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Evaluación de los sistemas de

aguas farmacéuticas 10
10.1 Introducción
El agua y los sistemas de distribución asociados pueden tener implicaciones
microbiológicas tanto para los productos farmacéuticos como para la atención
sanitaria [1]; esto es especialmente cierto cuando los sistemas de agua están mal
especificados, mal instalados o no se mantienen según las normas adecuadas. Los
riesgos microbiológicos son importantes porque el agua actúa como vector de
microorganismos y, con la adición de nutrientes, proporciona la base para la
replicación microbiana. En la mayoría de los casos, los riesgos que presentan los
sistemas de agua pueden controlarse en gran medida mediante la depuración. Este
control es importante porque el uso del agua es, en la fabricación farmacéutica,
inevitable.
El agua es uno de los materiales más importantes del sector farmacéutico. El agua
es el ingrediente básico de los medios de fermentación, la fabricación de tampones,
la extracción de productos, la purificación y como disolvente para disolver
productos; además, s e utiliza para limpiar equipos, enjuagar viales, diluir
detergentes, etc. [2]. Aunque las cantidades de agua requeridas varían de unas
instalaciones a otras, un estudio estima que se necesitan 30.000 litros de agua para
fabricar 1 kg de un producto farmacéutico estándar [3]. De hecho, el uso intensivo de
agua es uno de los factores ecológicos que impulsan la adopción de tecnologías
desechables estériles de un solo uso. Aunque las tecnologías desechables pueden
suponer un ahorro económico al reducir el nivel de lavado y esterilización de los
equipos, el uso de agua como ingrediente farmacéutico es ineludible.
Las instalaciones farmacéuticas purifican el agua mediante diversos tratamientos,
que c u l m i n a n en la ósmosis inversa o la destilación. Los objetivos de la
purificación del agua son tres:
1. reducir los niveles de los componentes químicos en el agua para evitar interacciones con la
sustancia farmacológica y prevenir la toxicidad;
2. reducir la carga biológica microbiana a niveles especificados y evitar una mayor
proliferación microbiana;
3. para eliminar las endotoxinas y evitar su futura acumulación (esto depende del grado del
agua; no todos los grados de agua están destinados a la "libre de endotoxinas").
El éxito de la purificación depende del diseño y el funcionamiento del sistema.
Debido a los caprichos de estos aspectos, y basándose en la criticidad del agua en la
producción farmacéutica, el muestreo y las pruebas del agua están sujetos a una alta
frecuencia de pruebas microbiológicas. En este capítulo se examinan los diferentes
tipos de agua utilizados en las instalaciones farmacéuticas junto con los métodos de
producción. A continuación, se examinan los riesgos microbiológicos y se concluye
con los principales métodos de control microbiológico.

Pharmaceutical Microbiology. http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-08-100022-9.00010-4

2016 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.
116 Microbiología farmacéutica

