1.

CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TRONG PHÂN

TÍCH THỰC PHẨM ...............................................................6
1.1. VAI TRÒ PHÂN TÍCH THỰC PHẨM ..............................................6
1.2.Các phương pháp phân tích trong phân tích thực phẩm ..........................7
1.2.1. Phương pháp hóa học .....................................................................7
1.2.2. Phương pháp hóa lý ........................................................................8
1.3.Phương pháp quang phổ ..........................................................................9
1.3.1. Phương pháp quang phổ UV – Vis ...............................................13
1.3.2. Cấu tạo thiết bị quang phổ UV – Vis ............................................14
1.3.3. Ứng dụng phương pháp quang phổ trong định lượng ..................14
2. PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU TRONG PHÂN TÍCH THỰC
PHẨM ....................................................................................16
2.1.MỤC ĐÍCH CỦA LẤY MẪU PHÂN TÍCH ........................................16
2.1.1. Mục đích .......................................................................................16
2.1.2. Một số khái niệm trong lấy mẫu...................................................16
2.1.3. Lấy mẫu và gửi mẫu .....................................................................17
2.2.Phương pháp lấy mẫu ............................................................................25
2.2.1. Phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên ................................................25
2.2.2. Phương pháp lấy mẫu phi ngẫu nhiên ..........................................25
3. CÁC KỸ THUẬT CHUẨN BỊ MẪU TRONG PHÂN TÍCH
THỰC PHẨM ........................................................................27
3.1.YÊU CẦU CHUNG CỦA CÁC KỸ THUẬT XỬ LÝ MẪU PHÂN
TÍCH .........................................................................................................27
3.1.1. Giới thiệu xử lý mẫu.....................................................................27
3.1.2. Tại sao phải xử lý mẫu phân tích .................................................27
3.2.KỸ THUẬT VÔ CƠ HÓA ƯỚT (XỬ LÝ ƯỚT) .................................29
3.2.1. Vô cơ hóa ướt bằng axit mạnh đặc nóng ......................................29

 3.2.2. Kỹ thuật vô cơ hóa ướt bằng dung dịch kiềm mạnh đặc nóng .....35
3.3.KỸ VÔ CƠ HÓA KHÔ .........................................................................38
3.3.1. Nguyên tắc và các quá trình xảy ra khi vô cơ hóa mẫu................38
3.3.2. Thiết bị và dụng cụ để xử lý khô ..................................................41
3.3.3. Vô cơ hoá khô không có phụ gia và chất bảo vệ ..........................42
3.3.4. Vô cơ hoá khô có phụ gia và chất bảo vệ .....................................43
3.3.5. Ưu nhược điểm .............................................................................44
3.4.KỸ THUẬT VÔ CƠ HOÁ KHÔ - ƯỚT KẾT HỢP .............................45
3.4.1. Nguyên tắc chung .........................................................................45
3.4.2. Phương pháp tiến hành và một số ví dụ .......................................45
3.4.3. Ưu nhược điểm .............................................................................47
3.5.KỸ THUẬT TRÍCH LY THƯỜNG SỬ DỤNG KHI XỬ LÝ MẪU ...48
3.5.1. Cơ sở, nguyên tắc và điều kiện trích ly ........................................48
3.5.2. Một số kỹ thuậttrích ly thường dùng trong xử lý mẫu phân tích .50
4. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯƠNG NƯỚC
TRONG THỰC PHẨM .........................................................77
4.1.GIỚI THIỆU CHUNG ..........................................................................77
4.2.MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NƯỚC.........79
4.2.1. Phương pháp khối lượng ..............................................................79
4.2.2. Phương pháp chuẩn độ KarlFischer .............................................80
5. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
PROTEIN TRONG THỰC PHẨM .......................................93
5.1.GIỚI THIỆU CHUNG ..........................................................................93
5.1.1. Protein trong thực phẩm ...............................................................93
5.1.2. Vai trò của việc phân tích protein .................................................95
5.2.CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH PROTEIN ...................................95
5.2.1. Xác định protein tổng theo phương pháp Kjeldahn .....................95

 5.2.2. Xác định protein tổng theo phương pháp Dusma .........................98
5.2.3. Phương pháp Biuret....................................................................104
5.2.4. Phương pháp Lowry ...................................................................106
5.2.5. Phương pháp nhuộm màu Bradford ...........................................109
5.2.6. Phương pháp Bicinchoninic Acid (BCA) ...................................111
5.2.7. Phương pháp hấp thụ tử ngoại ....................................................113
5.2.8. Xác định hàm lượng lượng axit amin trong thực phẩm bằng
phương pháp folmadehyl ............................................................115
6. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH GLUXIT TRONG THỰC
PHẨM ..................................................................................118
6.1. GIỚI THIỆU CHUNG ...................................................................118
6.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP .....................................119
6.3.XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP
BERTRAND ...........................................................................................122
6.3.1. Cơ sở của phương pháp ..............................................................122
6.3.2. Chuẩn bị mẫu .............................................................................123
6.3.3. Xác định hàm lượng đường ........................................................124
6.3.4. Tính toán kết quả ........................................................................125
6.4.XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP
DNS ........................................................................................................131
6.4.1. Nguyên tắc..................................................................................131
6.4.2. Xử lý mẫu ...................................................................................131
6.4.3. Tiến hành: ...................................................................................132
6.5.XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG SACCAROZA .......................134
6.6.XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG TỔNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP
BERTRAN ..............................................................................................135
6.7.XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TINH BỘT.............................................135

 6.8.XÁCĐỊNH ĐỘ POL CỦA ĐƯỜNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO GÓC

QUAY CỰC............................................................................................135
6.8.1. Cơ sở lý thuyết ...........................................................................135
7. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LIPID ........................137
7.1.GIỚI THIỆU........................................................................................137
7.2.CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LIPID ........................................138
7.2.1. Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet ...............138
7.2.2. Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp Adam – Rose –
Gottlieb .......................................................................................140
7.3.Phân tích một số chỉ tiêu đánh giá chất lượng dầu mỡ........................141
7.3.1. Xác đinh tỷ khối của dầu hay chất béo dạng lỏng ......................141
7.3.2. Xác định điểm đục của dầu mỡ thưc phẩm ................................142
7.3.3. Xác đinh điểm mềm (điểm nóng chảy ống hở) của dầu mỡ ......143
7.3.4. Xác định chỉ số Peroxide trong dầu mỡ .....................................145
7.3.5. Xác định chỉ số xà phòng hoá của dầu mỡ thực phẩm ...............147
7.3.6. Xác định chỉ số iod (Phương pháp Wijs)....................................149
7.3.7. Xác định chỉ số acid trong dầu mỡ .............................................151
7.3.8. Xác định chỉ số hydroxyl trong dầu mỡ ....................................153
7.3.9. Xác định hàm lượng chất không xà phòng hoá trong dầu mỡ ...155
7.3.10.Xác định hàm lượng xà phòng trong dầu ...................................157
7.3.11.Xác định hàm lượng tro cuả sản phẩm dầu ................................159
7.3.12.Xác định hàm lượng tạp chất của sản phẩm dầu mỡ thực phẩm 160
7.3.13.Xác định hàm lượng nước và các chất dễ bay hơi trong sản phẩm
dầu mỡ ........................................................................................161
7.3.14.Xác định hàm lượng acid béo tự do có trong dầu, mỡ thực phẩm ...
163

 1. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TRONG PHÂN TÍCH

THỰC PHẨM

1.1. VAI TRÒ PHÂN TÍCH THỰC PHẨM

− Việc kiểm nghiệm chất lượng thực phẩm nói riêng và và sản phẩm nói
chungphục vụ cho rất nhiều mục đích, như là:
+ Đối với công tác kiểm tra, cấp giấy chứng nhận chất lượng thì việc kiểm

nghiệm chất lượng để đưa đến quyết định chấp nhận lô hàng hoặc từ chối
cấp chứng nhận cho lô hàng.
− Trong sản xuất, quản lý chất lượng, nghiên cứu phát triển sản phẩm: đánh
giá chất lượng sản phẩm là để nhận biết mức chất lượng của sản phẩm đạt
được so với tiêu chuẩn qui định (về cảm quan, thành phẩm dinh dưỡng và vi
sinh) nhằm điều chỉnh những sai xót, tìm hiểu nguyên nhân gây ra, để có
biện pháp chấn chỉnh kịp thời đảm bảo chất lượng sản phẩm.
▪ Kiểm nghiệm còn nhằm xác định chính xác chất lượng sản phẩm, trên
cơ sở đó phân loại, xếp hạng sản phẩm đúng yêu cầu của từng mặt
hàng.
▪ Cung cấp số liệu về chất lượng thực phẩm phục vụ cho công tác quản
lý nhà nước.
▪ Người ta đã đưa ra nhiều phương pháp để đánh giá các khía cạnh khác
nhau về chất lượng sản phẩm. Một số phương pháp chỉ thích hợp cho
mục đích này mà không thích hợp cho mục đích khác.
▪ Tùy theo yêu cầu kiểm tra mà người ta chọn phương pháp thích hợp
để đạt được độ tin cậy cao nhất. Các phương pháp kiểm nghiệm đã
được áp dụng bao gồm: phương pháp cảm quan, phương pháp hoá học,
phương pháp vi sinh vật.

 1.2.CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM
Phân tích thực phẩm phải xuất phát từ việc lựa chọn phương pháp phân
tích. Vì thế, lựa chọn phương pháp là mắt xích đầu tiên trong quy trình phân
tích, nó có ý nghĩa quan trọng.
Hiện nay, các phương pháp định lượng được sử dụng trong phân tích được
chia thành hai nhóm phương pháp đó là nhóm các phương pháp hóa học (gọi
tắt là phương pháp hóa học) và nhóm các phương pháp hóa lý (gọi tắt là
phương pháp hóa lý).
Những tiêu chí được sử dụng để lựa chọn phương pháp phân tích bao gồm:
▪ Độ đúng của phương pháp
▪ Độ chính xác của phương pháp
▪ Tính chuyên biệt của phương pháp
▪ Kích cỡ mẫu
▪ Trang thiết bị
▪ Tính kinh tế
▪ Tính an toàn và độ độc hại
▪ Tốc độ và tính cấp thiết của công việc
1.2.1. Phương pháp hóa học
Phương pháp hóa học còn được gọi là phương pháp cổ điển không chỉ vì
nó là phương pháp dựa trên phản ứng hóa học để định lượng cấu tử mà đó còn
là nhóm những phương pháp được sử dụng sớm hơn so với những phương
pháp hóa lý.
Phương pháp hóa học lại được chia thành hai phương pháp nhỏ đó là
phương pháp khối lượng và phương pháp thể tích thông qua việc cân hay đo
chính xác khối lượng hay thể tích cấu tử hay thuốc thử cần xác định. Phương
pháp hoá học được sử dùng để phân tích xác định hàm lượng lớn (đa lượng)
của các chất, thông thường lớn hơn 0.05%

 Phương pháp phân tích khối lượng: dựa vào việc cân sản phẩm tạo thành
sau quá trình thực hiện phản ứng tạo kết tủa từ đó xác định hàm lượng cấu tử
cần phân tích như:
▪ Phương pháp bay hơi
▪ Phương pháp kết tủa
Phương pháp phân tích thể tích: Dựa vào việc đo chính xác thể tích dung
dịch thuốc thử có nồng độ chính xác để tính hàm lượng cấu tử cần phân tích
bao gồm:
▪ Phương pháp chuẩn độ axit – bazo
▪ Phương pháp chuẩn độoxy hóa – khử
▪ Phương pháp chuẩn độ kết tủa
▪ Phương pháp chuẩn độ phức chất
Cơ sở chung của phương pháp phân tích thể tích:
▪ Dựa vào bản chất của phản ứng để xây dựng phương
pháp
▪ Sử dụng những lý thuyết liên quan để xây dựng phương
pháp
▪ Dùng định luật đương lượng làm cơ sở việc tính toán
▪ Dùng chất chỉ thị màu để nhận biết điểm cuối
Các quá trình trong phương pháp thể tích chủ yếu là thao tác bằng tay và sự
quan sát bằng mắt của người thực hiện nên sự mất mát xảy ra là tương đối lớn
vì vậy để tránh sai số thì lượng phân tích thường lớn. Để xác định điểm tương
đương người ta dùng chất chỉ thị màu cho vào vì vậy, độ nhạy của phương
pháp không cao.
1.2.2. Phương pháp hóa lý
Phương pháp hóa lý còn được gọi là phương pháp hiện đại. Phương pháp
này được sử dụng khi cần yêu cầu độ chính xác cao, yêu cầu tốc độ phân tích

 nhanh chống hoặc khi hàm lượng cấu tử cần phân tích nhỏ. Cơ sở của phương
pháp dựa trên tính chất hóa lý của cấu tử để xác định chúng.
Phương pháp hóa lý được phân chia dựa trên tính chất được sử dụng để xác
định cấu tử đó là: phương pháp quang phổ, phương pháp điện, và phương
pháp sắc ký.
Trong giáo trình này, chúng tôi chỉ đề cập đến phương pháp quang phổ UV
– Vis trong phân tích định lượng.
1.3.PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ
Phương pháp quang phổ là phương pháp hóa lý, dựa trên sự tương tác giữa
bức xạ điện từ và vật chất (nguyên tử, phân tử). Khi có sự tương tác với vật
chất, bức xạ điện từ sẽ hấp thụ hoặc phát xạ mà bức xạ được ứng dụng trong
thiết bị quang phổ hấp thụ hay quang phổ bức xạ tương ứng.
Bức xạ điện từ bao gồm một dải các sóng điện từ có bước sóng dao động
trong một khoảng rộng từ bước sóng rất nhỏ như tia gamma (λ = 10-16 –
10-8m) đến bước sóng rất dài như sóng radio (λ = 100 – 108m). Bức xạ điện từ
là tổ hợp dao động của điện trường và từ trường vuông góc nhau, lan truyền
trong không gian như sóng ngang. Do vậy mà bức xạ điện từ vừa có bản chất
của sóng, lại vừa mang bản chất của hạt.

Hình 1.1. Bước sóng dải bức xạ điện từ

 Năng lượng phân tử hay nguyên tử là tổng các dạngnăng lượng:

E = Eđt+Edđ+ Eq
▪ Eđt: Năng lượng điện tử của phân tử
▪ Edđ: Năng lượng do những dao động gây bởi tươngtác giữa các nguyên
tử trong phân tử.
▪ Eq: Năng lượng do sự quay của các phân tử chungquay trong trục nào
đó của nó.
Ở điều kiện bình thường, các phân tử tồn tại ở trạng thái bền vững, có mức
năng lượng thấp – trạng thái cơ bản Eo. Khi chiếu chùm bức xạ điện từ vào
môi trường vật chất sẽ xảy ra hiện tượng hấp thu hoặc bức xạ năng lượng. Khi
đó điện tử sẽ dịch chuyển lên trạng thái có năng lượng lớn hơn gọi là trạng
thái kích thích.
Như vậy khi xảy ra tương tác, năng lượng của phân tử sẽ thay đổi (ΔE≠0,
với ΔE=E2-E1).Nếu năng lượng phân tử thay đổi thì phân tử hấp thu (nếu
ΔE>0) hoặc bức xạ năng lượng (nếu ΔE<0). Mỗi phân tử chỉ hấp thu hay phát
xạ chọn lọc các bức xạ điện từ có tần số hay bước sóng nhất định. Là đây
chính là cơ sở của phương pháp quang phổ nói chung.
Các dạng chuyển dịch điện tử: , , ,

Hình 1.2 Các dạng chuyển mức điện tử

10

 Chuyển mức

Sự chuyển vị của electron trong liên kết σ của các hợp chấthữu cơ từ
orbital liên kết σ lên phản liên kết σ*.Sự chuyển vị này đòi hỏi năng lượng khá
lớn, vìvậy quá trình chuyển vị nằm trong vùng tử ngoại xa. Đó là vùng có
bước sóng ngắn, năng lượng lớn.
Chuyển mức n → σ*
Sự chuyển vị của các điện tử từ obital n lên cácorbital σ* trong các nguyên
tử như O, N, S. Chuyển mức này xảy ra ở vùng phổ tử ngoại gần có năng
lượng khônglớn. Sự dịch chuyển này dao động ở 180nm với alcol còn vớidẫn
xuất halogen của nó là 190nm. Đối với các aminlà 220nm. Cụ thể: Ete có
λmax= 190nm (ε =2000), Metanol có λmax= 183nm (ε =50), Etylamin có λmax=
210 nm (ε =800).
Chuyển mức n→ π*
Điện tử từ orbital không liên kết n lên orbital phản liênkết π*.Đây là quá
trình thường xảy ra trong phân tử có một nguyêntử chứa điện tử không liên kết
như ở những phân tử chứanhóm chức cacbonyl (C=O) và bước sóng hấp thu
270nm- 295nm. Bản chất của các dung môi có ảnh hưởng đến bước sónghấp
thu vì nó tác động đến liên kết trong phân tử.
Chuyển mức π→π*
Các hợp chất đồng phân với etylen chứa liên kết đôi trongphân tử có khả
năng hấp thu mạnh trong vùng bướcsóng 170nm. Vị trí hấp thu phụ thuộc vào
sự hiện diện của nhóm thế vídụ etylen có λmax= 165nm (ε =16000). Những
hợp chất không màu thường có phổ hấp thu trongvùng cận tử ngoại. Khi
chúng hấp thu bức xạ thì chúng sẽchuyển tới trạng thái thông qua cơ chế
chonhận điện tử.Lúc này điện tử từ orbital cho điện tử sẽ chuyển lênorbital
nhận điện tử tạo thành những ion hay có sự phâncực trong phân tử.

11

 Chuyển mứcd→d
Sự chuyển mức xảy ra ở các orbital d, nhất là ở các kimloại vùng chuyển
tiếp. Các phối tử có cặp điện tử tự do tham gia lai hóa vớinhững orbital này
chuyển điện tử vào các orbital này gâyra sự chuyển mức.Màu tạo ra của các
phức làm cho phức có khả năng hấpthu những bước sóng ở vùng khả kiến.
Những yếu tố ảnh hưởng đến sự chuyển mức: sự liên hợp, dung môi, pH...
▪ Ảnh hưởng của dung môi
Bước sóng hấp thu và cường độ hấp thu của các hợpchất chịu ảnh hưởng
của dung môi.Sự tác động của những dung môi khác nhau lên cácphân tử làm
thay đổi mức năng lượng giửa các trạng tháikích thích và cơ bản.Sự tác động
của dung môi lên phân tử làm sinh rachuyển dịch xanh và chuyển dịch đỏ.
✓ Chuyển dịch xanh
Là hiện tượng hấp thu bức xạ của các hợp chấthữu cơ có bước sóng
ngắn hơn trong những dungmôi có tính phân cực cao. Hiện tượng
này được tìm thấy ở quá trình chuyển dịch n→π* của nhóm
cacbonyl.Nguyên nhân là do sự làm bền trạng thái n củadung môi.
✓ Chuyển dịch đỏ
Là hiện tượng các hợp chất hữu cơ có xu hướnghấp thu những bức
xạ có bước sóng dài hơntrong những dung môi có độ phân cực cao
hơn. Hiện tượng được tìm thấy ở các phân tử hữu cơmà trong cấu
trúc phân tử của nó có sự liên hợp.Nguyên nhân của hiện tượng này
là do:
o Khi mạch C càng dài thì hiệu ứng liên hợp càng tăng, dẫn
tới độ lệch năng lượng giữa hai trạng thái giảm.
o Trong phân tử hữu cơ có hiệu ứng liên hợp càng dài thì
bước sóng hấp thu càng giảm.

12

 1.3.1. Phương pháp quang phổ UV – Vis

Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis hay còn gọi là phương
pháp trắc quang – so màu. Đây là phương pháp dựa trên hiện tượng hấp thụ
bức xạ UV-Vis của các phân tử.
Sự hấp thụ năng lượng điện tử trong vùng sóng ánh sáng tử ngoại gần
(190-400nm) và khả kiến (400-780nm) của các chất gây ra sự chuyển dịch của
các điện tử từ trạng thái cơ bản sang trạng thái kích thích. Biểu đồ biển diễn sự
tương quan giữa cường độ hấp thu theo bước sóng của một chất được gọi là
phổ UV-Vis của chất ấy trong điều liện xác định.

Hình 1.3 Sự hấp thu ánh sáng trong vùng khả kiến
Định lượng cấu tử bằng phương pháp quang phổ UV – Vis được dựa trên
cơ sở định luật Lambert – Beer.
▪ Khi chiếu bức xạ đơn sắc có cường độ ban đầu I0vào môi trường vật chất
thì cường độ tia sáng giảm còn lại I. Khi đó: I< I0do
✓ Bị hấp thubởi môi trường vật chất IA
✓ Bị phản xạ ở bề mặt cuvet IR
Do vậy, I0= I + IA+ IR= I + IA
IR ≈0 khi bề mặt cuvet nhẵn

13

 ▪ Cường độ hấp thu được biểu diễn thông qua A hoặc T. A, T phụ thuộc
vào bản chất của chất hòa tan, chiều dày d và nồng độ C của dung dịch.
✓ Với A = lg(Io/I) : độ hấp thu
✓ T = I/Io: độ truyền suốt
✓ A = - lgT
▪ Độ hấp thu A = εdC phụ thuộc vào ε: độ hấp thu của chất hấp thu, d:
đường kính cuvet, C: nồng độ chất hấp thu
▪ Khi đo ở λ xác định, εd = hằng số, A phụ thuộc vào C. Khi đó, quan hệ
giữa A và C tuyến tính: đây chính là cơ sở lý thuyết của phương pháp
quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis.
1.3.2. Cấu tạo thiết bị quang phổ UV – Vis
Bao gồm các bộ phận sau đây:
▪ Đèn nguồn
▪ Bộ phận tạo ánh sáng đơn sắc
▪ Cuvet và ngăn chứa cuvet
▪ Detector
▪ Bộ khuếch đại tín hiệu
▪ Bộ ghi nhận tín hiệu
1.3.3. Ứng dụng phương pháp quang phổ trong định lượng
Để sử dụng phương pháp quang phổ trong định lượng cấu tử cần chuyển
cấu tử cần phân tích về dạng hợp chất có khả năng hấp thu bức xạ điện từ
vùng UV-Vis. Lưu ý rằng hợp chất này phải nằm ở dạng hòa tan trong dung
dịch. Sau đó, tiến hành đo sự hấp thu bức xạ điện từ của hợp chất tạo thành để
tính toán hàm lượng chất cần xác định thông qua các phương pháp: phương
pháp trực tiếp, phương pháp so sánh, phương pháp đường chuẩn, phương pháp
thêm chuẩn. Sau đây chúng tôi xin giới thiệu phương pháp đường chuẩn trong
định lượng cấu tử.

14

 ▪ Bước đầu tiên, cần chuẩn bị dung dịch mẫu Cx và một loạt dung dịch
chuẩn có nồng độ tăng dần (thông thường là 5 nồng độ chuẩn: C1, C2,
C3, C4, C5). Loạt dung dịch chuẩn này phải nằm trong vùng tuyến tính
giữa độ hấp thu và nồng độ.
▪ Bước thứ 2, tạo phức màu và đo độ hấp thu của mẫu và dãy chuẩn trong
cùng điều kiệnAx và A1, A2, A3, A4, A5.
▪ Bước thứ 3, Xây dựng đường chuẩn của độ hấp thu theo nồng độ dung
dịch chuẩn. Và cuối cùng, từ phương trình đường chuẩn và độ hấp thu
của mẫu ta sẽ tính toán được nồng độ cấu tử (Cx) cần tìm trong mẫu.
Lưu ý
▪ Độ hấp thụ có tính cộng, tức là:
A123...n = A1 + A2 + A3 +... + An
▪ Nghĩa là, độ hấp thu của dung dịch bao gồm tổng độ hấp thu của chất
hấp thu và độ hấp thu của chất nền. Do đó, trước khi đo độ hấp thụ của
một dung dịch (ADD) thường dùng dung dịch nền (dung dịch có thành
phần giống dung dịch cần đo nhưng nồng độ cấu tử cần xác định bằng
không) để hiệu chỉnh máy sao cho độ hấp thu của dung dịch nền (ADD
nền) bằng không.

15

‎
‎

 2. PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU TRONG PHÂN TÍCH THỰC

PHẨM
2.1.MỤC ĐÍCH CỦA LẤY MẪU PHÂN TÍCH
2.1.1. Mục đích
Lấy mẫu sản phẩm nhằm mục đích thực hiện quá trình kiểm nghiệm thực
phẩm. Việc lấy mẫu đúng qui cách sẽ góp phần làm cho kết quả kiểm nghiệm
và xử lý kết quả sau này đúng đắn. Vì thực tế, chỉ một lượng mẫu rất nhỏ để
kiểm nghiệm mà kết quả lại được dùng để đánh giá một cách khách quan chất
lượng sản phẩm có khối lượng rất lớn.Vì lý do lấy mẫu đóng một vai trò rất
quan trọng nhất trong đánh giá chất lượng lô sản phẩmnên mẫu phải phản ánh
chính xác mọi đặc điểm chất lượng và phải đặc trưng cho thành phần trung
bình của lô sản phẩm.
Tùy thuộc vào đặc tính riêng biệt của lô sản phẩm mà có những quy định
cho việc lấy mẫu khác nhau. Không thể đưa ra những quy tắc cụ thể cố định
cho mọi tình huống mọi sản phẩm.
Việc áp dụng kỹ thuật lấy mẫu trong quá trình phân tích phản ảnh đúng hay
sai về thực tế chất lượng của sản phẩm mà mẫu đó đại diện, từ đó đưa ra
những quyết định ảnh hưởng đến quyền lợi của nhà cung cấp, doanh nghiệp
hoặc người tiêu dùng cũng như sức khỏe của cộng đồng.
Căn cứ để lập phương án kiển tra là chuẩn mực chấp nhận (cỡ mẫu, các
thông tin khác). Để xác định cỡ mẫu ta căn cứ vào: cỡ lô, mức độ phức tạp và
nguồn kinh phí, tầm quan trọng của sản phẩm, các thông tin khác và bậc kiểm
tra.
2.1.2. Một số khái niệm trong lấy mẫu
Lô hàng đồng nhất: lô hàng bao gồm những sản phẩm cùng tên gọi, cùng
loại về chất lượng, cùng khối lượng đựng trong bao bì cùng kiểu, được sản
xuất cùng một công nghệ, sản xuất trong cùng một thời gian (tuỳ theo sự thỏa

16

 thuận người có hàng và người kiểm nghiệm), do cùng một cơ sở sản xuất và
được xác nhận cùng một lần.
Đơn vị chỉ định lấy mẫu: đơn vị chứa trong lô hàng đồng nhất mà ta tiến
hành lấy mẫu ở đó.
Mẫu ban đầu: mẫu lấy ra từ một đơn vị chỉ định lấy mẫu, nó đại diện cho
sản phẩm trong đơn vị chứa đó.
Mẫu chung: tập hợp các mẫu ban đầu của lô hàng đồng nhất.
Mẫu thử trung bình: mẫu lấy ra từ một phần của mẫu chung sau khi đã trộn
đều. Mẫu này đại diện cho sản phẩm của lô hàng đồng nhất, nó được dùng để
kiểm nghiệm tất cả các chỉ tiêu chất lượng lô hàng.
Mẫu thử hoá học:mẫu lấy ra từ một phần của mẫu thử trung bình để tiến
hành kiểm nghiệm các chỉ tiêu hóa học của sản phẩm.
Mẫu thử cảm quan: mẫu lấy ra từ một phần của mẫu thử trung bình để tiến
hành kiểm nghiệm các chỉ tiêu cảm quan của sản phẩm.
2.1.3. Lấy mẫu và gửi mẫu
Những yêu cầu khi lấy mẫu cần phải thực hiện một số qui định sau đây:
▪ Mẫu thực phẩm phải có đủ tính chất đại diện cho cả lô hàng thực phẩm
đồng nhất.
▪ Trước khi lấy mẫu cần kiểm tra tính đồng nhất của lô hàng, xem xét các
giấy tờ kèm theo, đối chiếu nhãn trên bao bì, để riêng các sản phẩm có
bao bì không còn nguyên vẹn (rách, thủng, vỡ, mất nhãn...) phân chia số
còn lại thành lô hàng đồng nhất.
▪ Số đơn vị chỉ định lấy mẫu của từng lô hàng đồng nhất được qui định
như sau:
✓ Nếu lô hàng đồng nhất từ 1 đến 3 đơn vị chứa: số đơn vị chỉ định
lấy mẫu là tất cả các đơn vị chứa trong lô hàng.

17

 ✓ Nếu lô hàng đồng nhất từ 4 đơn vị chứa mẫu trở lên: số đơn vị chỉ
định lấy mẫu được tính theo công thức:
C=K n

Trong đó:
C là số đơn vị chỉ định lấy mẫu
n: số đơn vị chứa của lô hàng.
K: hệ số phụ thuộc vào dạng sản phẩm và đơn vị chứa trong lô
hàng (K ≤ 1)
K = 1 khi số đôn vị chứa trong lô hàng không quá lớn
K < 1 khi số đơn vị chứa trong lô hàng lớn.
Nếu số dư của phép khai căn lớn hơn phần khai căn thì C = K*n, + 1 (n, là
phần nguyên đã được khai căn)
▪ Khối lượng mẫu chung của các mặt hàng được qui định cụ thể theo từng
loại sản phẩm nhưng không được ít hơn mẫu thử trung bình qui định
như phần dưới đây.
▪ Khối lượng mẫu ban đầu bằng khối lượng mẫu chung chia cho số đơn
vị chỉ lấy mẫu.
Khi lấy mẫu ban đầu cần chú ý đến trạng thái, tính chất của sản phẩm. Phải
lấy ở nhiều vị trí khác nhau trong đơn vị chứa và trong lô hàng. Cụ thể như
sau:
Đối với sản phẩm ở thể rắn
▪ Cần chú ý sự không đồng đều về kích thước sản phẩm, cần phải lấy
cả sản phẩm có kích thước lớn và kích thước bé. Thường ta tiến hành
chia điểm để lấy mẫu tuỳ theo hình dạng của đơn vị chứa sản phẩm.
▪ Khi lấy mẫu ở thể rắn đựng trong toa xe, thùng xe (thùng có dạng
hình hộp chữ nhật) hay đổ thành đống hình nón, ta chia điểm lấy
mẫu như hình sau:

18

 Hình 2.1Những điểm lấy mẫu rắn khi mẫu ở dạng đống hay trên thùng
Đối với sản phẩm ở thể lỏng
▪ Nếu sản phẩm được chứa trong thùng, bể thì cầnphải khuấy đều,
dùng ống cao su sạch khô, cắm vào các điểm đã chia để hút lấy mẫu

Hình 2.2Những điểm lấy mẫu khi mẫu ở dạng lỏng

▪ Chia điểm khi lấy mẫu chất lỏng:
✓ Nếu lấy mẫu trên đường vận chuyển, thì thường ta lấy ở vòi chảy ra:
mở vòi cho chất lỏng chảy ra 5 phút rồi mới hứng để lấy mẫu. Khi lấy
củng phải lấy ở nhiều thời gian khác nhau.

19

 Hình 2.3Mô tả lấy mẫu trên đường ống

✓ Đối với sản phẩm vừa ở thể rắn vừa ở thể lỏng không đồng nhất thì
khi lấy mẫu, lấy ở các vị trí khác nhau nhưng phải lấy cả phần rắn, cả
phần lỏng theo đúng tỷ lệ của chúng trong sản phẩm.
✓ Đối với sản phẩm sệt đồng nhất, khuấy kỹ và lấy mẫu đều ở các vị trí
khác nhau.
✓ Đối với sản phẩm được đóng trong hộp, chai, lọ hoặc bao gói trong
túi... thì lấy mẫu ở trong bao gói.
Tập trung mẫu ban đầu lấy được từ các đơn vị chỉ định lấy mẫu cho vào
dụng cụ sạch, khô, trộn đều thành mẫu chung.
Mẫu thử trung bình được lấy tư mẫu chung. Khối lượng mẫu thử trung
bình được qui định riêng cho từng sản phẩm, nhưng phải đủ để tiến hành phân
tích các chỉ tiêu cần xác định (mỗi chỉ tiêu riêng biệt cần tiến hành 3 lần song
song) và mẫu lưu theo qui định phần dưới đây. Sau khi đã lấy xong mẫu trung
bình, lượng mẫu chung còn lại phải được trả lại lô hàng.
Chia mẫu thử trung bình làm 3 phần, tiến hành bao gói, bảo quản theo qui
định của từng loại sản phẩm, không được làm cho tính chất chỉ tiêu cần xác
định bị thay đổi. Trong đó:
▪ Hai phần mẫu được gởi ngay đến phòng thí nghiệm, kèm theo phiếu
ghi nội dung sau:

20

 ✓ Tên cơ quan chủ quản của đơn vị sản xuất

✓ Tên cơ sở sản xuất
✓ Tên và loại sản phẩm
✓ Số hiệu và khối lượng lô hàng
✓ Khối lượng mẫu gởi đến kiểm tra
✓ Ngày, tháng, năm lấy mẫu
✓ Lý do lấy mẫu
✓ Yêu cầu kiểm tra các chỉ tiêu gì
✓ Họ tên chức vụ người lấy mẫu
▪ Trong hai phần mẫu gởi tới kiểm nghiểm thì một phần dùng để kiểm
nghiệm còn một phần lưu lại phòng thí nghiệm.
▪ Phần mẫu thử còn lại được giữ tại cơ sở làm đối chứng khi có khiếu
nại.
▪ Thời gian lưu mẫu không được quá thời gian bảo hành qui định cho
từng loại sản phẩm.
Khi tiến hành lấy mẫu cần lưu ý:
▪ Dụng cụ đựng mẫu thử có thể là bao bì ban đầu của sản phẩm, hoặc
được đóng gói trong những dụng cụ không làm ảnh hưởng đến sản
phẩm, tốt nhất là trong những chai, lọ thuỷ tinh sạch có nút nhám.
▪ Trường hợp mẫu phải gởi đi xa để kiểm nghiệm hoặc có nghi vấn,
tranh chấp, phải đóng gói cẩn thận, phía ngoài dán niêm phong có
đóng dấu, hoặc kẹp dấu xi cẩn thẩn tránh trường hợp mẫu bị đánh tráo.
▪ Thực phẩm dể bị hư hỏng phải gởi mẫu gấp nhanh đến nơi kiểm
nghiệm trong thời gian thực phẩm còn tốt.
2.1.3.1.Nhận mẫu
Mẫu trung bình khi gởi tới phòng kiểm nghiệm cần tiến hành trình tự
những công việc sau:

21

 ▪ Kiểm tra xem bao bì có hợp lệ không.

