LUCRAREA PRACTICA NR. 2 EXAMENUL MICROSCOPIC iN STUDIUL HISTOLOGIC , Pteparatele histologice, de orice tip, nu se pot studia cu ochiul liber. Examenul histologic se face numai cu ajutorul microscopului. Studiile histologice se folosesc: * microscoape fotonice cu putere de marire de pana la 1000 de ori microscoape electronice cu putere de mirire de cateva sute de mii de ori. MICROSCOPUL FOTONIC utilizeaz’, ca Principiu de functiune, refractia razelor luminoase. La trecerea razelor luminoase dintr-un mediu in altul, cu densitati diferite, razele luminoase suferd procesul de refractie sub un unghi denumit unghi 0 Obeta). Fenomenul de refractie are loc chiar la suprafata de separare a celor doud medii. Unghiul de refractie al razelor luminoase este diferit de la un mediu la altul. Raportul dintre sinusul unghiului de incident alfa si sinusul unghiului de refractie beta) constituie indicele de refractie (a). Indicele de refractie al aerului are o valoare conventionala n=1. Microscopul este aparatul optic de miéarit folosit in studiul explorator al structurilor cu dimensiuni de ordinul micronilor (10m) si care foloseste ca surs& luminoasé lumina naturala sau artificial’. La ora actual s-a renuntat la microscoapele cu lumina naturala datoriti. faptului ca intensitatea fascicului luminos depindea de lumina natural din laborator, iar procesul de condensare la razelor luminoase asupra obiectului de studiat se face cu dificultate. (Aceste microscoape pot fi gasite numai fn tnvafimantul preuniversitar si au rolul de initiere al elevilor in studiul biologic). . . Microscopul fotonic este constituit din doua parti: © parte mecanic&d © parte optica. Scanné avec CamScannerI. PARTEA MECANICA este formata, la réndul s4u dintr-un sistem de piese mecanice ce contine sistemul optic de marit, pe cel de iluminat si pe cel de captat si transmis lumina. Aspectul si forma dispozitivului mecanic pot s& varieze de la un tip de microscop Ia altul. In esenfa, la toate, partea mecanicd slujeste aceluiasi scop: sustinerea partilor sistemului optic si crearea posibilitatilor de manevrare a componentelor sistemului optic. Partea mecanica este constituiti din: * piciorul sau talpa microscopului; © coloana microscopului; © platina sau masuta microscopului cu cavalerii (valetii); * dispozitivele de punere la punct a imaginii; © tubul microscopului; Piciorul sau talpa microscopului este dispozitivul metalic care susfine intregul ansamblu si asigura stabilitatea aparatului. Coloana microscopului are forme variate (dreapta, curba, angulaté). Ea se articuleaz’ in partea inferioara cu_piciorul microscopului iar la partea superioara prezintd articulafii pentru tubul microscopic si uneori pentru dispozitivele de fotografiat sau de inregistrat video. Coloana se articuleaz4 cu tubul microscopic printr-un sistem de angrenaj prevazut cu o “sind dinfata”, articulatie care permite tubului microscopic s se apropie sau sd se indeparteze de obiectul de studiat. in partea inferioara, deasupra piciorului microscopic, coloana se articuleaz4 cu masufa sau platina microscopului. Miasuta microscopului este o placd metalicd rotunda sau patratd, fixata orizontal la coloana microscopului, deasupra articulatiei acesteia cu piciorul. Central, platina tuturor microscoapelor Prezint’ un orificiu circular larg de 2,5 cm. sau dreptunghiular, care permite trecerea fascicolului luminos dinspre dispozitivul de captat si transmis lumina spre tubul microscopului. Platina poate fi fixa dar la microscoapele actuale ea este formati dintr-un sistem de doua placi metalice suprapuse: cea interioar& fixa, articulat& posterior cu coloana microscopului iar cea superioar’ mobila, articulata la placa inferioar’, Placa superioar4 este manevrati Printr-un 4 Scanné avec CamScanner RERABR RE ARA A A A BD & ow tw =surub lateral, puténdu-se deplasa lent pe cea inferioard in sens antero- Posterior, . Partea posterioar’ a plicii superioare a m&sufei exist un dispozitiv glisant denumit cArucior care permite migcéri de lateralitate. El prezinti dou’ dispozitive reglabile de prindere a preparatului histologic (cavaleri, valeti). Deplasarea laterali a cAruciorului se realizeaza cu un alt surub dispus lateral de masuta microscopului. Preparatul histologic se va deplasa in sens antero-posterior odat4 cu placa superioara a msufei, iar lateral prin