10.2 Agua de instalaciones farmacéuticas

Los diferentes tipos de agua que se encuentran en las plantas de producción
farmacéutica son el agua potable, el agua purificada, el agua altamente purificada y el
agua para inyección (WFI).
1. Agua potable (a veces llamada agua de ciudad o agua de red).
Se trata de agua potable, suministrada a la empresa farmacéutica a través del
suministro municipal de agua. El agua potable se utiliza para la limpieza rutinaria de
zonas menos críticas, como la preparación de detergentes y desinfectantes. También
es el agua de origen para la etapa de purificación necesaria para fabricar agua de
calidad farmacéutica (agua purificada y agua para inyecciones) [4].
Las compañías privadas de agua o los municipios suministrarán agua potable de
acuerdo con los requisitos locales de calidad. Estos requisitos tienen por objeto
proteger la salud humana. La protección de la salud consiste en garantizar que los
niveles de contaminantes químicos se mantengan dentro de los criterios de seguridad
establecidos y que no s e transmitan enfermedades transmitidas por el agua (como
el parásito Cryptosporidium y patógenos bacterianos). Los tipos de microorganismos
analizados incluyen los organismos indicadores: Escherichia coli, enterococos y
Pseudomonas aeruginosa.
La norma de control aplicada casi universalmente es el recuento de placas
heterótrofas, con un límite de 500 unidades formadoras de colonias (UFC) por
mililitro o menos, y la ausencia de microorganismos indicadores de origen fecal en
muestras de 100 mL. Aunque las pruebas las realizan obligatoriamente los
proveedores de agua, algunas instalaciones farmacéuticas optan por realizar pruebas
paralelas del agua suministrada al centro. Muchas empresas farmacéuticas conservan
el agua de red en tanques de almacenamiento, y es prudente tomar muestras de esta
agua para asegurarse de que no se produce un aumento de los niveles microbianos.
2. Agua purificada
El agua purificada se utiliza como disolvente en la fabricación de productos
acuosos y orales, como la mezcla para la tos, y para la generación de productos de
fermentación. También se utiliza en la preparación de detergentes y desinfectantes
para la limpieza de salas blancas certificadas de la UE de Buenas Prácticas de
Fabricación (BPF) Grado C/ISO 14644 clase 8 (en funcionamiento) y aquellas áreas
de una clasificación inferior. El agua purificada también actúa como fuente de
suministro de vapor a los autoclaves. Este grado de agua se utiliza ad- dicionalmente
para el enjuague final de los equipos y como agua ingrediente para productos no
estériles.
El agua purificada suele producirse por ósmosis inversa. Las unidades de ósmosis
inversa utilizan una membrana semipermeable y un diferencial de presión sustancial
para conducir el agua a través de la membrana con el fin de lograr mejoras químicas
y reducciones microbianas y de endotoxinas.
Los sistemas de ósmosis inversa existen en múltiples formatos de diseño. En
términos generales, la ósmosis inversa funciona como un filtro de tamaño excluyente
que opera en condiciones de alta presión. Un sistema eficaz bloquea el 99,5% de las
endotoxinas, así como los iones y las sales, al tiempo que permite el paso de las
moléculas de agua. Al eliminar la endotoxina, el sistema actúa como un tamiz
 Evaluación de los sistemas de aguas 117
farmacéuticas
molecular a través del cual no puede pasar el lipopolisacárido. El lector debe saber
que existe cierto debate sobre la eficacia relativa de la ósmosis inversa en
comparación con la destilación.
118 Microbiología farmacéutica