▪ Kiểm tra lại phiếu gửi kiểm nghiệm, biên bản lấy mẫu, nhãn dán, xác
định loại thực phẩm...
▪ Xác định yêu cầu thực nghiệm.
▪ Ghi sổ nhận mẫu với những lời chỉ dẫn cần thiết.
▪ Tiến hành kiểm nghiệm. Trường hợp có nhiều mẫu hàng chưa kiểm
nghiệm được ngay một lúc thì phải bảo đảm điều kiện bảo quản để
thực phẩm không bị thay đổi cho đến khi nghiểm kiểm.
▪ Nếu mẫu không phù hợp phải lấy giấy tờ kèm theo hoặc bị mất dấu
niêm phong, mất bì... thì không được nhận mẫu để phân tích
▪ Chuẩn bị mẫu thử hóa học
▪ Mẫu thử là các hải sản tươi, khô, ướp màu tối phải loại bỏ các phần
không ăn được: đầu, vẩy, da, vỏ, nội tạng, xương, nhưng không rữa.
Sản phẩm ướp đông phải làm tan băng trong không khí ở nhiệt độ
trong phòng đến khi nhiệt độ của sản phẩm đạt 50C. Tuỳ theo kích
thước (khối lượng) của sản phẩm để tiến hành xử lý mẫu như sau:
✓ Sản phẩm có khối lượng nhỏ hơn 30 gam: xay nguyên con. Riêng
tôm phải bóc vỏ, bỏ đầu mới xay nguyên con.
✓ Sản phẩm có khối lượng từ 30 đến 500 gam, chỉ lấy phần thịt không
có xương, da.
✓ Sản phẩm có khối lượng trên 500 gam: sau khi mổ, loại bỏ nội tạng,
tách da, tách xương, chỉ lấy phần thịt một bên (bên phải hoặc bên
trái). Trong trường hợp phần thịt một bên có khối lượng lớn hơn 500
gam thì tiến hành cắt thành từng khía ngang thân có chiều dài 2 tới 4
cm và cứ lấy một khúc loại bỏ một khúc
▪ Mẫu là các loại mắm:

22

 ✓ Đối với mắm loại sệt có phần nước và phần cái đồng nhất (mắm
tôm, mắm ruốt, mắm chua) trước khi lấy mẫu phân tích hoá học
phải khuấy đều.
✓ Đối với các loại mắm mà phần cái và phần nước không đồng nhất
như cá muối phải lọc qua màng vải tách riêng cái và nước rồi xử
lý như sau:
o Phần nước: lọc kỹ qua giấy lọc vào bình tam giác có dung tích
250 ml sạch và khô, dùng ống hút lấy chính xác 10 ml dịch đã
lọc và chuyển vào bình định mức 250 ml, thêm nước cất đến
vạch mức, lắc đều: dung dịch dùng để phân tích những chỉ
tiêu hoá học và chỉ được sử dụng trong thời gian 4 giờ kể từ
khi pha loãng.
o Phần cái: nếu là phần cái của các sản phẩm muối mặn, xử lý
như sản phẩm là hải sản tươi, khô, ướp muối như đã nói ở
trên.
o Nếu phần cái là các dạng mắm khác: nghiền nhuyễn, trộn đều
và chia làm hai phần: một phần để xác định các chỉ tiêu hóa
học, phần còn lại dùng nước cất trích ly ra hai lần: lần 1 tỷ lệ
nước cất và cái tỷ lệ 1:1 (theo khối lượng), lần 2 tỷ lệ 0,5: 1.
Sau đó tập trung dịch lọc hai lần lại, đo thể tích rồi tiến hành
xác định thành phần hoá học của phần cái hoà tan trong nước.
✓ Đối với các loại mắm chế biến từ nguyên liệu thuỷ sản xử lý như
phần lỏng ở trên.
▪ Đối với đồ hộp thủy sản:
✓ Đối với đồ hộp có phần cái và nước riêng biệt: kiểm nghiệm phần
cái riêng, phần nước riêng.Phần cái được xử lý như ở phần
trước.Phần nước dùng để xác định hàm lượng những chất có khả

23

 năng trao đổi và hoà tan trong chất lỏng (xác định độ axit, kim
loại hòa tan, H2S...) nhưng thời gian xác định không được sớm
hơn 15 ngày kể từ ngày xuất xưởng.
✓ Đối với các loại đồ hộp đặc, ướp đông (có ít nước). Có thể gạn
phần nước (thường là rất ít) vào chén sứ. Phần cái được xử lý như
phần ở trên, sau đó lại cho phần nước vào và trộn đều cho đến khi
tất cả thành một khối đồng nhất.
✓ Các mẫu thử được chuẩn bị theo những phương pháp xử lý ở
trên, nhanh chóng được xay nhỏ hai lần qua máy xay thịt có sàng
với đường kính lỗ sàng từ 2 đến 3 mm. Trộn đều và lấy từ 150
đến 200 g cho vào lọ thủy tinh miệng rộng có nút mài.Có thể
dùng dao, kéo cắt mẫu thử và nghiền nhỏ trong cối sứ hoặc thủy
tinh.
✓ Mẫu thử sau khi chuẩn bị xong, trong điều kiện bình thường phải
tiến hành phân tích ngay trong vòng 4 giờ kể từ khi chuẩn bị mẫu
thử.
Chú ý:
▪ Nếu không kiểm nghiệm ngay được thì phải bảo quản mẫu ở nhiệt độ
thấp hoặc có sấy mẫu hoặc đun nóng khoảng một giờ để bảo quản (chỉ
áp dụng việc sấy mẫu hoặc đun nóng trong trường hợp xác định các
thành phần hóa học dưới tác dụng của nhiệt độ không làm thay đổi các
thành phần đó).
▪ Khi xác định độ ẩm của thực phẩm nếu nghiền mẫu quá nhiều thì
nước sẻ mất vì vậy khi thao tác phải thật nhanh, nghiền xong phải đem
đi xác định ngay. Dụng cụ để lấy mẫu và nghiền mẫu không được làm
thay đổi tính chất hóa học của mẫu.

24

‎
 Ngoài ra, có thể tham khảo các cách lấy mẫu cho từng sản phẩm thực phẩm
cụ thể sau :
▪ Lấy mẫu kẹo (theo TCVN 4067 :1985).
▪ Lấy mẫu đường (theo TCVN 4837 :1989).
▪ Lấy mẫu khoai tây (theo TCVN 4999 :1989).
▪ Lấy mẫu rau quả tươi (theo TCVN 5102 : 1990).
▪ Lấy mẫu rau quả chế biến (theo TCVN 5072 : 1990).
▪ Lấy mẫu gia vị (theo TCVN 4886 :1989; 4889 :1989).
▪ Lấy mẫu cà phê nhân (theo TCVN 5702 :1993).
▪ Lấy mẫu sản phẩm sữa (theo TCVN 5531 : 1991; 6266 : 1997;
6267 :1997; 6400 :1998).
▪ Lấy mẫu thịt và các sản phẩm thịt (theo TCVN 2833-1 :2002).
2.2.Phương pháp lấy mẫu
2.2.1. Phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên
Thường sử dụng khi lô hàng có số lượng nhỏ, được phân bố trong một
phạm vi hẹp như nhà kho. Mẫu được lấy ở những vị trí bất kỳ. Mỗi cá thể
trong lô hàng được chọn vào mẫu với cùng một xác suất bằng nhau.Nếu như
tổng số cá thể trong lô hàng là N, kích thước thước mẫu là n thì xác suất đó sẽ
bằng tỷ số giữa tổng số cá thể và kích thước mẫu. Để thực hiện lấy mẫu bằng
phương pháp này cần mã hóa các cá thể trong lô hàng bằng dãy số ngẫu nhiên.
Khi đó, cá thể được chọn theo sự ngẫu nhiên của con số.
Ưu điểm của phương pháp này là không cần nhiều thông tin về lô hàng, có
thể tính được sai số do chọn mẫuvà dễ dàng thực hiện các phương pháp thống
kê, kiểm định giả.
2.2.2. Phương pháp lấy mẫu phi ngẫu nhiên
Phương pháp chọn mẫu phi ngẫu nhiên hay còn gọi là chọn mẫu phi xác
suất (non-probability sampling methods). Với phương pháp này các đơn vị

25

 trong lô hàng không có khả năng bằng nhau để được chọn vào mẫu nghiên
cứu.
Phương pháp này được sử dụng khi đó, mỗi cá thể được lựa chọn vào một
theo một cách thuận tiên, sẵn có và dễ tiếp cận do nhanh và chi phí thấp. Được
sử dụng trong nghiên cứu khám phá, để xác định ý nghĩa thực tiễn hoặc để
khảo sát sơ bộ.

26

 3. CÁC KỸ THUẬT CHUẨN BỊ MẪU TRONG PHÂN TÍCH

THỰC PHẨM
Xử lý mẫu trong phân tích thực phẩm là khâu hết sức quan trọng, một
trong những yếu tố ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả phân tích.Tuỳ đối
tượng mẫu, tuỳ từng chỉ tiêu phân tích mà phải có cách xử lý khác nhau.
3.1.YÊU CẦU CHUNG CỦA CÁC KỸ THUẬT XỬ LÝ MẪU PHÂN TÍCH
3.1.1. Giới thiệu xử lý mẫu
Xử lý mẫu là quá trình hoà tan (dissolution) và phân huỷ (digestion), phá
huỷ cấu trúc mẫu ban đầu lấy từ đối tượng cần phân tích, để giải phóng và
chuyển các chất cần xác định về một dạng đồng thể phù hợp (ví dụ dạng dung
dịch) cho một phép đo đã chọn để xác định hàm lượng của chất mà chúng ta
mong muốn.
Ví dụ: Hòa tan mẫu hợp kim Al trong axit HNO3 45% để được dung dịch
xác định Al và các tạp kim loại trong hợp kim Al.
Xử lý mẫu có hai quá trình xảy ra đồng thời là:
▪ Pháhuỷ cấu trúc ban đầu của chất mẫu (digestion of sample Matrix).
▪ Hòa tan giải phóng chất cần xác định về dạng dung dịch đồng thể.
Quá trình xử lý thường được tiến hành tại phòng thí nghiệm trước khi thực
hiện kiểm nghiệm. Tuy nhiên, trong một số trườnghợp mẫu cần phải được xử
lý sơ bộ ngay trước khi mang mẫu về phòng thí nghiệm vì những mẫu này rất
dễ bị biến đổi khi lấy chúng ra khỏi lô hàng.
3.1.2. Tại sao phải xử lý mẫu phân tích
Để đưa các chất cần xác định về một trạng thái thích hợp với phép đo, theo
phương pháp phân tích đã chọn.
Các kết quả phân tích phải phản ánh và đại diện đúng cho đối tượng cần
nghiên cứu, theo dõi.

27

 Với bất kỳ một phương pháp xác định, mỗi chất phân tích chỉ có thể được
xác định chính xác khi nó tồn tại ở một trạng thái nhất định và đồng nhất phù
hợp với kỹ thuật phân tích.
Ví dụ: Để xác định các kim loại (ví dụ: Fe, Cu, Mn...) trong mẫu thịt,
chúng ta không thể bỏ ngay mẫu thịt vào máy quang phổ hấp thụ nguyên tử để
đo mà cần phải đưa các kim loại tồn tại trong mẫu về trạng thái ion hay hợp
chất tan được trong dung dịch nước, sau đó mới xác định được chúng trong
dung dịch này.
Mẫu phân tích có nhiều chủng loại, rất đa dạng, từ loại có thành phần đơn
giản đến loại có thành phần phức tạp. Chúng có thể tồn tại ở các trạng thái
khác nhau như rắn từng cục, từng mảnh, hay lỏng, khí, huyền phù nên không
thể cho nguyên mẫu như thế vào thiết bị phân tích để xác định được.

Các chất cần xác định tồn tại ở trạng thái liên kết hoá học khác nhau, trong
các hợp chất vô cơ, hữu cơ khác nhau, có khi rất bền vững, lượng chất ở mỗi
vị trí trong mẫu cũng không đồng đều, nên không thể xác định đúng hàm
lượng của nó trong một tổ hợp phức tạp, bền vững và bị các nguyên tố, các
chất liên kết khác cản trở.
Vì vậy muốn phân tích một đối tượng nào, chúng ta phải lấy mẫu, xử lý
phù hợp để có được một trạng thái hay một dung dịch mẫu phân tích xác định
các chất mong muốn.
Việc xử lý mẫu theo cách nào, là tuỳ thuộc vào:
▪ Đối tượng mẫu, matrix của mẫu.
▪ Bản chất, tính chất của các chất cần phân tích.
▪ Trạng thái tồn tại, cấu trúc vật lý, hoá học của các chất trong mẫu.
▪ Phương pháp phân tích được lựa chọn để xác định chúng.
▪ Hàm lượng của chất cần xác định ở mức nào trong mẫu.

28

 Trên cơ sở các yếu tố đó, chúng ta sẽ lựa chọn được biện pháp xử lý phù
hợp cho chất phân tích. Các kỹ thuật xử lý mẫu phân tích đã và đang được sử
dụng phổ biến hiện nay đó là:
▪ Kỹ thuật vô cơ hoá khô (xử lý khô),
▪ Kỹ thuật vô cơ hoá ướt (xử lý ướt),
▪ Kỹ thuật vô cơ hoá khô- ướt kết hợp,
▪ Các kỹ thuật trích ly (trích ly lỏng-lỏng, trích ly rắn-lỏng, trích ly rắn
– khí...)
3.2.KỸ THUẬT VÔ CƠ HÓA ƯỚT (XỬ LÝ ƯỚT)
3.2.1. Vô cơ hóa ướt bằng axit mạnh đặc nóng
3.2.1.1.Nguyên tắc và bản chất
Nguyên tắc chung
Dùng axit mạnh đặc và nóng (ví dụ HCl, H SO ), hay axit mạnh, đặc và
2 4

nóng có tính oxy hoá mạnh (HNO , HClO ), hoặc hỗn hợp 2 axit (HNO +
3 4 3

H SO ), hay 3 axit (HNO + H SO + HClO ), hoặc là 1 axit đặc và một chất

2 4 3 2 4 4

oxy hoá mạnh (H SO + KMnO ), v.v. để phân huỷ mẫu trong điều kiện đun
2 4 4

nóng trong bình Kendan, trong ống nghiệm, trong cốc hay trong lò vi sóng.
Lượng axit cần dùng để phân huỷ mẫu thường gấp 10 - 15 lần lượng mẫu,
tuỳ thuộc mỗi loại mẫu và cấu trúc vật lý hoá học của nó.
Thời gian phân huỷ mẫu (xử lý) trong các hệ hở, bình Kendan, ống
nghiệm, cốc... thường từ vài giờ đến hàng chục giờ, cũng tuỳ loại mẫu, bản
chất của các chất. Còn nếu trong lò vi sóng hệ kín thì chỉ cần 50 - 90 phút.
Các dung dịch axit dùng để hoà tan và xử lý mẫu
Khi xử lý ướt, người ta thường dùng các loại dung dịch axit đặc và có tính
oxy hoá mạnh, song tất nhiên chọn loại axit nào là tuỳ thuộc vào bản chất của

29

 chất nền (matrix) của mẫu và chất phân tích tồn tại trong mẫu đó. Chẳng hạn
như:
▪ Dùng 1 axit đặc: HCl, HF, H3PO4, H2SO4,
▪ Dùng 1 axit có tính oxy hoá: HNO3, H2SO4, HClO4,
▪ Hỗn hợp 2 axit: Cường thuỷ, (HCl+HNO3),(HNO3+H2SO4),
(HF+H2SO4)
▪ Hỗn hợp 3 axit: (HCl + HNO3 + H2SO4), ( HNO3 + H2SO4 +
HClO4)
▪ Hỗn hợp 1 axit và chất oxy hoá: (H2SO4+ KMnO4), (HNO3+H2O2)
▪ Hỗn hợp 2 axit và 1 chất oxy hoá mạnh: (HNO3+ H2SO4+ KMnO4)
▪ Dung dịch muối có pH nhất định: (KCl 1M, pH=5, NH4Ac 1M,
pH=6)
Nhiệt độ dung dịch phân huỷ mẫu
Nhiệt độ sôi của hỗn hợp mẫu khi xử lý mẫu phụ thuộc vào nhiệt độ sôi
của dung dịch axit dùng để phân huỷ mẫu. Khi cần nhiệt độ sôi cao thì phải
dùng dung dịch axit có nhiệt độ sôi cao (bảng 2.1). Trong hệ kín áp suất cao sẽ
tạo ra nhiệt độ sôi cao, tuỳ thuộc vào loại axit dùng để phân huỷ mẫu.
Tất nhiên khi dùng hỗn hợp, thì nhiệt độ sôi của dung dịch axit hỗn hợp sẽ
phụ thuộc vào thành phần của hỗn hợp axit ta dùng và nhiệt độ sôi của dung
dịch phân huỷ sẽ nằm giữa nhiệt độ sôi của hai axit được trộn với nhau. Vì thế
với các chất mẫu khó phân huỷ (khó xử lý) chúng ta phải dùng các axit và hỗn
hợp axit có nhiệt độ sôi cao và tính oxy hoá mạnh.

30

 Bảng 3.1Nhiệt độ sôi của các dung dịch axit đặc

Với axit đơn

Axit HCl HNO H SO H PO HClO HF

3 2 4 3 4 4

Nồng độ(%) 36 65 98 78 72 40
o
T(sôi) C 110 121 280 213 203 120
Với hỗn hợp axit
Thành phần (V/ o
Loại hỗn hợp của Nhiệt độ sôi C
V)
(HCl + HNO ) 3/1 116-118
3

(HNO + H SO ) 4/1 130-135

3 2 4

(HNO + H SO ) 3/2 150-155

3 2 4

(HNO + H SO + HclO ) 4/2/2 137-140

3 2 4 4

(HF+ H SO ) 2/1 130-150

2 4

(HNO + H SO + HF) 2/1/1 120-130

3 2 4

3.2.1.2.Các kỹ thuật vô cơ hóa ướt

Việc xử lý mẫu theo phương pháp ướt, có thể được thực hiện trong các
thiết bị và dụng cụ khác nhau.
a. Trong điều kiện thường
▪ Xử lý trong cốc thuỷ tinh, khi đun nóng trên bếp điện hay nồi cách
thuỷ.
▪ Xử lý trong bình Kendan thường khi đun nóng
▪ Xử lý trong bình Kendan có ống sinh hàn hồi lưu dung môi, v.v.

31

 b. Trong hộp kín: Mẫu để trong hộp kín, thêm dung dịch axit để phân huỷ
mẫu, đậy kín, sau đó thực hiện phân huỷ bằng cách:
▪ Sấy trong tủ sấy, trên bếp cát, hoặc trong lò nung ở nhiệt độ thích
hợp.
▪ Ngâm hay luộc hộp mẫu trong nồi nước sôi, hay trong dầu sôi, v.v.
c. Xử lý mẫu trong lò vi sóng (trong hệ kín và hở)
Trong các hệ lò vi sóng đơn giản và điều khiển bằng tay:
▪ Hệ bình mẫu hở,
▪ Hệ bình mẫu đóng kín (có áp suất cao),
Trong các hệ nhiều bình và hoạt động theo chương trình lập trình:
▪ Hệ bình mẫu hở có khống chế nhiệt độ.
▪ Hệ bình mẫu đóng kín (áp suất cao), có khống chế nhiệt độ, áp suất...
Hiện nay kỹ thuật xử lý ướt với axit đặc có tính oxy hoá mạnh trong bình
kendan và trong lò vi sóng hệ kín đang được dùng nhiều nhất.
3.2.1.3.Cơ chế và các tác nhân phân huỷ mẫu
❖ Cơ chế của sự phân huỷ mẫu
Trong điều kiện thường hệ hở, thì tác nhân phân huỷ mẫu là:
▪ Tác dụng phá huỷ và hoà tan mẫu của axit,
▪ Tác nhân năng lượng nhiệt, làm tan rã các hạt mẫu cùng với axit,
▪ Sự khuếch tán đối lưu, chuyển động nhiệt và va chạm của các hạt
mẫu với nhau làm chúng bị bào mòn dần.
Các tác nhân này tấn công và bào mòn dần các hạt mẫu từ ngoài vào, làm
cho các hạt mẫu bị mòn dần dần, bé dần rồi tan mất hết, khi chúng ta đun mẫu
trong bình Kendan hay trong cốc trong một thời gian nhất định.
Trong lò vi sóng:
Ngoài các tác nhân phân huỷ như trên, trong lò vi sóng còn có sự phá vỡ từ
trong lòng hạt mẫu ra ngoài, do các phân tử nước hấp thụ ( 90%) năng lượng

32

>‎

 vi sóng và nó có động năng rất lớn, nên chúng có chuyển động nhiệt rất mạnh,
làm căng và xé các hạt mẫu từ trong ra. Thêm vào đó lại là hệ kín, nên có áp
suất cao và sẽ làm nhiệt độ sôi lại cao hơn và đây là tác nhân phân huỷ mạnh
nhất, do đó thúc đẩy quá trình phân huỷ mẫu rất nhanh từ trong ra và từ ngoài
vào. Vì thế nên việc xử lý mẫu trong lò vi sóng chỉ cần thời gian ngắn (30 - 70
phút) mà lại triệt để.
❖ Các quá trình xảy ra khi phân huỷ mẫu
Dưới tác dụng của axit đặc và năng lượng nhiệt (nhiệt độ), cả năng lượng
vi sóng, các quá trình vật lý và hoá học sau đây sẽ xảy ra:
▪ Sự phá vỡ mạng lưới cấu trúc của hạt chất mẫu, giải phóng các chất
phân tích, để đưa chúng vào dung dịch dưới dạng các muối tan.
▪ Quá trình oxy hoá khử làm thay đổi hoá trị, chuyển đổi dạng, làm tan
vỡ các hạt vật chất mẫu, để giải phóng chất phân tích về dạng muối
tan.
▪ Nếu xử lý mẫu hữu cơ phân tích kim loại, thì có sự đốt cháy, phá huỷ
các hợp chất hữu cơ và mùn tạo ra khí CO2 và nước, để giải phóng
các kim loại trong chất mẫu hữu cơ về dạng muối vô cơ tan trong
dung dịch.
▪ Tạo ra hợp chất dễ bay hơi, làm mất đi các anion trong phân tử chất
mẫu, làm mẫu bị phân huỷ tạo ra các hợp chất tan trong dung dịch.
▪ Sự tạo thành các hợp chất hay muối phức tan trong dung dịch.
▪ Có thể tách chất phân tích ra khỏi mẫu ban đầu ở dạng kết tủa không
tan và nhờ đó người ta tách được các chất phân tích và làm giàu
chúng.
Như vậy, trong quá trình xử lý mẫu ở đây cũng có thể có các phản ứng hoá
học xảy ra như phản ứng oxy hoá khử, phản ứng thuỷ phân, phản ứng tạo
phức, phản ứng hoà tan, phản ứng kết tủa, v.v. của các phần tử chất mẫu với

33

 các axit dùng để phân huỷ mẫu và các chất có trong mẫu với nhau. Trong đó
quá trình nào là chính hay phụ là do thành phần, chất nền, bản chất của chất
mẫu và các loại axit dùng để phân huỷ và hoà tan mẫu quyết định.
❖ Ví dụ về kỹ thuật xử lý ướt
Xử lý mẫu rau quả bằng hỗn hợp 2 axit (HNO + H O trong bình
3 2 2

Kendanđể xác định hàm lượng các kim loại nặng (Cd, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb,
Zn). Quá trình được thực hiện như sau:
▪ Lấy 5.00 g mẫu đã nghiền mịn và trộn đều vào bình Kendan
▪ Bổ sung thêm 60 mL HNO3 65%, 5 mL H2O2 30%

▪ Cắm phễu nhỏ vào bình kendan, lắc đều và đun sôi nhẹ cho mẫu
phân huỷ, đến khi được dung dịch trong không màu (6-8 giờ tuỳ loại
mẫu).
▪ Chuyển mẫu sang cốc 250 mL, làm bay hơi hết axit bằng đèn IR đến
còn muối ẩm, để nguội, định mức bằng dung dịch HCl 2% thành 25
mL.
▪ Trong quá trình xử lý, các nguyên tố kim loại ở dạng các hợp chất cơ
kim của mẫu rau quả, sẽ bị axit đặc oxy hoá đưa các kim loại về các
muối vô cơ tan trong dung dịch nước theo phương trình tổng quát
như sau:
(Mẫu) + HNO + H O → Me (NO ) + H O + CO + NO
3 2 2 n 3 m 2 2 2

(muối tan của kim loại )

3.2.1.4.Ưu nhược điểm và ứng dụng
❖ Ưu và nhược điểm:
▪ Hầu như không bị tổn thất các chất phân tích, nhất là trong lò vi
sóng,

34

 ▪ Nhưng thời gian phân huỷ mẫu rất dài khi xử lýở điều kiện thường –
hệ hở,
▪ Tốn nhiều axit đặc tinh khiết cao, nhất là trong các hệ hở,
▪ Dễ bị nhiễm bẩn khi xử lý trong hệ hở, do môi trường hay axit dùng,
▪ Phải đuổi axit dư khi kết thúc quá trình xử lý nên dễ làm nhiễm bẩn,
bụi vào mẫu, v.v.
❖ Ứng dụng:
Ứng dụng chủ yếu của kỹ thuật xử lý ướt này là để xử lý mẫu xác định các
- - - 3- 2-
kim loại và một số phi kim hay anion vô cơ, như Cl . Br , I , AsO , SO ,
4 4

3- 2
PO , SiO … trong các mẫu sinh học, mẫu hữu cơ, mẫu vô cơ, mẫu môi
4 3

trường, mẫu đất, mẫu nước, mẫu bụi không khí, mẫu kim loại, hợp kim, rau
quả và thực phẩm, v.v.
3.2.2. Kỹ thuật vô cơ hóa ướt bằng dung dịch kiềm mạnh đặc nóng
3.2.2.1.Nguyên tắc chung
Trong kỹ thuật này này, người ta thường dùng các dung dịch kiềm mạnh,
đặc nóng (như NaOH, KOH 15 - 20%), hay hỗn hợp của kiềm mạnh và muối
kim loại kiềm (như NaOH + NaHCO ), hay một kiềm mạnh và peroxit (như
3

KOH + Na O ), nồng độ lớn (10 - 20%), để phân huỷ mẫu phân tích trong
2 2

điều kiện đun nóng trong bình Kendan hay trong hộp kín, hoặc trong lò vi
sóng.
Những thông số của quá trình:
▪ Lượng dung dịch: cần lượng lớn từ 8-15 lần lượng mẫu.
▪ Thời gian phân huỷ: từ 4 - 10 giờ trong hệ hở.
▪ Còn trong hệ lò vi sóng kín chỉ cần thời gian 1 - 2 giờ.

35

 ▪ Nhiệt độ phân huỷ: nhiệt độ sôi của dung dịch kiềm. Nó thường
trong vùng 150 – 2000C.
❖ Các quá trình xảy ra khi phân huỷ mẫu
Dưới tác dụng của kiềm và nhiệt độ, cả năng lượng vi sóng, có thể xảy ra
các quá trình sau:
▪ Phá vỡ cấu trúc của chất mẫu, chuyển các chất của mẫu vào dung
dịch
▪ Các chất của mẫu tương tác với kiềm tạo ra các sản phẩm tan được
▪ Có thể sinh ra các khí bay ra, giúp sự tan của mẫu tốt hơn
▪ Có thể tạo ra các hợp chất bền ít phân li và tan trong dung dịch
▪ Tạo ra các sản phẩm kết tủa muối khác của chất phân tích để tách nó
ra khỏi mẫu ban đầu.
❖ Các cách hoà tan và dung dịch hoà tan
Chất phân huỷ: Theo kỹ thuật xử lý ướt này chúng ta có thể dùng các
dung dịch của các chất sau đây để xử lý mẫu:
▪ Dung dịch kiềm đặc (20 - 25 % NaOH, hay KOH),
▪ Dung dịch kiềm đặc nóng có chất oxy hoá mạnh (NaOH + Na2O2),

▪ Hỗn hợp kiềm đặc nóng có chất khử (KOH + NaHSO3),

▪ Hỗn hợp kiềm mạnh và muối (NaOH + NaHCO3), (KOH +

Na CO ),
2 3

▪ Hỗn hợp kiềm, muối và peroxit (KOH + NaHCO3+ H2O2),

▪ Hỗn hợp kiềm, muối và peroxit kiềm (KOH + NaHCO3+ Na2O2)…

Quá trình phân huỷ

36

 ▪ Quá trình phân huỷ được thực hiện khi đun sôi dung dịch mẫu, trong
một thời gian nhất định trong bình Kendan hay trong ống nghiệm,
thường là từ 6 -10 giờ trong bình kenđan hở, trong lò vi sóng hệ kín
(có áp suất cao) thì chỉ mất khoảng 40 - 70 phút, tuỳ loại mẫu.
▪ Cơ chế phá vỡ (phân huỷ) mẫu theo cách này cũng tương tự như
trong trường hợp dùng các axit ở trên, trong hệ hở hay hệ kín, nhưng
ở đây tác nhân phân huỷ là dung dịch kiềm mạnh nóng.
Nhiệt độ phân huỷ
Nhiệt độ sôi của các dung dịch kiềm là tuỳ thuộc vào thành phần và nồng
độ của dung dịch kiềm ta sử dụng để xử lý mẫu. Nói chung trong vùng từ 115
o
– 230 C, tuỳ thuộc nồng độ của kiềm và muối có trong dung dịch phân huỷ
mẫu và đây là một yếu tố thúc đẩy sự phân huỷ xảy ra nhanh hơn. Nghĩa là tác
nhân phân huỷ mẫu ở đây là kiềm và nhiệt độ (năng lượng nhiệt) và năng
lượng vi sóng, nếu dùng lò vi sóng.
Ví dụ ứng dụng kỹ thuật vô cơ hóa ướt bằng kiềm đặc nóng: Hoà tan oxit
nhôm bằng dung dịch NaOH 10% nóng: Lấy 0,5g mẫu dạng bột vào bình
Kendan, tẩm ướt bằng vài giọt nước cất, thêm 10 mL NaOH 10%, đun sôi để
hoà tan mẫu.
Cơ chế ở đây là chuyển trạng thái tinh thể rắn oxit sang ion tan trong dung
dịch là muối NaAlO và khí hydro theo phản ứng:
2

Al O + NaOH → H + NaAlO + H O
2 3 2 2 2

3.2.2.2.Ưu nhược điểm và phạm vi ứng dụng

Ưu nhược điểm
Kỹ thuật xử lý ướt bằng dung dịch kiềm đặc nóng cũng có ưu điểm là hầu
như không làm mất các chất phân tích, nhất là các nguyên tố có hợp chất dễ
bay hơi và các nguyên tố và các matrix của mẫu dễ tan trong kiềm.

37

‎
 Nhưng kỹ thuật này có một nhược điểm lớn là tốn rất nhiều kiềm tinh khiết
cao, thường phải dùng gấp từ 10 – 15 lượng mẫu, khả năng gây nhiễm bẩn dễ
xảy ra. Lượng kiềm dư nhiều, sau khi xử lý xong thường phải loại hết, nhưng
rất khó, chỉ bằng cách trung hoà bằng axit, song lại làm loãng mẫu và dễ dàng
nhiễm bẩn, mất thời gian cô đặc mẫu. Đây là một công việc rất khó khăn và
mất nhiều thì giờ và cũng hay làm nhiễm bẩn mẫu. Vì thế kỹ thuật này chỉ
được dùng cho một số trường hợp, mà cách xử lý bằng axit không đem lại
hiệu quả.
Ví dụ phân huỷ mẫu xác định một số anion vô cơ, phi kim hay á kim, như
1- 1- 1- 2- 3-
các chất: Cl , Br , NO , SO , PO … trong các đối tượng mẫu sinh học và
3 4 4

một số mẫu thực phẩm không xử lý được bằng phương pháp axit.
Phạm vi áp dụng: Kỹ thuậtnày thích hợp cho:
▪ Các hợp chất hay các mẫu tan tốt trong kiềm.
▪ Phân huỷ các chất hữu cơ để lấy các phi kim.
3.3.KỸ VÔ CƠ HÓA KHÔ
3.3.1. Nguyên tắc và các quá trình xảy ra khi vô cơ hóa mẫu
3.3.1.1.Nguyên tắc
Kỹ thuật xử lý khô (vô cơ hóa khô) là kỹ thuật nung để xử lý mẫu trong lò
o
nung ở một nhiệt độ thích hợp (450 - 750 C), song thực chất đây chỉ là bước
đầu tiên của quá trình xử lý mẫu. Vì sau khi nung, mẫu bã còn lại phải được
hoà tan (xử lý tiếp) bằng dung dịch muối hay dung dịch axit phù hợp, thì mới
chuyển được các chất cần phân tích trong tro mẫu vào dạng dung dịch, để sau
đó xác định nó theo một phương pháp đã chọn. Khi nung các chất hữu cơ của
mẫu sẽ bị đốt cháy thành các hợp chất vô cơ.
❖ Nhiệt độ nung

38

 o
Nhiệt độ nung xử lý mẫu thường trong vùng 450 - 750 C, tuỳ thuộc vào
mẫu (chất nền và cấu trúc của nó) và các chất cần phân tích và đó là yếu tố
quyết định. Nhưng phải đảm bảo đốt cháy được hết các chất hữu cơ và không
làm mất chất phân tích. Ví dụ khi nung xử lý các mẫu rau quả và thực phẩm ở
o
nhiệt độ từ 500 – 550 C, để xác định các kim loại nặng, các kim loại kiềm và
kiềm thổ. Song nếu không có chất phụ gia bảo vệ thì thường các nguyên tố
Cd, Pb, Zn... có thể bị mất từ 10 - 15% mà chúng ta không khống chế được.
Nhiệt độ nung thường phụ thuộc vào:
▪ Bản chất của chất mẫu và chất phân tích,
▪ Cấu trúc, dạng liên kết, loại hợp của các chất trong mẫu,
❖ Thời gian nung: Có thể từ 5 – 12 giờ, tuỳ thuộc vào:
▪ Mỗi loại chất mẫu
▪ Mỗi chất phân tích
▪ Cấu trúc, dạng liên kết, loại hợp của các chất trong mẫu

❖ Các loại chất phụ trợ (phụ gia)

Kỹ thuật tro hoá khô thường được dùng cho các mẫu hữu cơ, xử lý để xác
định các kim loại, và các mẫu quặng vô cơ có cấu trúc bền vững rất khó tan
trong các axit mạnh. Việc tro hoá cũng có thể được thực hiện khi có thêm chất
phụ gia, chất bảo vệ hay chất chảy. Các chất bảo vệ và chất chảy thường hay
được dùng là:

▪ Các axit: HNO3, H2SO4, H3PO4,

▪ Một số muối: KNO3, Ca(NO3)2, Mg(NO3)2, LiBO2, Na2B4O7,

▪ Hỗn hợp axit và muối: (Mg(NO3)2+ HNO3), (HNO3 + H2SO4),

39

‎
‎

 ▪ Hỗn hợp kiềm và muối: (KOH + NaHCO3), (KOH + Na2SO4),

▪ Hỗn hợp muối và peroxit: (KHCO3 + Na2O2), (NaHCO3 +

Na O ),
2 2

▪ Hỗn hợp kiềm mạnh và peroxit: (NaOH + Na2O2), (KOH +

Na O ).
2 2

▪ Hỗn hợp kiềm, muối và chất oxyhóa (KOH + NaHCO3+ Na2O2).

▪ Hỗn hợp kiềm và muối pyrosnphat (KOH + Na2S4O7), v.v.

Các chất phụ gia này có hai tác dụng:

▪ Bảo vệ các chất phân tích không bị mất
▪ Góp phần làm cho mẫu được phân huỷ nhanh và triệt để hơn
3.3.1.2.Những quá trình xảy ra khi xử lý
Trong quá trình nung xử lý mẫu có thể có nhiều quá trình vật lý và hoá học
xảy ra, tuỳ theo bản chất, thành phần của mỗi loại mẫu và chất phụ gia được
thêm vào, đó là các quá trình:
▪ Trước tiên làm bay hơi mất nước hấp thụ và nước kết tính trong
chất mẫu,
▪ Sự tro hoá, đốt cháy các chất mùn và các chất hữu cơ của mẫu,
▪ Phá vỡ cấu trúc ban đầu của chất mẫu,
▪ Chuyển dạng các hợp chất phức tạp của chất mẫu về dạng đơn giản
hơn,
▪ Quá trình oxy hoá khử thay đổi hoá trị của nguyên tố trong các chất
mẫu,

▪ Giải phóng ra một số khí, như CO, CO2, SO2,..