deplasarea cAruciorului, astfel incat se poate aduce in axul optic si poate fi studiat orice punct al Preparatului histologe, __La_ microscoapele modeme placa superioar’ a méasufei microscopului poate executa si miscari de rotatie astfel incat preparatul histologic poate fi pozitionat optim pentru inregistrare pe banda video sau film. "Fig.l Microscop fotonic monocular 35, Scanné avec CamScannerDispozitivele de punere la punct a imaginii sunt fixate la coloana microscopului. Ele sunt formate din doud perechi de suruburi numite vize, dispuse simetric de o parte si de alta a coloanei. Exist vize muicrometrice $i vize macrometrice, Vizele macrometrice sunt 0 pereche de suruburi ce imprima tubului microscopic deplasiri ascendente sau descendente mari fati de Preparatul de studiat, obtinand o punere la Punct a imaginii aproximativ de clara. Aceast4 a Pereche de vize se angreneazA prin dinfii axei sale orizontale la dinfaturile oblice spate in sistemul de angrenaj de pe coloana microscopului. _ Vizele micrometrice constituie cealalti pereche de vize ce prima microscopului miscari foarte fine, lente, pentru a completa claritatea si precizia imaginii inceputi cu viza macrometric’. Ele sunt agrenate similar vizelor macrometrice numai cd dintii de angrenaj mecanic dintre axa lor orizontala si coloana microscopului prezinté “pasi” foarte mici. Tubul microscopului este format din dou’ tuburi cilindrice, telescopate innegrite in interior pentru a evita reflectarea luminii. El poarté la cele doud extremitati partea opticd propriu-zisi a microscopului. La extremitatea superioar’ a tubului interior, se adapteaza ocularul, iar la partea inferioara obiectivul. Tubul purtator al sistemului optic, in totalitatea sa, este angrenat la coloana verticala de suport prin sind dinfat& si se apropie sau se dep&rteaz4 de platina care sprijina preparatul de studiat prin deplasarea verticala determinata de rotirea celor doua perechi de vize. Microscoapele binoculare prezinta in interiorul tubului un sistem complex de prisme de difractie a fascicolului luminos, astfel incat imaginea oferit’ de obiectiv s fie redaté identic de ambele oculare. Studiul binocular reduce oboseala examinarii si permite mai usor depistarea detaliilor. Microscoapele actuale prezint& Ja partea inferioara a tubului microscopic un dispozitiv metalic denumit revorver ce permite atasarea a 4-5 obiective cu putere de miarire diferita, Revolverul este format din doua calote sferice unite printr-o axa de rotatie. Calota superioara este fixaté excentric la capatul inferior al tubului. Ea prezint un orificiu circular in dreptul capatului inferior al tubului microscopic. im 36 Scanné avec CamScannerCalota inferioara, mobil, este atasat’ printr-un ax central calotei superioare. Ea poate executa migcari de rotatie in jurul axului sau si prezinta unu pana la cinci orificii filetate pentru adaptarea obiectivelor. Prin miscarea de rotatie a calotei inferioare pe prima calot& se aduc, pe rand in axul optic al microscopului, obiectivele. ___Un dinte metalic montat intre cele dou’ calote blocheaz4 fiecare obiectiv in parte cand acesta a fost adus in axul optic al microscopului. Fig. 2 Microscop optic binocular. Il. PARTEA OPTICA Este formata din: © sistemul de iluminare; © sistemul optic propriu-zis. A. Sistemul de iluminare cuprinde: © sursa de lumina, e sistemul de captat si transmis lumina. 7 Scanné avec CamScanner> oglinda > condensator > iris (diafragm) 1. Sursa de lumina, Dupa sursa de luming, microscoapele se clasifica in: * microscoape fir surs proprie de lumina * microscoape cu sursd proprie de lumina La microscoapele din prima categorie, lumina folositd poate fi cea naturala (difuzi de zi) sau lumina artificiala a unui bec electric obignuit sau o lampa speciala pentru microscop. Lumina este captata si dirijaté in axul optic al microscopului prin orientarea manual a oglinzii, La aceste microscoape oglinda care reflect’ lumina asupra preparatului histologic prezint& o fat’ pland pentru lumina naturald sio fat concava pentru lumina artificial. (Acest tip de microscop nu mai este utilizat decat in invataméntul preclinic). Microscoapele cu surs proprie de lumina folosesc numai lumina artificiala, iar sursa (becul) este montat in piciorul microscopului. Sursa de lumina este reprezentatd de un bec incandescent sau cu halogen de 6 