorfismos de dianas de restriccidn y repeticiones en tandem Los RSP (Restriction Site Polymorphisms) son polimorfismosClonacién y andlisis del DD Tipticacién de marcadores genéticos Obtencién de DNA para el cribado de mutaciones Dateccion de mutaciones puntuales Glonacién de cDNA Clonacion de DNA gendmico Paseo genémico Obtencién de DNA para secuenciacién Mutagénesis in vitro iA mediante PCR RFLP (ver Figura 6.4); STRP (ver Figuras 6.5y 6.6) Cribado de mutaciones gendmicas y RT-PCR (ver Figura 6.7) ‘Mutaciones que alteran dianas de restriccién el mismo principio que en la Figura 6.4. Otras mutaciones por amplificacién especilica de alelo (ARMS; Figura 6.8) ‘A patti de la secuencia de aminodcidos utlizando DOP-PCA (Figura 6.9): clonacién de tos extremos de un cONA utilzando RACE (Figura 19.4) Clonacién de nuevos miembros de una familia de DNA mediante DOP- PCR (ver pagina 548). Ampliicacion del genoma completo o amplificacién subgenémica (por ejemplo, bandas cromosémicas microdiseccionadas) mediante DOP-PCR 0 PCR iniciada con oligonucledtides conectores/adaptadores (Figura 6.10) PCR inversa (Figura 6.11); POR con conectores burbuja (vectorettes, Figura 6.12 y pagina 152), IRE-PCR (Figura 6.13 pagina 153) DNA de cadena sencilla mediante PCR asimétrica (pagina 154). DNA de doble cadena para secuenciacién directa 0 para clonacién convencional sseguida de secuenciacién (paginas 153-155} Usando mutagénesis por aftadidos en 5’ para crear un producto de PCR recombinante (ver Figura 6.144) Usando cebadores con apareamientos incorrectos para cambiar un tnico huctestido previamente determinado (ver la Figura 6.148) Figura 6.3: La PCR tiene numerosas aplicaciones de cardcter general La figura ustra las aplicaciones generales. Las aplicaciones espectficas se describen en otros capitulos, El paseo cromosémico se ‘efter a la posiblidad de acceder a DNA no caracterizado a partr de una secuencia vecina conocida, en alguna diana de restriccién (creacién 0 destruccién) entre los diferentes alelos. Estos polimorfismos pueden detectarse por hibridacién de transferencias Sout- her de muestras de DNA gendmico digeridos con la enzima de restriccién ade- cuada y separadas por tamafio en clectroforesis en gel de agarosa, utilizan- do sondas de DNA que representen el locus de interés, Los RFLP resuiltantes Presentaran dos alelos, uno que corresponde al conjunto de fragmentos que tiene la diana de resiriccién (pagina 131) y otro que corresponde a los que carecen de 41. Una alternativa sencilla a la metodologia de RFLP es la deteccién de RSP mediante PCR, basada en el diseito de cebadores que flanqueen la zona polimérfi- «a, la posterior digestion de los productos de PCR con las enzimas de restriceién adecuadas y la (Figura 6.4), paracién de los fragmentos por electroforesis en gel de agarosa Los polimorfismos de repeticiones cortas en tandem (STRP), también llamados marcadores microsatélite, son secuuencias cortas, de uno a cuatro nuclestidos, que se repiten en téndem varias veces, y se caracterizan por la existencia de muchos alelos. Por ejemplo, las repeticiones (CA), /(TG), son a menudo polimérficas cuan do la m es mayor que 12, y han sido muy utilizadas como marcadores polimérficos en el genoma humano (véase més adelante). Sin embargo, uiltimamente se estén 145146 Capitulo 6 Alot $4 _ J (1) Amptiicar j {@) Cortare producto de PCR con la enzima de resticcén R © Festa potato mearie ecko on Alelo A 2.2 42 Figura 6.4: La PCR permite identiicarfaciimente polimorfismos de danas de restviccién, y por clio consttuye una alternativa a los laboriosos ensayos de RFLP. Los alelos 1 y 2 se pueden diferenciar por un polimorisme que modifica la secuencia de ‘nuclestidos de una diana espectica para la nucleasa de restriccién R: el alelo 1 posee la diana, peo el alelo 2 tiono uno o