40

 ▪ Có một số tương tác hoá học của các chất với nhau, tương tác với
chất phụ gia thêm vào tạo ra các chất lúc đầu không có.
Tất cả các quá trình đó đều góp phần làm tan vỡ cấu trúc ban đầu của các
hạt mẫu tạo ra tro bã mẫu, để sau đó hoà tan chất phân tích vào dung dịch axit.
Đó là những quá trình có thể xảy ra, tất nhiên là đa dạng và phức tạp, nó xảy
ra như thế nào là tuỳ thuộc vào các yếu tố sau đây:
▪ Thành phần, chất nền và trạng thái liên kết của chất mẫu và chất
phân tích,
▪ Các chất phụ gia, chất chẩy và chất bảo vệ thêm vào mẫu,
▪ Các điều kiện nung, trong đó nhiệt độ là yếu tố chính, sau đó là môi
trường nung là không khí, hay trong khí trơ (Ar, N , He,..).
2

3.3.2. Thiết bị và dụng cụ để xử lý khô

Các thiết bị để xử lý mẫu theo phương pháp khô thường không có nhiều.
Thông thường mẫu được cho vào chén hay bát nung (thạch anh, sứ, Ni, Fe,
hay Pt, hoặc Au, hay W,..) có dung tích khác nhau (từ 30 - 200 mL). Sau đó
được nung tại nhiệt độ phù hợp trong lò nung.
Dụng cụ chứa đựng mẫu để nung:
▪ Các loại chén nung thạch anh, sứ, graphit, platin, vàng, zirconi, v.v.
▪ Các loại bát nung thạch anh, sứ, kim loại (platin, vàng, zirconi), v.v.
▪ Các loại chén và bát Teflon chịu nhiệt.
Thiết bị để nung mẫu có hai loại chính:
▪ Thiết bị thông thường: Tủ sấy và lò nung các loại.
▪ Thiết bị hiện đại: Các loại lò vi sóng và lò cao tần, v.v.

41

 Bảng 2.2 Các quá trình trong xử lý khô trong lò nung

Loại mẫu Phụ gia Nhiệt độ Sản phẩm sau khi nung

Đất sét KOH+Na O 550-650 Na SiO +K SiO +H O

2 2 2 3 2 3 2

Quặng Silicat KOH+Na O 500-600 Na SiO +K SiO +H O+MeX

2 2 2 3 2 3 2

Quặng Ferrit 550-600 FeO+Fe O +SO +H O

2 3 2 2

Quặng CuS 550-600 CuO+SO +H O + Me X

2 2 n m

Dolomit 550-650 CaO+MgO+H O+CO + Me X

2 2 n m

LnCO FxH O 550-650 Ln O +CO +HF+H O +Me X

3 2 2 3 2 2 n m

Nhựa đường 550-650 Me O +CO +SO +H O+Me X

x y 2 2 2 n m

Thực phẩm KNO +HNO 500-550 Me O +CO +H O+ K X +NO

3 3 x y 2 2 x y

Rau quả KNO +HNO 500-550 Me O +CO +H O+ K X +NO

3 3 x y 2 2 x y

Rau quả 500-550 Me O +CO +H O+Me X

x y 2 2 n m

Chất hữu cơ 500-600 Me O + CO + H O + (NO )

x y 2 2 x

3.3.3. Vô cơ hoá khô không có phụ gia và chất bảo vệ

Nung để xử lý mẫu không có phụ gia và chất bảo vệ là quá trình xử lý mẫu
sơ bộ nhờ tác dụng của năng lượng nhiệt thích hợp trong một thời gian nhất
định, để phá vỡ cấu trúc tinh thể dạng ban đầu của mẫu phân tích, đốt cháy
chất hữu cơ, chuyển nó sang dạng các hợp chất khác đơn giản, dễ hoà tan tiếp
bằng dung dịch axit hay bằng dung dịch kiềm nhằm đưa chất phân tích vào
dung dịch, sau đó có thể xác định được chúng theo một phương pháp nhất
định.

Chẳng hạn: Tro hoá khô mẫu rau quả để xác định các kim loại (Na, K,

42

 Ca, Mg, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb, Zn).
Cân lấy 5 g, mẫu đã nghiền mịn vào trong chén thạch anh, đem sấy từ từ
o
cho đến khi mẫu khô đen, rồi đem nung 3 giờ đầu ở nhiệt độ 450 C, sau đó
o
nâng lên 550 C, cho đến khi mẫu hết than đen, sẽ được tro mẫu trắng. Hoà tan
tro thu được trong 12 - 15 mL dung dịch HCl 18% và 0.5 mL HNO 65%, đun
3

nhẹ cho tan hết, đuổi hết axit dư đến còn muối ẩm và định mức thành 25 mL
bằng dung dịch HCl 2%. Các nguyên tố Cd, Cu, Pb, Zn sẽ bị mất một ít (10 -
15%) khi nung. Phương pháp này thích hợp để xác định các kim loại nhóm I,
II và Fe, Mn, Ni.
Theo cách này, thông thường một số nguyên tố trong mẫu sẽ có thể bị mất
khi nung, như Cd (10 - 15%), Cu (7 - 12%), Pb (15 - 20%)... Và hàm lượng bị
mất đi này lại không kiểm soát và không khống chế được trong quá trình
nung. Sự mất này càng nhiều khi nung mẫu ở nhiệt độ càng cao, hay thời gian
o
nung càng lâu. Như ví dụ 1 ở trên, nếu nung mẫu ở nhiệt độ 550 C, Cd, và Pb
o
sẽ mất từ 2 - 10%, khi ở 600 C, thì Cd và Pb sẽ mất đến 18 - 20%... Đó là vấn
đề cần phải chú ý.
3.3.4. Vô cơ hoá khô có phụ gia và chất bảo vệ
Tro hoá khô có phụ gia và chất bảo vệ cũng là quá trình xử lý mẫu sơ bộ
o
nhờ tác dụng của nhiệt độ thích hợp (500 - 600 C ), có thêm tương tác hỗ trợ
của chất phụ gia để hạn chế sự mất một số nguyên tố như cách nung không
phụ gia ở trên. Các chất phụ gia thường là các chất chảy, muối kiềm, axit đặc
để phá vỡ cấu trúc tinh thể dạng ban đầu của mẫu phân tích, để chuyển nó
sang một dạng khác dễ hoà tan tiếp bằng axit.

43

‎
‎

‎
‎
 Khi có chất chảy và chất phụ gia nhiệt độ nung thường thấp hơn khi không
có chất chảy, thời gian ngắn hơn, song lại triệt để hơn, mà lại không mất chất
phân tích. Nhất là các mẫu có cấu trúc bền, chịu nhiệt, hay mẫu matrix hữu cơ,
thì tác dụng của chất bảo vệ là rất quan trọng. Như hai ví dụ trên, nhưng khi
xử lý có chất bảo vệ, thì không bị mất một số nguyên tố phân tích đã nêu.

Ứng dụng tro hoá mẫu sữa để xác định các kim loại (Na, K, Ca, Mg,
Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb, Zn) như sau:
Lấy 5 gam mẫu vào chén thạch anh, thêm chất phụ gia (8 mL H SO 45%
2 4

và 2g KNO (hay 2 g LiBO ), trộn đều, sấy khô cẩn thận cho mẫu khô và
3 3

o
thành than đen, sau đó đem nung 3 giờ đầu ở nhiệt độ 400 - 450 C, rồi sau đó
o
ở 550 C, đến khi hết than đen, được tro mẫu trắng. Sau đó hoà tan tro thu
được trong 15 mL dung dịch HCl 18% và 1 mL HNO 65%, đun nhẹ cho mẫu
3

tan hết, đun nhẹ làm bay hơi axit đến còn muối ẩm, định mức thành 25 mL
bằng dung dịch axit HCl 2%. Đó là dung dịch để xác định các nguyên tố kim
loại nói trên.
3.3.5. Ưu nhược điểm
▪ Thao tác và cách làm đơn giản,
▪ Không phải dùng nhiều axit đặc tinh khiết cao đắt tiền
▪ Xử lý được triệt để, nhất là các mẫu nền hữu cơ.
▪ Đốt cháy hết các chất hữu cơ, vì thế làm dung dịch mẫu thu được sạch
▪ Nhưng có nhược điểm là có thể mất một số chất dễ bay hơi, ví dụ như
Cd, Pb, Zn, Sn, Sb, v.v. nếu không có chất phụ gia và chất bảo vệ.

44
‎

 3.4.KỸ THUẬT VÔ CƠ HOÁ KHÔ - ƯỚT KẾT HỢP

3.4.1. Nguyên tắc chung
Nguyên tắc của kỹ thuật này là mẫu được phân huỷ trong chén hay cốc
nung. Trước tiên người ta thực hiện xử lý ướt bằng một lượng nhỏ axit, và
chất phụ gia, để phá vỡ sơ bộ cấu trúc ban đầu của các hợp chất mẫu và tạo
điều kiện giữ một số nguyên tố có thể bay hơi khi nung. Sau đó mới nung ở
nhiệt độ thích hợp. Vì thế lượng axit dùng để xử lý thường chỉ bằng 1/4 hay
1/5 lượng cần dùng cho xử lý ướt. Sau đó nung sẽ nhanh hơn và quá trình xử
lý sẽ triệt để hơn xử lý ướt, đồng thời lại hạn chế được sự mất của một số kim
loại khi nung. Do đó đã tận dụng được ưu điểm của cả hai kỹ thuật xử lý ướt
và xử lý khô, nhất là giảm bớt được các hoá chất (axit hay kiềm tinh khiết cao)
khi xử lý ướt, sau đó hoà tan tro mẫu sẽ thu được dung dịch mẫu trong, vì
không còn chất hữu cơ và sạch hơn tro hoá ướt bình thường.
Các quá trình vật lý và hoá học xảy ra khi xử lí là tương tự như trong xử lí
ướt và khô đã nêu ở trên, song ở đây là sự kết hợp cả hai kế tiếp nhau. Trong
đó xử lý ướt ban đầu là để bảo vệ một số nguyên tố cho xử lí khô tiếp theo
không bị mất. Kỹ thuật này thích hợp với các mẫu có nền (matrix) là chất hữu
cơ, như rau quả, thực phẩm... xử lí để xác định các kim loại và một số phi kim.
Những phòng thí nghiệm không có thiết bị lò vi sóng, thì đây là một cách tốt
cho việc xử lý mẫu xác định các kim loại nặng trong các đối tượng mẫu sinh
học, mẫu môi trường và quặng đất đá.
3.4.2. Phương pháp tiến hành và một số ví dụ
Để sử dụng phương pháp này, trước tiên xử lý ướt sơ bộ, sau đó mới nung,
nên tính chất và sự diễn biến của nó cũng tương tự như trong hai kỹ thuật đã
nói ở trên. Chỉ có khác là sau khi xử lý mẫu không phải đuổi lượng axit dư
quá nhiều như trong xử lý ướt. Sau đây là vài ví dụ.

45

 ❖ Ví dụ 1: Xử lý mẫu rau quả để xác định các kim loại (Na, K, Ca, Cd,
Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb, Zn)
Lấy 5.000 g mẫu đã nghiền mịn vào chén nung, thêm 5 mL HNO 45% và
3

5 mL Mg(NO ) 5%, trộn đều, rồi sấy, hay đun nhẹ trên bếp điện cho mẫu sôi
3 2

o
và đến khi khô thành than đen dòn. Sau đó đem nung lúc đầu ở 400 - 450 C
o
trong 3 giờ, rồi nâng lên 550 C, đến hết than đen. Hoà tan tro thu được trong
20 mL dung dịch HCl 1/1 và có thêm 1 mL HNO 65%, đun nóng cho tan
3

hoàn toàn, làm bay hơi hết axit dư đến còn muối ẩm, định mức bằng dung dịch
HCl 2% thành 25 mL. Đây là dung dịch để xác định các nguyên tố đã nói trên
(Na, K, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb, Zn).
❖ Ví dụ 2: Xử lý mẫu sữa để xác định các kim loại (Na, K, Ca, Mg, Cd,
Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb, Zn)
Lấy 5.000 g mẫu vào chén nung, thêm 5 mL HNO 45%, 2 mL H SO 98%
3 2 4

và 5 mL Mg(NO ) 5% (hay KNO ), trộn đều, để xử lý ướt sơ bộ sấy mẫu trên

3 2 3

bếp điện hay trong tủ sấy cho đến khi khô và thành than đen dòn. Sau đó nung
o o
ở 400 - 450 C trong 3 giờ, tiếp đó ở 550 C cho mẫu tro hoá đến khi thấy bã
không còn đen. Hoà tan tro thu được trong 18 mL HCl 1/1và có thêm 1.0 mL
HNO 65%, đun nóng cho mẫu tan hoàn toàn, đuổi hết axit dư đến còn muối
3

ẩm, và định mức thành 25 mL bằng axit HCl 2%. Đây là dung dịch mẫu để
xác định các kim loại bằng các phương pháp UV-VIS, hay AAS, hay ICP-
OES, hoặc ICP-MS.
❖ Ví dụ 3: Xử lý mẫu tôm, cua, cá... để xác định các kim loại (Na, K, Ca,
Mg, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb, Zn).

46
‎

‎
‎
‎

‎
 Lấy 5.00 gam mẫu vào chén thạch anh, thêm 8 mL H SO 75% và 3 mL
2 4

Mg(NO ) 5% , trộn đều, để xử lý ướt sơ bộ, ta sấy hay đun trên bếp điện cho
3 2

mẫu sôi nhẹ và đun từ từ cho đến khô và thành than đen. Sau đó đem nung 3
o o
giờ đầu ở 400 - 450 C, và nung tiếp ở 550 C cho mẫu tro hoá đến được bã
không còn đen. Hoà tan tro thu được trong 18 mL HCl 1/1 và có thêm 1 mL
HNO 65%, đun nóng cho mẫu tan hết, làm bay hơi hết axit dư đến còn muối
3

ẩm, định mức thành 25 mL bằng HCl 2%. Đây là dung dịch mẫu để xác định
các kim loại nói trên bằng các phương pháp phổ UV-VIS, hay phổ AES, AAS
hoặc ICP-OES.
3.4.3. Ưu nhược điểm
Các ưu của kỹ thuật này là tận dụng được các ưu điểm của kỹ thuật xử lý
ướt và cả xử lý khô, cụ thể là:
▪ Hạn chế được sự mất của một số chất phân tích dễ bay hơi
▪ Sự tro hoá triệt để, sau khi hoà tan tro còn lại có dung dịch mẫu
trong
▪ Không phải dùng nhiều axit tinh khiết cao tốn kém
▪ Thời gian xử lý nhanh hơn tro hoá ướt
▪ Không phải đuổi axit dư lâu, nên hạn chế được sự nhiễm bẩn
▪ Phù hợp cho nhiều loại mẫu khác nhau để xác định kim loại, ...
Kỹ thuật này được ứng dụng chủ yếu để xử lý mẫu cho phân tích các
- - - -
nguyên tố kim loại và một số anion vô cơ, như Cl . Br , SO , PO ,.. trong các
4 4

loại mẫu sinh học, mẫu môi trường, mẫu hữu cơ và vô cơ. Không dùng được
cho xử lý mẫu để xác định các chất hữu cơ. Trong các phòng thí nghiệm bình

47

 thường, không có trang bị lò vi sóng, thì cách xử lý này vẫn là một phương
pháp thích hợp, đơn giản, mà vẫn đảm bảo có được kết quả tốt.
3.5.KỸ THUẬT TRÍCH LY THƯỜNG SỬ DỤNG KHI XỬ LÝ MẪU
3.5.1. Cơ sở, nguyên tắc và điều kiện trích ly
3.5.1.1.Hệ số phân bố của chất
Hệ số phân bố của chất tan (chất phân tích) trong 2 pha không tan vào nhau
là một hằng số hoá lý (hằng số nhiệt động) và nó đặc trưng cho sự phân bố của
mỗi chất. Nó cho ta biết sự phân bố (hay sự hoà tan) của chất phân tích vào
hai pha (2 dung môi) không trộn lẫn vào nhau theo tỷ lệ nhất định. Nếu giá trị
hằng số này càng lớn, thì sự phân bố đó càng khác nhau nhiều và càng thuận
lợi cho quá trình trích lytách chất phân bố từ pha này sang pha kia.
Chất tan S phân bố vào hệ pha gồm 2 dung môi A và B (ví dụ Benzen và
nước) không trộn vào nhau theo định luật phân bố Nersnt:
K= C (A)/ C (B)
S S

Trong đó:

▪ CS(A) là nồng độ chất X trong pha A (dung môi A, pha Benzen);

▪ Còn CS(B) là nồng độ của chất X trong pha B (dung môi B, pha

nước)
Như vậy nếu như hệ số phân bố K> 99/1, thì coi như chất X đã chuyển gần
hết vào pha A. Đó là một điều kiện của quá trình trích ly để lấy chất phân tích
và tách chúng ra khỏi chất nền (matrix) của mẫu ban đầu, chuyển chất cần
phân tích vào dung môi trích ly. Sau đó, tiến hành xác định chúng trong dung
môi này. Thông thường người ta trích ly chất phân tích từ pha nước vào pha
hữu cơ không tan vào nước. Hai pha này tạo thành hệ trích ly (hệ pha), ví dụ
hệ pha: (Benzen / H O), (CCl / H O), (CHCl / H O), (MIBK / H O), v.v.
2 4 2 3 2 2

48

 3.5.1.2.Nguyên tắc và cơ sở của quá trình trích ly

Bản chất của quá trình trích ly là dựa trên cơ sở sự phân bố (hay hoà tan)
khác nhau của chất phân tích vào trong hai pha (2 dung môi) không trộn lẫn
vào nhau. Tức là các chất phân tích tan tốt trong dung môi này, nhưng lại
không tan tốt trong dung môi kia. Nghĩa là sự phân bố của một chất trong hai
dung môi (2 pha) là rất khác nhau. Nhờ đó mà chúng ta lấy được chất cần
phân tích ra khỏi pha mẫu ban đầu, chuyển nó vào pha thứ 2 (dung môi) mà
chúng ta mong muốn. Sau đó xác định nó trong dung môi trích ly. Như thế yếu
tố quyết định sự tách và xử lý mẫu ở đây là hệ số phân bố của chất trong 2
pha(dung môi), và các điều kiện thực hiện trích ly. Khi hệ số Klớn sẽ có hiệu
suất trích ly cao.
3.5.1.3.Điều kiện của quá trìnhtrích ly
Để có được hiệu quảtrích ly tốt, quá trình trích ly phải có các điều kiện và
đảm bảo được các yêu cầu nhất định sau đây:
▪ Dung môi trích ly phải có độ tinh khiết cao để không làm nhiễm bẩn
thêm các chất lạ vào mẫu.
▪ Dung môi trích ly phải hoà tan tốt các chất phân tích, nhưng không được
hoà tan tốt với các chất khác có trong mẫu.
▪ Hệ số phân bố của hệ trích ly phải lớn, để cho quá trình trích ly được triệt
để.
▪ Cân bằng trích ly nhanh đạt được và thuận nghịch, để giải trích ly được
tốt.
▪ Sự phân lớp khi trích ly phải rõ ràng, nhanh và dễ tách ra riêng biệt các
pha.
▪ Phải thực hiện trong nhiệt độ phù hợp và giữ không đổi trong cả quá
trình.
▪ Phải lắc hay trộn đều mạnh để quá trình trích ly xảy ra được tốt.

49

 3.5.2. Một số kỹ thuậttrích ly thường dùng trong xử lý mẫu phân tích

Dựa theo bản chất của pha:
▪ Chiết lỏng – lỏng: chất phân bố từ pha lỏng ban đầu được chiết bởi
pha dung môi lỏng
▪ Chiết rắn – lỏng: chất phân bố ban đầu ở pha rắn được chiết bởi pha
dung môi lỏng
▪ Chiết lỏng – rắn (chiết pha rắn): chất phân bố ban đầu ở pha lỏng
được chiết bởi pha rắn
Dựa theo kỹ thuật chiết:
▪ Chiết gián đoạn: lượng dung môi được chia thành làm nhiều phần,
để tiến hành chiết nhiều lần nhằm tăng hiệu suất chiết. Trong kỹ
thuật này dụng cụ được sử dụng là phễu chiết
▪ Chiết liên tục: pha dung môi và pha chứa chất tách tiếp xúc liên tục
với nhau bằng cách là cho 2 pha di chuyển liên tục ngược chiều nhau
hoặc cho một pha chuyển động còn một pha đứng yên. Dụng cụ
được sử dụng trong chiết lỏng – lỏng: perforator, còn trong chiết rắn
– lỏng: soxhlet.
3.5.2.1.Kỹ thuật trích ly tĩnh
Kỹ thuật trích ly này khá đơn giản, không cần thiết bị phức tạp, mà chỉ cần
một số phễu trích ly (dung tích 100, 250, 500 mL) là có thể tiến hành được ở
mọi phòng thí nghiệm. Việc lắc trích ly có thể thực hiện bằng tay, hay bằng
máy lắc nhỏ. Hiện nay, người ta đã cung cấp các hệ trích ly đơn giản có 6, 9
hay 12 phễu với máy lắc nhỏ, nên việc thực hiện trích ly cũng dễ dàng và dễ
đồng nhất điều kiện.
Kỹ thuật trích ly tĩnh đơn giản, dễ thực hiện nên nó được ứng dụng phổ
biến và rất có hiệu quả trong lĩnh vực tách trích ly phân tích hay làm giàu các
chất phân tích phục vụ cho việc xác định hàm lượng vết. Nhất là tách và làm

50

 giàu các kim loại, các chất hữu cơ, HCBVTV độc hại trong các mẫu nước,
nước thải, nước biển, v.v.
3.5.2.2.Kỹ thuật trích ly dòng chảy liên tục
Trong kỹ thuật này, khi thực hiện trích ly, hai pha lỏng không trộn được
vào nhau (hai dung môi, có một dung môi có chứa chất phân tích) được bơm
liên tục và đi ngược chiều nhau với tốc độ nhất định trong hệ trích ly, như
phễu trích ly, hay bình trích ly liên hoàn đóng kín để chúng tiếp xúc với nhau.
Hoặc cũng có thể chỉ một dung môi chuyển động, còn một pha đứng yên trong
bình. Khi đó, chất phân tích sẽ được phân bố vào hai dung môi theo tính chất
của chúng, để đạt đến trạng thái cân bằng. Trích ly theo kỹ thuật này hiệu suất
cao hơn so với kỹ thuật trích ly tĩnh. Đây là phương pháp trích ly được ứng
dụng trong trích ly sản xuất công nghệ.
Để thực hiện kỹ thuật trích ly này, phải có hệ thống máy trích ly, cột trích
ly hay bình trích ly, bơm để bơm các chất theo dòng chảy ngược chiều nhau
với tốc độ nhất định thích hợp, hoặc chỉ một chất, hay cả 2 chất chuyển động
ngược chiều nhau, và phải có bộ tách pha, để tách các chất ngay trong quá
trình trích ly, để thu chất được trích ly ra liên tục, hay theo từng thời điểm (chu
kỳ) nhất định, mà cân bằng trích ly đạt được.
3.5.2.3.Kỹ thuật trích ly lỏng - lỏng
Nguyên tắc của kỹ thuật trích ly này là dựa trên cơ sở sự phân bố của chất
phân tích vào hai pha lỏng (2 dung môi) không trộn lẫn được vào nhau (trong
hai dung môi này, có thể một dung môi có chứa chất phân tích) được để trong
một dụng cụ trích ly, như phễu trích ly, bình trích ly. Vì thế hệ số phân bố
nhiệt động Kcủa cân bằng trích ly là một yếu tố quyết định hiệu quả của sự
trích ly. Kếđến là sự ảnh hưởng của nhiệt độ, pH của môi trường trích ly. Trích
ly theo kỹ thuật này có hai loại là trích ly tĩnh và trích ly theo dòng chảy liên

51

‎
 tục. Trong phân tích, kỹ thuật trích ly tĩnh được ứng dụng nhiều hơn, vì sự đơn
giản của nó.
❖ Cân bằng khi trích ly chất phân bố S từ pha thứ nhất sang pha thứ hai
Trong quá trình trích ly, chất tan S phân bố giữa 2 pha. Khi đạt trạng thái
cân bằng: S1 ↔ S2
Theo định luật phân bố ta có

Gọi: + pha ban đầu và pha trích ly tương ứng là 1 và 2

+ n là số mol chất S có trong pha 1
+ V1, V2 là thể tích pha 1 và pha 2
+ q1 là % số mol chất tan S còn lại ở pha 1 sau lần trích ly thứ nhất
Khi đó, ; ;

Do đó, ta được:

Nếu tiếp tục trích ly lần thứ 2, q2 là % số mol chất tan S còn lại ở pha 1
sau lần trích ly thứ hai thì

Tiếp tục như vậy, % số mol chất tan S còn lại ở pha 1 sau lần trích ly thứ n
là

Do qn < qn-1 <. ..< q1 < 1, nếu n đủ lớn thì qn ≈ 0. Quá trình trích ly được
xem như hoàn toàn.
❖ Ảnh hưởng của pH đối với chất phân bố là acid hữu cơ

52

 Trong môi trường nước, acid hữu cơ (HA) phân ly theo phương trình:
HA ↔ H+ + A-

Hay

Khi đó nồng độ axit HA trong pha 1 là

Khi đó,

Và

❖ Ảnh hưởng của pH đối với chất phân bố là bazo hữu cơ

Trong môi trường nước, bazo hữu cơ (HA) phân ly theo phương trình:
B + H+↔ BH+

Hay

Khi đó nồng độ axit HA trong pha 1 là

Khi đó,

Và

3.5.2.4.Kỹ thuật trích ly rắn - lỏng

Vào năm 1879, Franz Soxhlet đã giới thiệu thiết bị trích ly mà sau này được

53

 đặt tên của ông dùng để tách chất béo từ thực phẩm. Kỹ thuật này nhận được
nhiều sự quan tâm vì sự trích ly kéo dài được thực hiện mà không cần giám sát.
Từ đó, việc trích ly các hợp chất hóa học được chú trọng vào dung môi hữu cơ
thích hợp là một trong các phương pháp phổ biến nhất trong phân tích thực
phẩm vì không cần quá trình lọc, nhiệt độ trích ly cao hơn nhiệt độ phòng, mẫu
sẽ liên tục đi vào dung môi mới và có thể sử dụng cả dung môi phân cực lẫn
không phân cực. Bất lợi của kỹ thuật này là đòi hỏi một lượng lớn dung môi
(300 – 500 ml), dung môi cần phải bay hơi để giúp quá trình loại bỏ dung môi
được dễ và quá trình thực hiện kéo dài nhiều giờ hay nhiều ngày mới có thể
hoàn tất.
Trích ly Soxhlet là một kỹ thuật trích ly bán liên tục với pha mẫu là ở trạng
thái rắn: bột, hạt dạng mảnh, dạng lá. Còn dung môi trích ly (chất hữu cơ) là ở
dạng lỏng. Ví dụ như trích ly lấy dầu melton từ lá cây bạc hà bằng dung môi
hữu cơ n-hexan, hay benzen. Trích ly các thuốc trừ sâu hay hợp chất bảo vệ
thực vật trong mẫu rau quả, mẫu đất bằng n-hexan.
Vì thế đây là kỹ thuật trích ly của hệ dị thểmà chất phân tích ở trong mẫu
rắn, bột, lá, sợi, v.v mà các kỹ thuật trích ly đã nêu ở trên không làm được tốt,
đặc biệt là trích ly các chất hữu cơ trong các mẫu không ở dạng lỏng (hệ trích
ly dị thể) nên kỹ thuật này có tên gọi là kỹ thuật trích ly rắn – lỏng.
❖ Thiết bị :
▪ Thiết bị của kỹ thuật trích ly này có hai loại là:
✓ Các hệ trích ly Soxhlet thường và đơn giản.
✓ Các hệ trích ly Soxhlet tự động (Auto-Soxhlet).
▪ Kỹ thuật trích ly theo hệ loại 1 là đơn giản, vận hành bằng tay, còn kỹ
thuậttrích ly theo hệ máy loại 2 là vận hành một cách tự động theo
chương trình.
❖ Ưu nhược điểm và phạm vi ứng dụng

54

 Kỹ thuật trích ly này có ưu điểm là trích ly triệt để, song các điều kiện trích
ly phải nghiêm ngặt và thời gian trích ly cũng dài, thì mới có kết quả trích ly
tốt. Vì thế hệ thống vận hành tự động (auto-Soxlet) cho kết quả tốt hơn. Nó
thích hợp cho việc trích ly lượng vết các chất hữu cơ, nhất là các chất độc hại
từ các đối tượng mẫu khác nhau, chất phân tích có trong mẫu ở trạng thái rắn,
bột, vật mẫu xốp khô (lá cây), v.v. Kỹ thuật trích ly này được ứng dụng chủ
yếu để trích ly các HCBVTB từ các mẫu cây, lá, rau quả, thực phẩm, mẫu đất.
Ngày nay, kỹ thuật được cải tiến bằng cách sử dụng kỹ thuật siêu âm để hỗ
trợ. Đó là kỹ thuật trích ly siêu âm. Nguyên tắc chung chung của kỹ thuật này
cũng vẫn dựa trên cơ sở chung của kỹ thuậttrích ly là sự phân bố của chất vào
hai pha không trộn lẫn vào nhau, chỉ có khác là ở đây được thực hiện trong
môi trường có thêm tác dụng của năng lượng sóng siêu âm. Pha chứa mẫu
phân tích cần trích ly là pha nước và pha lỏng để trích ly chất phân tích là
dung môi hữu cơ (pha thứ hai) đều được cho vào bình trích ly, sau đó được đặt
vào trong hộp trích ly của hệ trích lydưới tác dụng của sóng siêu âm thích hợp
trong một thời gian nhất định (1,5 - 2 giờ). Kỹ thuật trích ly này có thể được
thực hiện ở hai trạng thái mẫu đồng thể và dị thể.
3.5.2.5.Kỹthuật trích ly lỏng có áp lực (PFE)
Kỹ thuật này sử dụng dung môi được tăng tốc gần tới vùng chảy tới hạn,
khi đó khả năng trích ly tốt hơn. Ở nhiệt độ cao, tốc độ trích ly tăng do độ nhớt
và sức căng bề mặt của dung môi giảm trong khi tính hòa tan và tốc độ
khuyếch tán của nó vào mẫu tăng lên. Áp suất giữ cho dung môi nằm ở dưới
điểm sôi và khiến nó xâm nhập qua các lỗ nhỏ trên bề mặt mẫu. Sự kết hợp
giữa nhiệt độ cao và áp suất đem lại hiệu quả trích ly cao hơn, do đó sẽ tối
thiểu hóa lượng dung môi sử dụng và giúp trích ly triệt để hơn. Thời gian cần
trích ly trên thực tế có sự độc lập với khối lượng mẫu và hiệu quả trích ly chủ
yếu phụ thuộc vào nhiệt độ. Hình 2 là một mô hình thiết bị PFE.

55

 Mẫu được cho vào ngăn trích ly bằng thép không rỉ mà tại đó dung môi
được bơm vào và đưa lên nhiệt độ và áp suất xác định. Thông thường nhiệt độ
được giữ trong khoảng từ 80ºC đến 200ºC và áp suất trong khoảng từ 10 đến
20 MPa. Các điều kiện này được giữ nguyên trong vài phút để tạo sự dịch
chuyển ổn định chất phân tích từ mẫu vào dung môi. Dịch trích ly được đẩy
vào ống thu nhận bởi một lượng dung môi thứ 2 và lượng dung môi thứ 2 này
cũng được đẩy vào ống đó bởi một dòng khí trơ. Toàn bộ quá trình diễn ra
trong 15 – 20 phút.
Khi thao tác với mẫu ẩm, để tránh hiện tượng vón cục, có thể sử dụng
điatomit (kizegua). Điatomit khi tro hóa có chứa khoảng 65 – 87% SiO2, 2,3 –
11,7% Al2O3, gần 3% Fe2O3 và vết CaO, MgO, Na2O và K2O.
Phương pháp thực hiện thường cho kết quả trung thực vì các điều kiện gần
giống như trích ly bằng Soxhlet

Hình 2.1 Mô hình thiết bị PFE

(a) Bình chứa dung môi, (b) Bơm, (c) Van lọc, (d) Ngăn trích ly, (e) Lò nung,
(f) Van cố định, (g) Ống thu nhận, (h) Lỗ thông khí, (i) Bình khí trơ
Trích ly lỏng có áp lực được ứng dụng chủ yếu trong kiểm soát các thông số
56

‎
‎
 ô nhiễm và gần đây là tiền xử lý thực phẩm. Bảng 6 giới thiệu một vài ứng
dụng của nó.

57

 Bảng 2.6 Trích ly lỏng có áp lực trong phân tích thực phẩm

58

 t (0C) / p
Thực phẩm Chất phân tích Dung môi
(MPa)
Thuốc trừ sâu, thuốc Hexane+10%
Rau quả, bột 125/10
diệt cỏ acetone,
Rau quả, nước ép Thuốc trừ sâu chứa
Ethyl acetate 100/10,4
trái cây, bột Photpho hữu cơ
Rau quả, trái cây n -Methylcarbamate Acetonitrile 100/13,8
Trái cây Polyphenol Methanol 40/6,9
Dược phẩm Vitamin K1
Chlorpyrifos,
Thức ăn trẻ em malathion, 4.4’-DDE, Acetonitrile 80/13,8
4,4’–DDT
Hydrocarbon chứa Methylene chloride
Thịt xông khói 80/10
vòng thơm + 10% acetonitrile
Chất béo,
Cá polychlorinated Hexane 125/10
biphenyls
Arsenobetaine,
Methanol + 50%
Cá arsenocholine,
H2O
dimethylarsenic acid
Cá Hợp chất có mùi Hexane-ethyl 80/10
Thịt Chất béo Hexane 125/10
Isopropyl alcohol +
Bột ngũ cốc, thịt
Axit béo hexane-methanol + 120/0,8
gà, trứng
chloroform

59

 Hexane +
Bột sữa Chất béo methylene + 80/10,4
chloride +
Dầu gan cá tuyết,
Polychlorinated
bột sữa, thức ăn Hexane 100/10,3
biphenyls
gia súc
Sản phẩm từ sữa,
thịt, bột ngũ cốc,
Chất béo Ether dầu hỏa 100/13,8
chất béo và dầu
thực vật.
Malt Proanthocyanidins Acetone + 20% 60/100

So sánh giữa trích ly lỏng có áp lực với phương pháp Soxhlet, ưu điểm của
nó là giảm lượng dung môi sử dụng và thời gian trích ly nhưng nhược điểm là
sử dụng thiết bị dụng cụ chuyên dụng rất đắt tiền nhằm đảm bảo sự an toàn
tránh mối nguy do dung môi bị quá nhiệt và dụng cụ chịu áp suất cao.
3.5.2.6.Kỹ thuật trích dòng siêu chảy (SFE)
Trích ly bằng dòng siêu chảy với thực phẩm được giới thiệu nhiều năm
trước đây trên quy mô công nghiệp nhưng nó chỉ được ứng dụng vào công
đoạn chuẩn bị mẫu phân tích vào thời gian gần đây.
Dung môi sử dụng là một dòng siêu chảy, là một chất nằm ở trạng thái có
nhiệt độ và áp suất tới hạn, tạo nên những tính chất kết hợp đặc biệt. Dòng siêu
chảy khuếch tán qua chất rắn cũng như chất khí nhưng có thể hòa tan chất phân
tích ở pha lỏng, để tốc độ trích ly tăng và ít bị tổn thất nhiệt. Ngoài ra, nhiều
quá trình tiền xử lý mẫu có thể thực hiện với dòng siêu chảy không bị nhiễm
bẩn, không gây ngộ độc, chẳng hạn như CO2, là sự lựa chọn hoàn hảo so với
việc phải chấp nhận những nguy cơ tiềm tàng và sử dụng dung môi đắt tiền

60

 trong trích ly bằng Soxhlet.