volfi. Orientarea fascicolului luminos spre preparatul histologic si tubul microscopului se face prin intermediul unei oglinzi a crei pozitie poate fi modificat& cu ajutorul a doud vize montate in partea anterioarA a talpii microscopului. Unele microscoape au oglinzi fixe, nereglabile, iar altele au renunfat la sistemul de oglinzi, sursa de lumina fiind orientata direct spre preparatul histologic. Microscoapele’ moderne prezint& sisteme de diafragmare a luminii ca gsi sisteme care miresc sau micsoreazA intensitatea fasciculului luminos. Deschiderea circulara a talpii, prin care se face Proiectia verticala a fasciculului luminos, permite asezarea unor filtre de corectie a culorii sau anexarea unor dispozitive speciale. 2. Sistemul de captat si transmis lumina cuprinde: oglinda, condensatorul si diafragmul. Oglinda se giseste amplasata sub condensator la microscoapele care nu au sursi de lumin& proprie sau se afla situata in picional microscopului la cele cu lumina proprie. Condensatorul este constituit dintr-un sistem de lentile convergente, angrenat la coloana microscopului_printr-o monturs, metalicd, culisanti, dispusd imediat sub miasuti. Sistemul de angrenaj 38 4 ee ae Scanné avec CamScanneral condensatorului este actionat de o viz care prin rotire pe o sind dintatd coboara sau ridicd condensatorul. fn functie de obiectivul folosit Se stabileste si pozitia condensatorului, mai apropiatA sau mai indepartata de preparatul histologic. Cand se utilizeazi obiective cu Putere mare de marire se ridic&d condensatorul, iar cind se folosesc obiective cu putere de marire slab’ condensatorul se coboara. _ Diafragma sau irisul este format din lamele metalice subfiri, Semilunare, ce circumscriu un orificiu circular al c&rui diametru se Poate regla dup& necesititi. Irisul se gaseste situat imediat sub condensator. El este montat intr-un inel metalic constituind un diafragm a c&rui deschidere se regleazA printr-o tija laterala, putand micsora sau mari conul luminos ce iese prin deschiderea circulara din talpa microscopului. Inelul metalic al irisului este atasat_monturii metalice a condensatorului, astfel incdt miscarea condensatorului este insotita de miscarea diafragmului. La unele microscoape sub diafragma sunt atasate inelele pentru filtre. B. Sistemul optic este reprezentat de: © obiective oculare Obiectivele sunt sisteme de lentile convergente dispuse in ordine intr-o armatur’ tubulara metalic’. Ele se infileteazA in partea inferioara a tubului microscopic, direct sau prin intermediul revolverului. Lentila inferioara a obiectivului se numeste lentili frontala. Distanta dintre aceastd lentila si preparat este distana frontala si ea este invers proportionala cu puterea de marire a obiectivului. Cu cat aceasta distan{a este mai mic& cu att puterea de marire a obiectivului este mai mare. Raportul dintre diametrul lentilei frontale si puterea de marire a obiectivului este tot de invers proportionalitate, adicd o lentila frontala cu diametrul mic va avea o putere de marire mare. Prin urmare, lentila frontal este lentila care determina puterea de mirire a obiectivului. {n general, puterea de mérire a unui obiectiv este cu atat mai mare cu ct diametrul lentilei sale frontale si distanta frontal a acesteia sunt mai reduse. 39 Scanné avec CamScannerRestul lentilelor din sistemul ocular au rolul de a corecta aberatiile de sfericitate, de culoare si de camp date de lentila frontala. __In functie de corectiile efectuate existd mai multe tipuri de obiective: © obiective simple sau acromatice, la care corectiile de culoare si de cmp sunt putin realizate; © obiective apocromatice care corecteazi foarte bine aberatiile de culoare; © objective plan-apocromate care pot face corectia tufuror aberafiilor date de lentila frontala. Fiecare obiectiv are o putere de marire determinaté. Acest parametru este inscris prin gravare pe fata extend a obiectivului. Obiectivele diferd intre ele in primul rnd, dupa puterea lor de marire. in functie de mediul dintre preparatul histologic si lentila frontala exist doud tipuri de obiective: © obiective uscate, objective umede sau cu imersie. Obiectivele uscate sunt acelea la care spatiul dintre lentila frontal a obiectivului si preparatul de examinat este ocupat de aer. Obiectivele cu imersie sunt obiectivele care necesitd, pentru studiu, existenta intre