El límite de acción microbiana es de 100 UFC/mL (equivalente a 10.000

UFC/100 mL, dado que el método de prueba recomendado es por filtración de
membrana).
3. Agua altamente purificada
Se trata de un tipo de agua descrito en la Farmacopea Europea (Ph. Eur.). La
especificación es muy similar a las especificaciones para el agua purificada, con la
principal diferencia de una especificación para la endotoxina. Este grado de agua
está destinado a la preparación de medicamentos para los que se necesita agua de alta
calidad biológica. Se utiliza para medicamentos estériles que no necesitan ser
apirógenos, como los preparados oftálmicos, nasales/oídos y cutáneos. El agua se
prepara por ósmosis inversa, y el límite de acción microbiana es de 10 UFC/100 mL.
La especifica- ción de endotoxinas está fijada al mismo nivel que por WFI (0,25
EU/mL).
4. Agua para inyección (WFI).
WFI es la forma más "pura" de agua de calidad farmacéutica. Se utiliza para la
generación de medios de fermentación microbiana y la preparación de medios de
cultivo para líneas celulares. El agua también se utiliza como materia prima en la
fabricación de productos farmacéuticos destinados a ser estériles, y para la
preparación de detergentes y desinfectantes utilizados en salas limpias de grado
superior, como las áreas de clase 7 (en funcionamiento) de la UE GMP Grado B/ISO
14644. Cuando se requiere agua para reconstituir viales de producto liofilizado, se
suministra WFI estéril (es decir, WFI que ha sido sometida a un proceso de
esterilización terminal).
En el caso del WFI, las especificaciones de la Ph. Eur. y de la United States
Pharmacopeia (USP) son muy similares. Sin embargo, existe una diferencia de
opinión fundamental en cuanto a su preparación. En Estados Unidos, el WFI puede
prepararse por ósmosis inversa o por destilación, mientras que las autoridades
europeas insisten en que sólo se utilice la destilación para su producción (en el
momento de escribir estas líneas, existe cierto debate sobre si habrá armonización
con el enfoque estadounidense, permitiendo así el uso de la ósmosis inversa. Esto no
cuenta con consenso científico, y la principal preocupación con respecto a la ósmosis
inversa se centra en el riesgo de acumulación de endotoxinas).
La destilación funciona convirtiendo el agua de líquido a vapor y luego de vapor a
líquido. A través de este proceso, la endotoxina es eliminada por la rápida actividad de
ebullición. Esto hace que las moléculas de agua se evaporen y que las moléculas de
lipopolisacáridos, relativamente más grandes, se queden atrás. La mayoría de los
modelos de equipos de destilación están validados para alcanzar reducciones de 2,5-
3 log en la concentración de endotoxinas durante la destilación. Esto se basa en que
el lipopolisacárido tiene un peso molecular de alrededor de 106 Da. Por lo tanto, la en-
dotoxina es lo suficientemente pesada como para quedar rezagada cuando el agua
hierve rápidamente, como ocurre en un alambique. En el funcionamiento de las
unidades de destilación, la principal preocupación es el a r r a s t r e de
contaminación, especialmente de endotoxinas. Niveles bajos de microorganismos
Gram-negativos en el agua de alimentación contribuirán con endotoxinas, que son
concentradas por la evaporación. En sistemas mal diseñados o mal mantenidos, los
niveles de endotoxina se acumulan en el agua de alimentación.
Evaluación de los sistemas de aguas 119
farmacéuticas
puede producirse en el depósito del alambique.
Para cumplir los requisitos de la Ph. Eur., el límite de acción microbiana es de 10
UFC/100 mL, y el nivel de endotoxina bacteriana debe ser <0,25 EU/mL. Con el fin
de demostrar que la unidad de destilación funciona según lo previsto, es una buena
práctica controlar los niveles de endotoxinas del agua de alimentación para
garantizar que no se superen los siguientes valores
120 Microbiología farmacéutica

Agua bombeada a través del filtro de

Recogida en el
Entrada de agua profundidad [1] Luego bombeada a
depósito de
potable
almacenamient través de la trampa orgánica [2]
o (y en el
depósito de A continuación, se bombea a
ruptura) través de un filtro de carbón
(carbón activado) [3].

Intercambiador
Filtración o uso de Intercambiador
de cationes
luz ultravioleta [5] de aniones (para
(también para
desionización)
desionización) [4]

Ósmosis inversa (para

fabricar agua purificada
(Europa) o agua purificada/
WFI (EE.UU.) [6].
Grado Almacenamiento y
de agua distribución de
seleccio agua [8]
nado Destilación: para la fabricación
de WFI [7]

Figura 10.1 Representación esquemática de un sistema de aguas farmacéuticas.

250 EU/mL (para generar WFI con un nivel de endotoxinas inferior a 0,25 EU/ mL,
es decir, se ha logrado una reducción de tres logaritmos).
La figura 10.1 muestra un esquema típico para la generación de agua de calidad
farmacéutica.
En relación con la figura 10.1:
1. El filtro de profundidad está hecho de antracita granulada, arena lavada y grava. El filtro
requiere una regeneración periódica mediante lavado a contracorriente;
2. La trampa orgánica es una resina a la que se adhiere la materia orgánica del agua;
3. El filtro de carbón absorbe las materias orgánicas residuales, como el cloro;
4. Los aniones, por ejemplo, Cl- y SO2−3 , se intercambian con contraiones hidroxilo (OH-).
del intercambiador de aniones;
5. Los cationes del agua, como Na+, Mg2+ y Ca2+, se retienen desplazando l o s i o n e s H+ del intercambiador.
Tanto el intercambiador de cationes como el de aniones se controlan midiendo la
restividad. A medida que los iones se intercambian y el proceso progresa, la restividad
debería aumentar;
6. La filtración se realiza con un filtro de 0,22 μm; la luz ultravioleta suele tener una longitud
de onda de 254 nm;
7. La ósmosis inversa utiliza una membrana semipermeable (hecha de polímeros como el
acetato de celulosa o las poliamidas), que es permeable al agua pero no a los contaminantes
microbianos. La ósmosis permite el movimiento del agua a través de la membrana,
pasando de una solución de menor concentración de soluto a otra de mayor concentración
de soluto, mediante la fuerza de la presión osmótica. En algunos procesos, se realiza una
doble ósmosis inversa para garantizar que se han eliminado los contaminantes
microbianos.
8. Con la destilación se calienta el agua para que se condense y se convierta de nuevo en
agua; este proceso elimina la mayoría de las impurezas junto con la endotoxina bacteriana.
Evaluación de los sistemas de aguas 121
farmacéuticas