mas nucledtidos cambiados, X, X’, por lo que carece de ella. Es Bosble clear cebadores para PCR quo lanqueen la reqién que contene la cana de restrecicn, | de forma que se amplfique un producto corto. La aigestion del producto de la PCR uitlizando la tenzima de restriceién R y el fraccionamiento por tamario de los tragmentos resultantes permite la | identificacién sencilla de ambos alelos. | identificando cada vez més polimorfismos marcadores basados en repeticiones de tri tetranucledtidos. En todos los casos los STRP pueden estudiarse cmodamente mediante PCR. Se disefian los cebadores de forma que reconozcan secuencias situa das en Ios flancos de un locus STRP especifico, lo que permite la amplificacién de alelos cuyos tamafios difieren en un miltiplo entero de la unidad que se repite (Fi- gura 6.5). Los productos de PCR se pueden fraccionar utilizando electroforesis en gel de poliactilamida, Para favorecer la identificacién de los productos se mezcla con los precursores un precursor marcado, normalmente un nuicledtido radioactive © fluorescente, Antes de la electroforesis se desnaturaliza el producto de la PCR, para asegurar que cl fraccionamiento por tamafto es correcto. En la Figura 6.6 se muestra un ejemplo para el maxcador CA. Cribado de mutaciones Gracias a su rapidez y simplicidad, la PCR es muy adecuada para la obtencién de una cantidad de DNA suficiente para realizar un cribado de mutaciones. Cuando se tiene una secuencia parcial del DNA genémico o del DNA de un gen asociado con una enfermedad 0 con algtin fenotipo interesante, se pueden disefiar inmedia- famente reacciones de PCR especificas para ese gen. La amplificacién del segmento génico apropiado permite el examen répido de la existencia de mutaciones asocia das, haciendo extensivo el andlisis a un elevado ntimero de individuos. En contras- te, si se pretendiera hacer lo mismo utilizando clonacién en sistemas celutlares el proceso seria tan sumamente lento y laborioso que no podria ser considerado una alternativa seria06 s del DNA mediante PCR 147 ion y andl Clonaci Emplearlos cabadores Pt y P2 para amplticar los alos en muestras de ONA genbmico 2 Allelo 1 = (CA), ae IACRTCRIATCATORTOR OA ee Gresser esos eee ee-——+ v a rocucto de PCR 80 +82 112 bp a Allo 2 = (CA)ye Hs | ____§orenearoronon cx a exen carey oxcn — S Gr ers lat [et ster erst erler lane | fe Produce de PCR © 60+ 28 = 108 bp Alela 3 = (CA), 7 eee—1 e——— >= Sees fy Producto de POR = 60 + 22 = 102 bp Desnatualzar los proc 5 1ct0s de la PCR fraccionarlos por tamafo mediante eletroforesis © on gel de poliacritamid @ Autoraciogiatia Figura 6.5: La PCR se puede ullizar para identificar polimarfismos de repeticiones cortas en tdndem (STRP}. El ejemplo ilusra la identicacion (piticacién) del polimorfismo de una repelicién del dinucledtido (CAV/(TG), aue presenta tes alelos ‘como consecuencia de la vatiacién del nimero de repeticiones de (CA). En la autorradiogratia, cada alelo queda representao por una banda superior mas intensa y dos bandas "sombra’inferiores menos intensas (ver la Figura 6.6). Los individuos 1 y 2 tienen los siguientes ganotipos (entre paréntesis): 1 (1.8), 2 (22) iii 5 10 15 Figura 6.6: Ejompio de tpticacion de una repeticién CA, El ejemplo de la figura muestra la tipiticacion de los miembros de una famia grande ullizando el ‘marcador (CAV/(TG) D17S800. Las tlechas dela iquierda sefialan la banda superior (banda Principal) que puede aprociarso on los diferentes alolos 1-7. Obsérvese que os alelos individuales exhiben una banda superior intensa soguida de dos “bandas sombra’ inleriores, una bo intensidad intermedia situada inmediatamante por dobajo de la banda superior, y otra que es Muy débil y que se sitda inmodiatamente por deoajo de la primera banda sombra. Los genotipos Correspondientes alos alferentes