Tốc độ thấm nhanh của dòng siêu chảy vào thực phẩm, ngay cả khi độ xốp
thấp, cho phép sự thẩm thấu ngược các chất cần phân tích một cách nhanh
chóng, làm giảm thời gian trích ly. Công đoạn hoàn tất diễn ra dưới 20 phút
thay vì nhiều giờ đồng hồ như trong trích ly lỏng – rắn truyền thống. Kỹ thuật
này cũng được sử dụng đối với các chất phân tích không ổn định nhiệt khi
chọn dòng siêu chảy với nhiệt độ tới hạn thấp.
Một trong tính chất thú vị nhất của các dòng chảy này là mối liên quan trực
tiếp giữa nồng độ dung môi với tỷ trọng. Do tỷ trọng của dòng chảy là một
hàm của nhiệt độ và áp suất nên điều chỉnh chính xác các thông số này sẽ cho
phép sử dụng được một dung môi có khoảng nồng độ hòa tan thấp. Từ đó cho
phép thay thế nhiều loại dung môi truyền thống với một dòng siêu chảy duy
nhất. Ví dụ như CO2 siêu chảy ở 7,515 Mpa và 80ºC (d = 0,15 g/ml) được xem
như một dung môi có độ hòa tan cao như những chất khí như pentan, trong khi
ở 38,265 Mpa và 40ºC (d = 0,95 g/ml) độ hòa tan của nó gần giống như các
chất lỏng chẳng hạn như metylen clorua, cacbon tetraclorua, toluen hay
benzen. Khi chọn áp suất trích ly, cần lưu ý là khi tăng áp suất, hợp chất có
khối lượng phân tử cao hơn sẽ trở thành chất tan, trong khi giảm áp suất dòng
siêu chảy sẽ mất đi một vài phần khả năng hòa tan của nó. Nếu giảm áp suất
đến áp suất khí quyển, dòng chảy sẽ mất gần như toàn bộ khả năng hòa tan và
những hợp chất đã trích ly sẽ tách ra khỏi dung dịch.
Nước là một lựa chọn kém với kỹ thuật này vì nhiệt độ và áp suất tới hạn
cao của nó. Dòng siêu chảy được sử dụng phổ biến là CO2 với giá trị tới hạn
thấp và độ hoạt động hóa học thấp. CO2 dễ thu nhận được ở dạng siêu tinh
khiết với giá thành hợp lý, nó là chất thân thiện với môi trường và có thể tách
trích ly ra khỏi các chất phân tích thu nhận được dễ dàng không có trở ngại gì
cũng như không gây tổn thất đáng kể.

61
‎

 Nitơ oxyt cũng là dòng siêu chảy tốt nhưng nó rất dễ cháy nổ. Amoniac là
chất phân cực với độ hòa tan tốt nhưng nó dễ tương tác hóa học và gây ăn mòn.
Hydrocacbon cũng thường có khả năng cháy nổ và cũng không dùng được với
kỹ thuật phân tích SFE.
Một phương pháp thực hiện thông thường trong trích ly bằng dòng siêu
chảy được đề cập trong mối liên quan với tính chất hóa lý của dòng siêu chảy
đó là việc sử dụng các chất hỗ trợ (đồng dung môi). Đó là những hợp chất
được thêm vào dòng chảy nguyên thủy để tăng hiệu suất trích ly. Ví dụ như
thêm vài phần trăm (1 – 10%) dung môi metylic vào cacbon dioxyt sẽ mở rộng
khoảng trích ly với những chất phân tích có độ phân cực cao hơn.
Kỹ thuật trích ly với dòng siêu chảy ứng dụng trong thiết bị đơn giản được
giới thiệu trong Hình 3.

Hình 2.2 Sơ đồ thiết bị SFE

(a) Nguồn chất hỗ trợ, (b) Bơm, (c) Ngăn trích ly, (d) Lò nung, (e) Thu hồi, (f) Bộ phận
hãm dòng, (g) Nguồn dòng chảy, (h) Bộ lọc (i) Bơm pittong cao áp tác dụng kép
Mẫu được đưa vào ngăn trích ly bên trong, mà dòng chảy được bơm vào đó

62

 ở một áp suất trên điểm tới hạn. Nhiệt độ của ngăn tăng trên giá trị tới hạn của
dòng chảy. Lượng thực phẩm cần khoảng 1 – 3 g trong mỗi ngăn. Trong trường
hợp thực phẩm rắn cần đồng nhất mẫu, còn thực phẩm lỏng thì cần hấp thụ lên
một chất trơ và có lỗ xốp để tránh trở ngại trong việc điều chỉnh 2 pha khi có
áp suất. Thành phần nước trong mẫu phải được điều chỉnh kỹ lưỡng vì nước,
được coi là một đồng dung môi mạnh, có thể làm thay đổi khả năng trích ly
của dòng siêu chảy và đồng thời nó bị đóng băng khi dòng chảy bay hơi gây
tắc nghẽn các van và bộ phận hãm dòng.
Sự trích ly có thể thực hiện ở chế độ tĩnh hay động, hoặc chế độ tuần hoàn.
Khi thực hiện trích ly chế độ tĩnh, ngăn trích ly được lấp đầy bởi dòng siêu
chảy, được tăng áp và giữ yên cân bằng. Ở chế độ động, dòng siêu chảy liên
tục chảy qua ngăn trích ly. Ở chế độ tuần hoàn, dòng chảy được bơm tuần hoàn
qua mẫu và sau khi đạt được số lần tuần hoàn yêu cầu, nó được bơm về bộ
phận thu hồi.
Trong suốt quá trình trích ly, chất phân tích hòa tan được phân tách từ mẫu
vào dòng siêu chảy đã bị giảm áp, không bị tổn thất, đi qua 1 bộ phận thay đổi
tốc độ dòng, về ống thu nhận. Ống thu nhận này có thể rỗng hay có chứa chất
hấp phụ thích hợp hay những chất chuẩn cần thiết của phân tích theo yêu cầu
của việc chuẩn độ sau đó. Trong phân tích thực phẩm, chất béo và dầu thường
được thu nhận trong 1 ống rỗng hay trong một dung môi. Tương tự như vậy,
thuốc trừ sâu và các vitamin tan trong béo cũng đươc thu nhận trong 1 dung
môi hay hấp thụ lên bề mặt chất triết ở pha rắn, trong khi đó mùi và hương
được thu nhận trong một ống đông lạnh.
Bản chất dòng siêu chảy, nhiệt độ và áp suất, thời gian trích ly, hình dạng
ngăn trích ly, cỡ mẫu và loại hợp chất dùng trong thu nhận chất phân tích là
những yếu tố chung ảnh hưởng đến sự trích ly.
Ngay từ ban đầu, kỹ thuật trích ly này được sử dụng rộng rãi để phân chia

63

 các thành phần hữu cơ trong phân tích thực phẩm, đặc biệt là trích ly chất béo
và dầu. Theo thời gian, ứng dụng của kỹ thuật SFE trong thực phẩm được
củng cố nhiều và vì vậy bảng 7 chỉ tổng hợp một vài cách phân chia gần đây
trong thực phẩm, hương thơm và gia vị.
Các dòng siêu chảy góp phần tiến bộ đáng kể về dung môi trích ly trong
phân tích thực phẩm. Các chất trích ly sạch hơn so với các dung môi hữu cơ và
giảm sựu tổn thất nhiệt. Không cần phải cô đặc trước khi phân tích hóa học.
Mặc dù những ưu việt đã được chứng minh và ứng dụng đáng kể của nó vào
việc phân chia trong lĩnh vực công nghiệp, kỹ thuật này vẫn bị thất bại trong
việc trở thành công cụ phân chia chính vì yêu cầu lựa chọn dòng siêu chảy và
chất hỗ trợ đòi hỏi nhiều kinh nghiệm, trong khi có rất ít thông tin về dung môi
phân tích và thêm vào đó sự hiểu biết về sự tương tác giữa dòng siêu chảy, các
chất cần phân tích và điểm hấp phụ trên thực phẩm vẫn còn hạn chế.

64

 Bảng 2.7 Trích ly bằng dòng siêu chảy trong phân tích thực phẩm

65

 t(ºC)/
Thực phẩm Chất phân tích Dòng chảy + chất hỗ trợ
p(MPa)
Thịt heo Chất béo CO2+(CH3)2CHOH 120/62
Thịt heo sấy Cholesterol CO2 50/34
Polychlorinated
Mỡ heo
biphenyl
40/10,3 và
Nạc bò Hương quá nhiệt CO2
30
Thịt, trứng Nicarbazin dư CO2+C2H5OH 85/27,6
Atrazine và thuốc diệt
Trứng CO2 50/69
cỏ chứa triazine khác
Trứng Chloramphenicol CO2 80/69
Trứng Thuốc trừ sâu gốc clo CO2 40/0,72
Sản phẩm
Vitamin A CO2+5% C2H5OH 60/26
từ sữa, thịt
Bột sữa Vitamins A và E CO2+5% CH3OH 80/37
Dầu cám Ferulate-phytosterol CO2 80/69
bắp ester CO2+5% CH3OH 40/34,5
80/55,2
Dầu hạt ngũ
CO2 80/13,8,
cốc, Phytosterol
CO2+10% (CH3)3COCH3 27,6 và
margarin
41,4
Thuốc trừ sâu gốc clo
Chất béo và
hữu cơ và photpho CO2+3% CH3CN 60/27,6
dầu
hữu cơ
Táo Fenpyroximate CO2 90/20

66

 CO2+10% CH3OH hay

Nho Glycoside 40/69
CO2
5-Hydroxymethyl-2-
Nho CO2+20% CH3OH 35/38,5
furaldehyde
Dầu ớt bột, β-
Ớt bột CO2 40/13,8 và
carotene, các
Gia vị Hương thơm CO2 40/12
Cám gạo Chất béo và γ- CO2 50/69
Thuốc trừ sâu gốc
Lúa mì, ngô CO2 70/24,5
photpho hữu cơ
Mầm ngũ
Tocopherol CO2 80/25
cốc
Carotenoid, β-
Thức ăn ăn
carotene, β- CO2+15% C2H5OH 75/35
kiêng
cryptoxanthin và
Atrazine, carbofuran,
Thức ăn trẻ
chlorpyrifos, CO2+10% CH3CN 70/17,3
em
metolachlor
40–
Mầm lúa mì Vitamin E CO2 45/27,5–
34,5
Cá 30 VOC CO2 45/10

67

 Lycopene, β-carotene,
α- carotene, α-
Cà chua tocopherol, γ- CO2
tocopherol, δ-
tocopherol

3.5.2.7.Kỹ thuật trích ly pha rắn (SPE)

a. Nguyên tắc và điều kiện
Nguyên tắc chung
Một kỹ thuật trích ly theo cơ chế hấp phụ phổ biến là kỹ thuật trích ly trên
pha rắn (SPE) trong đó người ta dùng những ống cartridge thích hợp để hấp
phụ chất phân tích và tách chúng ra khỏi hỗn hợp. Khi dung dịch mẫu đi qua
vùng chất hấp phụ đã được hoạt hóa, chất xác định bị hấp phụ trên bề mặt rắn
trong khi những thành phần khác của mẫu lại đi qua (hay ngược lại, trong
trường hợp làm sạch tạp chất). Sự cân bằng giữa chất phân tích và chất hấp phụ
nhanh chóng đạt được do bề mặt hấp phụ lớn.
Nhiều loại chất hấp phụ như nhôm, magiê silicat và than hoạt tính đã được
thương mại hóa nhưng vật liệu phổ biến nhất là silic dioxyt vì nó dể dàng tái
hoạt hóa bề mặt để sử nhiều lần và phạm vi sử dụng rộng rãi. Chất hấp phụ là
nhựa trao đổi cũng được dùng rất phổ biến và các nghiên cứu gần đây, cho thấy
các phân tử của chúngcó thể dùng làm vật liệu trong kỹ thuật trích ly SPE
trong thực phẩm.
Thông thường, kích thước của hạt hấp phụ trong khoảng từ 10 đến 60 µm.
Bản chất vật liệu sử dụng giống như trong sắc ký lỏng (chỉ khác về kích cỡ).
Chất hấp phụ gồm 3 loại cơ bản: không phân cực, phân cực và trao đổi ion. Độ
hoạt động của chúng phụ thuộc vào bản chất của pha liên kết, nồng độ pha liên
kết. Việc lựa chọn chất hấp phụ phụ thuộc vào cấu trúc thực phẩm, bản chất

68

‎
 chất cần tách vì nó liên quan tới sự tương tác của những chất này với bề mặt
pha. Quá trình trích ly thực hiện qua 4 bước: thiết lập (các nhóm chức của nền
hấp phụ được solvat hóa để dễ tương tác với mẫu hay là sự hoạt hóa bề mặt),
củng cố (các chất cần phân tích được gắn vào bề mặt khung), rửa giải (những
chất không mong muốn bị loại bỏ) và giải hấp (các chất cần phân tích được
giải hấp phụ và thu nhận để tiến hành phân tích). Quá trình rữa giãi phải chú ý
là rất dể sự rữa giãi sẽ làm mất đi pha liên kết, sau này sẽ không tái sử dụng
được hay làm giảm tuổi tho của vật liệu.
Phương pháp SPE được phát triển hoàn thiện thông qua những nghiên cứu
về pH, lực ion, sự phân cực, tốc độ dòng chảy của dung môi và bản chất hóa
lý của nền hấp phụ.

Trong lãnh vực sắc ký hệ thống này được ghép với cột sắt ký để tách và
định lượng. Ban đầu mẫu được hòa tan và cho vào bộ phận nạp mẫu tự động,
rồi từ đó được bơm vào ống cartridge của hệ thống SPE, lúc này cột sắc ký
được giữ cho dòng ra của sắc ký đồ ổn định theo một chế độ chạy phù hợp
được cài đặt. Những tạp chất nhiễu được rửa giải ra khỏi ống cartridge của hệ
thống SPE bằng dung môi thích hợp, ở bước thứ 4 ống chứa các chất xác định
được nối với cột sắc ký và các chất cần phân tích được rửa giải bằng một dung

69

 môi thích hợp. Có thể xem như đây là một quá trình tiền xử lý mẫu trước khi
cho vào cột sắc ký. Kỹ thuật này có nhiều cải tiến hơn phương pháp trích ly
lỏng – lỏng và cho phép loại bỏ đồng thời những tạp chất nhiễu và cô đặc chất
cần phân tích.
Nhiều loại thực phẩm được làm sạch bằng kỹ thuật trích ly trên pha rắn rất
thành công cho việc xác định nhiều chất hợp chất.

Hình 2.3 Quy trình hoạt động của thiết bị SPE gắn nối tiếp với hệ thống
sắc ký ion.

70

 (A) Mẫu được chuyển từ bộ phận nạp mẫu tự động (s) vào ống cartridge (SPE); cột IC được
giữ cho dòng ra ổn định (e) từ bơm p2
(B) Tạp chất nhiễu được rửa giải ra khỏi ống cartridge (SPE) đi vào thùng chứa tạp chất (w)
bằng dung môi thích hợp (sw) được bơm từ bơm p3; cột IC vẫn giữ trạng thái như ở
bước A
(C) Chất cần phân tích được tháo ra khỏi ống cartridge (SPE) bằng bộ phận tháo mẫu (e) và
ống (l) được lắp đầy; cột IC vẫn giữ trạng thái như ở bước A và B.
(D) Ống (l) được nối với cột IC và các chất cần phân tích được tháo ra bằng bộ phận tháo
mẫu (e) và cùng lúc đó ống cartridge (SPE) mới được gắn vào cho quá trình tiền xử lý
mẫu tiếp theo.
❖ Phân loại kỹ thuậttrích ly pha rắn
Theo đặc điểm và bản chất của kỹ thuật trích ly, các chất trích ly pha rắn
được chế tạo và phân chia theo các loại chất:
• Loại hấp phụ pha thường. Đó là các Silica trung tính và ôxit nhôm,
• Hấp phụ pha ngược. Đó là các Silica thường được alkyl hoá nhóm-
OH,
• Loại chất trao đổi ion (để tách Cation và Anion),
• Chất rây hay sàng lọc phân tử theo độ lớn, kích thước của phân tử
chất,
• Loại chất hấp phụ khí (purge and trap Extraction), để hấp thụ chất
khí.
b. Điều kiện của trích ly pha rắn
Quá trình trích ly ở đây thực chất cũng là sự phân bố của chất phân tích
giữa 2 pha, pha rắn (chất trích ly) và pha lỏng (dung dịch chứa chất phân tích)
không trộn lẫn vào nhau trong những điều kiện nhất định, như pH, dung môi,
nhiệt độ, tốc độ chảy của mẫu qua cột trích ly. Trong đó hệ số phân bố nhiệt
động K của chất phân tích giữa hai pha (rắn và lỏng chứa mẫu) cũng là một
b

71

 yếu tố quyết định hiệu quả của sự trích ly. Nó cũng tương tự như trong hệ sắc
ký cột lỏng-rắn (của các hệ HPLC).
Vì thế muốn thực hiện trích ly pha rắn tốt phải có các điều kiện sau đây
▪ Pha rắn hay chất trích ly (dạng cột trích ly hay đĩa trích ly) phải có
tính chất hấp thụ hay trao đổi chọn lọc với một chất, hay một nhóm
chất phân tích nhất định, tức là tính chọn lọc của pha tĩnh trích ly.
▪ Các chất trích ly và dung môi rửa giải phải có độ sạch cao theo yêu
cầu của cấp hàm lượng phân tích.

▪ Hệ số phân bố nhiệt động Kfb của cân bằng trích ly phải lớn, để có

được hiệu suất trích ly cao.

▪ Quá trình trích ly phải xảy ra nhanh và nhanh đạt cân bằng, nhưng
không có tương tác phản ứng hoá học làm mất hay hỏng pha rắn và
chất phân tích.
▪ Quá trình trích ly phải có tính thuận nghịch, để quá trình rửa giải
được tốt giúp lấy chất phân tích ra khỏi pha trích ly bằng một pha
động phù hợp.
▪ Không làm nhiễm bẩn thêm chất phân tích trong quá trình trích ly
bởi bất kỳ từ nguồn nào.
▪ Quá trìnhtrích ly phải được thực hiện trong điều kiện nhất định phù
hợp, phải lặp lại được tốt và tất nhiên là càng đơn giản dễ thực hiện
thì càng tốt.
c. Các kỹ thuật trích ly pha rắn và cơ chế trích ly
❖ Trích ly theo cơ chế hấp phụ pha thường
Trong kỹ thuật này, chất trích ly (pha tĩnh) là các Silica trung tính, có bề
mặt xốp phân cực. Nó tác dụng tốt với các chất mẫu không phân cực và ít
phân cực. Đó là sự tương tác hấp phụ. Tuỳ theo bản chất và cấu trúc phân tử
của mỗi nhóm chất phân tích, bản chất hấp phụ của Silica trung tính và các

72

 điều kiện thực hiện trích ly, mà nhóm chất phân tích nào bị pha tĩnh hấp phụ
và giữ lại trên cột trích ly và hoàn toàn tương tự như sự tương tác hấp phụ
trong cột sắc ký NP-HPLC.
Dung môi để giải trích ly chất phân tích trong loại này thường là các dung môi
hữu cơ không phân cực hay ít phân cực và kị nước (không tan vào nước), hay
hỗn hợp của chúng với nhau theo tỷ lệ thích hợp. Ví dụ n-Hexane, n-Heptane,
CCl , CHCl , Benzen, Diclo-Etan, Ethyaxetat, v.v. Các dung môi này được gọi
4 3

là pha động (MP) và nó phải hoà tan tốt chất phân tích, để lấy được các chất
phân tích ra khỏi pha tĩnh (chất trích ly rắn).
❖ Trích ly theo cơ chế hấp phụ pha ngược
Trong kỹ thuật này, chất trích ly (pha tĩnh) là các Silica pha ngược, có bề
mặt hầu như không phân cực. Nó tác dụng tốt với các chất mẫu không phân
cực và phân cực. Đó là sự tương tác hấp phụ của pha tĩnh (chất trích ly). Tuỳ
theo bản chất và cấu trúc phân tử mỗi nhóm chất phân tích và các điều kiện
thực hiện trích ly, mà nhóm chất phân tích nào bị pha tĩnh hấp phụ và giữ lại
trên cột tách trích ly.
Cơ chế trích ly ở đây là sự tương tác hoàn toàn tương tự như sự tương tác
hấp phụ trong cột sắc ký lỏng hiệu năng cao hấp thụ pha ngược (RP-HPLC ).
Kỹ thuật này dễ thực hiện, đơn giản và được ứng dụng nhiềudo tính tiện lợi
của hệ dung môi rửa giải tan trong nước, dung môi chứa chất phân tích.
Chúng ta có thể minh hoạ sự tương tác này như mô hình sau:
❖ Trích ly theo cơ chế trao đổi ion
Nguyên tắc
Dựa trên cơ sở của quá trình trao đổi ion của chất phân tích với ion đối (ion
trao đổi) của chất trích ly (pha tĩnh trao đổi ion) để hấp thu (giữ) chất phân
tích lại trên pha tĩnh (cột trích ly). Sau đó dùng một pha động (dung dịch) phù
hợp để rửa giải chất phân tích vào dung môi đó và sau đó tiến hành xác định

73

 nó theo một phương pháp phân tích thích hợp đã chọn. Dung môi rửa giải ở
đây là dung dịch nước của các muối tan của kim loại kiềm, amoni có pH phù
hợp, hay dung dịch axit loãng và có thể có thêm chất tạo phức.
Chất trao đổi ion
Chất trao đổi ion của kỹ thuật này có thể là hai loại sau đã và đang được sử
dụng phổ biến, đó là:

▪ Trao đổi Cation axit mạnh (R-SO3Na) và axit yếu (R-COONa).

+
▪ Trao đổi Anion Bazơ mạnh (R-N (-OH)), bazơ yếu (R-NH OH).
2

Cơ chế của sự trao đổi ion

▪ Loại trao đổi Cation theo phương trình tổng quát quá trình trao đổi
Cation:
n+ +
nMat-SO Na + Me → (Mat-SO ) -Me + nNa
3 3 n

(Chất trích ly) (Chất phân tích)

Trong đó:
Mat: Mạng rắn của chất trao đổi ion;
n+
Me : Cation của chất phân tích.
+
Na : Cation trao đổi của chất trích ly.
-SO Na: Nhóm chức trao đổi ion.
3

▪ Loại trao đổi Anion: theo phương trình tổng quát quá trình trao đổi
Anion
n- -
nMat-OH + X → (Mat) -X + nOH
n

n- -
hay nMat-Cl + X →(Mat) -X + nCl
n

74

 (Chất trích ly) (Chất phân tích)

Trong đó:
Mat: Là mạng rắn của chất trao đổi ion;
n-
X : Anion của chất phân tích.
- -
OH và Cl là anion trao đổi.
Trong quá trình trao đổi ion, tuỳ thuộc vào mỗi loại chất phân tích và chất
pha tĩnh (chủ yếu là nhóm chức trao đổi ion thuộc loại axit yếu hay mạnh,
hoặc bazơ mạnh hay yếu), mà quá trình có thể được thực hiện tốt trong một
vùng pH (môi trường axit) nhất định. Vì thế,trích ly theo cơ chế này cần phải
được thực hiện trong môi trường pH (hay axit) phù hợp.
❖ Trích lytheo cơ chế trao đổi cặp ion
Cùng với sự trao đổi cation và anion, trong trích ly pha rắn còn có cơ chế
trích ly theo kiểu cặp ion. Đây cũng là bản chất trao đổi của ion của chất phân
tích thông qua chất trung gian- chất tạo cặp ion, nó cho ion trao đổi với chất
phân tích. Nó cũng hoàn toàn tương tự như sắc ký cặp ion của hệ pha ngược
hấp phụ (hệ RP-HPLC). Chất trích ly ở đây thường là chất hấp phụ pha
ngược.Ví dụ Silica LiChrosorb RP-8, RP- 18 hay là Hypersil ODS. Và ở đây
cũng có hai kiểu trao đổi cặp ion.
3.5.2.8.Kỹ thuật trích ly hấp phụ pha khí (rắn-khí)
❖ Nguyên tắc chung
Kỹ thuật này dựa trên cơ sở là ở một nhiệt độ nhất định thích hợp, khi thổi
một dòng khí trơ nóng (argon hay hêli) dẫn mẫu ở dạng khí vào cột trích ly, thì
một nhóm các chất phân tích bị pha tĩnh rắn trong cột hấp phụ giữ lại, còn các
chất khác thì đi qua. Vì thế về bản chất nó cũng là quá trìnhtrích ly giữa hai
pha khí và rắn (pha trích lylà rắn, chất phân tích được trích lyở dạng khí)
không tan vào nhau. Ở đây, trích lytheo cơ chế hấp phụ. Sau đó có thể:

75

 ▪ Người ta lại làm nóng cột hấp phụ và cũng dùng dòng khí trơ nóng
để giải hấp các chất phân tích đưa trực tiếp chúng vào hệ cột của
máy GC hay cho chúng tan vào một dung môi hữu cơ phù hợp để
xác định bằng cách khác, như HPLC hay phổ UV-VIS.
▪ Hay cũng có thể giải trích ly chất phân tích ra khỏi cột trích ly bằng
một dung môi hữu cơ thích hợp hoà tan tốt chất và xác định chúng
bằng HPLC hay IR.
Phương pháp trích lynày được ứng dụng cho cả mẫu rắn và lỏng, hay bùn,
hay bã thải, nhưng chỉ cho các chất phân tích là các hợp chất hữu cơ có nhiệt
o
độ bay hơi thấp (dưới 150 C) và dễ bay hơi. Kỹ thuật này rất thích hợp cho
trích lycác chất hữu cơ trong môi trường khí, hay các mẫu rắn, mẫu bột, hay
mẫu bùn và mẫu nhão. Tất nhiên, việc trước tiên là phải nhũ hoá các mẫu này
bằng một dung môi thích hợp, như nước hay dung môi hữu cơ có nhiệt độ sôi
cao. Còn chất hấp phụ ở đây là các hạt silica rắn xốp được nhồi vào cột trích
ly đóng kín. Nó cũng thường là các silica trung tính xốp hay silica đã được thế
hoá (alkyl hoá), tương tự như trong hệ trích ly NP-HPLC và RP-HPLC.
Kỹ thuật này rất thích hợp cho việc xử lý các loại mẫu để xác định các
o
chất hữu cơ có nhiệt độ sôi thấp (dưới 150 C) và dễ bay hơi trong các loại
mẫu rắn, mẫu bùn, các mẫu bã thải và các mẫu khí. Nó có ưu điểm là chọn lọc
cao, thích hợp cho các phương pháp phân tích HPLC, GC, hay GC-MS, để xác
định lượng nhỏ các chất hữu cơ, một số hợp chất cơ kim và một số chất vô cơ,
như H S, HCN, v.v.
2

❖ Thiết bị và một số ví dụ
Thiết bị gồm có hai loại là các hệ đơn giản và hệ hoàn chỉnh tự động theo
chương trình. Khí mang trơ ở đây là khí argon, hêli hay nitơ tính khiết (>
99,9%). Cụ thể thiết bị là gồm các bộ phận:

76

 + Hệ cột trích lykín và buồng cột trích lycó gia nhiệt được,
+ Khí trơ mang mẫu, cũng như để rửa giải chất phân tích (Ar, N , hay
2

He).
+ Hệ máy bơm khí và nén khí mẫu vào cột trích ly.
♦ Ví dụ: Trích ly lấy một số hợp chất pesticide dễ bay hơi trong các loại
nước hay mẫu rắn, bùn (Method 502.2b. EPA).
Cột hấp phụ là chất trích ly pha rắn loại LC2-25x1 cm. Mẫu được giữ ở
o
150 C và dòng khí trơ Argon thổi qua bình mẫu với tốc độ 0,8-1,0 mL/phút để
đưa chất phân tích vào cột hấp phụ. Các chất phân tích sẽ được hấp phụ vào
cột này. Sau đó cũng giải hấp các chất trong cột hấp phụ bằng dòng khí trơ đó
o
nhưng ở 200 C, để dẫn vào máy GC/MS để tách và xác định các chất.

4. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯƠNG NƯỚC

TRONG THỰC PHẨM
4.1.GIỚI THIỆU CHUNG
Nước là thành phần vốn có ở hầu hết cơ thể sinh vật và chiếm khoảng 90%
khối lượng tươi của một số nguyên liệu thực vật. Do đó, nước giữ vai trò quan
trọng đối với sự sống nói chung và ngành công nghiệp thực phẩm nói riêng.
Hàm lượng nước trong thực phẩm dao động khá rộng từ rất nhỏ trong các loại
hạt ngũ cốc khô đến rất lớn ở các loại nguyên liệu tươi sống như rau, quả tươi.

77

 Dù không cung cấp năng lượng nhưng nước lại giữ vai trò ổn định cấu trúc
đặc trưng cho mỗi sản phẩm thực phẩm. Nước vừa có thể đóng vai trò là môi
trường phản ứng mà cũng vừa có thể là chất tham gia phản ứng xảy ra trong
thực phẩm.
Nước không chỉ là một nguyên liệu quan trọng không thể thiếu của công
nghiệp thực phẩm mà nước còn là yếu tố ảnh hưởng lớn đến tính chất của
nguyên liệu và sản phẩm thực phẩm. Dựa vào hàm lượng nước có trong thực
phẩm mà người ta chia thực phẩm thành 3 nhóm:
▪ Thực phẩm có hàm lượng nước cao: hàm lượng nước chiếm hơn 40%.
▪ Thực phẩm có hàm lượng nước trung bình: hàm lượng nước từ 10 – 40%
▪ Thực phẩm có hàm lượng nước thấp: những thực phẩm có hàm lượng
nước nhỏ hơn 10%.
Trong các sản phẩm thực phẩm, nước tồn tại ở hai dạng là nước tự do và
nước liên kết:
▪ Nước ở dạng tự do: nước vẫn giữ được tính chất của nước nguyên chất.
▪ Nước ở dạng liên kết được chia thành ba dạng tùy thuộc vào mức độ
liên kết.
✓ Nước liên kết hóa học: nước liên kết rất chặt chẽ với các thành
phần trong thực phẩm và rất khó để tách chúng ra khỏi tương tác
hóa học này.
✓ Nước liên kết hấp thụ: độ bền liên kết kém hơn trong liên kết hóa
học và được hình thành do tương tác lưỡng cực của nước với các
thành phần phân cực trong thực phẩm.
✓ Nước liên kết mao quản: nước được hấp thụ bởi các phần tử ở bề
mặt mao quản rồi di chuyển vào bên trong các mao quản.
Nước liên kết là nước tham gia liên kết với các phân tử khác bằng lực
Vanderwal, liên kết hydro, liên kết ion… Khi nước ở dạng liên kết thì nước

78

 không còn những tính chất như nước tự do. Cụ thể, nước liên kết không còn
khả năng là dung môi hòa tan các chất khác, không đóng băng và khó bốc hơi
hơn nước tự do.
Xác định chính xác lượng nước có trong thực phẩm là điều quan trọng vì
nó ảnh hưởng quyết định đến hiệu quả chế biến, bảo quản những sản phẩm
này.
Hàm lượng nước được đánh giá thông qua độ ẩm hoặc hoạt độ nước. Có
nhiều phương pháp xác định hàm lượng nước trong thực phẩm, dưới đây là
một số phương pháp tiêu biểu:
▪ Xác định độ ẩm
✓ Phương pháp khối lượng
✓ Phương pháp chuẩn độ Karl Fischer
✓ Phương pháp xác định gián tiếp thông qua oBrix
▪ Xác định hoạt độ nước
✓ Phương pháp điểm sương
✓ Phương pháp đường đẳng áp
4.2.MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NƯỚC
4.2.1. Phương pháp khối lượng
Độ ẩm trong mẫu được xác định bằng cách xác định sự chênh lệch khối
lượng mẫu trước và sau khi sấy trong thiết bị sấy thích hợp (tủ sấy đối lưu, sấy
chân không hoặc microwave) và trong một thời gian sấy nhất định để hóa hơi
hoàn toàn nước có trong mẫu.
Phương pháp khối lượng được sử dụng đế xác định độ ẩm còn được gọi là
phương pháp sấy đến khối lượng không đổi. Bởi phương pháp này sử dụng sự
chênh lệch khối lượng của mẫu trước và sau khi sấy đến khối lượng không đổi
để tính toán giá trị độ ẩm. Chính vì sự chênh lệch khối lượng của mẫu được sử
dụng để tính toán độ ẩm mà phương pháp này được đánh giá là phương pháp

79

 không phản ánh chính xác lượng nước có trong mẫu. Điều này được lý giải
như sau: thứ nhất là, không phải tất cả nước có mặt trong thực phẩm đều có
thể bay hơi một cách dễ dàng khi tiến hành sấy mẫu mà chỉ có một phần nước
tồn tại trong mẫu không bị bay hơi khi sấy. Chẳng hạn, nước liên kết khó có
thể bay hơi hoàn toàn khỏi mẫu. Lý do thứ hai đó là tốc độ của quá trình bay
hơi nước sẽ tăng nhanh khi nhiệt độ sấy tăng. Tuy nhiên, thực phẩm là một tổ
hợp của rất nhiều thành phần nhạy cảm với nhiệt độ cao. Khi nhiệt độ sấy tăng
lên đến hoặc cao hơn 100°C thì những hợpc chất này có thể bị biến đổi thành
những hợp chất khác nhau. Lý do cuối cùng đó là không chỉ có nước mới bị
hóa hơi khi bị xử lý nhiệt mà còn có một số những thành phần khác cũng hóa
hơi khi nhiệt độ tăng. Mặc dù vậy, phương pháp khối lượng vẫn được lựa chọn
là phương pháp chuẩn để xác định hàm ẩm.
Phương pháp này chỉ cần một lượng mẫu nhỏ đã được đồng nhất và có thể
xác định chính xác độ ẩm trong khoảng từ 0,01% đến 99,99%. Sau đây,
chúng tôi sẽ trình bày cách tiến hành xác định độ ẩm bằng thiết bị sấy đối lưu.
4.2.2. Phương pháp chuẩn độ KarlFischer
Không giống như phương pháp khối lượng khi giả sử tất cả các chất bay
hơi được loại ra dẫn đến sự giảm khối lượng mẫu là nước, phương pháp chuẩn
độ Karl Fischer là phương pháp trực tiếp xác định hàm lượng nước. Phương
pháp này đặc biệt thích hợp với mẫu có độ ẩm thấp (nhỏ hơn 1%) và có thể
xác định hàm lượng ẩm ở mức 0,01%. Phương pháp Karl Fischer cũng thích
hợp khi xác định hàm lượng nước của những mẫu có hàm lượng đường hay
protein cao, mà không cần phải lo lắng về khả năng các chất này có thể phân
hủy khi xác định hàm lượng nước như ở phương pháp khối lượng.
Bản chất của phương pháp là dựa vào sự chuẩn độ nước bằng dung dịch
methanol khan có chứa iod, SO2 và một lượng dư pyridine. Chuẩn độ dựa trên

80

 phản ứng giữa iod với SO2, phản ứng này chỉ xảy ra khi có sự hiện diện của
nước theo phương trình:
I2-Pyr + SO2-Pyr + Pyr + H2O ➔ SO3-Pyr + 2PyrH+I-(Pyr được ký hiệu cho
pyridine)
Sản phẩm SO3-Pyr tiếp tục phản ứng với methanol tạo thành anion
methylsulfate:
SO3-Pyr + CH3OH ➔ PryH+CH3SO4-
Từ các phản ứng trên có thể thấy rằng mỗi một mol nước cần một mol I2.
Điểm tương đương của quá trình chuẩn độ đạt được khi chuẩn độ mẫu với
thuốc thử Karl Fischer cho đến khi màu iod bền (điều này cho thấy tất cả nước
đã phản ứng hết). Trong quá trình thực hiện phản ứng, màu của dung dịch
thường thay đổi từ màu vàng sang màu nâu, điều này gây khó khăn cho quá
trình phát hiện điểm tương đương bằng trực quan khi chuẩn độ thể tích. Ngoài
ra, điểm tương đương có thể dễ dàng được nhận biết khi thực hiện bằng
phương pháp chuẩn độ điện thế.
Phần này, chúng tôi sẽ giới thiệu phương pháp chuẩn độ thể tích Karl
Fischer với mẫu sử dụng ở dạng rắn và có độ ẩm thấp.
Chuẩn độ Karl Fischer có thể phân làm 2 loại: chuẩn độ điện dẫn và chuẩn
độ thể tích. Trong chuẩn độ Karl Fischer màu, một trong những biện pháp xác
định lượng nước phản ứng tại điện cực bằng cách đo lượng điện (Culông) cần
thiết để thực hiện phản ứng hoàn toàn giữa nước và thuốc thử Karl Fischer.
Ưu điểm của phương pháp là không cần chất chuẩn nhưng độ nhạy rất cao (có
thể xác định đến 10µg nước) và rất hữu ích cho xác định ở dạng vết. Đối với
chuẩn độ Karl Fischer thể tích dựa trên chất chuẩn (đó là thuốc thử Karl
Fischer) khi nó được thêm vào để phản ứng với nước hiện diện trong mẫu. Từ
thể tích thuốc thử có nồng độ chính xác tiêu tốn tại điểm tương đương có thể
xác định nồng độ nước nên vấn đề chuẩn hóa thuốc thử rất quang trọng.