9. El agua de calidad farmacéutica se almacena en un recipiente hermético y se conduce a

través de una red de tuberías (circuito de distribución) hasta la zona de fabricación. El agua
no utilizada se devuelve al recipiente de almacenamiento. La calidad del agua está
protegida por un caudal rápido (normalmente superior a 9 pies/s; 2,7 m/s), que crea un flujo
constante y turbulento para minimizar la adhesión microbiana y la formación de
biopelículas. Las tuberías también están diseñadas para evitar los puntos muertos (para
evitar el estancamiento del agua, como se explica más adelante). Para mantener la calidad
de las tuberías, es necesario realizar una pasivación y desobstrucción periódicas. Además,
las válvulas, especialmente las asociadas a los puntos de usuario, deben poder limpiarse,
drenar libremente y no ser propensas a fugas [5].

10.3 Ecología microbiana del agua

Toda el agua presenta algún tipo de riesgo microbiano, ya que proporciona un medio
para que los microorganismos se reproduzcan y también es una forma eficaz de
transferir microorganismos a través de las distancias. Con los tipos de agua que se
encuentran en las instalaciones farmacéuticas, hay variaciones en la ecología
microbiana. Con el agua potable entrante, la composición microbiana variará en
función de dos factores. El primer factor es la zona de captación. El agua utilizada
para la producción de agua potable se recoge en entornos muy diferentes. Estos van
desde los ríos de montaña pobres en nutrientes (oligotróficos), donde el recuento
microbiano, incluso utilizando métodos de recuento directo, rara vez superará unos
pocos miles de UFC por mililitro, hasta las regiones ricas en nutrientes (eutróficas)
de los ríos de tierras bajas, donde los recuentos pueden superar 1 millón por mililitro.
El segundo factor es la estación; los niveles de microorganismos en aguas naturales
siguen una curva de distribución estacional controlada por la cantidad de nutrientes
disponibles y la temperatura [6].
La composición de la flora microbiana del agua de origen será
predominantemente Gram negativa y contendrá bacterias prostéticas (bacterias que
poseen apéndices), como las especies Hyphomicrobium, Caulobacter, Gallionella y
Pseudomonas [7]. Las bacterias no son los únicos microorganismos que habitan en
las aguas de origen; el ecosistema incluirá hongos, protozoos y algas. La
contaminación procedente de la escorrentía y del alcantarillado puede añadir un gran
número de patógenos potenciales [8].
Con el agua farmacéutica, a través de un proceso de mayor purificación, la
complejidad del ecosistema microbiano disminuye, al igual que la diversidad de los
microorganismos que prevalecen en el sistema hídrico. Esto se debe a una reducción
de los nichos dentro del ecosistema [9]. Con agua purificada y WFI, el número de
microorganismos debería ser muy bajo. En general, es poco probable que la
generación de agua dé lugar a altos niveles de microorganismos, si el sistema
funciona bien. La contaminación tiende a introducirse a través de tuberías mal
diseñadas o en los puntos de los usuarios.