individuos de a familia son (entre paréntasis): 1 (3,6): 2 (1,5): 3 (3,5); 4 (2.5); 5 (8,6); 6 (2,5); 7 (9,5); 8 (3,6); 9 (8,5); 10 (5.7); 11 (3.3) 12 (24); 19 .9): 14 (9.8); 18 (3,3) 16 (84). Obsérvase que en el ultimo caso la banda media es parlicularmente intonsa ‘dobido a que contiene tanto la banda principal del allo 4 como la banda media del alelo 3. So Supone que el apareamiento desiasado de las hebras (pagina 275) es el principal responsable de la produccién de las bandas sombra en las 1 Ainuclestidos (Hauge y Lit, 1983)148 Capitulo g La posibilidad de identificar fronteras exén/intrOn y secuenciar los extremos de lo intrones de un gen de interés permite el crib fo de mutaciones gentdmicas: se ponen punto ensayos de amplificacidn espectficos de exones individuales del gen de i rés, disettando cebadores que reconozcan secuencias intr6r icas proximas a la fron, tera con el exdn investigado (véase la Figura 6.7A). Los productos de PCR resultan, tes se analizan mediante métodos répidos de cribado de mutaciones, muchos de los cuales se basan en el andlisis cle productos dle tamano no superior a las 200 by (ver pagina 428). En Jos seres humans el tamano medio de los exones es de 180 bp, Jo que resulta muy conveniente para este tipo de anslisis. Sin embargo, en caso de que se trate de exones muy grandes, lo habitual es disefiar una serie de cebadores jue permitan generar productos exdnicos ipados que cubran toda su extensién, de cDNA nes, Bste cribado de mutaciones en el cDNA puede ser el tinico método para estudiar mutaciones que afecten a un gen si no se dispone ci6n de intrones /exones. Pata realiza La PCR permite también amplificar secuencias ara el cribado de mutacio. informacién sobre su organiza el estudio sobre cDNA se purifica en primer gar el mRNA a partir de un tejido conveniente, por ejemplo células sanguineas. Este MRNA se pasa a cl)NA utilizando transcriptasa inver cDNA asi obtenido se utiliza como sustr sa (ver la pagina 102), y el to para una reaccién de PCR. Esta version de la reaccién estindar sobre DNA gendmico recibe el nombre de RT-PCR (acrénimo de inglés Reverse Transcriptase PCR, o transcriptasa inversa -PCR, ver Figur 6.7B). El mé todo es obviamente adecuado para genes que se expresan mucho en oélulas de féci acceso, como las eélulas sangul eas. Sin embargo, dado que en toclos los tejidos existe tuna cierta transcripeién ectépica (transcripcién de bajo nivel que se da para casi todos Jos genes en casi todos los tejidos) el método se ha aplicado también para el estudio de transcrit nes que no se expresan de forma significativa en célul ‘como por ejemplo el gen de la distrofina (DMD, Chelly et l., 1989), ee Poraue su expresion natural es allo bien porque, ‘mantione un nivel basal de expresion ectdpiea —— mRNA Tansertas iversa RoR oon Sr —F eon >—s— > eo 8 Figura 6.7: Los productos de POR destiaados al erbado de mutaciones se obiionen a part DNA genémico utilzando cebadores espectices de intrones que flanqueen exones o bieh Utlizando RT-PCR, (A) DNA gonémico. Los exones 1~# pueden ser ampiicados independientamente a partir de DNA gendmico utiizando los pares de oligos especiicos de intrones 1F + 1R. 2F + 2A. etc. (8) RT-PCR, Esta roaccién so basa en que existe un minimo de MANA del gen de interés, resente en céiulas de facil acceso, come las céiulas sanguineas, y esto permite su conversion @ DNA. El CDNA puede ser uitlizado como moide en tina reaccién de PCF con pares de ceebadores especticos de exones coma por ejemplo 1F + 1R, 2F + 2R, elc.. que permit jobtencion da fragmentos solapados.icin y andlisis del DNA mediante PCR PCR especifica de alelo y deteccién de mutaciones 9s oligonuclestidos que sirven de cebadores en la reacciGn de PCR pueden ser di- xean capaces de discriminar secuencias de DNA diana que sefiados de