lentila frontala si preparatul de examinat a unui lichid cu indice de refractie egal sau apropiat de al sticlei (ulei de cedru). Obiectivele cu imersie au putere de mirire cuprins& in general intre 90-100 ori. Aceasta este gravata pe obiectiv ca gi indicele IU. sau HL Un-obiectiv di o prima imagine real, risturnat& si marité a preparatului histologic. De obicei microscoapele moderne au o gamitur& de 5 obiective: obiective cu putere de marire de 2,3,4, sau 6 X (0b.1) obiective cu putere de marire de 10 X (ob.2) obiective cu putere de marire de 20 X (ob.3) obiective cu putere de mirire de 40 X (ob.4) obiective cu putere de mirire de 90 sau 100 X (imersie) Microscoapele modeme au putere de miarire a obiectivelor inscrise pe obiective ca atare, de ex.: de 10 X, de 20 X, 40X, 60X, 100X. 40 Scanné avec CamScannerOcularele sunt sisteme de doud perechi de lentile convergente, Separate printr-un diafragm fin, angrenate intr-o montura metalic& Tubulara introdusa 1a partea superioara a tubului microscopic. Numele de oculare deriva de la faptul c& prin el priveste examinatorul. _ Ocularul actioneaz& asupra imaginii date de obiectiv ca o lupa. Prin ocular se priveste deci 0 imagine real si réstumat& data de Obiectiv, imagine pe care o mareste gi o transforma in imagine virtual, mArita si ristumata fafa de obiect. Ocularul prezintd o lentila inferioar numité lentil de cmp sau colectoare si o lentil superioara numita lentila oculara propriu-zisd. Puterea proprie de mirire a ocularelor este notaté de maniera urmitoare: 2X, 5X, 7X, 10X, 16X. La microscoapele folosite in histologie, binoculare, deasupra obiectivelor se gaseste un sistem de prisme ce proiecteazi imaginea intr-un plan inclinat si odatd cu flectarea razelor in unghiul obiectiv ocular se realizeazA si o dedublare care este proiectatd in doud tuburi si examinata prin observatie binocular’. Acest fapt reduce efortul de adaptare al ochiului examinatorului in timpul unei cercetari prelungite. Puterea de mirire a microscopului este egald cu puterea de mirire a obiectivului inmultita cu puterea de marire a ocularului. De ex.: © obiectiv 10X si ocular 10X, puterea de mirire a microscopului respectiv este de 100X © obiectiv 40X si ocular 10X, puterea de miarire a microscopului este de 400 X © obiectiv 100X si ocular 10X, puterea de miarire a microscopului este de 1000 X. Utilizarea microscopului Utilizarea microscopului are ca scop obfinerea unei imagini de buna calitate si reducerea minima a efortului de adaptare a ochiului examinatorului. jn manevrarea acestui instrument optic de mirit este necesara 0 atentie deosebiti, mai ales din partea celor mai putin instruiti, deoarece, obiectivele de putere mare se apropie foarte mult cu lentila frontala de preparatul histologic si o manevrare brusc& sau excesiva a macrovizei duce la distrugerea preparatului si la deteriorarea lentilei frontale a iectivului. obiectivull a“ Scanné avec CamScannerExaminarea preparatelor histologice incepe cu obiective de putere mai mica pentru a avea o imagine de ansamblu asupra structurii de examinat, Aceasti. examinare se efectueazi in mai multi timpi © se aseazA preparatul histologic pe masufa microscopului cu lamela spre lentila frontalé a obiectivului, se fixeazd cu ajutorul cavalerilor sau a lamelor caruciorului astfel incat preparatul de examinat s& fie in axul optic al microscopului se aduce obiectivul 10X in axul tubului microscopic prin rotirea calotei inferioare a revolverului pana se aude un clinchet metalic, iar incercarea de a-l roti mai departe intampind o usoara rezistent’; se coboara tubul microscopic pind la circa 10 mm de platina folosindu-se miscarea pe verticala cu ajutorul vizei macrometrice; © se coboara condensatorul pana la circa 1-2 cm pan& cand campul microscopic, privind prin oculare, apare iluminat uniform; © privind prin oculare se manevreazi microviza inainte sau inapoi pana cand imaginea histologicd apare clara (conturul nucleilor, celulelor sau a membranelor se observa net); © se corecteaza iluminarea preparatului astfel incat acesta si. nu fie prea slab sau prea excesiv. Pentru examinarea cu obiective mai puternice se procedeazi astfel: se aduce zona aleasi pentru cercetare cat mai in centrul cdmpului, deoarece cu cat obiectivul folosit este mai puternic se reduce suprafata cémpului studiat; se roteste revolverul pana se aduce in axul optic obiectivul imediat superior ca putere de marire; * se reduce deschiderea sistemului optic prin actionarea diafragmului de sub condensator; se ridicd condensatorul pentru o iluminare cét mai bund a preparatului histologic; © cu ajutorul vizei micrometrice, rotim usor inainte sau inapoi, privind prin oculare, pind se corecteaz& claritatea imaginii histologice. 