10.4 Diseño y control de sistemas de agua

122 Microbiología farmacéutica

Como ya se ha indicado, la mayoría de los problemas microbianos surgen del

almacenamiento y la distribución del agua más que de su generación. Esto se debe
principalmente al desarrollo de biopelículas que, una vez establecidas, pueden ser
muy difíciles de eliminar. Además de la distribución, el mantenimiento inadecuado
de los componentes de generación, como el carbón
 Evaluación de los sistemas de aguas 123
farmacéuticas

lechos, ablandadores, membranas de ósmosis inversa (componentes ilustrados en la

figura 10.1), también pueden contribuir a la contaminación posterior aguas abajo
dentro del sistema de distribución. Por lo tanto, el diseño de los sistemas de agua es
de gran importancia.
Un ejemplo de la importancia de las buenas prácticas de diseño puede ilustrarse
con los sistemas WFI. Los sistemas WFI a menudo se extienden a lo largo de cientos
de metros, a veces a lo largo de varias plantas, y requieren grandes caudales de agua
[10]. El diseño debe incluir una ubicación adecuada de las salidas para facilitar la
logística operativa, garantizar un muestreo representativo y minimizar los tramos
muertos. Como parte del control de la biopelícula (como se explica más adelante), se
utilizarán tuberías de acero inoxidable o de plástico de buena calidad (como el
fluoruro de polivinilideno). Además, es importante el diseño sanitario de las
válvulas. El diseño debe minimizar las oportunidades de estancamiento del flujo de
agua, por ejemplo, los tramos muertos o los lugares que permiten la acumulación de
residuos [11].
Entre los requisitos que deben cumplir unas tuberías de distribución de agua bien
diseñadas figuran los siguientes:
(a) Superficies internas lisas en tanques y tuberías. Los microorganismos se adhieren peor a
las superficies lisas que a las rugosas. Las juntas y soldaduras de las tuberías pueden
alterar la lisura;
(b) Movimiento continuo del agua en depósitos y flujo rápido en tuberías. Cuando hay fuerzas
de cizallamiento, los microorganismos se adhieren mal a las superficies. Cuando no hay
movimiento del agua, no hay cizallamiento, el cizallamiento aumenta con la velocidad del
flujo;
(c) Evitar las zonas donde el agua pueda permanecer estancada.
i. Entre ellos se incluyen los "tramos muertos": el agua puede estancarse en los ramales
de una tubería principal circulante si la longitud del ramal es demasiado larga para
permitir que la turbulencia de la tubería principal circulante altere el contenido del
ramal. En este caso, el principio es reducir siempre al mínimo la longitud de los
ramales;
ii. El agua también puede quedarse estancada en las válvulas, sobre todo en los puntos de
usuario y especialmente en los puntos de usuario que no se utilizan con frecuencia.
Este problema puede contrarrestarse con el uso de las llamadas válvulas higiénicas o de
"punto muerto cero". Aunque son mucho mejores que las alternativas (por ejemplo, las
válvulas de bola), no deben dar lugar a una falsa sensación de seguridad, ya que
pueden albergar biopelículas que liberan endotoxinas;
iii. Las tuberías principales deben tener pendiente (tener "caída") desde el punto de origen
hasta el punto de retorno para garantizar que los sistemas sean completamente
drenables;
(d) Evitar las fugas. Las fugas de agua pueden provocar un puente de agua con el entorno
exterior a través del cual pueden entrar bacterias en el sistema. Los tanques de
almacenamiento deben estar equipados con filtros en sus respiraderos para evitar la
entrada de microorganismos por el aire. Incluso pueden mantenerse bajo una "manta" de
un gas inerte como el nitrógeno;
(e) Los sistemas WFI requieren un almacenamiento y una distribución a temperatura
controlada. Se considera que los riesgos de biopelículas que desprenden endotoxinas, a
pesar de los mejores intentos de control mencionados anteriormente, son tan importantes
que los organismos reguladores exigen que la temperatura de almacenamiento y
distribución se mantenga por encima de 75 °C. Sin embargo, hay que tener en cuenta que
124 Microbiología farmacéutica

75 °C es una temperatura demasiado elevada para la mayoría de las formulaciones

farmacéuticas. Esto significa que los puntos de consumo suelen estar equipados con algún
tipo de mecanismo de refrigeración. Debe tenerse en cuenta que los intercambiadores de
calor utilizados para este fin pueden ser una fuente de endotoxinas y contaminación
bacteriana, por lo que pueden anular muchos de los beneficios de la circulación a alta
temperatura.