forma que difieran en un solo nucleétido en la regidn de interés. Esta estrategia seria la ver- sidn PCR de la hibridaci6n especifica de alelo utilizando sondas ASO (pagina 117), En el caso de la hibridaci6n especifica de alelo, las sondas ASO allernativas se dise fan de forma que las diferencias se concentren en la regiGn central de la secuencia {para maximizar la inestabilidad termodinémica de los chiplex mal apareados). Sin embargo, en el caso de la PCR especifica de alelo los cebadores ASO se disenan para que difieran en el nuclestido situado en el extremo 3. La razén es que el paso de sintesis de DNA de la reaccin de PCR depende eriticamente de que haya un ecto de bases en el extremo 3 (ver la Figura 6.8). El método de de alelo se puede aplicar para la identificacion de ale! apareamiento PCR especif en un locus polimérfico, pero para lo que se ha aplicado prine os especificos falmente es para la deteccién de mutaciones patogénicas especificas, con un método denominado sis- tema de mutacién refractario a la amplificacion (ARMS, de Amplification Refrae ystera; Newton et al, 1989) tory Mutetion Alelo 1 Alelo 2 Disohar cebadores especttions Ge aloo (rucosticos 4-17) del aloo 1 (ASI Cobador especitico do alolo 2(ASP2) P19 ASP? + cebador CON [Paxaorweor) 149 Figura 6.8: El apareamiento de bases correcto on ol extremo 3' de los cabadores de una reaecién de PCA constituye la base de la POR ota de ale, Los oligonuclestidos especticas de alelo ASP! y ASP2 son idénticas ala region que cortione .6o variant siando su ro 3 el elestido variante de uno u otro alelo, ASP1 se unira portectamento ala here complementaria de la secuencia de! alelo 1, mientras que ASP2 hard lo propio con @lalelo 2. Sin ‘embargo, el extrema 3 terminal il cobador ASP2 (en el ejemplo ‘ccupado por una C) no es ‘omplementaroa fa T dela secuencla del allo 1, por lo que este cebador no serd capaz de Iniciar la reaccidn sobre DNA que sontenga a este alelo. Lo mismo urird con ASP1 actuando sobre tenga al aloo 21 Capita 5 La PCR utilizando oligonuclestidos degenerados como cebadores permite la clonacién rapida de cDNA y de miembros no caracterizag, de familias de DNA og La PCR iniciada por oligonucledtidos degenerados (DOP-PCR, dle Degeerg sonueleoide-Primed PCR) es una variante de PCR disefiada expresamente pert mitir a amplificacién de varios productos. Los cebadores utilizados son tt te ollgonuclestidos degenerados,oligonuicletidos que en realidad son un pare sgeuecins con ceria bases communes y ors cents. En consecunes, el ie diana puede tener més de un lugar de unin para cada cebacior. La aplicacin exis ei proporcona un sem pala detifcain de suenc nes no caractrizadas que pertenezcan a una familia de secuencias emparentas de misma especie o de especies diferentes. Ademés, permite clonar un gen cua ‘nico que se conoce de él es una parte de la secuencia de aminosicidos de ducto polipeptidico (Figura 6.9). Indo ig SU Pro, La PCR se puede aplicar para la amplificacién indiscriminada de 8 de DNA a partir de una mintiscula cantidad de DNA origina] Como se ha mencionado antes, una de las limitaciones principales de la reaccin de PCR estindar es que se necesita informacién previa sobre la secuencia del DNA que se pretende amplificar. Sin embargo, ciertas aplicaciones permiten la amplificactn, de DNA sin que se tenga informacion acerca de su secuencia, Esta modificacion de Ja reaccién estndar se basa en que la amplificacin pasa de sex selectcu (Figura 61) ser indiscriminada. Bste tipo de estrategias resulta particularmente titil cuando se di Pone de muy poca cantidad de DNA en una muestra (por ejemplo, extractos de muestras de DNA muy antiguas, bandas cromosémicas provenientes de microd secci6n, caracterizacién de células individuales, ete), y la amplificacion de prictica. ‘mente todas