81

 Phương pháp này có thể xác định lượng ẩm từ 10 ppm đến 100%.. Mặc dù
không nhạy với những mẫu có lượng ẩm rất nhỏ so với phương pháp chuẩn độ
Karl Fischer màu nhưng chuẩn độ Karl Fischer thể tích cho phép đo trong một
khoảng dao động lớn.
Thuốc thử Karl Fischer không ổn định do đó phải được chuẩn hoá thường
xuyên. Có thể sử dụng thuốc thử thương mại vì nó ổn định hơn.
Việc nhiễu có thể xảy ra đối với các mẫu có chứa những thành phần làm
giảm lượng iod. Mẫu chứa hàm lượng ketone hoặc aldehyde cao, đặc biệt khi
đo ở độ ẩm thấp, có thể có vấn đề vì những chất này có thể tạo ra nước.
Với phương pháp này có thể xác định độ ẩm nhỏ hơn 0.01%. Thời gian
phân tích mất từ 20-45 phút (tùy thuộc vào mẫu) bao gồm: hiệu chuẩn, đo
blank, trích ly mẫu trong dung môi Karl Fischer và kiểm tra.
4.3.PHƯƠNG PHÁP NỘI SUY GIÁN TIẾP ĐỂ ƯỚC TÍNH LƯỢNG
NƯỚC BẰNG CÁCH ĐO OBRIX
Phương pháp gián tiếp xác định hàm lượng nước có thể chia thành 2 nhóm:
nhóm phương pháp khối lượng, tức là xác định khối lượng mẫu trước và sau
khi sấy và nhóm phương pháp xác định nồng độ chất tan trong mẫu từ đó suy
ra nồng độ nước. Khi xác định hàm lượng nước dựa trên việc xác định nồng
độ chất tan trong mẫu có hai giả định cần được thực hiện. Giả định đầu tiên là
đặc tính của phép đo phải có một độ lặp dựa trên nồng độ chất tan. Giả định
thứ hai là nồng độ nàycó thể được chuyển đổi chính xác sang hàm ẩm.
Những phương pháp gián tiếp dựa vào việc ước lượng nồng độ chất tan
thường sử dụng đường cong hiệu chỉnh để biểu diễn mối quan hệ giữa đặc tính
được đo với nồng độ chất tan, từ đó suy ra hàm lượng nước. Hai phương pháp
cổ điển dành cho việc ước lượng hàm lượng chất tan là dựa vào khối lượng
riêng và chỉ số khúc xạ của dung dịch vì khối lượng riêng (hay chỉ số khúc xạ)
sẽ thay đổi khi nồng độ chất tan của dung dịch thay đổi.

82

 4.3.1. Ước lượng nồng độ bằng khúc xạ kế

4.3.1.1.Nguyên tắc
Chỉ số khúc xạ là một hệ quả của sự thay đổi tốc độ ánh sáng trong các môi
trường khác nhau, được xác định bằng tỷ số giữa vận tốc ánh sáng trong chân
không với vận tốc ánh sáng trong môi trường. Nếu ánh sáng trong chân không
là tia tới theo đường biên bề mặt phẳng với môi trường, thì chỉ số khúc xạ
cũng là tỷ số của sin góc tới của tia ánh sáng trong chân không và sin của góc
khúc xạ trong môi trường.
Chỉ số khúc xạ của một chất so với không khí là tỷ lệ giữa sin góc tới và
sin góc khúc xạ của chùm tia sáng truyền từ không khí vào chất đó. Trong
thực tế thường được sử dụng không khí là môi trường tham khảo chứ không
phải là chân không. Chỉ số khúc xạ của không khí ở 1 atm, 25°C là 1.00027,
giá trị này có thể được sử dụng như một hằng số để xác định chỉ số khúc xạ
thực của hệ thống.
Chỉ số khúc xạ là một đặc tính vật lý của môi trường, nó phụ thuộc vào
bước sóng ánh sáng và nhiệt độ đo. Nó có thể được xác định bằng cách nhận
dạng góc phản xạ tới hạn, đó là góc tới, góc giới hạn giữa bề mặt ranh giới của
một tia ánh sáng trong môi trường mà tại đó góc khúc xạ bằng 90o. Bất kỳ tia
ánh sáng bên trong môi trường đến bề mặt với một góc tới lớn hơn góc giới
hạn sẽ bị phản xạ nội toàn phần.
Trong thực tế, góc phản xạ tới hạn được đo tại biên của chất lỏng bằng lăng
kính thủy tinh có chỉ số khúc xạ đã biết, chứ không phải tại biên của chất lỏng
với khí. Một thiết bị thông dụng là khúc xạ kế Abbe có sử dụng lăng kính bù
trừ (lăng kính Amici) cho phép sử dụng ánh sáng trắng để xác định chỉ số
khúc xạ ánh sáng của bước sóng của dòng sodium D (kết quả đọc tương ứng
với vạch D của đèn natri). Điều này là một lợi thế vì nguồn ánh sáng trắng có

83

‎
 sẵn hơn nguồn sodium D và do đó việc sử dụng khúc xạ kế cầm tay rất khả
thi.
Yêu cầu đầu tiên là mẫu phải ở dạng dung dịch. Trong một vài thiết bị,
dung dịch được đặt giữa hai lăng kính và hình ảnh của đường biên tia giới hạn
được điều chỉnh để gặp mốc tham khảo. Sự điều chỉnh này để chỉ số khúc xạ
và đương lượng oBrix có thể được đọc từ một thang đo. Nhiệt độ mẫu phải
được xác định, hoặc thiết bị phải có chế độ bù trừ nhiệt. Một số khúc xạ kế kỹ
thuật số tự động sử dụng phương pháp trình bày mẫu tương tự nhưng chúng có
thể tự động ghép đôi biên giới hạn tới mốc tham khảo. Một số loại thiết bị đo
khúc xạ tự động khác không yêu cầu mẫu được đặt vào giữa hai lăng kính.
Thiết bị loại này yêu cầu mẫu được đặt trên bề mặt thủy tinh và sự phát hiện
dựa vào phản xạ tới hạn bên trong đến thủy tinh. Trong thiết bị này sử dụng
đầu dò điện tử và chế độ bù trừ nhiệt có thể được lập trình khi vận hành.
4.3.1.2.Cách tiến hành
a. Dụng cụ, hóa chất
! Khúc xạ kế Abbe (UPF-22 hoặc UPF-23 hoặc tương đương)
! Máy điều nhiệt
! Nhiệt kế chuẩn xác ( loại 4 E.2 )
! Rượu etanola tinh khiết hoặc các dung môi tinh khiết khác.

(a) (b)
Hình 3.8: (a) Brix kế cầm tay, (b) Brix kế để bàn

84

 b. Chuẩn bị xác định

− Trước khi xác định, phải rửa bề mặt lăng kính của khúc xạ kế bằng vài
giọt rượu hay dung môi khác, lau sạch và thấm khô bằng giấy lọc hoặc
vải lụa sạch, mềm và không bị xơ bông.
− Nối máy điều nhiệt với vỏ lăng kính của khúc xạ kế và cho nước có
nhiệt độ 20oC đi qua vỏ trong 15 đến 20 phút.
− Trước khi bắt đầu thí nghiệm, phải kiểm tra lại độ chính xác của thiết bị
với nước cất hai lần, độ khúc xạ của nước cất này ở 20oC bằng 1,3330
hoặc theo chất lỏng mẫu kèm theo khúc xạ kế. Việc tiến hành kiểm tra
dựa theo bản hướng dẫn kèm theo máy.
− Nếu khúc xạ kế không theo đúng chỉ số khúc xạ của nước hoặc mẫu nói
trên, phải dùng núm hiệu chỉnh số 0 để hiệu chỉnh về độ chia cần thiết.
c. Tiến hành xác định
− Dùng pipet nhỏ một đến hai giọt mẫu lỏng lên bề mặt của lăng kính (bề
mặt này đã được rửa sạch và làm khô từ trước), nhưng không được
chạm pipet vào lăng kính, sau đó nhanh chóng kết hợp hai lăng kính và
ép chúng lại.
Với những chất lỏng dễ bay hơi phải nhỏ qua lỗ vào khe giữa hai lăng
kính. Nhẹ nhàng đặt ống nhìn ở vị trí nằm nghiêng.
− Điều chỉnh gương tương ứng với nguồn sáng tự nhiên hoặc nhân tạo sao
cho có được sự chiếu ánh sáng mạnh nhất trường quan sát về xuất hiện
ranh giới sáng tối (đen trắng).
Nếu ranh giới sáng tối có chút màu, thì phải quay lăng kính bù trừ để
triệt tiêu màu. Nếu hai vùng sáng tối không thật rõ rệt thì cần rửa cẩn
thận lăng kính ở chỗ tia sáng đi vào.

85

 Sau đó từ từ quay núm quay gắn với thang chia độ hình cung cho đến
khi ranh giới sáng tối cắt giao điểm hai vạch đen một cách chính xác và
cân đối.
− Việc tính toán chỉ số khúc xạ được tiến hành nhờ một kính lúp ở thang
chia độ hình cung theo vạch chia tương ứng với đường ngầm của thang.
Ghi lại kết quả thu được và lặp lại năm lần (lần lượt từ trên xuống và từ
dưới lên) sau đó lấy giá trị trung bình của năm lần đo, coi đó là kết quả
xác định.
− Lấy giá trị trung bình số học của hai lần xác định song song làm kết quả
thí nghiệm, đồng thời chênh lệch giữa kết quả hai lần đo không được
vượt quá 0.0003.
− Sau khi kết thúc, phải rửa cẩn thận bề mặt lăng kính bằng rượu hoặc
bằng các dung môi tinh khiết khác (điều này phụ thuộc vào độ hoà tan
của chất nghiên cứu) và làm khô lăng kính như trước khi bắt đầu xác
định.
4.3.1.3.Một số lưu ý
− Để xác định chỉ số khúc xạ ở các nhiệt độ cao hơn 20oC cũng phải làm
tương tự nghĩa là cho nước có nhiệt độ cần thiết qua vỏ lăng kính của
khúc xạ kế.
− Trong trường hợp nhiệt độ phòng cao hơn nhiệt độ cần xác định chỉ số
khúc xạ thì phải làm theo một trong các phương pháp sau đây:
Tiến hành xác định trong các phòng có máy điều hoà nhiệt độ.
Đặt một chậu nước có làm lạnh bằng đá xuống dưới 20oC ngay cạnh
máy điều nhiệt. Nước hồi lưu cho chảy qua một ống xoắn bằng kim loại
đặt trong chậu rồi mới chảy về máy điều nhiệt. Phải chờ cho nhiệt độ vỏ
lăng kính xuống 20oC (hoặc nhiệt độ cần thiết khác) rồi mới tiến hành
xác định.

86

 Nếu chất lỏng xác định có chỉ số khúc xạ tỷ lệ tuyến tính với nhiệt độ
thì có thể xác định chỉ số khúc xạ ở hai nhiệt độ khác nhau rồi ngoại suy
về nhiệt độ cần thiết.
− Trong trường hợp độ ẩm không khí lớn hơn nước thường đọng ở lăng
kính khúc xạ kế làm mờ đi, ảnh hưởng đến độ chính xác của phép đo.
Phải dùng giấy lọc hay vải sạch thấm khô lăng kính ở phần đi vào và đi
ra của ánh sáng.
− Với những chất có nhiệt độ sôi quá thấp bay hơi rất nhanh, không nên
mở lăng kính mà phải nhỏ chất lỏng nghiên cứu qua khe hở giữa hai
lăng kính của khúc xạ kế.
4.3.2. Ước lượng nồng độ bằng tỷ trọng kế
4.3.2.1.Nguyên tắc
Tỷ trọng kế được sử dụng để xác định khối lượng riêng hoặc trọng lượng
riêng của một chất lỏng sử dụng nguyên lý của lực đẩy Archimedes. Những
kết quả lực đẩy Archimedes từ áp lực từ dưới lên trên bất kỳ đối tượng bị
nhúng chìm hoặc bị nhúng một phần trong chất lỏng. Áp lực từ dưới lên được
tạo ra như một hệ quả của khối lượng chất lỏng bị thế chỗ. Tại điểm của phần
bị nhúng chìm khi áp lực từ dưới lên vừa bằng khối lượng của tỷ trọng kế, thì
tỷ trọng kế sẽ nổi. Mực chất lỏng có thể được đo dựa theo thang đo đã khắc
trên tỷ trọng kế. Một cách đơn giản, khối lượng riêng là khối lượng của tỷ
trọng kế chia cho thể tích chất lỏng bị chiếm chỗ khi tỷ trọng kế nổi.
Tỷ trọng kế được thiết kế với phần chân đế có bầu rộng và phần đỉnh hình
ống hẹp. Giả sử rằng mức chất lỏng bên trong phần ống, thể tích chất lỏng thế
chỗ là thể tích của bầu cộng với phần tương đương vị trí của chất lỏng trong
phần thân tỷ trọng kế. Khi thể tích bầu lớn trái ngược với thân, một sự thay
đổi nhỏ về tỷ trọng sẽ gây kết quả biến động lớn trên vạch của thân tỷ trọng.
Những vạch tương ứng với những thể tích thay thế khác nhau được khắc trên

87

 thân tỷ trọng. Những vạch này có thể được đặt nhãn như những giá trị tỷ trọng
hoặc như những nồng độ dung dịch đường tương đương (oBrix). Kích thước
của bầu và thân tỷ trọng xác định phạm vi tỷ trọng hoặc khối lượng riêng của
tỷ trọng kế.
Tỷ trọng kế đã được hiệu chỉnh trước bởi nhà sản xuất, những phép hiệu
chỉnh này chỉ có giá trị ở một nhiệt độ xác định. Do đó trước khi sử dụng cần
hiệu chỉnh lại bằng cách sử dụng những dung dịch đường đã biết nồng độ. Tỷ
trọng kế khác nhau có sự khác nhau trong tỷ lệ của thể tích bầu chính với thể
tích thân đo. Ngoài ra, chúng còn có sự khác nhau về khối lượng, do đó mức
bị nhúng chìm dưới nước là khác nhau. Độ nhạy của tỷ trọng tăng khi độ
mỏng của thân giảm, nhưng điều này lại làm giảm giới hạn đo của tỷ trọng.
Khi sử dụng, để xác định tỷ trọng của dung dịch một cách chính xác, đầu tiên
người ta sử dụng tỷ trọng có giới hạn đo lớn để ước lượng giá trị đo, sau đó
dùng một tỷ trọng tinh có giới hạn đo phù hợp để xác định chính xác giá trị tỷ
trọng.
4.3.2.2.Cách tiến hành
a. Dụng cụ, hóa chất
▪ Tỷ trọng kế có độ chia phù hợp. Nếu không biết độ chia phù hợp có thể
lựa chọn tỷ trọng có giới hạn đo lớn. Sau khi đo có thể ước lượng được
giá trị đo, trên cơ sở đó lựa chọn tỷ trọng có giới hạn đo phù hợp để thu
kết quả chính xác.
▪ Nhiệt kế
▪ Bộ điều nhiệt
▪ Bình hình trụ bằng thuỷ tinh không màu có đường kính tối thiểu phải
lớn hơn đường kính lớn nhất của tỷ trọng kế 25 mm.

88

 b. Tiến hành xác định

▪ Trước khi xác định, phải rửa tỷ trọng với nước cất và lau sạch và thấm
khô bằng giấy lọc hoặc vải lụa sạch, mềm và không bị xơ bông.
▪ Cho dung dịch mẫu vào bình hình trụ sạch và khô sao cho mức chất
lỏng cách miệng bình 4 cm. Đưa bình hình trụ có chất lỏng vào bể điều
nhịêt và giữ 20 phút ở nhiệt độ 20±0.1oC, sau đó dùng nhiệt kế vừa
khuấy vừa đo nhiệt độ của chất lỏng . Khi nhiệt độ của chất lỏng đạt
20±0.1oC cẩn thận thả tỷ trọng kế khô vào bình hình trụ sao cho tỷ trọng
kế không chạm vào đáy và thành bình hình trụ. Sau 3-4 phút đọc trực
tiếp mật độ của chất lỏng. Khoảng cách đáy dưới của tỷ trọng kế đến
đáy hình trụ không được nhỏ hơn 3 cm.
▪ Sau khi đo kiểm tra lại nhiệt độ của chất lỏng, nếu sự thay đổi nhiệt độ
lớn hơn 2oC, cần phải đo lại. Hoặc có thể sử dụng phương pháp hiệu
chỉnh nhiệt độ tương ứng.
▪ Tỷ trọng của chất lỏng ứng với độ chia của tỷ trọng kế theo điểm dưới
của mặt cầu lõm đối với chất lỏng trong suốt và sáng màu và giới hạn
trên của mặt cầu lõm đối với chất lỏng hơi đục và tối màu.
▪ Sau khi sử dụng xong, tỷ trọng kế được rửa sạch, lau khô và đặt vào
hộp.
c. Tính kết quả
Kết quả đo trung bình của hai lần đo liên tiếp.

89

 Giá trị đo

Dung dịch mẫu

Tỷ trọng kế

Hình 3.10 Xác định nồng độ bằng tỷ trọng kế

Một số lưu ý
Tỷ trọng kế được nhà sản xuất thiết kế với nhiệt độ đo chuẩn là ở 20oC.
Nếu nhiệt độ đo lớn hơn hay nhỏ hơn ở 20oC, cần phải hiệu chỉnh. Vì nếu
nhiệt độ thay đổi, dẫn đến sự thay đổi sức căng bề mặt gây ra sai số (sai số
đáng kể). Mặc khác, nhiệt độ cao, thủy tinh giản nở gây ra sai số khi đo (tuy
nhiên sai số này không đáng kể). Do đó nhiệt độ của chất lỏng phải tương ứng
với nhiệt độ ghi trên tỷ trọng kế (thường là 20oC). Trong trường hợp phải đo tỷ
trọng của dung dịch có nhiệt độ cao hơn nhiệt độ ghi trên tỷ trọng kế, cần lập

90

‎
 bảng hiệu chỉnh, đồng thời dựa vào bảng này để xác định sai số trong quá
trình đo.
Khi đọc chỉ số, tỷ trọng kế phải đứng yên, không chạm vào đáy và thành
bình.
Ngoài việc dùng tỷ trọng kế, còn rất nhiều phương pháp khác xác định tỷ
trọng của dung dịch. Một phương pháp nữa rất thường hay xác định tỷ trọng
của dung dịch đó là sử dụng bình đo tỷ trọng.
4.3.3. Xác định tỷ trọng bằng bình đo tỷ trọng
4.3.3.1.Nguyên tắc
Tỷ trọng của mẫu thử được xác định bằng cách so sánh khối lượng mẫu thử
và nước trong cùng 1 bình tỷ trọng ở 20oC.
4.3.3.2.Dụng cụ, hóa chất
! Bình tỷ trọng có kích thước và kiểu dáng thích hợp với chất lỏng cần đo
! Bể điều hoá nhiệt có thể điều chỉnh được nhiệt độ ở 20oC ± 0.1oC.
! Nhiệt kế

Hình 3.11 Bình đo tỷ trọng

4.3.3.3.Tiến hành
! Cân bình tỷ trọng sạch và khô (cả nút) với độ chính xác đến 0.0001g
! Cho nước cất đã đun sôi và để nguội vào bình, xác định khối lượng
nước chứa trong bình một cách chính xác sau khi đã để trong bể điều

91

 hoà nhiệt có nhiệt độ 20oC ± 0.1oC. Ghi khối lượng của nước cất trong
bình (m2) .
! Cho mẫu vào cùng bình tỷ trọng đã rửa sạch sấy khô xác định chính xác
khối lượng của mẫu chứa trong bình ở 20oC ghi khối lượng (m1). Đối
với chất lỏng để bay hơi cần phải thao tác hết sức cẩn thận để tránh mất
mát do bị bay hơi.
4.3.3.4.Tính kết quả
! Kết quả có thể biến đổi với các điều kiện áp suất nhưng thông thường
sự biến đổi này không đáng kể và ta có thể bỏ qua được.
! Khối lượng riêng của mẫu ở 20oC tính bằng g/ml được tính theo công
thức sau:

Trong đó:
m1: khối lượng chính xác của mẫu thử cho vào bình ở 20oC tính
bằng g
m2: khối lượng chính xác của nước cất cho vào bình ở 20oC tính
bằng g
dnước: khối lượng riêng của nước ở 20oC bằng 0.9982g/ml
A: số hiệu chỉnh được tính bằng A = Pa.m2 (Pa là khối lượng
riêng của không khí bằng 0.001g/ml)

92

‎
‎
‎

‎
‎
‎

 5. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN

TRONG THỰC PHẨM
5.1.GIỚI THIỆU CHUNG
5.1.1. Protein trong thực phẩm
Protein là thành phần có nhiều ở trong t t c c c tế bào. Trừ m t s lo i
protein dự trữ, h u h t protein đ u có chức năng sinh học quan trọng ho c c
vai tr t o cấu trúc cho tế bào. Protein l đại phân tử được cấu tạo từ các axit
amin. Trong phân tử, các axit amin liên kết với nhau bằng liên kết peptit tạo
thành chuỗi peptit. Phân tử protein có thể chứa một hay nhiều chuỗi peptit.
Các nguyên tố hóa học tham gia vào cấu tạo của protein gồm hydro, carbon,
nitơ, oxy, lưu huỳnh, có thể có photpho và một số nguyên tố khác. Khối lượng
phân tử của protein tương đối lớn và dao đ ng trong một khoảng rộng từ 5000
đến hơn 1,000,000 đơn vị dalton. Một điều đặc biệt khi nghiên cứu hàm lượng
các nguyên tố có mặt trong phân tử protein thì người ta nhận thấy rằng nitơ là
nguyên tố có hàm lượng thay đổi nhất trong số các nguyên tố có mặt trong
protein. Hàm lượng nitơ thay đổi từ 13,4% đến 19,1% do sự khác nhau về
thành phần axit amin có trong protein. Nói chung, nh ng lo i protein giàu axit
amin kiềm t nh chứa nitơ nhiều hơn.

93

ò
ạ
í
ầ
ế

ề

‎
à
ấ
ộ
ả
á
ữ
ạ
ộ
ố
‎
ặ
ạ
ó
 Protein có thể được phân loại theo thành phần, cấu trúc, chức năng sinh
học hoặc tính tan. Ví dụ, protein đơn giản chỉ chứa các axit amin, tuy nhiên
protein ph c t p còn chứa thêm các thành phần kh c không có bản chất
protein.
Chính vì kích thước phân tử lớn làm cho protein tạo thành dịch keo khi hòa
tan. Và các phân tử keo này không thể đi qua màng bán thấm nên có thể tiến
hành tinh sạch protein ra khỏi những thành phần có kích thước nhỏ. Độ bền
của dịch keo phụ thuộc vào pH, nhiệt độ và mức độ hydrat hóa. Khi loại bỏ
các yếu tố giúp bền hệ keo thì các phân tử protein sẽ kết tụ lại với nhau. Đặc
tính này cũng được lợi dụng để tinh sạch protein hay để sản xuất những sản
phẩm giàu protein như đậu hủ, phô mai…
Hiện tượng protein chuyển từ trạng thái keo trong dung dịch thành dạng
kết tụ còn được gọi là hiện tượng kết tủa protein hay biến tính protein. Sự biến
tính protein được chia thành hai loại: loại thứ nhất là biến tính thuận nghịch,
khi loại bỏ tác nhân gây biến tính thì phân tử protein trở về trạng thái ban đầu
và loại thứ hai là biến tính không thuận nghịch là khi loại bỏ tác nhân gây biến
tính mà protein vẫn không thể trở về trạng thái ban đầu được. Khi bị biến tính
thì tính tan, cấu trúc không gian cũng như tính chất chức năng của protein có
thể bị thay đổi.
Phân tích protein l m t quy tr nh phức tạp do kh năng gây nhi u c a một
số thành phần thực phẩm kh c có những tính chất hóa lý tương tự như protein.
Hay khi phân tích hàm lượng nito trong prtein cũng sẽ gặp một vấn đề đó là
nitơ không ch có nguồn gốc từ protein m c n từ các axit amin tự do, peptit
nh , axit nucleic, phospholipit, porphyrin và một số vitamin, alcaloit, axit uric,
urea và các ion amonium. Do đó, phụ thuộc vào phương pháp phân t ch, các
thành phần khác của thực phẩm có thể ảnh hưởng đến k t qu phân tích
protein m c đ kh c nhau. Thông thường để khảo sát hàm lượng protein thì

94

ỏ

ở
ứ
ứ
ỉ

ạ
ộ
à
á
ộ
á
ì

à
ò
ả
á
ế
ễ
ả
ủ
í
 cần phải tiến hành bước tinh sạch bằng các phương pháp như : kết tủa thuận
nghịch, sắc ký ái lực…
Nhiều phương pháp x c đ nh h m lư ng protein đã được phát triển.
Nguyên tắc chung của các phương pháp này d a trên vi c xác định hàm lượng
nitơ nguyên t , liên kết peptit, axit amin thơm, khả năng nhuộm màu, độ hấp
thụ tử ngoại của protein và tính chất khuếch tán ánh sáng.
Những yếu tố cần được xem xét khi lựa chọn phương pháp phân tích đó là
độ nhạy, độ đúng, độ chính xác, thời gian và chí phí phân tích, c c đặc điểm
của vật liệu phân tích.
5.1.2. Vai trò của việc phân tích protein
Phân t ch protein c vai tr quan tr ng v c c m c đ ch sau:
▪ Khai báo giá trị dinh dưỡng trên nhãn
▪ Khảo sát c c tính chất chức năng. Protein trong nhiều loại thực phẩm có
các tính chất chức năng đặc biệt: ví dụ, gliadin và glutenin của bột mì
để làm bánh mì, cazein trong s a để đông tụ trong sản xuất pho mai và
albumin trứng để tạo bọt.
▪ Xác định hoạt tính sinh học. Một s protein, như enzym và chất ức chế
enzym l đ i tư ng nghiên c u c a khoa học thực phẩm và dinh dưỡng
học. Ví dụ, các enzym protease để làm mềm thịt, pectinase trong quá
trình chín của quả và chất ức chế trypsin trong hạt họ đậu đều có bản
chất protein.
▪ Ngoài ra, phân tích hàm lượng protein để nhà sản xuất đánh giá sự đồng
đều của các lô hàng trong sản xuất.
5.2.CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH PROTEIN
5.2.1. Xác định protein tổng theo phương pháp Kjeldahn
Nguyên tắc của phương pháp này là vô cơ hóa mẫu thực phẩm bằng
H2SO4 đậm đặc với chất xúc tác để hình thành (NH4)2SO4. Khi đó, kiềm

95

í
à
á
ố

ố
ợ
ó

á

ò
ị
ứ
ữ

ủ
à
ọ

ố

ì
ợ
á

ự
ụ

í
ệ

á
 mạnh (NaOH hoặc KOH) sẽ đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4. Hệ thống ngưng
tụ sẽ giúp ngưng tụ NH3 vào bình hứng có chứa sẵn một lượng dư H2SO4.
Định phân lượng H2SO4 dư bằng dung dịch NaOH, từ đó xác định được
lượng H2SO4 đã phản ứng và tính được hàm lượng nitơ tổng có trong mẫu.
Các Phương trình phản ứng xảy ra:
▪ Quá trình vô cơ hóa mẫu:
Xúc tác, to

RCH(NH2)COOH + H2SO4 đđ → CO2! + SO2! + NH3 + H2O

NH3 + H2SO4đđ → (NH4)2SO4
▪ Quá trình chưng cất:
✓ Dùng dung dịch NaOH đuổi NH3 ra khỏi dung dịch.
NaOH + (NH4)2SO4→ Na2SO4 + NH3! + H2O
✓ NH3 bay sang bình hứng có chứa dung dịch H2SO4(đã biết trước nồng
độ, thể tích).
2NH3 + H2SO4→ (NH4)2SO4
▪ Cơ chế tác dụng của chất xúc tác:
✓ Xúc tác CuSO4:
2CuSO4 → Cu2SO4 + SO2! +2O
Cu2SO4 + H2SO4 → CuSO4 + SO2! + 2H2O
✓ Xúc tác Selenium:
Se + H2SO4 → H2SeO3 + 2SO2 + 2H2O
H2SeO3 → SeO2 + H2O
SeO2 → Se + 2O
Dùng Se sẽ làm cho tốc độ phản ứng nhanh hơn so khi dùng CuSO4 nhưng
lại xảy ra tiêu hao một số đạm vì các phản ứng sau đây:
(NH4)2SO4 + H2SeO3 → (NH4)2SeO3 + H2SO4
(NH4)2SeO3 → 3H2O + 2/3NH3 + Se + 2/3N2

96

 ✓ Xúc tác thủy ngân:

2HgO → Hg2O + O
Hg2O → Hg + HgO
Hg + H2SO4→ HgO + SO2 + H2O
Dùng xúc tác thủy ngân cũng làm hao hư một số đạm. Đó là (NH2Hg)2SO4.
Để loại trừ hợp chất này người ta dùng bột kẽm và chất kiềm để tạo ra H+, H+
này sẽ khử hợp chất này trở lại (NH4)2SO4. Thủy ngân củng cố tốc độ phản
ứng rõ rệt nhưng có nhiều phiền phức, tốn kém và độc hại. Còn K2SO4 được
dùng để tăng nhiệt độ sôi của dung dịch lên gần 300 - 4000C.
Hàm lượng protein thô theo % (X) được tính bằng công thức:
[(VB − VS ) × N × 0,014 × 100 × K ]
X1 = ,%
M

X 2 = X 1 × 6.25, %

Trong đó:
N: Nồng độ dung dịch chuẩn NaOH, N
VB: Thể tích dung dịch NaOH chuẩn mẫu trắng, mL
Vs: Thể tích dung dịch NaOH chuẩn mẫu thử, mL
M: Khối lượng mẫu thử, g
K: Hệ số chuyển đổi nitơ sang đạm tương ứng (theo bảng4.1)
X1:Hàm lượng nitơ, %
X2: Hàm lượng protein thô, %

97

 Bảng 4.1H s chuy n đ i nitơ protein c a nhi u lo i th c ph m

Th c ph m H s chuy n đ i
Tr ng, th t 6.25
S n ph m ch bi n t s a 6.38
L am 5.70
C c lo i ng c c kh c, h t c d u 6.25
H nh nhân 5.18
Đ u ph ng, đ u Braxin 5.46
C c lo i đ u kh c, d a 5.30

Phương pháp này được áp dụng với mọi trạng thái khác nhau của thực
phẩm từ rắn, lỏng, sệt... với chi phí thấp, l phương ph p ch nh th c x c đ nh
protein thô, c th đo lư ng microgram protein b ng phương ph p c i ti n
(phương ph p micro Kjedahl). Nhưng cần lưu ý rằng phương pháp này xác
định hàm lượng nitơ t ng chứ không riêng gì hàm lượng nitơ t protein, thời
gian phân tích khá dài, và hóa chất có tính ăn mòn
5.2.2. Xác định protein tổng theo phương pháp Dusma
Nguyên tắc chung của phương pháp đó là mẫu được đốt cháy hoàn toàn
bằng khí oxi tinh khiết ở nhiệt độ khoảng 950oC. Hỗn hợp khí sau quá trình
đốt cháy chủ yếu là CO2, H2O, O2, NOx và N2. Ngoài ra,có thể có halogen,
hiđro halogenua, các đioxit và trioxit của lưu huỳnh. Hỗn hợp khí được cho
qua đồng kim loại và đồng oxit nóng đỏ. Các oxit của nitơ bị đồng phân huỷ
thành nitơ và oxy, đồng thời oxy này cùng với oxy nằm trong các khí đốt tạo
với đồng kim loại thành đồng oxit. Hợp chất cacbon oxit khi gặp đồng oxit sẽ
bị oxy hoá thành cacbondioxit trước khi hấp phụ vào dung dịch kiềm chỉ còn
lại khí nitơ thoát ra. Đo lượng khí nitơ thoát ra bằng nitơ kế sẽ tính toán được
hàm lượng protein có trong mẫu

98
ả
ú
á
á
ậ
ạ
ệ
ứ

ự
ố
ì
ạ
ạ
ẩ
ụ
ẩ
ị
ậ
ũ
ể
ệ
á
ế
ậ
ó
ố
ố
á
ổ
ế
ể
á
ừ
ừ
ể
ổ
ữ
ạ
ợ
ổ
ó
ầ

à
ủ

ề


ằ
ạ
á

ự
í

ừ
ẩ
ứ
á

á
ả
ị
ế

 Khi dùng phương pháp Dumas cần phải đảm bảo các oxit nitơ chuyển hoàn
toàn thành nitơ, còn những khí không bị hấp thụ bởi dung dịch kiềm (ví dụ khí
oxy và cacbon oxit) phải được loại hoàn toàn trước khi đi vào bình thu chứa
dung dịch kiềm. Khí nitơ sẽ được đẩy vào bình thu khí bằng khí CO2 được nén
sẵn hoặc được tạo ra bởi dung dịch có tên là bình kip. Bình kip tạo ra CO2
bằng cách cho axít HCl đậm đặc vào đá vôi. Khí CO2 đẩy khí N2 vào nitơ kế
và sau đó CO2 bị hấp thụ bởi dung dịch kiềm KOH (nồng độ khoảng 50%).
Sau khi khí N2 đi vào khí áp kế, để cho nhiệt độ cân bằng khoảng 15 phút, sau
đó đo lần lượt nhiệt độ, áp suất và thể tích khí của khí áp kế và từ đó tính ra
hàm lượng nitơ.
Lg %N = lgV + lga + (1 – lg(lượng cân))
Trong đó:
V: thể tích khí ở điều kiện đã cho
a: trọng lượng của 1 mL nitơ ở nhiệt độ và áp suất ghi trên khí áp kế
Quy trình xác định hàm lượng protein theo phương pháp Dumas

99

 Hệ thống khí (Khí mang, khí oxy)

Cho mẫu vào lò đốt

(Cho mẫu rắn hoặc lỏng đã cân vào ống đựng hoặc giấy thiếc, tiêm mẫu lỏng

Lò đốt hoạt động ở nhiệt ở nhiệt độ từ 850oC đến 1200oC

(Nguồn oxy cung cấp cho lò đốt ở dạng điều chỉnh hoặc tự động)

Chất hấp thụ

(Dùng chất hấp thụ SO2/SO3, halogen tùy thuộc vào nhà sản xuất thiết bị)

Loại nước bằng cách ngưng tụ, sử dụng bộ làm lạnh bằng điện

Khử NOx thành N2 và loại oxy sinh ra bằng đồng

Loại ẩm và CO2 bằng cách sử dụng các hóa chất khô Mg(ClO4)2 cho nước,

Detector dẫn nhiệt

(Dòng khí dùng cho xác định: khí mang và N2, dòng khí bù trừ: khí mang)

Bộ xử lý tín hiệu

100

 101

 102

 103

 5.2.3. Phương pháp Biuret

5.2.3.1.Nguyên tắc
Trong môi trường kiềm, ion đồng (II) có khả năng tạo phức với các liên kết
peptid sẽ tạo phức có màu tím hồng. Độ hấp thu của phức tạo thành được đo ở
bước sóng 540 nm. Từ độ hấp thu đo được người ta có thể xác định hàm
lượng protein có trong mẫu bằng phương pháp đường chuẩn. Đây là phương
pháp phổ biến được sử để xác định hàm lượng protein vì phản ứng này là phản
ứng đặc trưng của liên kết peptit.