A diferencia de los sistemas WFI, los sistemas de agua purificada pueden

mantenerse como sistemas calientes o fríos. A diferencia de los sistemas WFI, los
sistemas de agua purificada suelen ser sistemas fríos y dependen de la luz
ultravioleta y de filtros en línea para mantener la calidad microbiana. La radiación
ultravioleta (254 nm) se utiliza para la desinfección de agua de buena claridad
óptica, y funciona especialmente bien en un sistema de recirculación donde el agua
fluye sobre
Evaluación de los sistemas de aguas 125
farmacéuticas

un sistema de lámparas múltiples. Si se produce contaminación, tanto los sistemas

WFI como los de agua purificada deben poder desinfectarse mediante vapor o
productos químicos como el dióxido de cloro [12].
Incluso un buen diseño puede salir mal; por lo tanto, el control operativo también
es importante. Los procedimientos operativos deben exigir que las salidas se laven
antes de su uso para garantizar la utilización del agua circulante y eliminar el agua
estancada o la contaminación de la superficie de la salida. Es importante destacar
que, en el contexto del muestreo microbiológico, el lavado de las salidas antes del
muestreo con fines de control debe ser equivalente al que se aplica en el uso
operativo.
El uso de mangueras y tuberías temporales es una fuente importante de
contaminación del producto durante la fabricación y, por lo tanto, su uso debe
reducirse al mínimo. Cuando se utilicen, deberán someterse a controles adecuados
para minimizar el riesgo de contaminación procedente de esta fuente. Por ejemplo,
no deben dejarse en las salidas; deben secarse después de su uso, colgarse
verticalmente en lugares adecuados para garantizar un drenaje libre, supervisarse y,
diariamente, limpiarse, desinfectarse y sustituirse.
Tanto en el diseño como en el funcionamiento, los componentes del sistema de
almacenamiento y distribución deben permitir llevar a cabo una limpieza e
higienización validadas.

10.5 Sistemas de abastecimiento de agua admisibles

Cuando se diseña un nuevo sistema de agua, debe someterse a una cualificación
formal. Los sistemas de agua requieren una cualificación basada en la carga
biológica, la endotoxina bacteriana y las impurezas orgánicas e inorgánicas [13]. Los
pasos de la cualificación incluyen una cualificación operativa, en la que cada salida
se monitoriza durante un mínimo de 2 semanas a lo largo de cada día laborable antes
de que el agua se libere para la producción; y una cualificación del rendimiento en
dos fases. La fase I de la cualificación consistirá en 4 semanas de muestreo a medida
que el agua es utilizada por la producción, en las que se tomarán muestras en
diferentes momentos de las operaciones de producción. La fase II es una evaluación
del agua a lo largo de 1 año. Durante la cualificación, deben investigarse todos los
resultados fuera de los límites y establecerse una causa raíz.

10.6 Contaminación microbiana

Los sistemas de agua de uso farmacéutico pueden contaminarse. La contaminación
puede deberse a causas especiales, como la contaminación en la salida de un usuario
(por ejemplo, una manguera que se deja en un fregadero), y a causas comunes, que
son problemas sistemáticos que afectan a todo el sistema de agua. Una causa común
típica puede ser la formación de una biopelícula.

10.6.1 Biopelículas
126 Microbiología farmacéutica

Las biopelículas están formadas por un complejo consorcio de microorganismos

organizados en extensas glicolices de exopolímeros. Una vez formadas, las
biopelículas pueden ser muy difíciles de reubicar, por lo que requieren una
combinación de tratamientos térmicos y químicos. Los problemas causados
 Evaluación de los sistemas de aguas 127
farmacéuticas

de las biopelículas son la bioincrustación, el biodeterioro y la obstrucción física de