las secuencias aumenta la cantidad de DNA disponible para el estudio PCR iniciada con conectoresladaptadores (PCR con adaptadores para ligacién) Sisse liga una secuencia eonocida a todos los fragmentos de una mezcla, se tiene un método que permite la amplificacién de practicamente todas las secuencias de DNA presentes en una mezcla compleja, Para esto se digiere en primer lugar I po Econ ANTISENTIDO "| 123 456 2 29 9 3 se Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Gly Lys Tye Hs mores sr i= GAC CGA ARATAC CAC. Teg My OMG 8: [ GAAGEIGGAT TAT AAR aan aay Ga re (i [ete ? ‘nat (CON SENT! Figura 6.9: La DOP-PCR permite la clonacién de cDNA ullizand ligonuclestides degenerados. Ge Saka usta la lonacion de un cDNA de a urato-oxidasaporcinaullizando olgonuclodidos degenerados derivados de una seauencla cosoninnécidos conocida. El cebador con sentido se construyéa partir de fos primeros cinco codones mas las dos pitas baer or Sooucneiag oa Gut lccbasor antserido se basé en as posibles secuencias coleantes do lo codones 20-3 (Le ofa, Tobey, Las amiedclees paminodcidos elegidas para la construccion de los cebadores fueron seloccionadas en base a su elevado serteniot we eran eseciicados por uno 0 dos cadones (Asp, Tyr, Lys, Asn, His, ver Figura 1.22), Los cobadoros hueon dooney exens.ones 5’ que contenian danas derestccié, lo que fcitaria su conan posterior en sistomas colares Wer pagne 15H[ee re 6 Clonacion y andlisis del DNA mediante PCR 151 spt del DNA dian con una nacleasa de resricciénadecvada, Una ver diges- bla fragmentos de DNA se mezcan con cligonucedtidosbicsienarios consi sos ples (inkrsadptors) que tienen eremasprotuberantes compatibles com la | ane fe resticddn ulizads,y se permite su ligaionaftadiendo gas, Una vez erie la reacciOn se realiza la emplifiacién por PCR ulllzando como ceba- camp igorileGtioo eopetios dela secuena de los conectores, De esta forma dows sien ampliica todos aquellos fagmentos que estén flanqueados por estos se Pemuele6tios (Figura 6.10) : Amplificacion de DNA genémico total utilizando DOP-PCR : Gi se aplica el método DOP-PCR descrito arriba utilizando oligonuclebtidos que ° jean completamente aleatorios (es decir, que contengan todas las secuencias posi- ples para su longitud), se tiene un sistema alternativo al de PCR con conectores pare obtener una amplificacién indiscriminada: los oligonuclestidos completamen- fe degenerados permiten la amplificacién del genoma completo, método que ha sido atl para el diagndstico pre-implantacién (pagina 464). | LaPCR se puede utilizar para clonar regiones no caracterizadas de DNA que flanquean una regién ya conocida Una de las limitaciones principales de la reaccién esténdar de PCR es que permite la amplificacin de una secuencia de DNA comprendida entre dos cebadores con- vergentes, llamados asi porque cada uno inicia la sintesis del DNA en la direccién del otro, Sin embargo, a menudo lo que interesa saber es qué tipo de secuencias de 1 Nuclease do resticagn A? SEES cra ———> ATC mm Muchos tragmentos (@e) MOO} 3 OTAG ‘erentos ATC me, Sone NA complejo ae. © 4 gat a oligonuciestido bicatenario ‘on salantos complementaroe 1 Conect (adaptador 0110 a rg ois ‘onectoriadeptador para Iniciar la Usar cobador espectico et ‘ampileacion del ONA desnaturazado el conector/adantadar Figura 6.10: La PCR iniciada por oligonuctestcos con mezcia compleja ctores permite la ampliicacién indiscriminada de secuencias de DNA de una La molécula conectora (adaptadora) (linkar/adaptor) es un oligonuclestido de doble cadena que se cbtione asociando dos oligos "onocatenarios complementarios entre si, excepto que uno posee un extremo §’ protuberante compatible con el extremo protuberante {tejado por alguna endonucleasa de resticién (en este caso, ol extremo 5. protuberante GATC dojado por la enzima