Hình 4.4 Phản ứng xảy ra trong phương pháp Biuret.

5.2.3.2.Quy trình phân tích
▪ Ho 5 ml dung dịch cơ chất phản ứng biuret với 1 ml dung dịch protein
(1-10 mg protein/ml). Dung dịch cơ chất phản ứng biuret gồm CuSO4,
NaOH và tartrat kali natri (để n đ nh ion đồng trong môi trường kiềm).
▪ Sau khi hòa dung dịch phản ứng, để ở nhiệt độ phòng 15 phút hoặc 30
phút và đo mật độ quang c a m u ở bước sóng 540 nm.
▪ Nếu dung dịch phản ứng không trong suốt cần lọc hoặc ly tâm.
▪ Xây d ng đường chuẩn v i albumin của serum bò (BSA: Bovine Serum
Albumin).

104
à

ự

ớ
ủ
ổ
ẫ

ị

 5.2.3.3.Áp dụng
Phương pháp biuret được dùng để xác định hàm lượng protein c trong ngũ
cốc, thịt, đậu nành cũng như để đánh giá chất lượng thức ăn chăn nuôi (AOAC
Method 935.11).
5.2.3.4.Ưu điểm
▪ Là phương pháp phân tích protein đơn giản nhất.
▪ So với phương pháp Kjeldahl ít tốn kém hơn; nhanh hơn (có thể hoàn
thành nhanh hơn 30 phút).
▪ Ít c sự chênh lệch về màu sắc hơn so với các phương pháp Lowry,
phương pháp đo hấp thụ UV hoặc đo độ đục.
▪ Rất ít các hợp chất khác có trong thực phẩm gây nhi u đến phản ứng
biuret.
▪ Gi tr đo đư c không tính nitơ từ các nguồn không phải từ peptid hoặc
protein.
5.2.3.5.Nhược điểm
▪ Không nhạy như phương pháp Lowry, đòi hỏi lượng protein tối thiểu
cho phân tích 2-4 mg.
▪ Mật độ quang đo đư c có thể bị tăng lên do sự có mặt của các sắc màu
khác.
▪ Nồng độ muối amon cao ảnh hưởng đến phản ứng.
▪ Màu sắc khác nhau tùy loại protein: gelatin cho màu hồng tím.
▪ Dung dịch trước khi đo có thể bị đục nếu có mặt lipit và carbohydrat ở
nồng độ cao.
▪ Không phải là phương pháp tuyệt đối: cần phải xây dựng đường chuẩn
hoặc đối chiếu với phương pháp Kjeldahl.

105
á

ó

ị

ợ

ợ

ễ

ó
 5.2.4. Phương pháp Lowry
5.2.4.1.Nguyên tắc
Phương pháp Lowry kết hợp phản ứng biuret với phản ứng khử của dung
dịch Folin-Ciocalteau (phosphomolybdic/ phosphotungstic acid) v i các gốc
tyrosine và tryptophan của phân tử protein. Phức màu xanh da trời tạo ra được
đo ở bước song 750 nm. T quy trình ban đầu Miller và Hartree đ c nh ng
cải tiến để cải thiện độ tuyến tính của quan hệ gi a mật độ quang v i nồng độ
protein.
Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong
một phạm vi nhất định. Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn,
ta có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu.

Hình 4.5 Phản ứng xảy ra trong phương pháp Lowry

5.2.4.2.Quy trình
Quy trình sau dựa trên nh ng cải tiến của Hartree:
▪ H a tan m u protein cần phân tích đến hàm lượng thích hợp (20-100
µg)
▪ Sau khi l m ngu i, bổ sung dung dịch Tartrat Kali Natri - Na2CO3 và ủ
ở nhiệt độ phòng 10 phút.
▪ Cho thêm dung dịch CuSO4 – KNaC4H4O6 (Tartrat Kali Natri) – NaOH
sau khi đ nguội và ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút.

106
ò

à
ể

ẫ
ộ

ữ

ừ

ữ

ã
ớ
ớ
ó

ữ
 ▪ Bổ sung tiếp dung dịch phản ứng Folin mới được chuẩn bị, khuấy đ u
và ủ ở 50oC trong 10 phút.
▪ Đo mật độ quang ở 750 nm.
▪ Xây dựng đường chuẩn c n th n b ng albumin của serum bò (BSA:
Bovine Serum Albumin) để xác định nồng độ protein của mẫu.
5.2.4.3.Áp dụng
Do tính đơn giản và độ nhạy cao, phương pháp Lowry được sử dụng rộng
rãi trong phân tích hóa sinh. Tuy nhiên, đây không ph i l phương ph p được
dùng rộng rãi để xác định protein trong thực phẩm nếu chưa chi t t ch protein
ra kh i sản phẩm.
5.2.4.4.Ưu điểm
▪ Rất nhạy:
✓ 50-100 lần nhạy hơn so với phương pháp biuret
✓ 10-20 lần nhạy hơn so với phương pháp hấp thụ UV ở 280 nm.
✓ Độ nhạy tương đương với phương pháp Nessler hóa, tuy nhiên tiện
lợi hơn
▪ Ít bị ảnh hưởng bởi độ đục của mẫu.
▪ Có tính đặc hiệu cao hơn so với các phương pháp khác
▪ Tương đối đơn giản; có thể thực hiện trong vòng 1-1,5h.
5.2.4.5.Nhược điểm
Vì một số lý do sau, quy trình Lowry đòi hỏi ph i xây dựng đường chuẩn
cẩn thận cho từng áp dụng:
▪ Màu sắc thay đổi tùy loại protein rõ hơn so với phương pháp biuret.
▪ Cường độ màu không tỷ lệ thuận nghiêm ngặt theo nồng độ protein.
▪ Phản ứng bị ảnh hưởng ở mức độ khác nhau bởi đường sacaroza, lipit,
đệm phosphat, monosacarit và hexoamin.

107

ỏ
‎

ẩ

ậ

ằ

ả
‎
ả

à

ế
á

ề
á
 ▪ Đường khử, sulfat amon và các hợp chất có nhóm SH- với nồng độ cao
ảnh hưởng đến phản ứng.
5.2.4.6.Tiến hành
Hoá chất cần dùng:
▪ Dung dịch A: 4g NaOH (0,1M) và 20g Na2CO3 (2%) pha trong 1000ml
nước cất.
▪ Dung dịch B: 0,5g CuSO4.5H O (0,5%) pha trong dung dịch Natri citrat
(1%) hoặc trong dung dịch Natri Kali Tactơrat 1%.
▪ Dung dịch C: Hỗn hợp của hai dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1 (pha
trước khi dùng).
▪ Thuốc thử folin, trước khi dùng pha loãng hai lần sao cho độ axit bằng
1N.
▪ Albumin huyết thanh bò 1mg/ml.
Cách tiến hành:
▪ Mẫu thí nghiệm
Lấy chính xác 0,5ml dịch chứa protein với hàm lượng thích hợp cho vào
ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C, lắc đều để yên trong 10 phút. Sau
đó thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25ml folin đã pha loãng 2 lần, lắc
đều và để yên trong 30 phút, mầu vàng của hỗn hợp chuyển sang mầu xanh da
trời và đạt đến cường độ mầu cực đại. Đem so màu của hỗn hợp trên máy so
màu quang điện ở bước sóng 750nm. Xác định được trị số mật độ quang học
của dung dịch nghiên cứu. Đo trên máy 3 lần lặp lại và lấy trị số trung bình.
▪ Mẫu đối chứng:
Cho 0,5ml đệm cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C và
bước tiếp theo được tiến hành như mẫu thí nghiệm.
Xây dựng đường đồ thị chuẩn:

108

 ▪ Hàm lượng protein tan trong dung dịch được xác định theo phương
pháp Lowry, dùng albumin huyết thanh bò (BSA) làm chất chuẩn.
▪ Cân 0,01g (10mg – albumin huyết thanh bò) hoà tan trong 10ml nước,
ta được dung dịch gốc có nồng độ là 1mg/ml. Sau đó pha loãng dung
dịch gốc bằng nước cất với các nồng độ 20, 40, 60, 80, 100, 120 g/ml
để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn.
✓ Mẫu thí nghiệm: lấy chính xác 0,5ml dung dịch BSA ở nồng độ
pha loãng như trên cho vào ống nghiệm, thêm vào mỗi ống 2ml
dung dịch C để ở nhiệt độ phòng 10 phút, sau đó cho 0,25ml
thuốc thử folin (1N) đem so màu với bước sóng 660nm.
✓ Mẫu đối chứng: lấy 0,5 ml nước cất cho vào ống nghiệm, thêm
vào đó 2ml dung dịch C và các bước tiếp theo được tiến hành như
mẫu thí nghiệm.
▪ Qua 3 lần lặp lại thí nghiệm có thể xây dựng đường hồi quy. Kết quả
được xử lý theo phương pháp thống kê thông thường.
5.2.5. Phương pháp nhuộm màu Bradford
5.2.5.1.Nguyên tắc
Khi thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250 liên kết với protein, màu
thuốc đổi từ đỏ nhạt đến xanh nhạt và bước sóng hấp thụ cực đại của màu
nhuộm dịch từ 465nm đến 595nm. Sự thay đổi mật độ quang ở bước sóng
595nm tỷ lệ thuận với nồng độ protein có trong mẫu. Cũng giống như các
phương pháp nhuộm màu khác, phương pháp Bradford dựa vào bản chất
lưỡng tính của protein. Khi dung dịch có chứa protein được axit hóa đến pH
nhỏ hơn điểm đẳng điện của protein, thu c nhuộm sẽ bám vào protein bằng
tương tác tĩnh điện. Hiệu quả nhuộm màu tăng lên do tương tác kỵ nước giữa
phân tử phẩm nhuộm với bộ khung polypeptit kề bên các gốc tích điện dương

109

‎
ố

 của protein. Trong trường hợp của phương pháp Bradford, phẩm nhuộm sau
khi bám vào protein sẽ thay đổi phổ hấp thụ so với lúc chưa liên kết.

Hình 4.6 Phản ứng xảy ra trong phương pháp Bradford

5.2.5.2.Quy trình
▪ Hòa tan phẩm màu Coomassie Brilliant Blue G-250 trong etanol 95%
và axit hóa bằng axit phosphoric 85%.
▪ H a tr n mẫu protein (1-100 µg/ml) và dung dịch chuẩn BSA (Bovine
Serum Albumin) với dung dịch Bradford.
▪ Đo mật độ quang ở 595 nm đối chiếu với mẫu trắng.
▪ Nồng độ protein c trong mẫu được tính từ đường chuẩn BSA.
5.2.5.3.Áp dụng, ưu và nhược điểm:
Phương pháp Bradford sử dụng Coomassie Brilliant Blue G-250 là phương
pháp nhanh và nhạy. Phương pháp này đã thay thế h u h t các phương pháp
nhuộm màu sử dụng các phẩm nhuộm tích điện âm với gốc axit sulfonic, như
acid orange 12, Orange G và Amido Black. Phương pháp Bradford đã được
ứng dụng thành công khi xác định protein của cháo, bia thành phẩm trong sản

110
ò

ộ

ó
‎

ầ
ế

 xuất bia. Quy trình này cũng được cải tiến để định lượng protein ở hàm lượng
µg. Do phép đo nhanh, nhạy và ít bị nhiễu hơn so với phương pháp Lowry, nó
đã được sử dụng rộng rãi trong phân tích c c lo i protein tinh sạch.
Ưu điểm của phương pháp:
▪ Thời gian tiến hành nhanh, phản ứng có thể hoàn thành trong 2 phút.
▪ Độ lặp lại tốt
▪ Nhạy gấp nhiều lần so với phương pháp Lowry
▪ Không bị nhiễu bởi sulfat amon, polyphenol, carbohydrat như đường
sacaroza hoặc các cation như K+, Na+ và Mg2+
▪ Đo protein và các peptit có phân tử xấp xỉ hoặc lớn hơn 4000 Da.
Nhược điểm
▪ Bị nhiễu bởi các chất tẩy rửa ion hoặc phi ion như Triton X-100 và
sodium dodecyl sulfat. Tuy nhiên, đây l các sai số nhỏ 0.1%) có thể
hiệu chỉnh đư c b ng các mẫu kiểm tra phù hợp.
▪ Phức protein-phẩm màu có thể b m dính vào cuvet thạch anh. Phân tích
cần phải thực hiện với cuvet thủy tinh hoặc nhựa.
▪ Màu sắc thay đổi tùy loại protein; Phải lựa chọn cẩn thận protein chu n.
5.2.6. Phương pháp Bicinchoninic Acid (BCA)
5.2.6.1.Nguyên tắc
Protein khử ion đồng (II) thành ion đồng (I) trong môi trường kiềm. Phức
tạo ra giữa ion đồng (I) và dung dịch cơ chất BCA màu xanh táo sẽ có màu
hồng nhạt. Cường độ màu tạo ra sẽ tỷ lệ thuận với nồng độ protein.

111

ợ
ằ

á

à
á

ạ

(‎

ẩ

 Hình 4.7 Phản ứng xảy ra trong phương pháp BCA.

5.2.6.2.Quy trình
▪ Hòa c ng l c dung dịch protein với c c dung dịch cơ chất ph n ng
BCA, gồm muối BCA natri, carbonat natri, NaOH, sulfat đồng pH
11.25.
▪ Ủ ở nhiệt độ 37 oC thời gian 30 phút hoặc ở nhiệt độ phòng với thời
gian 2 h, hoặc ở 60 oC trong 30 phút. Việc lựa chọn nhiệt độ phụ thuộc
vào độ nhạy mong muốn. Nhiệt độ cao hơn cho tín hiệu màu lớn hơn.
▪ Đo màu dung dịch ở 562 nm đối chiếu với mẫu trắng.
▪ Xây dựng đường chuẩn sử dụng BSA
5.2.6.3.Áp dụng, ưu và nhược điểm:
Phương pháp BCA được dùng cho protein đã được tách và tinh sạch. Chưa
có báo cáo nào cho thấy có thể áp dụng phương pháp này để xác định protein
trong thực phẩm.
Ưu điểm
▪ Độ nhạy có thể so sánh được với phương pháp Lowry; độ nhạy của
phương pháp micro BCA (0.5-1.0 µg) tốt hơn so v i phương pháp
Lowry.

112

ù

ú
‎
‎

á

ớ

ả
ứ

 ▪ Việc hòa trộn các dung dịch phản ứng 1 lần thực hiện dễ dàng hơn so
với phương pháp Lowry.
▪ Các dung dịch cơ chất phản ứng bền hơn so với ở phương pháp Lowry.
▪ Không bị nhiễu bởi các chất tẩy rửa phi ion và các muối đệm.
▪ Các tác nhân gây biến tính protein n ng đ v a ph i (guanidine-HCl
4M ho c ure 3M) không gây nhiễu.
Nhược điểm
▪ Màu sắc không bền theo thời gian. Người phân tích cần ch cẩn thận
đ n thời gian đọc k t qu đo mật độ quang.
▪ Bất kỳ hợp chất nào có khả năng khử Cu2+ thành Cu+ đều góp phần làm
tăng cường độ màu.
▪ Đường khử gây nhiễu ở mức độ nhiều hơn so với ở phương pháp
Lowry. Sulfat amon ở nồng độ cao cũng gây nhiễu.
▪ Sự khác biệt màu sắc giữa các protein cũng tương tự như ở phương
pháp Lowry.
5.2.7. Phương pháp hấp thụ tử ngoại
5.2.7.1.Nguyên tắc
Protein hấp thụ bức xạ UV mạnh ở bước sóng 280 nm, chủ yếu do các gốc
tryptophan và tyrosine của phân tử protein. Vì hàm lượng của tryptophan và
tyrosine trong phân tử protein của mỗi loại thực phẩm khá ổn định, độ hấp thụ
UV ở 280 nm có thể dùng để tính nồng độ protein dựa vào định luật Lambert
Beer. Vì mỗi protein có thành phần axit amin có chứa số vòng thơm khác nhau
nên cần xác định độ hấp thụ phân tử (molar absorptivity hay extinction
coeficient) cho từng loại protein.
5.2.7.2.Quy trình
▪ Protein được hòa tan trong dung dịch đệm hoặc kiềm.
▪ Đo độ hấp thụ của dung dịch protein ở 280 nm đối chiếu với mẫu trắng.

113
ế

‎
ặ

ế

ả

ở
‎
ồ

ộ
ừ

ả
ú

ý

 ▪ Nồng độ protein được tính theo công thức:

A = abc
Trong đó, A: mật độ quang
a: độ hấp thụ phân t
b: chiều dày cuvet
c: nồng độ
5.2.7.3.Áp dụng, ưu và nhược điểm:
Áp dụng:
▪ Phương pháp hấp thụ UV được dùng để xác định protein c trong sữa
và các sản phẩm thịt. Đây không ph i l phương ph p c ng dụng rộng
rãi đối với c c lo i thực phẩm kh c. N đư c áp dụng tốt hơn đối với
các hệ protein đã được tinh sạch hoặc protein được trích ly t ch nh
kiềm hoặc các tác nhân gây biến tính như ure 8 M.
▪ Mặc dù các liên kết peptit c trong protein hấp thụ UV ở 190-220 nm
mạnh hơn so với ở 280 nm, tuy nhiên đo UV ở vùng bước sóng ngắn
như vậy khó khăn hơn.
Ưu điểm:
▪ Nhanh và tương đối nhạy (ở 280 nm cần 100 µg protein hoặc hơn để
phân tích; nhạy hơn phương pháp biuret nhiều lần).
▪ Không bị nhiễu bởi sulfat amon và các muối đệm khác.
▪ Mẫu không bị phân hủy; có thể dùng cho các phân tích khác sau khi
phân tích xong protein; được áp dụng rộng rãi để xác định protein chạy
qua cột sắc ký.
Nhược điểm:
▪ Axit nucleic cũng hấp thụ UV ở 280 nm. Tỷ số giữa độ hấp thụ ở 280
nm và 260 nm của protein tinh sạch và axit nucleic tương ứng là 1,75 và
0,5. Do đó có thể hiệu chỉnh phần hấp thụ của axit nucleic ở 280 nm

114

á

ạ

ử

ó
‎

‎
á
ả
à
ó

ợ

á

ó
ứ
‎
ó
‎
á
‎
ờ
 nếu biết các tỷ số này. Có thể hiệu chỉnh độ hấp thụ của axit nucleic dựa
vào sự chênh lệch độ hấp thụ ở 235 và 280 nm.
▪ C s chênh l ch đ ng k v hàm lượng các axit amin thơm trong th nh
ph n c u t o c a protein từ các nguồn khác nhau.
▪ Dung dịch đo cần phải trong suốt và không màu. Độ đục do các hạt có
trong dung dịch sẽ làm sai l ch k t qu đo mật độ quang.
▪ Đòi hòi hệ protein c n xác định phải tương đối tinh sạch.
5.2.8. Xác định hàm lượng lượng axit amin trong thực phẩm bằng phương
pháp folmadehyl
5.2.8.1.Lý thuyết
Khi thêm một lượng dư formol trung tính vào dung dịch axit amin, lúc này
formol sẽ đẩy H+ ra khỏi – NH3+ và phản ứng với nhóm – NH2 tạo thành dẫn
xuất methyl hóa. Dẫn đến, axit amin mất đi tính bazo và chỉ còn tính axit do
chỉ còn lại nhóm – COOH tự do.

Định lượng các nhóm cacboxyl của chúng bằng dung dịch kiềm tiêu chuẩn.
Từ đó tính được lượng nito amin của các axit amin có trong dung dịch.
Khi dùng phương pháp này cần chú ý những điểm sau:
▪ Phải tuân thủ những điều kiện để cho phản ứng tạo thành metylen
monoacid và phản ứng trung hòa tiến hành hoàn toàn, nghĩa là cần
có dư một ít dung dịch formaldehyd vào phản ứng trung hòa hoàn
toàn các nhóm cacboxyl được thực hiện khi pH môi trường đạt tới
9,2 – 9,5.

115
ó
ầ

ự
ấ

ạ
ệ
ủ

á
ầ
ể
ệ
ề
‎
ế

ả

à

 ▪ Arginin và ure không phản ứng với formaldehyd cho nên không
tính khi chuẩn bằng kiềm
▪ Tirosin cho kết quả cao hơn vì ngoài nhóm cacboxyl, nhóm
phenol cũng một phần được định phân bởi kiềm. Một số acid amin
cho kết quả ít hơn như prolin
▪ Nếu trong dung dịch có chứa nhiều NH3, nhất là trong các dịch
thủy phân protein thì phải loại trừ NH3 trừ trong chân không ở nhiệt
độ 400C.
▪ Các muối amon như NH4Cl, (NH4)2SO4 cũng tác dụng với
formaldehyde tạo thành hexamethylen tetramin và acid. Acid này
sau đó được trung hòa bởi kiềm gây ra sai số
2(NH4)2SO4 + 6CH2O → (CH2)6N4 + 2H2SO4 + 6H2O
4NH4Cl + 6CH2O → (CH2)6N4 + 4HCl + 6H2O
▪ Dung dịch nghiên cứu có màu đậm phải pha thật loãng vì nếu
màu đậm thì khó nhận biết sự thay đổi màu khi chuẩn độ
▪ Phương pháp này chỉ cho kết quả thật đúng đối với trường hợp
của acid monoamino monocacboxylic. Để kết quả đúng với mọi
trường hợp (khi trong dung dịch ngoài các acid monoamino
monocacboxylic ra còn có chứa các acid monoamino dicacboxylic
và diamino monocacboxylic) cần phải trung hòa dung dịch pH = 7
trước khi phân tích.

116
‎

 5.2.8.2.Dụng cụ và thiết bị

Máy lắc 3 erlen 100mL

Máy khuấy từ, cá từ 1 burette 25mL
Máy đo pH 2 becher 100mL
Bình định mức 100mL Ống nhỏ giọt
1 pipet 1mL
1 pipet 20mL
5.2.8.3.Hóa chất

Na2HPO4 0,1N Formol trung tính 20%

NaOH 0.05N Phenolphtalein 1%
Ba(OH) 2 bão hòa trong
CH3OH
5.2.8.4.Tiến hành
▪ Lấy 1mL nước mắm cho vào bình định mức 100mL, dùng nước cất
tráng, rửa và chuyển vào bình định mức sao cho khoảng 50mL, đậy
lắp và lắc trong 10 phút
▪ Thêm 3 giọt chỉ thị PP; cho từng giọt Ba(OH)2 bão hòa cho đến khi
dung dịch có màu hồng. Cho dư 3mL Ba(OH)2 bão hòa, đun sôi 1
phút rồi tiến hành lọc, rữa kết tủa bằng nước nóng. Thể tích dung
dịch sau khi lọc khoảng 70mL.
▪ Trung hòa dung dịch lọc bằng HCl 0,1N cho đến không màu. Dung
NaOH 0,01N thêm từng giọt cho tới hồng nhạt, rồi dùng HCl 0,01N
thêm từng giọt lắc đều cho đến không màu. Định mức dung dịch
bằng nước cất trung tính đến 100mL
▪ Lấy 25mL dịch lọc cho vào becker 250mL, thêm vào 20mL dung
dịch focmon trung tính, 50mL nước cất; 2 giọt PP lắc đều trong 5
phút

117

 ▪ Chuẩn độ bằng dung dịch chuẩn NaOH 0,05N đến khi dung dịch có
màu hồng nhạt. Ghi thể tích NaOH 0,05N tiêu tốn và tính kết quả
theo công thức dưới đây.
▪ Song song tiến hành làm thí nghiệm kiểm chứng cho mẫu trắng,
bằng cách thay dung dịch nghiên cứu bằng nước cất.
5.2.8.5.Tính toán kết quả
Lượng gam Nitơ acid amin có trong 1 lít nước mắm:
g/lit N amin =
V 1000
0,014 × (Vth − Vtr ) NNaOH dm ×
Vxd Vbd

Trong đó:
Vth và Vtr: Số mL NaOH dùng chuẩn độ cho mẫu thực và mẫu trắng.
N: Nồng độ dung dịch NaOH dung để chuẩn độ
Vbd : Thể tích mẫu cho vào bình định mức (1mL)
0,014: Khối lượng của 1mdlg N.
Vdm: Thể tích bình định mức (100mL)
Vxd: Thể tích mẫu đem đi phân tích (25mL)
6. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH GLUXIT TRONG THỰC
PHẨM
6.1. GIỚI THIỆU CHUNG
Glucid là những hợp chất hữu cơ trong phân tử có chứa C, H, O kết hợp với
nhau, trong đó có nhiều nhóm hydroxyt và một nhóm aldehyt (-CHO) hoặc
xeton (-CO) tự do như glucoza, fructoza… hoặc một hay nhiều nhóm aldehyde
hay ketone kết hợp với các nhóm chức khác như saccaroza, tinh bột… Ngoài
ra, trong phân tử gluxit tỉ lệ mol của nguyên tố oxy và hydro là 1:2 giống phân
tử nước nên gluxit còn có tên gọi là hydratcacbon.
Về phương diện hóa học, glucid có thể chia làm 2 nhóm:

118

 Nhóm oza gồm các loại đường khử trực tiếp khử oxy do có nhóm aldehyt
hay xeton tự do trong phân tử, như glucoza, fructoza, lactoza...
Nhóm ozit không trực tiếp khử oxy vì các nhóm aldehyt và xeton ở dưới
dạng kết hợp với nhóm chức khác, khi thủy phân cho hai hoặc nhiều oza (các
holozit) như tinh bột, saccaroza… hoặc khi thủy phân ngoài các oza còn cho
các chất không phải oza (các heterozit), thí dụ như glucozit. Những glucozit
không có giá trị về dinh dưỡng mà những chất có tính chất dược lý dùng làm
thuốc chữa bệnh hoặc là chất độc.
Đường khử là các đường chứa nhóm aldehyt (-CHO) hoặc xeton (-CO) như
glucoza, fructoza, arabinoza, maltoza, lactoza; trong khi đó saccaroza,
trehaloza không phải đường khử.
Đa số các phương pháp chuẩn độ đường đều dựa trên khả năng khử của
đường, do đó để xác định thành phần các đường không khử, người ta thường
dùng phương pháp thủy phân đường không khử thành đường khử và chuẩn độ
tổng lượng đường khử bao gồm lượng đường khử ban đầu trong mẫu và đường
khử tạo ra do thủy phân đường không khử (thường là các di, tri hay
polysaccarit). Sau đó lượng đường không khử được tính bằng công thức:
Đường không khử = (đường tổng – đường khử) * hệ số k
Hệ số k phụ thuộc vào đường không khử, k = 0,95 với saccaroza và k = 0,9
với tinh bột.
6.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP
Hầu hết các phương pháp xác định hàm lượng gluxit bằng phương pháp
hóa học đều dựa vào tính chất khử của nhóm andehyt và ceton tự do trong
phân tử. Do đó, các phương pháp này chỉ xác định các loại đường khử
(glucoza, fuctoza…). Để xác định hàm lượng các loại đường đôi, ba, hay
polysaccarit (đường không khử) phải thủy phân các loại đường này thành các
loại đường khử đơn giản.

119

 Các hợp chất như lipit, protit, các kim loại… cũng ảnh hưởng lớn đến kết
quả xác định. Do đó trước khi xác định gluxit cần loại bỏ các loại hợp chất này.
Có rất nhiều phương pháp xác định gluxit (đường khử, đường tổng, tinh
bột). Song để có một kết quả chính xác, phải đặc biệt chú ý đến hai khâu quan
trọng trong khi chuẩn bị mẫu: Phương pháp thủy phân và phương pháp khử
tạp. Ngoài ra, độ tinh khiết hóa chất, thao tác kỹ thuật cũng góp phần tạo nên
một kết quả chính xác
Phương pháp thủy phân:
Thông thường khi xác định loại đường không khử trực tiếp oxy hóa như
saccaro, tinh bột… người ta thường dùng axid để thủy phân các đường này
thành đường khử. Nhưng trong môi trường axid mạnh, nhiệt độ cao thì không
những các đường này bị thủy phân mà còn một số đường khác như levuloza,
pentoza… cũng bị thủy phân tạo thành các dẫn xuất của furfurol làm ảnh
hưởng đến quá trình định phân. Do đó, khi tiến hành thủy phân cần xác định
nồng độ axit, nhiệt độ và thời gian tối ưu để thủy phân vừa đủ các loại đường
không khử mục tiêu thành đường khử mà không làm ảnh hưởng đến những
thành phần khác trong mẫu.
Những điều kiện của quá trình thủy phân:
▪ Dung dịch mẫu phải có nồng độ từ 4 – 10% tính bằng đường
glucoza.
▪ Môi trường thủy phân là axit HCl 1N.
▪ Nhiệt độ và thời gian: tuỳ theo từng loại đường mà có các chế độ
khác nhau: Thủy phân đường saccaro trong nồi cách thủy ở 70 –
750C trong 15 phút. Thủy phân tinh bột, dextrin trong nồi cách thủy
sôi trong 3 giờ. Sau khi thủy phân cần làm lạnh ngay dưới vòi nước.

120

 ▪ Trung hòa (bằng dung dịch NaOH) để đưa dung dịch về môi trường
trung tính hay bazơ yếu. Vì ở môi trường này thuận lợi cho việc khử
tạp và tủa đồng.
Phương pháp khử tạp:
Tuỳ theo từng nguyên liệu, từng loại thực phẩm mà sử dụng những phương
pháp khử tạp khác nhau. Sau đây là một số dung dịch dùng để khử tạp.
▪ Dung dịch chì axetat 30%
▪ Dung dịch kaliferocianua 15%, dung dịch kẽm sungfat 30%
▪ Dung dịch patanh: HNO3(d=1.39) 160mL + Chì oxit đỏ 22g +
NaOH (d= 1.33) 10mL + Nước cất vừa đủ 1000mL
▪ Dung dịch kaliiodmercurat: KI 33.2g + HgCl2 13.5g + CH3COOH
200mL + Nước cất 640mL
▪ Khử tạp bằng nhôm hydroxit
▪ Dung dịch nhôm clorua 1% (hoặc nhôm sunfat 1%)
▪ NH4OH vừa đủ để kết tủa
Mục đích của việc sử dụng các dung dịch này làm kết tủa các protid, lipid
và các chất hữu cơ khác, nhằm loại chúng ra khỏi dịch thử, hạn chế sự ảnh
hưởng của chúng đến việc xác định kết quả.
Các phương pháp xác định hàm lượng đường như:
▪ Phương pháp Bertran
▪ Phương pháp Somogyi
▪ Phương pháp Codextan
▪ Phương pháp DNS
Trong các phương pháp trên, phương pháp Bertran là phương pháp thường
được sử dụng nhất vì độ chính xác, tính kinh tế và phù hợp với tiêu chuẩn đo
lường của Việt Nam cũng như của thế giới.

121

 Trong phương pháp Bertran, để khử tạp người ta sử dụng dung dịch kẽm
feroxyanua. Ưu điểm của dung dịch này là: kinh tế, không gây độc, đảm bảo
việc khử tạp tốt ít ảnh hưởng đến quá trình định phân.
6.3.XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP
BERTRAND
6.3.1. Cơ sở của phương pháp
Đa số các phương pháp hoá học dùng để xác định đường khử đều dựa trên
khả năng khử các hợp chất khác nhau của chúng. Một trong những phương
pháp xác định đường khử chính xác. Phổ biến rộng rãi nhất là phương pháp
Bertran.
Nguyên tắc: Ở môi trường kiềm mạnh, các đường khử (glucose, fructose,
mantose…) có thể dễ dàng khử oxi của Cu(OH)2 tạo kết tủa dạng Cu2O màu
đỏ gạch, qua đso tính được lượng đường khử:
Để định lượng đường khử ta thường dùng thuốc thử feling: thuốc thử này
gồm hỗn hợp (1:1) của hai dung dịch: dung dịch sunfat đồng (feling A) và
dung dịch kieàm cuûa muoái kali-natri tactrat keùp (feling B).
Khi trộn hai dung dịch feling A và feling B với nhau thì xảy ra phản ứng
giữa chúng theo hai giai đoạn. Đầu tiên tạo thành kết tủa hidroxit đồng xanh
da trời.
CuSO4 + 2NaOH → Cu(OH)2 + Na2SO4
Sau đó Cu(OH)2 tác dụng với muối kali-natri tactrat kép tạo thành muối
phức hòa tan và dung dịch có màu xanh thẫm.
HO CH COONa O CH COONa
Cu(OH)2 + Cu + 2H2O
HO CH COOK O CH COOK

Như vậy, muối kép này có tác dụng giữ cho ion Cu2+ trong môi trường
kiềm không bị kết tủa dưới dạng Cu(OH)2. Muối phức trên không bền, vì thế
các đường có chứa các nhóm andehid hoặc ceton đễ dàng khử Cu2+ thành Cu2+

122

 tạo kết tủa đỏ và bản thân đường bị oxi hoá khi dung dịch đường tác dụng với
dung dịch Felling.
O CH COONa HO CH COONa
RCHO + Cu + 2H2O RCOOH + Cu2O +
O CH COOK HO CH COOK

Để định lượng Cu2O có tính khử, trước hết ta oxi hóa nó bằng muối sắt ba
(Fe3+) làm cho muôi sắt này chuyển thành muối sắt 2 (Fe2+) ở môi trường acid:
Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4 → 2CuSO4 + H2O + 2FeSO4
FeSO4 được xác định bằng cách cho tác dụng với KMnO4 là chất oxi hóa,
do đó dùng KMnO4 để chuẩn độ FeSO4 ở môi trường acid
10FeSO4 + 8H2SO4 + 2KMnO4 → K2SO4 + 2MnSO4 + 5Fe2(SO4)3 +8H2O
Từ số mL KMnO4 0,1N dùng để chuẩn độ FeSO4 hình thành, tra bảng để
có số mg đường glucose, maltose, saccharose, nhân với hệ số pha loãng ta có
hàm lượng đường trong 100g thực phẩm.
6.3.2. Chuẩn bị mẫu
Cân 10g mận (phần lọc để chuẩn độ sẽ có nồng độ đường biểu thị bằng
glucoza vào khoảng 4 – 10%). Nghiền cẩn thận và cho vào 30mL nước cất
nóng 70-800C để hoà tan mẫu, lấy nước trích ly. Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào
erlen 100mL
Đun cách thuỷ ở 80oC trong 15 phút. Lắng gạn lấy phần dung dịch cho vào
bình định mức 250. Cho thêm 30mL nước vào becker chứa xác mận tiến hành
trích ly như trên đến lần thứ 3. Cho toàn bộ dịch trích ly vào erlen 250.
Khử tạp chất: Cho vào 1mL kaliferocyanua 15%, lắc đều, để yên trong 2–3
phút. Cho thêm 5mL kẽm acetat 30% vào erlen chứa dịch xác định trên, khuấy
mạnh.
Tiến hành lọc kết tủa (tạp) bằng giấy lọc băng vàng, rửa tạp bằng nước
nóng cho sạch.