tuberías industriales e intercambiadores de calor en sistemas de agua [14]. Las
biopelículas microbianas se desarrollan cuando los microorganismos se adhieren a
una superficie mediante la producción de polímeros extracelulares que facilitan la
adhesión y proporcionan una matriz estructural. Aunque la mayoría de las bacterias
quedan atrapadas en una biopelícula, ésta genera constantemente bacterias que se
liberan como células individuales que flotan libremente y partes de la biopelícula
pueden desprenderse en grupos. Cuando el agua se utiliza y fluye a través de la
tubería o el grifo que contiene la biopelícula, el riesgo de contaminación surge en el
punto en el que se utiliza el agua.
Los pasos que intervienen en la formación de la biopelícula son:
1. las células individuales pueblan la superficie (adhesión inicial);
2. se producen sustancias extrapoliméricas (EPS) y la adhesión se vuelve irreversible;
3. La arquitectura de la biopelícula se desarrolla y madura;
4. se liberan células individuales (o grupos de células) de la biopelícula.

La principal preocupación es que las biopelículas son muy recalcitrantes y

extremadamente difíciles de eliminar una vez establecidas.
Se pueden utilizar varias características de diseño para prevenir el desarrollo de
biopelículas y controlar la contaminación. El diseño del sistema debe incluir una
circulación continua con un caudal adecuado para ayudar a prevenir la formación de
biopelículas (normalmente 1-3 m/s). Otras características comunes del diseño son la
capacidad de calentar el agua a temperaturas elevadas (como se ha comentado
anteriormente, elevando el WFI a 75 °C o más) con fines de higienización y la
inclusión de lámparas de luz ultravioleta (UV) de alta intensidad. La inclusión de
lámparas UV aguas abajo de posibles depósitos microbianos, por ejemplo, lechos de
carbón y ablandadores, tiene la ventaja añadida de permitir el uso de ozono para
fines de higienización. Cuando se utilicen lámparas UV, deben revisarse y
mantenerse periódicamente para garantizar que estén limpias y proporcionen la
longitud de onda y la potencia energética correctas. La inclusión de filtros en el
circuito de distribución es difícil de justificar y no es aconsejable. Los sistemas más
antiguos, sin estas características de diseño, pueden requerir una desinfección
periódica con un agente oxidante para controlar la biopelícula (por ejemplo, ozono,
peróxido de hidrógeno o hipoclorito). Cada uno de estos métodos presenta
desventajas, como la necesidad de tener en cuenta consideraciones de diseño
adicionales (como la luz ultravioleta para destruir el ozono o la necesidad de un
lavado exhaustivo para eliminar los residuos químicos si se utiliza hipoclorito, lo
cual es caro y costoso).
perturbador [15]).

10.7 Muestreo y pruebas microbiológicas

Para evaluar la eficacia de un sistema de agua, es necesario realizar un muestreo
microbiológico. Esto incluye la toma de muestras del agua entrante en el punto de
entrada, el proceso de generación utilizado para producir agua, los tanques de
distribución y las salidas de los usuarios, tanto para el agua purificada como para la
128 Microbiología farmacéutica

WFI. La frecuencia de muestreo debe ser lo suficientemente alta como para permitir
l a realización de análisis de tendencias significativos. Para ello, se requiere al
menos un cierto nivel de muestreo diario (aunque no es necesario muestrear cada
punto de usuario todos los días). Es importante que las muestras para el análisis
microbiológico se tomen adecuadamente. Las buenas prácticas de muestreo incluyen
la toma de muestras a través de tubos recién esterilizados en autoclave, lo que
permite
Evaluación de los sistemas de aguas 129
farmacéuticas