Mal). Tras la 'igackén del adaptador a los tragmentes de restrccién del DNA diana, un cebador especitico del adaptador permite la ampiticacion de ‘dos os fragmentos flanqueados por dos moléculas adapladoras.152 Capitulo 6 DNA no caracterizadas ocupan la regién adyacente extema a la regién conocida, Para acceder a esta informacién se han desarrollado varios métodos basados en la PCR, los cuales se indican a continuacién. PCR inversa Este es un método general de amplificacién del DNA adyacente a una regién pre- viamente caracterizada (Ochman ef al., 1988). Se basa en el empleo de cebadores derivados de los extremos de la regiGn caracterizada, pero que son dive decir, la direccién 5” > 3’ de cada cebador apunta hacia el lado opuesto al que se encuentra el otro cebaclor. En condiciones normales la reaccién de PCR seria impo. sible con tales cebadores. Sin embargo, para la PCR inversa se corta primero el DNA de forma que la regién deseada queda comprendida en un pequefo frag. mento de restriccién, al que se permite la circularizacién (la circularizaci6n, fruto de la ligacién intramolecular, se favorece si se utiliza muy poco DNA, ya que en esas condiciones los extremos de una misma molécula tienen mayor prababilidad de asociarse que los extremos de moléculas diferentes). Una vez. circularizado el fragmento, se procede a una reaccién de PCR esténdar utilizando los cebadores di- vergentes, que ahora si permiten que se desarrolle la reaccién (Figura 6.11) PCR con conectores burbuja (bubble linker PCR) La PCR con conectores burbuja, o PCR de vectorettes, es un método alternativo a la PCR inversa, que permite la amplificacibn de secuencias no caracterizadas adya. centes a una regién de secuencia conocida (Riley et al, 1990). El método es una riante parcial del método de la PCR iniciada con conectores (pagina 150), ya que antes de la reaccién se liga al DNA problema un oligonucleétido conector de doble cadena. Sin embargo, en la PCR con conectores burduja la amplificacién se basa en el uso de un cebador derivado de la secuencia diana y de uno derivado de la se cuencia del adaptador, El conector, por su parte, no esti formado por dos hebras ‘exactamente complementarias, como seria lo habitual (exceptuando los salientes que se disetan para favorecer la ligacién con el DNA problema), sino que los dos ; ; } Figura 6.11: La PCR inversa permite la cionacion de secuencias de DNA \ ry flanqueantes a partir de un molde circularizado. \ 4) Los cobadores se disefian de forma que se unan a la secuencia de DNA a on Ios cebadores de POR previamente diseriados ———il lo 6 ida, "ly mes el 1B ito al Clonaci sgonucletidos del conector se disefian para que sean complementarios en los ex- alin pero no en la regidn central; [a falta de apateamiento en el segmento cen- ermal conector es la base de su denominacién de “burbuja’, La falta ce comple- tea tariedad entre las secuencias de la zona central de los conectores burbuja write el disefto de cebadores especificos de hebra, los cuales pueden utilizarse en getieion conocida por uno de sus lados (cer la Figura 6.12) La PCR de vectors ha sido particularmente ti] para la amplificacion de regiones frontera entre intro- iamiento de los extremos de los YAC (pagina 513) ais IRE-PCR (PCR de elemento repetido intercalado, IRE) ste método va dirigido a la amplificacin de secuencias no earacterizadas situadas centre dos mie amente repetiti- vos, algunas de las cuales se han caracterizado particularmente bien en el DNA de mamiferos (ver las paginas 214-219). Si una de estas familias tiene un ntimero de pros de alguna familia de elementos intercalados all ‘pias lo suficientemente elevado como para que haya uno de sus miembros cad Ci —— a —S= Ei p i Nei CNC ee ATC 3 os P > > 1 2 2 PCR sélo con ol cebador ~ 1 0con el cebador 2 Séia —— Solo