42 Scanné avec CamScannerTrecerea Ia un obiectiv si mai puternic se face urménd aceeast Succesiune de operatiuni: © centrarea in camp a zonei de studiat cu noul obiectiv; © aducerea acestui obiectiv in ax; * ridicarea condensatorului; © corectarea clarititii imaginii prin migc&ri de rotafie ale microvizei. . C4nd este necesari examinarea preparatului cu obiectivul cu imersie se procedeaza in felul urmator: © se realizeazi o centrare foarte riguroasi a zonei de studiat cu obiectivul de 40 X; se ridic& condensatorul cat mai sus posibil; * se scoate din ax obiectivul respectiv; © se pune pe lamé o picdtura de ulei de cedru in dreptul axului optic; © se aduce obiectivul cu imersie in axul optic. fn acest moment, dac& obiectivul cu imersie apartine microscopului, lentila frontal a obiectivului ia contact cu lichidul de imersie si se afl la mai putin de 1 mm de preparatul de examinat. Privind prin oculare apare imaginea histologicd mai mult sau mai putin clara. Rotind microviza inainte sau inapoi imaginea microscopicd se clarificd. Tot acum se poate regla iluminarea cimpului microscopic, Daca obiectivul cu imersie aparfine altui tip de microscop, pentru a putea realiza o examinare corectd, fara a deteriora preparatul histologic sau lentila frontala a obiectivului, se apropie acest obiectiv de preparat si se priveste din pozitia lateral pentru a verifica distanta dintre lentila frontal si preparat, care trebuie s& fie mai mic& de 1 mm. Corectia clarititii imaginii se realizeaz4 tot cu ajutorul microvizei. $i in acest caz obiectivul cu imersie necesita o manipulare foarte atenti si delicat4, evitand miscarile bruste pentru a feri lovirea acestuia de lama. Obiectivele cu imersie actuale au lentila frontala inglobat& intr- un sistem mecanic care permite telescoparea acesteia, astfel incAt la un contact mai dur intre preparatul histologic si obiectiv si nu determine distrugerea lentilei frontale sau a preparatului histologic. 43 Scanné avec CamScannerfn trefinerea gi pAstrarea microscopului fotonic Microscopul este un aparat optic de folosinta indelungata. Pentru i de a putea fi utili protectie si ingrij © microscopul va fi pastrat acoperit cu hus La operatiuni: it in condifii optime sunt necesare céteva masurl ¢ din plastic care $8 istemul optic; Jemente ale biectivelor impiedice depunerea de particule de praf pe si se recomand’ s& nu se atinga cu mana unele ¢! sistemului optic (oglinda, lentilele ocularelor, 0} sau condensatorului) pentru a nu lasa amprente; se va evita, pe ct posibil, transportul microscopului pentru a-l feri de socuri mecanice care pot deregla sursa de lumina sau sistemul de transmitere al acesteia (oglinda, condensator, iris); se vor evita curenfii de aer care pot antrena praful pe sistemul optic; componenta metalica se curdja periodic prin stergerea cu 0 bucat& de panzi moale care s4 nu lase scame; partile mecanice, mobile ale microscopului, vor fi curdfate, degresate si lubrefiate periodic cu un ulei special; lentilele ocularelor se curafa de praf cu o pensula fina sau se sterg cu o bucatd de panza curat imbibat4 cu un amestec de alcool-eter 10%; lentilele frontale ale obiectivelor se curata cu tifon inmuiat ‘piele de ciprioara”; tn benzen sau xilen si apoi se sterg cu “ terminarea folosirii microscopului se fac urméatoarele se scoate preparatul histologic de pe platina; se aduce in axul optic al microscopului cel mai mic obiectiv; se cobora condensatorul; se stinge sursa de iluminare; se acopera microscopul cu o hus& din plastic. Scanné avec CamScanner— a Oo ALTE TIPURI DE MICROSCOAPE . {n afara microscopului fotonic folosit curent si a c&rui descriere a ‘ost ficuta mai inainte, mai existi gi alte tipuri de microscoape. Aceste tmicroscoape Se pot imparfi in dou& categorii in functie de tipul de tadiafii utilizate. Astfel exist’: A. Microscoape fotonice . @ Microscoape fotonice ce folosesc radiatiile spectrului vizibil: © microscopul cu fond intunecat © ultramicroscopul © microscopul cu lumina polarizati microscopul cu contrast de fazé. b. Microscoape fotonice ce utilizeaz& alte tipuri de radiatii: * microscop cu lumina ultraviolet, © microscop cu lumina ultraviolet pentru fluorescent. ¢. Microscopul confocal. B. Microscoape electronice A. Microscoape fotonice Microscopul cu fond intunecat Este utilizarea unui efect de tip Tyndal in microscopie. Obiectul examinat apare stralucitor intr-un cdmp intunecat, datorita iluminarii laterale a preparatului. Acest microscop se foloseste in unele demonstratii histologice dar mai mult in dermatologie pentru identificarea spirochetei (Treponema pallidum). Are ca principiu formarea imaginii prin difractia luminii de catre obiect, prin utilizarea unui condensator special numit cardioic care dirijeaza razele marginale laterale in jurul preparatului. Ultramicroscopul Este o varianta a microscopului cu cmp intunecat. Sursa de lumina utilizaté este o sursa foarte puternicd -arcul voltaic- si proiectia razelor laterale spre preparat se face aproape sub un unghi de 90°. Scanné avec CamScannerFolosirea acestui microscop permite identificarea unor particule ultramicroscopice cu dimensiuni pana la 0,03 microni. Acest microscop se utilizeaz& in studiul starilor coloidale. Microscopul cu lumina polarizatt Difera de microscopul obisnuit prin faptul c4 prezint& interpuse in drumul fascicolului luminos doua prisme din spat de Islanda numite nicoli, dispuse incrucisat. ~ Un nicol numit “polarizator’ se monteazi sub condensator, celalalt, “analizatorul” este plasat in ocular. Se obfine o lumina polarizata care permite studiul structurilor interne ale corpilor, din punct de vedere al refringentei lor. Birefringenta sau monorefringenta sunt date de dispunerea moleculelor din constitutia obiectelor studiate: monorefringenta apare la corpurile cu molecule dispuse neordonat iar birefringenfa la cele cu dispozitie ordonata a moleculelor. in histologie, cu acest tip de microscop se studiazA structurile miofibrilare, mielina $i mitocondriile, osteonul. Microscopul cu lumina polarizata se mai foloseste si in biologie si mineralogie. Microscopul cu contrast de faza. Este un microscop obisnuit dar la care s-a adaptat un condensator special si un sistem de obiective cu placa de fazare. Principiul de functionate se bazeaz4 pe observatia c4 atunci cand lumina trece dintr-un mediu cu indice de refractie scazuta in altul cu indice de refractie mai ridicat isi micsoreaza viteza si schimba faza. Astfel, unele detalii celulare, care au un indice de refractie apropiat, nedecelabile in microscopie opticd obisnuitd, pot fi identificate deoarece, dispozitivele amintite mai sus permit transformarea diferentei de faz4 neperceptibila de retina in diferenti de intensitate luminoasi care se poate percepe optic. Cu acest tip de microscoape se pot studia preparate histologice fixate si colorate, preparate proaspete, frotiuri sau celule libere in culturi de celule sau fesuturi. ace eel 46 aaahthtt Scanné avec CamScanner3 Microscopul cu contrast de faz Microscopul cu lumina ultraviolet Este un microscop obignuit clruia i s-a adaptat o optic de cuart gio surs& de lumina special’ (vapori de Hg). Datorit’ faptului cA radiatiile ultraviolete sunt vatimatoare pentru ochiul uman, imaginea obfinuti cu acest tip de microscop este proiectatd pe o plac’ fotograficd sau pe un ecran. Acest tip de microscop se foloseste la studiul acizilor nucleilor datorit& proprietAfii acestora de a absorbi radiatiile ultraviolete. S-au construit astAzi $i microscoape cu lumina ultravioleta pentru citospectrofotometrie care permit detectarea absorbtiei_razelor ultraviolete printr-o tehnic& fotometrica. Microscoapele cu lumina ultraviolet se folosesc in biologie si histologic. a7 Scanné avec CamScannerMicroscopul cu fluorescent Microscopul cu fluorescent poate fi utilizat pentru a detecta gi localiza unele proteine intracelulare sau extracelulare marcate cu anticorpi fluorescenti, specifici. Acest tip de microscop foloseste tot radiafiile ultraviolete. Substanfele fluorescente absorb din spectrul ultraviolet anumite radiatii cu lungimi de unda specifice fiecdrui flourocrom si emit radiafii luminoase specifice. : Aceast& proprietate, numiti fluorescent’, permite clasificarea substantelor care o poseda in: Mi substante cu fluorescent natural’, M substante