123

 Cho dung dịch vào bình định mức dung tích 250 mL, tráng lại dụng cu
chứa dung dịch vài lần với nước cất. Nước tráng cho cả vào bình và không
được quá 250mL. Trung hòa axit hữu cơ có trong chất thử bằng dung dịch
NaOH 10% đến khi pH = 7 (kiểm tra bằng giấy chỉ thị màu vạn năng).
Định mức bằng nước cất tới 250mL. Đem đi xác định hàm lượng đường
6.3.3. Xác định hàm lượng đường
Lần lượt cho vào erlen 250mL:
Dung dịch feling A 10 mL;
Dung dịch feling B 10 mL;
Cho 10 ml dịch lọc đã chuẩn bị ở trên và khoảng 20 ml nước cất. Đun sôi
hỗn hợp đúng 3 phút tính từ khi bột nước xuất hiện đầu tiên. Sau khi đun sôi,
dung dịch vẫn phải có màu xanh biếc đặc trưng. Nếu dung dịch bị mất màu
hoàn toàn, màu lục, vàng hoặc nâu chứng tỏ lượng dung dịch feling cho vào
không đủ để oxi hoá lượng đường trong mẫu. Trường hợp đó cần làm lại thí
nghiệm hoặc với lượng thuốc thử nhiều hơn hoặc với lượng mẫu ít hơn.
Lấy bình ra và để nghiên cho cặn Cu2O lắng xuống. Dung dịch bên trên lớp
cặn phải có màu xanh của Cu(OH)2. Khi keát tuûa Cu2O lắng xuống, tiến hành
lọc phần nước bên trên qua phễu lọc.
Cho nước đã đun sôi vào bình nón và tiếp tục gạn lọc vào phễu cho đến khi
nước trong bình nón hết màu xanh.
Trong quá trình gạn lọc chú ý tránh đừng để cho kết tủa rơi vào phễu và
luôn luôn giữ 1 lớp nước đã đun sôi trên mặt kết tủa trong bình nón và trong
phễu để tránh oxi hoá.
Lần gạn lọc cuối cùng, gạn hết nước và cho ngay vào bình nón 20mL dung
dịch Fe2(SO4)3 để hòa tan kết tủa Cu2O. Rút hết nước trong phễu, thay bình
hút lọc cũ bằng bình mới. Đổ dung dịch Fe2(SO4)3 đã hòa tan hết kết tủa Cu2O
trong bình nón, lên trên lớp cặn còn lại trên phễu.

124

 Tráng bình nón và rửa phễu bằng dung dịch Fe2(SO4)3cho đến khi không
còn vệt Cu2O trong bình nón và trong phễu. Hút xuống bình lọc và tráng rửa
lại bằng nước cất đun sôi, hút cả xuống bình lọc. Chú ý là chỉ dùng khoảng
30–50mL Fe2(SO4)3 để hòa tan hoàn toàn kết tủa Cu2O, tráng bình và rửa
phễu.
Thêm 5mL H2SO4 20%
Lấy bình lọc ra và chuẩn độ dung dịch sắt (II) hình thành bằng dung dịch
KMnO4 cho ñeán khi xuaát hieän maøu hồng nhạt vững bền trong 15 giây.
Làm song song với mẫu kiểm chứng thay dung dịch đường bằng nước cất.
Ghi nhận số mL KMnO4 đã dùng và đem tra ở bảng để có lượng đường
glucose, lactose, maltose hoặc đường nghịch chuyển tùy theo yêu cầu.
6.3.4. Tính toán kết quả
Hàm lượng đường toàn phần biểu thị bằng đường glucose hoặc đường
nghịch chuyển (g) trong 100g thực phẩm.
Tính bằng công thức: a Vdm 100
X = . .
1000 Vxd Gbd

Trong đó:
X : Hàm lượng đường khử tính theo %
a: Số mg đường nghịch chuyển hoặc đường glucose (mg) tương
ứng với số mL KMnO4 0,1N, được ghi ở trong bảng của mẫu
thí nghiệm trừ đi mẫu kiểm chứng.
G bd: lượng mẫu cân ban đầu, g.
Vxd: lượng dung dịch thử lấy để làm thí nghiệm (mL)
Vdm: thể tích sau khi định mức.
1000: chuyển từ mg sang g.
100: Hệ số chuyển tính thành %

125

 Bảng 5.1 Bảng xác định đường glucoza

126

 Glucoz KMnO4 Glucoz KMnO4 Glucoza KMnO4

a (mg) 0,1N (ml) a (mg) 0,1N (ml) (mg) 0,1N (ml)
10 3,21 40 12,2 70 20,4
11 3,52 41 12,5 71 20,7
12 3,82 42 12,8 72 20,9
13 4,14 43 13,0 73 21,2
14 4,45 44 13,3 74 21,4
15 4,75 45 13,6 75 21,7
16 5,06 46 13,9 76 22,0
17 5,38 47 14,2 77 22,2
18 5,69 48 14,4 78 22,5
19 5,99 49 14,7 79 22,7
20 6,31 50 15,0 80 23,0
21 6,60 51 15,3 81 23,2
22 6,90 52 15,6 82 23,5
23 7,20 53 15,8 83 23,7
24 7,50 54 16,1 84 24,0
25 7,80 55 16,4 85 24,2
26 8,10 56 16,6 86 24,5
27 8,40 57 16,9 87 24,7
28 8,73 58 17,2 88 25,0
29 8,99 59 17,5 89 25,2
30 9,29 60 17,7 90 25,5
31 9,58 61 18,0 91 25,7
32 9,87 62 18,3 92 26,0
33 10,2 63 18,5 93 26,2
34 10,5 64 18,8 94 26,5

127

 35 10,7 65 19,1 95 26,7

36 11,0 66 19,3 96 27,0
37 11,3 67 19,6 97 27,2
38 11,6 68 19,9 98 27,5
39 11,9 69 20,1 99 27,7
100 28,0

128

 Bảng 5.2 Bảng xác định đường nghịch chuyển

129

 Đường Đường Đường

KMnO4
nghịch nghịch KMnO4 nghịch KMnO4
0,1N
chuyển chuyển 0,1N (ml) chuyển 0,1N (ml)
(ml)
(mg) (mg) (mg)
10 3,24 40 12,2 70 20,3
11 3,55 41 12,5 71 20,6
12 3,87 42 12,8 72 20,8
13 4,17 43 13,1 73 21,1
14 4,48 44 13,3 74 21,3
15 4,80 45 13,6 75 21,6
16 5,11 46 13,9 76 21,8
17 5,42 47 14,2 77 22,1
18 5,72 48 14,5 78 22,4
19 6,04 49 14,7 79 22,6
20 6,35 50 15,0 80 22,9
21 6,65 51 15,3 81 23,1
22 6,95 52 15,5 82 23,4
23 7,25 53 15,8 83 23,6
24 7,55 54 16,1 84 23,8
25 7,83 55 16,4 85 24,1
26 8,13 56 16,6 86 24,3
27 8,43 57 16,9 87 24,6
28 8,73 58 17,2 88 24,8
29 9,03 59 17,4 89 25,1
30 9,32 60 17,7 90 25,3
31 9,61 61 18,0 91 25,6
32 9,91 62 18,2 92 25,8

130

 33 10,2 63 18,5 93 26,1

34 10,5 64 18,7 94 26,3
35 10,8 65 19,0 95 26,5
36 11,1 66 19,3 96 26,8
37 11,4 67 19,5 97 27,0
38 11,6 68 19,8 98 27,3
39 11,8 69 20,1 99 27,5
100 27,8
6.4.XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP DNS
6.4.1. Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với
thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ
lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. So màu tiến
hành ở bước sóng 540nm. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucoza tinh khiết
với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.
Phương trình phản ứng tạo màu giữa đường khử và DNS acid:

Hình 5.1(a) Acid dinitrosalicylic, (b) 3-amino, 5- dinitrosalicylic acid

6.4.2. Xử lý mẫu
Tùy vào đối tượng nghiên cứu (hạt, quả...) mà cách chuẩn bị dung dịch
nghiên cứu dùng để định lượng đường có khác nhau đôi chút, nhưng nguyên
tắc chung như sau:
Trường hợp nguyên liệu thí nghiệm không chứa quá nhiều tinh bột hoặc
inulin, có thể trích lyđường từ nguyên liệu bằng nước. Cân và cho vào cối sứ 1

131

 g nguyên liệu hạt hay các mẫu thí nghiệm thực vật khô như cây, lá hoặc quả
khô... đã được nghiền nhỏ (và sấy khô đến khối lượng không đổi). Nếu là
nguyên liệu tươi (như hoa, quả tươi) thì cân 5 – 10 g. Nghiền cẩn thận với bột
thủy tinh hay cát sạch và 30ml nước cất nóng 70 – 80°C. Chuyển toàn bộ hỗn
hợp vào bình định mức dung tích 1000 ml. Đun cách thủy 70 – 80°C trong 35
– 40 phút, kết tủa protein và các tạp chất bằng dung dịch chì acetate
Pb(C2H2O2)2.3H2O hoặc chì nitrate Pb(NO3)2 10%.
Tránh dùng quá dư chì acetate (dùng 2 – 5 ml chì acetate). Sau đó loại bỏ
lượng chì acetate dư bằng dung dịch Na2SO4 bão hòa, để yên hỗn hợp 10 phút.
Tiếp đó thêm nước cất tới vạch mức và đem lọc qua giấy lọc vào cốc hay bình
khô. Nước lọc dùng làm dung dịch thí nghiệm.
▪ Trường hợp nguyên liệu chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin như khoai
lang, sắn, khoai tây... cần trích ly đường bằng rượu 70 – 80°C, đun hỗn
hợp cách thủy trong bình cách thủy có lắp ống làm lạnh không khí.
Trong trường hợp này không cần kết tủa protein bằng chì acetate vì
lượng protein chuyển vào dung dịch không nhiều.
▪ Trường hợp các nguyên liệu chứa nhiều acid hữu cơ như cà chua, dứa,
chanh, khế... cần chú ý là trong quá trình đun khi trích ly, đường
saccharoza có thể bị thủy phân một phần. Do đó cần xác định riêng
đường khử và riêng saccharoza. Trước khi đun cách thủy hỗn hợp phải
trung hòa acid bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa tới pH 6,4 – 7,0.
6.4.3. Tiến hành:
❖ Hóa chất
Thuốc thử acid dinitrosalisylic (DNS): cân 1g DNS pha trong 20ml NaOH
2N, thêm vào 50ml nước cất và 30g muối Sodium potassium tartrate, đun cách
thủy cho tan rồi định mức tới 100ml.
Dung dịch glucoza chuẩn (500ppm): cân 0.5g D_glucoza pha trong nước

132

 cất thành 1lit.

Dung dịch glucoza mẫu (50ppm): hút 10ml dung dịch glucoza chuẩn
500ppm cho vào bình định mức, thêm nước cất, định mức thành 100ml.
❖ Thực hiện
Cân khoảng 4 – 6 g nguyên liệu, tiến hành trích ly bằng 40ml cồn 960 bằng
cách chưng cách thủy cho sôi khoảng 10 phút trong một becker 250. Chuyển
dịch trong suốt của quá trình trích ly qua một becker khác. Cho tiếp vào becker
trích ly 40ml cồn 960 rồi tiến hành như trên, làm 3 lần để đảm bảo lượng
đường được trích ly là hoàn toàn. Song song với quá trình trích ly là quá trình
cô đặc dịch trích ly bằng phương pháp chưng cách thủy. Khi dịch cô đặc còn
30ml thì dừng lại, cho vào bình định mức 100ml, lắc đều định mức 100ml. Hút
10ml dd sau khi định mức cho vào bình định mức 100ml, lắc đều định mức
100ml. Đây là dung dịch chuẩn bị tạo phức để đo độ hấp thu. (Nếu lượng
đường trong mẫu ít có thể định mức 1 lần).
Lập đường chuẩn với các dung dịch glucoza chuẩn có nồng độ 50ppm và
tiến hành tạo phức màu cho mẫu theo bảng sau:
Bảng 5.3 Bảng xác định đường chuẩn cuarglucoza với DNS

Ống nghiệm 0 1 2 3 4 M1 M2
Chuẩn glucoza 50ppm 0 1 2 3 4
Dịch xác định 2 2
Dung dịch DNS 1 1 1 1 1 1 1
Nước cất 9 8 7 6 5 7 7

Chú ý: sau khi cho thuốc thử DNS vào thì tiến hành chưng cách thủy cho
sôi 3 phút (chuyển toàn bộ ống nghiệm vào becher 250ml rồi chưng cách thủy)
sau đó để nguội rồi thêm nước cất vào cho đủ 10ml như trong bảng.
Tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 530nm

133

 ❖ Một số chú ý khi đo

Nếu màu là phức đo quá đậm hoặc quá nhạt thì có thể giảm hoặc tăng thể
tích chuẩn cho phù hợp và bổ sung thể tích còn lại bằng nước cất cho đủ 10ml
hoặc có thể pha chuẩn có nồng độ thấp hơn hoặc cao hơn.
Nếu độ hấp thu của mẫu là nằm ngoài đường chuẩn thì có thể tăng hoặc
giảm lượng mẫu sao cho giá trị đo nằm trong đường chuẩn.
Từ số liệu thu được lập đường chuẩn y=ax
Tìm Cx
Công thức hàm lượng đường khử được tính như sau:

Trong đó:
- Vđo: là thể tích dung dịch phức đo trong bài là 10ml
- Vxd1,Vxd2: là thể tích đem đi xác định lần 1 và lần 2 trong bài là
10ml và 2ml
- Vdm1, Vdm2: là thể tích định mức lần 1 và lần 2 trong bài là 100ml
- mbđ: là khối lượng mẫu đem đi xác định.
6.5.XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG SACCAROZA
Để định lượng đường saccaroza, ta tiến hành xác định đường khử theo
phương pháp Bertrand hay Miler, sau đó thủy phân dung dịch ban đầu trong
môi trường HCl 1N ở nhiệt độ 68 – 70°C trong thời gian tối đa 7 phút để
không bị ảnh hưởng bởi đường lactoza và tinh bột. Sau đó trung hòa hỗn hợp
bằng dung dịch NaOH 2N hay dung dịch Na2CO3 bão hòa tới pH = 6,5 – 7
với chỉ thị phenolthalein (không màu sang hồng nhạt). Sau đó chuyển dung
dịch đã được trung hòa vào bình định mức 100ml, thêm nước cất tới vạch định
mức rồi định lượng đường tổng (tương tự như đường khử, với phương pháp
Bertrand sử dụng bảng tra đường nghịch chuyển).

134

‎
 Sau khi xác định đường khử và đường tổng ta có thể tính ra đường
saccaroza theo công thức sau:
Hàm lượng saccaroza = (hàm lượng đường tổng – hàm lượng đường khử) 0,95
H+ thành saccharose.
Trong đó, 0,95 là hệ số chuyển từ glucose
6.6.XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG TỔNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP
BERTRAN
Sử dụng dung môi để trích ly hoàn toàn đường tổng trong mẫu vào dung
dịch. Thủy phân trong môi trường axit, chuyển toàn bộ đường tổng về dạng
đường khử. Khi đó, sử dụng phương pháp xác định đường khử để xác định
hàm lượng đường khử tạo thành. Từ đó, tính toán đường tổng theo đường khử
6.7.XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TINH BỘT
Thủy phân mẫu trong môi trường acid HCl chuyển toàn bộ tinh bột về
dạng đườn khử glucose. Xác định hàm lượng glucose hình thành bằng phương
pháp Bertrand sẽ tính toán được hàm lượng tinh bột
6.8.XÁCĐỊNH ĐỘ POL CỦA ĐƯỜNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO GÓC
QUAY CỰC
6.8.1. Cơ sở lý thuyết
Phương pháp này có thể áp dụng cho đường thô, đường trắng, đường đặt
biệt là đường có cần làm sạch.Phương pháp đo góc quay cực của dung dịch
chuẩn đường thô theo độ Pol được biểu thị bằng thang đo 0Z theo thang đường
quốc tế.
Dung dịch đường chuẩn
Dùng 26,0160 gam đường saccaroza tinh kiết được cân trong chân không
và hòa tan trong nước tinh kiết ở 20,00 0C đến thể tích không đổi 100,00ml .
Dung dịch này tương ứng với cân 26,000 gam đường trong 100mL dung dịch.
Cơ sở của điểm 1000 Z

135

*‎

 Theo thang đường quốc tế(The basis of the 1000 Z point of international
sugar scale): sự quay cực của dung dịch đường chuẩn sacroza tinh khiết ở
bước sóng của đồng vị thủy ngân 198Hg là 546,2271 nm trong chân không, ở
200C trong ống phân cực 200,000mm. Góc quay cực khi đo ở bước sóng này
bằng 40,7770 0,0010, khi đo ánh sáng natri màu vàng đã lọc ( bước sóng

589,4400nm trong chân không), 1000Z tương ứng với góc quay 34,626

0,0010 . Đối với lăng kính thạch anh hoạt động hiệu quả ở bước sóng
587,000nm thì 1000Z tương ứng với góc quay 34,9340 0,0010

Nguyên tắc
Sự quay cực là tổng đại số các hiệu ứng chủ yếu của hàm lượng sacaraza
có trong dung dịch làm chuyển đổi do sự có mặt các chất hoạt động quang học
khác và do quy trình làm sạch.
Đây là phép phân tích vật lý bao gồm ba bước cơ bản sau :
▪ Chuẩn bị dung dịch chuẩn của đường thô trong nước, kể cả việc làm
trong bằng cách bổ sung dung dịch chì axetat kiềm tính.
▪ Làm sạch dung dịch bằng phương pháp lọc
▪ Xác định độ pol bằng cách đo góc quay cực của dung dịch đã được
làm sạch.

136

 7. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LIPID

7.1.GIỚI THIỆU
Lipd hay còn được gọi là chất béo là hợp chất hữu cơ được cấu tạo chủ yếu
từ triglycerit. Là một thành phần quan trọng cấu tạo nên tế bào, làm mô
đệm… Không những thế, lipid còn là dung môi của những vitamin tan trong
dầu, cung cấp và dự trữ năng lượng cho cơ thể. Năng lượng cung cấp bởi lipid
cao gấp hai lần mức năng lượng được cung cấp từ gluxit hay protein dù cùng
một khối lượng. Ngoài ra, lipid còn góp phần vào giá trị cảm quan của sản
phẩm thực phẩm như giá trị cảm quan, cấu trúc, mùi, vị,
Phụ thuộc vào nguồn gốc mà lipid sẽ tồn tại ở trạng thái lỏng đối với lipd
từ thực vật (dầu thực vật), dạng rắn với lipid từ động vật (mỡ động vật).
Nhưng dù tồn tại ở dạng lỏng hay rắn thì lipid đều có một số đặc tính cơ bản
là không tan trong nước và những dung môi phân cực mạnh, tan trong dung
môi hữu cơ không phân cực hay phân cực nhẹ.
Thành phần cấu tạo lipid chứa trung bình 76 - 79% cacbon và 10 - 12% oxi
nên khi đốt cho năng lượng rất lớn: 1g Lipid cho 9,5kCal
Có nhiều phương pháp phân loại lipid, tùy theo cơ sở để phân loạilà thành
phần, tính chất, vai trò hay nguồn gốc… Chủ yếulà phân loại theo thành phần
cấu tạo. Căn cứ vào thànhphần cấu tạo người ta phân thành lipid đơn giản và
lipidphức tạp
Lipid thuần: Là ester của acid cacboxylic và alcol. Trongthành phần cấu
tạo chỉ có chứa C,H,O. Thuộc nhóm này cógliceric (dầu thực vật, mỡ động
vật), sáp và stearic.
Lipid tạp: trong phân tử lipid tạp ngoài thành phần alcolvà acid béo còn có
các gốc acid phosphoric, cholin,monosaccharide hoặc oligosaccharide. Nên về
thành phầnnguyên tử ngoài C,H,O còn có N,P,S…

137

 7.2.CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LIPID

7.2.1. Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet
So với những thành phần khác trong mẫu thực phẩm như protein, gluxit...
lipid không tan trong nước nhưng có thể hòa tan trong các dung môi hữu cơ
không phân cực, hoặc phân cực nhẹ. Dựa vào tính chất này, lipid được định
bằng cách sử dụng dung môi phù hợp hòa tan lipid, từ đó tách lipid ra khỏi các
thành phần khác có trong mẫu.
Phương pháp được sử dụng để xác định hàm lượng lipid đó là phương pháp
Soxhlet. Với phương pháp này, độ hòa tan của lipid là một tiêu chí quan trọng.
Độ hòa tan của lipid phụ thuộc rất nhiều vào thành phần lipid và tỷ lệ giữa
lipid không phân cực (chủ yếu là triacylglycerol) và lipid phân cực (chủ yếu là
phospholipid và glycolipid) trong mẫu. Do đó, có thể có vài dung môi (một
dung môi hay hệ hỗn hợp các dung môi) được chọn phụ thuộc vào thành phần
và bản chất lipid có trong mẫu. Có thể tách bớt một phần lipid ra khỏi nguyên
liệu bằng cách ép lạnh trước khi trích ly bằng dung môi. Dung môi sử dụng
cũng thay đổi tùy theo phương pháp. Với phương pháp Soxhlet (AOAC, 1995)
và phương pháp Goldfisch sử dụng dung môi hexane. Phương pháp Folch
(Folch et al, 1957) và phương pháp Bligh và Dyer sử dụng dung môi
chloroform/methanol hoặc chloroform/methanol/nước.
Ngoài ra, để giải phóng hoàn toàn lipid ra khỏi nguyên liệu (tinh bột, thức
ăn cho cá, sữa) cần phải xử lý mẫu với axit trước khi trích ly. Với mẫu nguyên
liệu sữa thì phải thêm ammonium hydroxide để kết tủa casein trước khi trích
ly. Khi đó, lipid được giải phóng ra khỏi dạng liên kết với các thành phần
trong nguyên liệu. Mặt khác, nguyên liệu cần phải được sấy khô, giảm kích
thước trước khi trích ly cũng là một yếu tốt tăng hiệu suất trích ly lipid.

138

 Định lượng chính xác lipid trong thực phẩm là yêu cầu để ghi nhãn dinh
dưỡng, chứng nhận hoặc đánh giá sự đồng nhất cũng như kiểm tra tính chất
chức năng và giá trị dinh dưỡng của lipid trong thực phẩm.
Lưu ý: dung môi sử dụng trong quá trình trích ly rất dễ cháy nổ nên các
thao tác phải cẩn trọng.
Sử dụng dung môi hexane, diethyl ether, ether dầu hỏa để trích ly lipid
trong mẫu thực phẩm. Phương pháp này có thể được sử dụng định lượng lipid
trong nguyên liệu ít hay nhiều lipid. Tuy nhiên, dung môi sử dụng trong
phương pháp này chủ yếu chỉ hòa tan được lipid không phân cực mà rất ít hòa
tan lipid phân cực. Một điều cần lưu ý khi sử dụng phương pháp này đó là
hàm ẩm của mẫu nguyên liệu không được vượt quá 10%. Với các mẫu có độ
ẩm cao thì phải tiến hành sấy tách ẩm trước. Khi sấy cần lưu ý đến nhiệt độ
quá trình sấy bởi nếu nhiệt độ sấy cao sẽ ảnh hưởng tiêu cực đến trạng thái
oxy hóa của lipid. Thông thường, người ta tiến hành sấy ở nhiệt độ thấp và
thời gian sấy kéo dài. Cụ thể nếu sấy ở môi trường chân không 40 - 50°C thì
sấy thời gian sấy có thể lên tới 24h hoặc ở 95 - 100°C trong 5 giờ (AOAC,
1995). Trong trường hợp xác định hàm lượng chất béo các mẫu thịt theo
phương pháp Goldfisch thì phải giảm kích mẫu, tăng diện tích bề mặt trích ly
bằng cách nghiền mẫu với cát sạch nhằm giúp quá trình trích ly chất béo được
hoàn toàn.
Trích ly Soxhlet là một quá trình bán liên tục. Thời gian lưu của dung môi
trong trụ trích ly từ 5 đến 20 phút. Dung môi bay hơi sẽ được ngưng tụ quay
trở lại trụ trích ly. Khi dung môi dâng lên trong trụtrích ly lên đến ống siphone
sẽ chảy xuống bình đun. Quá trình trích ly có thể thực hiện cùng lúc nhiều
mẫu (các mẫu này có cùng hoặc khác nguyên liệu). Hạn chế của phương pháp
này là không thể tách chất béo phân cực và chất béo ở dạng liên kết.
Cách tiến hành phương pháp Soxhlet:

139

 ▪ Cân 5 – 10g mẫu đã được sấy khô, nghiền nhỏ vào giấy gói
▪ Gói kín mẫu và đưa gói mẫu vào trụ trích ly
▪ Lắp hệ thống Soxhlet, kiểm tra hệ thống sinh hàn
▪ Rót dung môi vào đến nhập trụ trích ly thông qua miệng ống sinh
hàn. Lưu ý, phải rót dung môi vào trụ chiét cho đến khi dung môi
chảy tràn xuống đến 2/3 bình đun.
▪ Dùng bông bịt kín miệng ống sinh hàn tránh dung môi bay hơi
▪ Cấp nước cho hệ thống sinh hàn
▪ Gia nhiệt bình đun
▪ Điều chỉnh tốc độ ngưng tụ của dung môi từ 2 – 6 giọt/ giây
▪ Tiến hành trích ly từ 6 - 8h, tùy thuộc vào hàm lipid có trong mẫu
▪ Kiểm tra quá trình trích ly đã hoàn toàn chưa
▪ Kết thúc trích ly
▪ Làm mát hệ thống trước khi lấy mẫu ra
▪ Loại bỏ dung môi trong gói mẫu
▪ Tính toán khối lượng lipid trong mẫu.
7.2.2. Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp Adam – Rose – Gottlieb
Đối với các loại thực phẩm dạng lỏng từ động vật như sữa bò, sữa dê, sữa
cừu, sữa ngựa và dịch lỏng từ thực vật như sữa dừa, các chất béo phân bố
trong dịch sữa dưới dạng các hạt cầu và được bao bọc bởi một lớp màng lipo-
protein. Do đó, để việc xác định chất béo trong dịch sữa đạt độ chính xác cao
thì cần loại bỏ lớp lipo-protein bảo vệ trước khi trích ly chất béo bằng các
dung môi hữu cơ.
Nguyên tắc
▪ Chất béo trong mẫu sữa được trích ly bằng cách bổ sung lần lược 4
dung môi khác nhau: amoniac, cồn, diethy ether và petroleum ether.
Cồn và amoniac được dùng để kết tủa và loại protein ra khỏi các hạt cầu

140

 béo. Diethy ether được dùng để trích ly béo và các thành phần tan trong
béo. Petroleum ether được bổ sung vào để trích ly béo và một lượng
nhỏ các thành phần tan trong béo do petroleum ether là dung môi trích
ly có tính chọn lọc cao hơn so với diethyl ether.
▪ Hỗn hợp sau khi bổ sung dung môi và khuấy đảo tách thành hai pha:
pha nhẹ nằm ở trên gồm dung môi và béo, pha nặng nằm dưới gồm
nước và các chất hòa tan trong nước. Ta thu pha nhẹ gồm dung môi và
béo, làm bay hơi dung môi ta thu được tổng béo trong mẫu sữa.
7.3.Phân tích một số chỉ tiêu đánh giá chất lượng dầu mỡ
7.3.1. Xác đinh tỷ khối của dầu hay chất béo dạng lỏng
Phạm vi áp dụng: Xác định tỷ khối của dầu hoặc chất béo dạng lỏng.
Tài liệu tham khảo: AOCS Cc 10a-25 (1997)
Thiết bị, dụng cụ
▪ Cân phân tích chính xác đến 0.0001 g
▪ Nhiệt kế có thể đo được đến 40 0C, vạch chia 0,10C
▪ Bình tỷ trọng dung tích 50 mL đã được sấy khô và cân để biết khối
lượng
Tiến hành:
Tiến hành thử nghiệm 2 lần cho mỗi mẫu thử theo các bước sau:
▪ Xác định khối lượng mẫu ở nhiệt độ cần đo:
✓ Làm chảy mẫu và lọc qua giấy lọc để loại tạp và ẩm.
✓ Làm lạnh mẫu đến nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ qui định khoảng 5 0C
và cho vào bình tỷ trọng đến đầy (chảy tràn), tránh có bọt khí bên
trong bình.
✓ Để mẫu tăng nhiệt độ tự nhiên đến đúng nhiệt độ cần đo rồi cân bình
tỷ trọng có chứa mẫu, chính xác đến 0,2 mg
▪ Xác định khối lượng nước ở nhiệt độ cần đo:

141

 Tiến hành tương tự như với mẫu thử nhưng thay mẫu thử bằng nước cất
Lưu ý: Xác định khối lượng mẫu và nước trên cùng 1 bình tỷ trọng.
Tínhkết quả:
▪ Kết quả được ghi chép và tính toán theo báo cáo thử nghiệm phụ lục 1.
▪ Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 2 kết quả thử song song được
làm tròn đến 4 số lẻ
▪ Chênh lệch kết quả giữa 2 lần thử song song không được vượt quá
0,002 đơn vị
7.3.2. Xác định điểm đục của dầu mỡ thưc phẩm
Điểm đục là nhiệt độ tại đó (trong điều kiện thử nghiệm qui định) mẫu trở
nên đục do quá trình kết tinh bắt đầu).
Phạm vi áp dụng: Xác định điểm đục của các sản phẩm dầu, mỡ động vật và
thực vật dùng trong thực phẩm.
Tài liệu tham khảo: AOCS Cc 6-25 (1997)
Thiết bị, dụng cụ
▪ Chai đựng mẫu bằng thuỷ tinh dung tích 100 mL .
▪ Nhiệt kế đọc được từ( 10 đến +100) oC có vạch chia 0,1oC .
▪ Bể điều nhiệt: Tuỳ nhiệt độ cần thiết bể sẽ chứa hỗn hợp nước và nước
đá hoặc nước, nước đá và muối sao cho nhiệt độ bể phải thấp hơn nhiệt
độ đông đặc của mẫu cần đo khoảng 5 oC. Bể được khuấy đều liên tục
để tạo sự đồng nhất nhiệt độ trong bể (Cho phép dùng cốc thủy tinh để
làm lạnh thay bể làm lạnh).
Tiến hành:
Tiến hành xác định điểm đục 2 lần cho mỗi mẫu thử theo các bước sau:
▪ Cân khoảng (60-75) g mẫu đã được trộn đều vào cốc thủy tinh và gia
nhiệt đến khoảng 130oC cho đến khi mẫu ở dạng lỏng hoàn toàn.
▪ Rót khoảng 45 mL mẫu đã gia nhiệt vào chai đựng mẫu.

142

-‎

 ▪ Đặt chai vào bể làm lạnh .

▪ Khi nhiệt độ mẫu cao hơn nhiệt độ điểm đục (dự đoán) khoảng 10 oC,
bắt đầu khuấy nhanh, đều dung dịch mẫu (theo một chiều) để tránh sự
quá lạnh và đóng rắn của mẫu tại các mặt tiếp xúc giữa chai đựng mẫu
và bể.
Chú ý:
▪ Kể từ lúc này không được lấy nhiệt kế ra khỏi mẫu để tránh bọt khí.
▪ Chai đựng mẫu phải được giữ ở vị trí sao cho mặt thoáng của mẫu trong
chai ngang với mặt thoáng của nước trong bể làm lạnh.
✓ Thường xuyên lấy chai ra khỏi bể để quan sát.
✓ Đọc điểm đục là nhiệt độ tại đó phần nhiệt kế nhúng ngập trong
mẫu sẽ không còn nhìn thấy được theo phương ngang qua chai và
mẫu.
Báo cáo kết quả:
▪ Kết quả được ghi chép và tính toán theo báo cáo thử nghiệm phụ lục 1.
▪ Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 2 kết quả thử liên tiếp được
làm tròn đến số lẻ thứ nhất.
Chênh lệch kết quả giữa hai lần thử liên tiếp cuả một mẫu không được vượt
quá 0.5oC
7.3.3. Xác đinh điểm mềm (điểm nóng chảy ống hở) của dầu mỡ
Điểm mềm là nhiệt độ tại đó mẫu bắt đầu mềm và bị đẩy trượt đi bên trong
ống mao dẫn.
Phạm vi áp dụng: Xác định điểm mềm của dầu dừa, stearin, các chất béo đã
hydrogen hoá và mỡ rắn.
Tài liệu tham khảo: AOCS Cc 3-25 (1997)
Thiết bị và dụng cụ:

143

 Ống mao dẫn thuỷ tinh đường kính trong 1 mm, đường kính ngoài tối đa 3
mm; chiều dài ống (50-80) mm.
▪ Nhiệt kế đọc được (từ 5 đến + 100) oC; vạch chia 0,1oC.
▪ Cốc thuỷ tinh dung tích 600 mL.
▪ Bếp điện điều chỉnh được nhiệt độ.
Tiến hành:
Tiến hành thử nghiệm 3 lần cho mỗi mẫu thử theo các bước sau :
▪ Cho mẫu đã trộn đều vào cốc thủy tinh và gia nhiệt cho đến khi mẫu
nóng chảy hoàn toàn, lọc qua giấy lọc để loại tạp chất và vết ẩm. Mẫu
phải khan nước hoàn toàn.
▪ Nhúng ống mao dẫn sạch vào dung dịch mẫu đã lọc trên cho đến khi
chiều cao mẫu trong ống đạt khoảng 10 mm. Làm lạnh các ống mao dẫn
bằng cách áp chặt đầu dưới của ống mao dẫn lên nước đá cho đến khi
mẫu đặc lại.
▪ Đặt các ống mao dẫn vào bình kín và để trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4–
10)oC qua đêm (khoảng 16 h).
▪ Cột ống mao dẫn vào nhiệt kế sao cho đầu dưới của ông mao dẫn ngang
với đáy bầu thuỷ ngân của nhiệt kế.
▪ Treo nhiệt kế lên giá và chỉnh sao cho đáy của nhiệt kế ngập sâu khoảng
30 mm trong nước cất (chứa trong cốc thuỷ tinh dung tích 600 mL ).
▪ Lúc bắt đầu đun, nhiệt độ của nước phải thấp hơn điểm mềm (dự đoán)
của mẫu khoảng( 8 - 10) oC. Khuấy nước trong cốc và gia nhiệt sao cho
nhiệt độ của nước tăng 1oC/ phút và khi gn đến điểm mềm chỉ còn tăng
0,5 oC / phút.
▪ Tiếp tục đun nóng cho đến khi mẫu bên trong ống mao dẫn bị đẩy lên.
▪ Ghi nhiệt độ khi mẫu bắt đầu bị đẩy lên.
Báo cáo kết quả:

144

-‎

(‎

 ▪ Kết quả được ghi chép và tính toán theo báo cáo thử nghiệm phụ lục 1.
▪ Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 3 kết quả thử song song được
làm tròn đến 0,1 0C.
▪ Chênh lệch giữa kết quả lớn nhất và nhỏ nhất không được quá 0,5 0C.
7.3.4. Xác định chỉ số Peroxide trong dầu mỡ
Chỉ số peroxyt (PoV) là lượng chất có trong mẫu thử được tính bằng mili
đương lượng oxy hoạt tính làm oxi hoá KI trên 1kg mẫu dưới các điều kiện
thao tác theo quy định. Chỉ số này phản ánh sự ôi hóa của dầu mỡ.
Nguyên tắc của phương pháp này đó là dựa vào phản ứng của peroxyt với
dung dịch KI tạo ra I2 tự do (trong môi trường acid acetic và cloroform). Sau
đó chuẩn độ I2 sinh ra bằng dung dịch chuẩn Na2S2O3 với chỉ thị hồ tinh bột.
Điểm tương đương nhận được khi dung dịch chuyển từ màu tím đen sang
không màu.
Phương trình phản ứng:

R1 CH CH R2 R1 CH CH R2

O O + 2KI + 2CH3COOH O + 2CH3COOK + H2O + I2

I2 + 2 Na2S2O3 = 2 NaI + Na2S4O6

Chú ý tiến hành thí nghiệm trong môi trường trung tính hoặc acid yếu. Nếu
tiến hành trong môi trường acid mạnh hoặc kiềm dễ xảy ra phản ứng oxi hoá
của iod với oxi không khí gây sai số lớn.
Phạm vi áp dụng : Xác định chỉ số Peroxide trong dầu mỡ
Tài liệu tham khảo: AOCS Cd 8-53 (1997)
Thiết bị và dụng cụ:
▪ Pipet 1 mL
▪ Bình tam giác nút mài dung tích 250 mL.