cebadore | } cebador + A a) o- —3 5 —3 3 ey — oo Figura 6.13: La IRE-PCR ampiifica secuencias de DNA situadas entre elementos intercalados altamente repetitivos. Los cebadores que permiten la ampiiicacion do una determinada clase de elementos intercalados dispersos repetidos (IRE, de Interspersed Repeated Elements) se disefian de forma que hibriden con secuencias especiicas situadas en ambos extremos dol ‘elemento repetido, con Ia cireccidn 5° > 9’ hacia fuera del elemento, Uno solo de astos cebadores permite la ampilicacion por POR de las socuencias situadas entre dos elementos de la familia stuados en oriantaciones opuestas, y organizados de manera tal ue los dos ‘Cebadores son convergentes (por ejempio, una PCR con el cebador 2 permitiia amplicar la secuencia A, pero no la B; el cobador 1 ermitra la ampiiicacion de B, pero no de A). En teoria, combinando los cebadores 1 y 2 se podrian ampliicar las secuencias situadas ‘nize elementos repetidos de Ia familia situados en la misma orientacion. En la prctica, la ampiticacién por PCR serta dificil o imposible sla distancia entre los elomentos repetidos es demasiado grande (ver pagina 143),jon y andlisis del DNA mediante PCR .métrico). La concentracién de uno de los cebadores se fija tipicamente en 100 Ja concentraciGn del otro. Durante las fases iniciales (hasta los ciclos 15 a 25), “payor parte del producto que se genera es bicatenario, y se acumula exponen njentes generan tn exceso de una de las dos hebras, y se obtiene una acumulaci6n Clonacién de productos de PCR en sistemas celulares [ra calidad de las secuencias de DNA que se obtienen a partir de productos de PCR picatenarios desnaturalizados © monocatenarios obtenidos por PCR asimétrica es sentemente menos que Optima. Como alternativa, los productos de PCR in. a menudo siendo clonades en sistemas celulares convencionales. Sin em: argo, la clonacién de un producto de PCR en una diana de clonacién de un vector no es facil. Esto se debe a que existe una parte importante de los productos de una reaccién de PCR que no tiene los extremas romos. Algunas DNA polimerasas termo- stables, como la Taq, tienen una actividad desoxinucleotidil transferasa terminal gque permite a la enzima afiadir residuos adenilato al extremo 3’ de los productos de PCR, fundamentalmente sobre aquellos productos con una citosina 3” terminal. acaba Para aprovechar la existencia de una A 3’ terminal se han disefiado varios vectores. Por ejemplo, existe uno que tiene una extensién 3’ de un residuo T, complementa- rio a A, que por tanto puede aparearse con la A 3’ protuberante del producto de PCR (Mead et al., 1991). Otra estrategia, no basada en la actividad terminal transfe- rasa, consiste en la adicién de una extension 5’ a los cebadores (ver més adelante) que contenga una diana de restriccién, de forma que los productos de la PCR pue- dan ser cortados con la enzima correspondiente para generar fragmentos con extre- mos compatibles con la diana elegida (ver la Figura 6.14A para el principio basico y la Figura 6.9 para un ejemplo). La PCR se puede usar para introducir mutaciones especificas predeterminadas en las secuencias de DNA. Dado que la limitacién principal para la amplificacién especifica es que los cebado- +63 estén correctamente aparcados en su extremo 3 se dispone de una flexibilidad considerable para el diseito de los cebadores por el extremo 5’. Aprovechando esta flexibilidad se han desarrollado métodos basados en la PCR que permiten la muta: Bénesis especifica in vitro dirigida por oligonuclestidos. Estos métodos constituyen una altemativa a otros sistemas de mutagénesis especifica de sitio no basados en 1a PCR (paginas 566-568). La mutagénesis empleando PCR se ha basado en dos cs- trategias principales: (@ Mutagénesis con cebadores con apareamientos incorrectos: los cebadores se sintetizan deliveradamente de forma que sean similares, aunque no idénticos, alla secuencia diana (i) Mutagénesis por afiadidos en 5 (5' add-on mutagenesis): los cebadores se dise- jian de forma que contengan una secuencia nueva en st extremo 5. La nueva secuencia de 5’ no participa en el primer paso de reasociacién de la reaccién de PCR (ya que sélo la parte 3° del cebador reconoce Ia sectencia del DNA diana), pero si en los ciclos posteriores, ya que se ha incorporado al producto amplificado. El producto final de la PCR es, por tanto, un producto recombi- nante (Figura 6.14), A menudo la secuencia adicional contiene una diana de restriccién que pueda ser titil de cara a la posterior clonacién del producto en un sistema celular. Alternativamente puede contener algtin componente fun- ional, como una secuencia promotora que se pretenda afladir al extremo 5’ de un fragmento de DNA del que se necesita un producto de expresién (por 155156 Capitulo 6 (a) ® ™ 3 Eliminarcobacores esnalurskzar y reasoeiar para formar Y heterodiniex Figura 6.14: | Mutagénesis empleando PCR, (A) Mutagénesis por affadiios en 5, El extrema 5’ de los cabadores se modifica para introduc, pa ejemplo, un grupo marcado (Figura 17.20), una secuencia que contenga una diana de restriocién adacuada (Figura 19.8) 0 un promotor lagjco (Figura 14.16) (B) Mutagénosis especiica de sitio. La mutagenesis que se iusia en la figura puede generar un producto amificado con una mmutacion especttica pre-especificada situada an un sagmento canta Las reacciones de PCR A y B so pantoan de forma que ampliiquen una regién solapante en el DNA que contenga la mutacién que se desea introducir(utizando los cebadores delveradamente mutantes 1M 0 2M), Tras combinar los dos productos, desnaturalizalos y permitr su reasociacién por la zona complementavia, la DNA polimerasa sera capaz de extender los extremos 3’ de los heteroduplex on los que estas extromos hayan quedado més cortos quo los extremos 5’. Tras la extensién, e! producto de tamara completo, portador dé la mutacidn en su zona central, podra ser ampliicado ulilzando solamente los cebadores exteriores 1 y 2 ejemplo, para ser transcrito por la RNA polimerasa de un fago sin necesidad del paso de clonacién normal mostrado en la Figura 5.5; véase la Figura 14.16). tra aplicacién es la adicién de un grupo marcado, por ejemplo un grupo biotinado, que de esta forma queda incorporado en el extremo del producto de PCR (ver Figura 11.20 para un ejemplo), Pese a que la mutagénesis por PCR implica el empleo de cebadores con la secuen- cia alterada respecto a Ja diana a fin de introducir la mutacién, el método no se li- mita a la modificacion de secuencias del extremo de la regidn elegida. El método sirve para introducir mutaciones en cualquier punto de la secuencia. Para ello ser Cillamente se disefan dos reacciones de mutagénesis de forma que los productos de las PCR individuales tengan una cierta regién de solapamiento en la cual se si- tie la mutacién. Tras la obtencién de estos productos, la regién completa puede re sgenerarse (ahora ya mutada) simplemente combinando los productos desnatural zados para generar un producto més grande con la mutacién en una posici central (Higuchi, 1990; ver la Figura 6.14B)ipttulo g rediante PCR 157 pibliografia adicional shtich HA. 1989) PCR Tectnlogy. Pineples and Applications for DNA on, Stock ton Press, New York pivlich HA, Gelfand D, Sninsky JJ. (1991) Recent advances in the polymerase chal re tion, Scene, 252, 1645-1651 Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ. (1990) PCR Profacls. A Guide ta Methods and syplontons. Academic Press, San Diego, McPherson MJ, Taylor GR, Quirke P. (1991) PCR# Pact IRL Press, Oxford Newton CR, Graham A. 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