cu fluorescent dobandit’ (secundara), ce devin fluorescente numai dupa tratarea lor cu fluorocromi. Se cunoaste un numar mare de substante fluorescente. Dintre acestea cele mai utilizate sunt fluoresceina care emite o lumina verde si rodamina care emite o lumina de culoare rosie. Aceste substante se cupleazi chimic cu anticorpi specifici unor proteine, purificati, realizAnd complexe anticorp-colorant care se aplica pe sectiuni tisulare sau pe celule in culturi. Se poate astfel evidentia localizarea specifica a anumitor proteine. Microscopul cu fluorescent4 a inlesnit studiul componentilor chimici ai celulei si este utilizat atat in histologie cat si in imunologie si in studiul tumorilor maligne. Microscopul confocal Microscopia confocalé este o noua varianta a microscopiei optice care permite o vizualizare si o cuantificare tridimensionala a celulelor si fesuturilor. Ea are aplicabilitate in studii de biologie celulara, neurobiologie, anatomie patologica, histologie, imunohistochimie etc. Este o tehnicd aparuté si perfectionata recent in biologie (dupa 1990) care elimina sau limiteazd foarte mult lumina paraziti provenita de la structuri situate in afara punctului ales pentru studiu. Dacd in microscopia opticd clasicA cémpul microscopic in totalitatea lui este iluminat de aceeasi sursa de lumina, in microscopia confocala structura histologica este iluminata punct cu punct, iar imaginea se formeazi tot Ppunct cu punct. 48 Scanné avec CamScannerImaginea de microscopie confocal& a fost obtinut prin punerea in planul imaginii date de obiectiv a unui disc care se roteste, constituit dintr-o multitudine de orificii dispuse intr-un aranjament caracteristic, bine precizat (discul Nirkow), . . Solutia optim’ la care s-a ajuns la ora actuala consté in baleierea imaginii histologic intr-un laser si analiza punct cu punct cu ajutorul ‘unui fotomultiplicator a semnalului reflectat sau emis. . Fotomultiplicatorul este plasat in spatele unui diafragm ("pinhole") ce realizeazi deschideri de mici dimensiuni gi care permite eliminarea semnalelor Provenite din afara planului de focalizare. Imaginea cAmpului microscopic este observatA pe un ecran si poate fi fotografiata sau arhivati pe un suport informatic (disc, disc optic numeric). Aceast’ metoda este denumiti microscopie confocala cu baleiaj laser si este bine adaptata in special pentru analiza semnalelor fluorescente. Microscopia cu baleiaj laser, domeniul major de aplicare al microscopiei confocale, utilizeazi o gama largé de lasere (cu argon, heliu-neon, argon-cripton) in functie de lungimea de undid a florocromului folosit ca marker al structurilor biologice. Spre deosebire de microscopia fotonic& clasict, microscopia confocalé amelioreaz4 rezolutia optic prin reducerea interferentei planurilor situate in afara focarului de focalizare si eliminarea haloului care diminua lizibilitatea marcajului fluorescent. Alte avantaje oferite de microscopia confocala cu baleiaj laser sunt: obfinerea de cupe seriate optice, vizualizarea tridimensional’ a unor structuri biologice, posibilitatea de analizi a suprafetelor celulare, observarea unor elemente ultrastucturale celulare, posibilitatea efectuarii unor studii morfometrice, determinarea concentratiei unor ioni intracelular etc. B. Microscoape electronice. Microscopul electronic de transmisie (TEM) Primul microscop electronic de transmisie a fost construit in 1931. El a inceput s& fie utilizat in studiul biologic dup& 1945. Principiului de funcfionare al microscopului electronic se aseamana cu cel al microscopul optic. Microscopul electronic foloseste in locul fascicolului luminos, un fascicol de electroni a cdror lungime de und& variaz4 in functie de voltaj. Acest fascicul este emis de un 49 Scanné avec CamScannerfilament de tungsten care joacd rolul de catod. Catodul sau generato® electronic (denumit si “tun electronic”) este montat in partea superioaré a coloanei microscopului. Fasciculul de electroni este accelerat SPI anod de o diferent de potential variabil de 50 000 — 100 000 volti. Pentru ca fascicolul de clectroni si se propage direct, coloana microscopului este vidata. Fascicolul de electroni este dirijat de o “lentila” elec cu rol de condensator asupra obiectului de examinat, dup dirijati de lentile elecromagnetice “obiective” spre un ecran sau o camera fotografica. Din