145

 Hóa chất : Hóa chất loại tinh khiết phân tích

▪ Hỗn hợp dung dịch acetic acid - chloroform gồm 3 phần thể tích acetic
acid băng với 2 phần thể tích chloroform.
▪ Dung dịch KI bão hòa : kiểm tra hằng ngày bằng cách thêm 2 giọt chỉ
thị hồ tinh bột vào dung dịch chứa 0,5 mL KI bão hòa và 30 mL axetic
acid - chloroform. Nếu dung dịch có màu xanh thì bỏ đi, pha lại dung
dịch KI khác. Nên chuẩn bị dung dịch KI ngay trước khi sử dụng.
▪ Dung dịch chuẩn Na2S2O3 0,1 N.
▪ Chỉ thị hồ tinh bột 1 %.
Tiến hành:
Tiến hành thử nghiệm 2 lần cho mỗi mẫu thử theo các bước sau:
▪ Cân (0,05÷ 5,00) g vào bình tam giác nút mài dung tích 250 mL. Thêm
30 mL hỗn hợp acetic acid - chloroform. Lắc nhẹ cho đến khi mẫu tan
hoàn toàn.
▪ Thêm chính xác 0,5 mL KI bão hòa. Để yên đúng 1 phút. Thêm 30 mL
nước cất.
▪ Chuẩn độ bằng dung dịch Na2S2O3 0,1 N (chuẩn nhanh, lắc mạnh và
đều) cho đến khi mất màu vàng. Thêm 0,5 mL chỉ thị tinh bột. Tiếp tục
chuẩn độ cho đến mất màu xanh.
Lưu ý: Nếu thể tích chuẩn độ nhỏ hơn 0,5 mL Na2S2O3 0,1 N, lặp lại thí
nghiệm và dùng dung dịch Na2S2O3 0,002 N để chuẩn độ .
Thực hiện mẫu trắng song song. Thể tích chuẩn mẫu trắng phải nhỏ hơn
0,1 mL Na2S2O3 0,1 N .
Tính kết quả:
Kết quả được ghi chép và tính toán theo báo cáo thử nghiệm phụ lục 1.
▪ Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 2 kết quả thử song song được
làm tròn đến số lẻ thứ nhất

146

 ▪ Chênh lệch kết quả giữa 2 lần thử song song không được quá 0,2 meq/
Kg
▪ Dầu mỡ thực phẩm– Chỉ s peroxide - AOCS CD 8 – 53 (1997)
(VS - VB) x N x 1000
X= ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ , meq/kg
W
N- nồng độ dung dịch Na2S2O3
VB -thể tích dung dịch Na2S2O3 chuẩn mẫu trắng, mL
VS -thể tích dung dịch Na2S2O3 chuẩn mẫu thử, mL
W- khối lượng mẫu thử, g
X- chỉ số peroxide, meq / kg
7.3.5. Xác định chỉ số xà phòng hoá của dầu mỡ thực phẩm
Chỉ số xà phòng hoá là lượng mg KOH cần để xà phòng hoá hoàn toàn 1 g
mẫu dầu béo.
Phạm vi áp dụng: Xác định chỉ số xà phòng của các sản phẩm dầu mỡ thực
phẩm thông thường.
Tài liệu tham khảo: AOCS Cd 3-25 (1997)
Thiết bị và dụng cụ :
▪ Bếp cách thuỷ điều chỉnh được nhiệt độ.
▪ Ống sinh hàn có chiều dài tối thiểu 650 mm .
▪ Bình tam giác dung tích 250 mL.
Thuốc thử : (loại tinh khiết phân tích).
▪ Dung dịch HCl chuẩn 0,5 N.
▪ Dung dịch KOH trong cồn: cân khoảng (5 –10) g KOH cho vào bình
cầu dung tích 2 L chứa sẵn 1,5 L cồn 95o . Đun hoàn lưu trên bêp cách
thuỷ 1 h. Chưng cất và thu hồi cồn.

147

 ▪ Hoà tan 40 g KOH trong 1 L cồn đã thu hồi trên (giữ ở nhiệt độ nhỏ hơn
15,5oC trong quá trình hoà tan). Dung dịch nầy phải để qua đêm, lọc.
▪ Dung dịch chỉ thị phenolphtalein 1 % trong cồn 95o .
Tiến hành thử:
Tiến hành thử nghiệm 2 lần cho mỗi mẫu thử theo các bước sau :
▪ Cho mẫu vào cốc thuỷ tinh và gia nhiệt cho đến khi mẫu ở dạng lỏng
hoàn toàn . Lọc qua giấy lọc để loại bỏ tạp chất và vết ẩm. Mẫu sau khi
lọc phải khan nước hoàn toàn .
▪ Cân chính xác khoảng (4-5) g mẫu đã chuẩn bị trên vào bình tam giác
dung tích 250 mL.
▪ Thêm 50 mL dung dịch KOH trong cồn.
▪ Đun hoàn lưu trên bếp cách thuỷ 1 h.
▪ Làm nguội bình đựng mẫu và ống sinh hàn (nhưng không làm đông
mẫu trong bình).
▪ Rửa bên trong ống sinh hàn bằng một ít nước cất.
▪ Lấy bình đựng mẫu ra khỏi ống sinh hàn ; thêm 1 mL chỉ thị
phenolphtalein.
▪ Chuẩn độ mẫu bằng dung dịch HCl 0,5 N cho đến khi mất màu hồng.
▪ Thực hiện mẫu trắng song song với mẫu thử.
Tính toán kết quả:
Chỉ số xà phòng hoá - AOCS CD 3 – 25 (1997)
( VB - VS ) x N x 56,1
X = ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
W
N - Nồng độ dung dịch HCl
VB - thể tích dung dịch HCl chuẩn mẫu trắng , mL
VS - thể tích dung dịch HCl chuẩn độ mẫu thử, mL

148

 W - khối lượng mẫu thử, g

X - chỉ số xà phòng hoá
7.3.6. Xác định chỉ số iod (Phương pháp Wijs)
Phạm vi áp dụng: Xác định chỉ số iod trong tất cả các loại dầu và mỡ thông
thường
Tài liệu tham khảo: AOCS Cd 1-25(1997)
Thiết bịvàdụng cụ:
▪ Bình iod nút mài dung tích 500 mL
▪ Bình định mức dung tích 1 L
▪ Pipet 25 mL
▪ Ống đong 20 mL, 50 mL
▪ Cân phân tích chính xác đến 0,0001 g
▪ Khuấy từ
▪ Giấy lọc
▪ Bình tam giác dung tích 50 mL
▪ Hệ thống tạo khí clo
▪ Tủ sấy
▪ Đồng hồ
Hóa chất: (Loại tinh khiết phân tích)
Dung dịchWijs: chuẩn bị như sau:
▪ Hòa tan 13 g Iod trong 1 L acid acetic băng. Đun nhẹ để hòa tan hoàn
toàn, làm nguội. Dùng pipet hút 5 mL dung dịch iod này vào bình tam
giác, thêm 5 mL dung dịch KI 10 %, 30 mL nước cất và chuẩn độ với
Na2S2O3 0,1 N (chỉ thị hồ tinh bột). Ghi thể tích. Lấy (100÷200) mL
dung dịch iod vào bình màu tối, để nơi thoáng mát để dùng sau. Phần
còn lại cho sục khí clo đi qua cho đến khi lượng dung dịch Na2S2O3
dùng để chuẩn độ dung dịch gấp đôi lượng dung dịch chuẩn ban đầu.

149

 Màu của dung dịch chuyển từ nâu sậm sang màu đỏ. Dung dịch Wijs
không nên thừa clo nhưng cần thừa 1 ít iod. Do đó sau khi thông khí
clo, lượng dung dịch Na2S2O3 chuẩn độ bằng hoặc lớn hơn 2 lần lượng
dung dịch chuẩn ban đầu thì cần thêm dung dịch iod vào. Dung dịch
Wijs phải được giữ trong chai màu nâu, nút nhám gắn Paraphin và được
bảo quản nơi tối, nhiệt độ dưới 30 oC.
▪ Tỷ số I/Cl của dung dịch Wijs phải nằm trong khoảng 1,1 ± 0,1 và được
xác định như sau:
▪ Hàm lượng iod: Rót 150 mL nước chlorine bão hòa vào bình tam giác
dung tích 500mL ,thêm chính xác 5mL dung dịch Wijs và vài viên đá
bọt.Lắc và đun sôi. Để sôi đều trong 10 phút, làm nguội, thêm 30 mL
H2SO4 2% và 15mL dung dịch KI 15%.Trộn đều và chuẩn độ ngay bằng
dung dịch Na2S2O3 0,1 N với chỉ thị là dung dịch tinh bột.
▪ Tổng hàm lượng Halogen:Lấy 150 mL nước cất vào bình tam giác dung
tích 150mL. Thêm 15mL dung dịch KI 15%.Dùng pipet thêm 20 mL
dung dịch Wijs vào bình lắc đều rồi chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,1 N với
chỉ thị là dung dịch tinh bột .
▪ Tổng hàm lượng Halogen:Lấy 150 mL nước cất vào bình tam giác dung
tích 150mL.Thêm 15mL dung dịch KI 15%.Dùng pipet thêm 20 mL
dung dịch Wijs vào bình lắc đều rồi chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,1 N với
chỉ thị là dung dịch tinh bột.
▪ Thêm vào bình 15 mL cacbon tetrachloride ,lắc kỹ đễ mẫu tan hoàn
toàn .
▪ Thêm chính xác 20 mL dung dịch Wijs vào bình ,đậy nút kỹ và lắc
đều.Để yên nơi tối ở nhiệt độ 25oC ± 5) oC trong 1h với mẫu có chỉ số
Iod nhỏ hơn 150 hoặc trong 2h với mẫu có chỉ số Iod lớn hơn hoặc bằng
150

150

(‎

 ▪ Lấy bình ra, thêm lần lượt 20 mL dung dịch KI, 150 mL nước cất.
▪ Chuẩn độ với dung dịch Na2S2O3 0,1N (khuấy đều và mạnh trong quá
trình chuẩn độ) đến màu vàng rơm.Thêm 2 mL chỉ thị hồ tinh bột.Tiếp
tục chuẩn độ cho đến khi mất màu xanh .
▪ Thực hiện đồng thời ít nhất một mẫu trắng trong cùng điều kiện thí
nghiệm với mẫu thử
Lưu ý:
Dung dịch wijs, cacbon tetrachloride, hydro chloride acid, khí chloride
acetic acid, sunfunric acid là những chất độc hại đối với mắt và phổi; dễ cháy
và hấp thu lên da do đó phải cẩn thận khi sử dụng. Các thao tác này nên thực
hiện trong tủ hút.
Tính toán kết quả
Chỉ số iod (Phương pháp Wijs) - AOCS Cd 1 – 25 (1997)
(VB - VS) x N x 12,69
X= ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
W
N - nồng độ dung dịch chuẩn Na2S2O3
VB- thể tích dung dịch Na2S2O3 chuẩn mẫu trắng, mL
VS - thể tích dung dịch Na2S2O3 chuẩn mẫu thử, mL
W - khối lượng mẫu thử, g
X - chỉ số Iod
7.3.7. Xác định chỉ số acid trong dầu mỡ
Chỉ số acid là số mg KOH cần dùng để trung hòa acid béo tự do có trong
1g dầu hoặc mỡ.
Nguyên tắc:

151

 Dùng dung dịch kiềm chuẩn KOH 0,1N để trung hòa hết acid béo tự do có
trong mẫu thử được hòa tan trong dung môi cồn trung tính với chỉ thị
phenolphtalein.
Điểm tương đương nhận được khi dung dịch từ màu vàng (đặc trưng cho
từng loại dầu) chuyển sang màu hồng nhạt và bền trong 30 giây.
Phương trình phản ứng:
RCOOH + KOH RCOOK + H2O
Phạm vi áp dụng: Xác định chỉ số acid trong dầu mỡ động thực vật
Tài liệu tham khảo: AOCS Cd 3d-63 (1997)
Thiết bị và dụng cụ :
Bình tam gíac dung tích 250 mL hoặc 300 mL.
Hóa chất: (Loại tinh khiết phân tích)
▪ Dung dịch chuẩn KOH 0,1 N: hòa tan 5,6 g KOH tinh khiết trong 1 lít
nước vào bình tam giác 2 lít. Đun sôi và khuấy 10 phút, thêm 2 g
Ba(OH)2, đun thêm( 5 ÷10) phút nữa, làm nguội, đậy nút kỹ và để yên ít
nhất 2 giờ trước khi lọc.Chuẩn độ lại bằng acid oxalic với chỉ thị
Phenolphtalein.
▪ Hỗn hợp dung môi đồng thể tích izopropyl alcohol và toluen.
▪ Dung dịch chỉ thị Phenolphtalein 1 % trong izopropyl alcohol.
Tiến hành:
Tiến hành thử nghiệm 2 lần cho mỗi mẫu thử theo các bước sau:
Thêm dung dịch chỉ thị vào hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ 2 mL : 125 mL)
rồi trung hòa bằng dung dịch KOH 0,1 N đến màu hồng bền trong 30 giây
Cân lượng mẫu (đã được khuấy trộn đến đồng nhất) vào bình tam giác dung
tích 250 mL . Lượng cân mẫu tùy thuộc vào chỉ số acid dự đoán có trong mẫu
theo bảng sau:

152

(‎

 ▪ Thêm 125 mL hỗn hợp dung môi đã trung hòa . Hòa tan mẫu (nếu cần,
làm ấm để hòa tan).
▪ Thêm vài giọt chỉ thị Phenolphtalein.
▪ Chuẩn độ bằng dung dịch KOH chuẩn 0,1 N đến màu hồng bền trong
30 giây.
Tính kết quả:
Kết quả được ghi chép và tính toán theo báo cáo thử nghiệm phụ lục 1.
▪ Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 2 kết quả thử song song được
làm tròn đến 2 chữ số có nghiã
▪ Chênh lệch kết quả giữa 2 lần thử song song không được quá 0,22 đối
với mẫu có chỉ số acid nhỏ hơn 4 hoặc không quá 0,36 đối với mẫu có
chỉ số acid lớn hơn 4.

Chỉ số acid - AOCS Cd 3a – 63 (1997)

V x N x 56,1
X = ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ , mg KOH / g
W
N - nồng độ dung dịch KOH
V - thể tích dung dịch KOH chuẩn mẫu thử, mL
W - khối lượng mẫu thử, g
7.3.8. Xác định chỉ số hydroxyl trong dầu mỡ
Chỉ số hydroxyl là số mg KOH cần thiết để trung hoà lượng acid acetic có
được khi acetyl hoá 1 g mẫu dầu mỡ.
Phạm vi áp dụng: Xác định chỉ số hydroxyltrong dầu mỡ và các chất thay
thế
Tài liệu tham khảo: FAO FNP 5/REV.1 (P.177) - 1983

153

 Hóa chất: (loại tinh khiết phân tích )

▪ Pyridine tinh khiết (đã được chưng cất lại và thu hồi ở 114oC - 115oC)
trước khi sử dụng
▪ Anhydride acetic tinh khiết (đã được chưng cất lại và thu hồi ở 139oC)
trước khi sử dụng
▪ Hỗn hợp pyridine - anhydride acetic : Điều chế ngay trước khi sử dụng
bằng cách trộn 3 thể tích pyridine với 1 thể tích anhydride acetic.
▪ Dung dịch KOH 0,5 N trong cồn.
▪ Dung dịch n - butanol đã được trung hoà bằng dung dịch KOH 0,5 N
trong cồn ( với chỉ thị phenolphtalein) đến màu hồng nhạt.
▪ Chỉ thị phenolphtalein 0,2 % trong cồn 600.
Tiến hành thử:
Tiến hành thử nghiệm 2 lần cho mỗi mẫu thử theo các bước sau :
▪ Cân chính xác đến 0,1 mg lượng mẫu thích hợp cho vào bình tam giác,
thêm chính xác lượng tương ứng hỗn hợp pyridine anhydride acetic
theo bảng trên. Lắc đều mẫu. Đun hoàn lưu trên bếp cách thuỷ 1 h.
Thêm 10 mL nước cất qua hệ thống hoàn lưu (Nếu dung dịch có mặt
phân cắt, thêm đủ pyridine để có dung dịch đồng nhất) .Tiếp tục đun
hoàn lưu thêm 10 phút nữa rồi làm nguội. Dùng 25 mL n-butanol trung
tính , một nửa để rửa ống hoàn lưu, 1 nửa để rửa thành bình tam giác.
Chuẩn độ bằng KOH 0,5 N , với 1 mL chỉ thị phenolphtalein đến màu
hồng nhạt.
▪ Làm mẫu trắng tương tự như trên nhưng không có mẫu thử.
▪ Để xác định acid tự do, cân 1 lượng mẫu cho vào bình tam giác khác.
Thêm 10 mL pyridine (đã được trung hoà với KOH, chỉ thị
phenolphtalein).Định phân bằng KOH 0,5 N trong cồn với 1 mL chỉ thị
phenolphtalein đến hồng nhạt.

154

‎
 Tính kết quả:
▪ Kết quả được ghi chép và tính toán theo báo cáo phụ lục 1
▪ Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 2 kết quả thử song song được
làm tròn đến hàng đơn vị.
▪ Chênh lệch kết quả giưã 2 lần thử song song không được quá 5 đơn vị
7.3.9. Xác định hàm lượng chất không xà phòng hoá trong dầu mỡ
Phạm vi áp dụng: Xác định hàm lượng chất không xà phòng hoá trong các
loại dầu mỡ thông thường.
Tài liệu tham khảo: AOCS Ca 6a- 40(1997)
Thiết bị và dụng cụ:
▪ Hệ thống đun hoàn lưu
▪ Bình lóng dung tích 500 mL
Thuốc thử: (Loại tinh khiết phân tích)
▪ Cồn 950
▪ Dung dịch KOH 50 %
▪ Ether petroleum
▪ Dung dịch chuẩn NaOH 0,02 N
▪ Dung dịch phenolphtalein 1% trong cồn 950
Tiến hành:
Tiến hành thử nghiệm 2 lần cho mỗi mẫu thử theo các bước sau:
▪ Cân khoảng 5 g (chính xác đến 0,0001g) mẫu đã trộn kỹ vào bình tam
giác nút mài
▪ Thêm 30 mL cồn 950 và 5 mL dung dịch KOH 50 %. Đun hoàn lưu trên
bếp cách thủy1giờ hoặc cho đến khi mẫu được xà phòng hoá hoàn toàn
▪ Chuyển toàn bộ mẫu đã xà phòng hoá vào bình lóng. Rửa bình bằng cồn
950 đến khi thể tích đạt 40 mL. Tiếp tục rửa bằng nước ấm và sau đó
nước lạnh đến khi tổng thể tích đạt 80 mL. Tráng rửa quanh bình tam

155

 giác bằng 5 mL ete petrol và cũng thêm vào bình lóng. Làm nguội đến
nhiệt độ phòng rồi thêm 50 mL ete petrol
▪ Đậy nắp, lắc mạnh ít nhất 1 phút, để yên tách lớp
▪ Chuyển lớp dưới sang bình lóng khác
▪ Lặp lại quá trình trích ly ít nhất 6 lần với mỗi lần dùng 50 mL ete petrol.
Tất cả dịch trích ly được dồn vào 1 bình lóng
▪ Rửa dịch trích ly 3 lần, mỗi lần 25 mL cồn 10 %. Lắc mạnh và loại bỏ
lớp cồn sau mỗi lần trích ly
▪ Tiếp tục rửa dịch trích ly bằng cồn 10% cho đến khi dung dịch rửa
không cho màu hồng với vài giọt phenolphtalein
▪ Chuyển dịch trích ly được vào bình tam giác khô sạch đã biết trước khối
lượng. Làm bay hơi toàn bộ ete petrol trên bếp cách thủy rồi sấy đến
khối lượng không đổi ở 70 – 80) 0C. Làm nguội 30 phút trong bình hút
ẩm rồi cân
▪ Hoà tan cặn bằng 50 mL cồn trung tính ở 50 0C, thêm 5 giọt
phenolphtalein.
▪ Chuẩn độ bằng NaOH 0,02 N đến điểm cuối
▪ Thực hiện mẫu trắng tương tự nhưng thay mẫu bằng nước cất
Tính kết quả:
▪ Kết quả được ghi chép và tính toán theo báo cáo thử nghiệm phụ lục 1
▪ Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 2 kết quả thử song song được
làm tròn đến số lẽ thứ 2.
▪ Chênh lệch kết quả giữa 2 lần thử song song không được quá 0,2%
Hàm lượng chất không xà phòng hóa - AOCS Ca 6a – 40 (1997)
( W3− W1 ) − [(VS - VB) x 0,0056 x f + (W4 – W2)]
X= ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ x 100 , %
W

156

(‎

 f- hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH

W1 - khối lượng bình mẫu thử ,g
W2 - khối lượng bình mẫu trắng, g
W3 - khối lượng bình và cặn mẫu thử sau khi trích ly, g
W4 – khối lượng bình và cặn mẫu trắng sau khi trích ly, g
VS - thể tích NaOH chuẩn độ mẫu thử,mL
VB - thể tích NaOH chuẩn độ mẫu trắng, mL
X - hàm lượng chất không xà phòng hoá, %
W- khối lượng mẫu thử,g
0,0056 là số gam axit oleic tương ứng chuẩn độ với 1ml NaOH 0,02 N trong
chuẩn độ trên
7.3.10.Xác định hàm lượng xà phòng trong dầu
Phạm vi áp dụng: Xác định hàm lượng xà phòng trong các sản phẩm dầu
thực vật đã tinh chế.
Tài liệu tham khảo: AOCS Cc 17-95 (1997)
Thiết bị và dụng cụ:
▪ Bếp cách thuỷ.
▪ Bình tam giác có nút mài
▪ Microburet 5 mL
Hóa chất: (Loại tinh khiết phân tích)
▪ Dung dịch kiểm tra Aceton chứa 2 % nước: cho 20 mL nước vào 980
mL aceton nguyên chất rồi chuẩn độ bằng HCl 0,01 N hoặc NaOH 0,01
N với chỉ thị bromophenol xanh cho đến khi dung dịch có màu vàng
▪ Dung dịch chuẩn HCl nồng độ 0,01 N.
▪ Chỉ thị bromophenol xanh 1% trong nước.
▪ Dung dịch NaOH 0,01N
Tiến hành thử:

157

 Tiến hành thử nghiệm 2 lần cho mỗi mẫu thử theo các bước sau:
▪ Cân khoảng 10 g mẫu (đã trộn đều) chính xác đến 0,0001g vào bình tam
giác dung tích 250 mL . Thêm 1 mL nước cất , làm ấm trên bếp cách
thuỷ và lắc mạnh .
▪ Thêm tiếp 50 mL dung dịch kiểm tra, làm ấm rồi lắc kỹ. Để yên cho
dung dịch trong bình tách thành hai lớp. Nếu mẫu có xà phòng, lớp trên
sẽ có màu xanh lá mạ đến xanh da trời, tiếp tục thực hiện các bước tiếp
theo sau đây để xác định hàm lượng xà phòng.
▪ Chuẩn độ mẫu trong bình bằng dung dịch HCl 0,01 N mẫu cho đến khi
màu xanh của lớp dung dịch trên chuyển thành màu vàng.
▪ Tiếp tục làm ấm, lắc và chuẩn độ đến khi lớp trên có màu vàng bền
▪ Thực hiện mẫu trắng với mẫu dầu không chứa xà phòng.
Tính kết quả:
▪ Kết quả được ghi chép và tính toán theo báo cáo thử nghiệm phụ lục 1
▪ Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 2 kết quả thử song song được
làm tròn đến số lẻ thứ nhất
▪ Chênh lệch kết quả giữa 2 lần thử song song không được quá 0,01%
Hàm lượng xà phòng - AOCS Cc 17- 95 (1997)
(VS -VB) x N x 0,304 ×100
X = ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ , %
W
N - nồng độ dung dịch HCl
VS - thể tích HCL chuẩn độ mẫu thử, mL
VB - thể tích HCL chuẩn độ mẫu trắng, mL
W - khối lượng mẫu, g
X - hàm lượng xà phòng theo natri oleat, %

158

 Lưu ý: Phương pháp này dùng cho mẫu có chứa hàm lượng xà phòng khoảng
0,05 % . Đối với mẫu có hàm lượng xà phòng lớn nên cân khoảng 4 g mẫu.
7.3.11.Xác định hàm lượng tro cuả sản phẩm dầu
Phạm vi áp dụng: Xác định hàm lượng tro của các sản phẩm dầu mỡ thực
phẩm
Tài liệu tham khảo: AOCS Ca 11 - 25 (1997)
Thiết bị và dụng cụ:
▪ Lò nung điều chỉnh được nhiệt độ đến 600 0C
▪ Chén nung dung tích 100 mL
Tiến hành:
Tiến hành thử nghiệm 2 lần cho mỗi mẫu thử theo các bước sau:
▪ Trộn mẫu thật đều , nếu cần , làm mềm bằng cách đun nhẹ nhưng không
làm chảy mẫu.
▪ Đặt chén vào lò nung (550 - 600) oC trong khoảng 30 phút. Làm nguội
trong bình hút ẩm và cân.
▪ Cân khoảng 50 g mẫu vào chén, đun nhẹ cho đến khi mẫu cháy thành
ngọn lửa trên mặt. Giảm kích thước ngọn lửa cho đến khi nhiệt vừa đủ
cho mẫu cháy.
▪ Tiếp tục đốt mẫu đến than đen rồi cho chén vào lò nung nhiệt độ 550 -
600) oC trong 1 giờ.
▪ Lấy chén ra khỏi lò nung , làm nguội 45 phút trong bình hút ẩm , cân.
▪ Lặp lại quá trình nung và cân cho đến khi chênh lệch khối lượng giữa
2 lần cân liên tiếp không quá 5 mg
Tính kết quả:
▪ Kết quả được ghi chép và tính toán theo báo cáo thử nghiệm phụ lục 1.
▪ Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 2 kết quả thử song song được
làm tròn đến 0,1g/Kg

159

(‎

 Chênh lệch kết quả giữa 2 lần thử song song không được quá 0,1g/Kg
Hàm lượng tro - AOCS Ca 11 – 25 (1997)
(W2 – W) x 1000
X = ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ , g/Kg
W1 - W
W2 - khối lượng chén và tro, g
W1 - khối lượng chén và mẫu, g
W - khối lượng chén, g
X - hàm lượng tro, g/kg
7.3.12.Xác định hàm lượng tạp chất của sản phẩm dầu mỡ thực phẩm
Phạm vi áp dụng: Xác định hàm lượng tạp chất không tan của sản phẩm dầu
mỡ thực phẩm
Tài liệu tham khảo: AOCS Ca 3a – 46(1997)
Thiết bị và dụng cụ:
▪ Tủ sấy điều chỉnh được nhiệt độ ở 101 ± 1) 0C
▪ Chén lọc Gooch có lót 2 g amian (đã được sấy khô đến khối lượng
không đổi ở 101 ± 1)0C . Làm nguội 30 phút trong bình hút ẩm và cân)
Thuốc thử: (Loại tinh khiết phân tích)
▪ Ete petrol
▪ Ete etylic
▪
Chuẩn bị mẫu
Trộn mẫu thật kỹ bằng dụng cụ thích hợp (có thể làm ấm mẫu nhưng không
được đến điểm nóng chảy)
Tiến hành
Tiến hành thử nghiệm 2 lần cho mỗi mẫu thử theo các bước sau:
▪ Cân chính xác khoảng 5 g mẫu vào cốc thủy tinh

160

(‎

(‎

 ▪ Thêm 50 mL ete etylic rồi làm ấm trên bếp cách thủy để hoà tan
▪ Lọc qua chén lọc Gooch
▪ Rửa 5 lần, mỗi lần với 10 mL ete etylic ấm, để dịch qua lọc hết rồi mới
cho lượng ete tiếp theo
▪ Rửa lại cặn bằng 1 ít ete petrol
▪ Sấy khô chén và cặn đến khối lượng không đổi ở 101 ± 1) 0C, làm
nguội 30 phút trong bình hút ẩm, cân
Tính kết quả
▪ Kết quả được ghi chép và tính toán theo báo cáo thử nghiệm phụ lục 1
▪ Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 2 kết quả thử song song được
làm tròn đến 0,01%
▪ Chênh lệch kết quả giữa 2 lần thử song song không được quá 0,01%
Hàm lượng tạp chất - AOCS Ca 3a – 46 (1997)
( W2 - W1 ) x 100
X = ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ , %
W

W2 - khối lượng chén và cặn sau khi sấy , g

W1 - khối lượng chén , g
W - khối lượng mẫu , g
X - khối lượng tạp chất , %
7.3.13.Xác định hàm lượng nước và các chất dễ bay hơi trong sản phẩm dầu
mỡ
Phạm vi áp dụng: Xác định hàm lượng nước và các chất dễ bay hơi trong các
sản phẩm dầu mỡ thông thường.
Tài liệu tham khảo: AOCS Ca 2c – 25(1997)
Thiết bị và dụng cụ :

161

(‎

 ▪ Tủ sấy điều chỉnh được nhiệt độ đến 1010C ± 10C

▪ Bếp điện
▪ Chén ẩm có nắp
▪ Bình hút ẩm
Tiến hành:
Tiến hành thử nghiệm 2 lần cho mỗi mẫu thử theo các bước sau:
▪ Cân chính xác khoảng 5 g (đã được trộn đến đồng nhất)mẫu vào chén
ẩm (đã được sấy khô đến không đổi và cân để biết khối lượng)
▪ Đặt chén có mẫu vào tủ sâý ở 101 ± 1)0C trong 30 phút
▪ Lấy ra, làm nguội trong bình hút ẩm 30 phút rồi cân
▪ Lặp lại quá trình sấy và cân cho đến khi chênh lệch giữa 2 lần cân liên
tiếp không quá 5 mg
Tính kết quả:
▪ Kết quả được ghi chép và tính toán theo báo cáo thử nghiệm phụ lục 1
▪ Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 2 kết quả thử song song được
làm tròn đến số lẻ thứ 2
▪ Chênh lệch kết quả giữa 2 lần thử song song không được quá 0,03%

Hàm lượng nước và các chất dễ bay hơi - AOCS Ca 2c – 25 (1997)

(W2 - W1) x 100
X = ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ , %
W2 - W
W2 - khối lượng chén và mẫu trước khi sấy, g
W1 - khối lượng chén và mẫu sau khi sấy, g
W - khối lượng chén, g
X - hàm lượng nước và các chất dễ bay hơi,%

162

(‎

 7.3.14.Xác định hàm lượng acid béo tự do có trong dầu, mỡ thực phẩm
Phạm vi áp dụng: Xác định hàm lượng acid béo tự do có trong dầu thực vật,
dầu hải sản, mỡ động vật ở dạng thô hoặc đã tinh chế.
Tài liệu tham khảo: AOCS Ca 5a-40 (1997)
Thiết bị và dụng cụ:
▪ Bình tam giác dung tích 250 mL
▪ Dụng cụ định phân (loại đơn giản hoặc tự động)
Thuốc thử: (loại tinh khiết phân tích)
▪ Ethyl alcohol 95% đã được kiểm tra độ trung tính bằng cách trung hoà
với dung dịch kiềm chuẩn và chỉ thị phenol phtalein.
▪ Dung dịch NaOH chuẩn
▪ Dung dịch chỉ thị phenol phtalein 0,1 % trong cồn 95o
Thiết bị và dụng cụ:
Tiến hành thử nghiệm 2 lần cho mỗi mẫu thử theo các bước sau:
Tuỳ thuộc vào hàm lượng acid béo (dự đoán) có trong mẫu, xác định hàm
lượng mẫu, cồn và nồng độ dung dịch NaOH cần thiết để phân tích theo bảng
sau:
▪ Trộn thật đều mẫu và làm chảy mẫu hoàn toàn ở nhiệt độ không quá
điểm nóng chảy 10oC trước khi cân
▪ Cân lượng mẫu tương ứng theo bảng trên và cho vào bình tam giác (lắc
mẫu 1 phút trước khi cân nếu mẫu có chứa bọt khí )
▪ Thêm lượng cồn tương ứng và 2 mL chỉ thị phenol phatalein.
▪ Định phân với dung dịch NaOH chuẩn tương ứng cho đến khi có màu
hồng nhạt bền trong 30 giây.
Hàm lượng acid béo tự do
VxNxK
X = ⎯⎯⎯⎯⎯ , %

163

 W
Trong đó :
▪ N -nồng độ dung dịch NaOH, N
▪ V -thể tích NaOH chuẩn mẫu thử, mL
▪ W -khối lượng mẫu thử, g
▪ K -hệ số chuyển đổi theo loại acid tương ứng, có giá trị:
▪ K= 28,2 nếu X tính theo acid oleic
▪ K= 20,0 nếu X tính theo acid lauric
▪ K= 25,6 nếu X tính theo acid palmitic
▪ X - hàm lượng acid béo tự do, %

164