cauza energiei mici a electronilor incidenti, pentru a putea vizualiza structurile biologice cu microscopul electronic de transmisie este necasar ca sectiunile prin materialul biologic s& fie foarte subfiri (de circa 50-100 nm). Acest lucru este posibil prin includerea materialului biologic in rasini sintetice (Epon) si secfionarea acestora la ultratom. Rezolutia microscopului electronic este de aproximativ 0,10 nm. tromagnetica 4 care sunt fluorescent Microscopul electronic cu voltaj inalt (HVEM) Pentru a vizualiza in totalitate o celula cu diametrul de 15 microni la microscopul electronic de transmisie trebuie efectuate si examinate cel putin 200 de secfiuni, urmata de compunerea lor tridimensionala. Acest inconvenient a fost inldturat de aparitia microscopului electronic de mare voltaj care permite vizualizarea unor structuri histologice mai mari sau in ansamblul lor. Microscopul electronic de inalt voltaj utilizeaz& un fascicul de electroni accelarati la © diferent de potential de pana la 1 milion de volfi. El are o rezolutie de 0,2 nm si penetreaz sectiuni histologice cu o grosime de pani la 3 microni. De asemenea permite examinarea tridimensionala a structurilor biologice. Dezavantajul major al microscopului de voltaj inalt sunt costurile foarte mari, ceea face ca numai unele centre de cercetare medicala din lume sa-| aiba in dotare. Microscopul electronic scanning (SEM) Acest microscop a inceput sa fie utilizat in cercetarile biologice din 1965. in microscopia electronicd scanning fasciculul de electroni emisi de catod nu strabat preparatul histologic cum se intampla in 50 Scanné avec CamScannermicroscopia electronica de transmisie, dar electronii emisi sunt baleiafi jnainte si inapoi pe suprafata preparatului histologic care este localizat ato camera mare in partea de jos a coloanei microscopului. asciculul de electroni este produs de un “tun electronic” similar cu cel de la microscopul electronic de transmisie. Céteva lentile clectromagnetice cu rol de condensatori focalizeaza fasciculul de electroni ‘in puncte fine de pe suprafata obiectului de examinat. Fasciculul de electroni este scanat pe suprafata preparatului histologic Printr-un sistem de baleiaj. Suprafata preparatului histologic, in urma Impactului cu fasciculul de electroni incidenti, emite electroni Secundari de energie joasi. Preparatul histologic este acoperit cu sdruri de aur-paladiu pentru a creste emisia de electroni secundari. Electronii secundari sunt atrasi spre un colector unde actioneaz4 pe un scintilator, fiecare electron secundar producind mai multi fotoni. Fotonii rezultati Sunt trimisi spre o camera fotomultiplicatoare unde rezult’ mai multi fotoelectroni. Acesti fotoelectroni reprezinté semnalul ce se indreapta spre doua tuburi catodice. Un tub va permite vizualizarea imaginii, iar cel de-al doilea tub permite inregistrarea fotografica a imaginii. Microscopul electronic scanning ofer’ o imagine tridimensionala a suprafatei obiectului de examinat. Puterea de marire a SEM este de la 10 la 100 000 de ori, iar rezolutia este de 0,10-0,20 nm. Preparatele studiate la microscopul electronic sunt foarte subtiri (200A), sectionate la ultramicrotoame, dupa ce au fost in prealabil incluse in medii sintetice speciale. Imaginea obfinuta este vizibila direct pe un ecran fluorescent sau se proiecteaz4 pe o placa acoperita cu un strat foto sensibil, folosita ca un negativ fotografic. Folosirea microscopului electronic in citologie a permis descoperirea organizarii ultrastructurale a celulelor, fapt ce inlesneste 0 mai buna intelegere a functiei diferitelor componente celulare. Aprecierea utilitatii unui microscop Orice microscop, oricare ar fi tipul lui, se apreciazd dupa doua criterii . @ puterea de marire @ puterea de rezolutie 51 Scanné avec CamScannerPuterea de mirire, grosismentul, indic& de cAte ori a fost marit obiectul examinat. La microscoapele fotonice, grosismentul este de aproximativ 1500 ori iar la microscoapele electronice ajunge, in prezent, la sute de mii si chiar un milion de ori. Puterea de rezolufie reprezinta capacitatea unui microscop de a distinge clar dou’ puncte cat mai apropiate posibil. Puterea de rezolutie la microscoapele fotonice este de pani la 0,2 microni iar la microscoapele electronice de aproximativ 2A. Scanné avec CamScanner aooeddd dade dda deia