La toma de muestras debe realizarse mediante una buena técnica aséptica. Otro
aspecto importante es analizar las muestras en las 2 horas siguientes a su toma, o
mantener las muestras a 2-8 °C antes de analizarlas. El periodo de retención, que
normalmente no superaría las 24 horas, debe validarse [16].
En cuanto a la metodología, la filtración por membrana es el método preferido, ya
que se evalúa un gran volumen de la muestra. Para el agua potable y el agua que se
procesa a través de la planta de generación (como el agua desionizada), algunos
usuarios optan por realizar recuentos en placa de 1 ml. Con agares microbiológicos,
se suele utilizar un agar estándar de recuento en placa (PCA) para evaluar el agua
potable [17]. Con agua purificada y WFI, la Farmacopea Europea recomienda el agar
Reasoner's 2A medium (R2A). Con la USP, no se recomienda ningún medio y la
selección del medio de cultivo más adecuado corresponde al microbiólogo del centro
(e idealmente a través de un estudio de validación). No obstante, el uso de R2A es
habitual.
El uso generalizado del R2A se debe a que desde hace tiempo se reconoce que los
recuentos aeróbicos totales realizados en muestras de agua utilizando medios con
bajo contenido en nutrientes (y preferiblemente temperaturas de incubación bajas de
20-25 °C) dan resultados mucho más altos en términos de recuentos microbianos
[18]. Cuando se compara el R2A con el agar nutritivo general, como el agar triptona
de soja, se suelen producir incrementos de entre 5 y 10 veces [19]. La razón de esta
diferencia de magnitud es que las bacterias sufren alteraciones físicas y una
reducción metabólica para sobrevivir en entornos oligotróficos. En este cambio
metabólico intervienen múltiples genes. Esto hace que las bacterias del agua se
encuentren en una de las dos condiciones fisiológicas, y estas condiciones afectan a
la capacidad de las bacterias para recuperarse en diferentes medios nutritivos.
Las bacterias que nadan libremente (fase planctónica) son comunes en los
sistemas acuáticos, y son estos microorganismos los que se recogen y cuentan en los
programas de control del agua. La fase planctónica es costosa energéticamente; es
una estrategia de distribución, pero no es una buena estrategia de supervivencia en
condiciones de inanición. El modo de supervivencia consiste en pasar de la fase
planctónica a la bentónica. Las bacterias de la fase bentónica pierden motilidad, se
adhieren firmemente a las superficies y empiezan a producir sustancias poliméricas
extracelulares (EPS), que son la base de una biopelícula (como ya se ha explicado).
Las EPS concentran factores de crecimiento traza y protegen de agentes antagonistas
como los biocidas y los tratamientos térmicos. Con frecuencia se producen
reducciones del tamaño celular. Los microorganismos de la fase bentónica suelen ser
muy difíciles de cultivar en medios complejos y ricos, y también se han descrito
como viables pero no cultivables. Sin embargo, estas bacterias pueden cultivarse en
medios con bajo contenido en nutrientes a temperaturas de incubación más bajas y
con tiempos de incubación más prolongados (10-14 días). No obstante, el valor de un
resultado de recuento aeróbico total obtenido 14 días después es ciertamente
cuestionable. Por lo tanto, la Ph. Eur. "transige" con el requisito de una temperatura
de incubación de 30-35 °C y un tiempo de incubación de 5 días [20].
Incluso a los 5 días, el valor de un resultado de enumeración es cuestionable, sobre
todo en el caso del agua, que proporciona un entorno dinámico. Si el recuento superó
un nivel de acción, lo hizo 5 días antes y posiblemente permaneció fuera de
especificación durante los 4 días siguientes. El resultado neto es una evaluación difícil
130 Microbiología farmacéutica

de la calidad microbiana de los productos fabricados durante ese periodo. Por este
motivo, debe hacerse hincapié en el análisis de tendencias más que en los resultados
individuales. También sobre esta base se ha invertido y desarrollado
considerablemente en métodos microbiológicos rápidos y alternativos (véase más
adelante).
 Evaluación de los sistemas de aguas 131
farmacéuticas

A partir de esta discusión sobre los agares, es importante tener en cuenta que
cualquiera que sea la técnica cul- tural utilizada, sólo mostrará una fracción de la
población microbiana de la muestra. Por esta razón, las especificaciones para el
recuento de agua se describen como límites de acción; no se consideran límites de
pasa/no pasa. Si se supera un límite de acción, debe evaluarse su impacto en el
producto, pero esto no suele provocar el rechazo del lote.
Para el WFI, los sistemas de agua deben ser evaluados en cuanto a endotoxinas
bacterianas. Esto se lleva a cabo mediante la metodología del lisado de amebocitos
de Limulus (LAL), aplicando un límite de 0,25 EU/mL. La LAL se trata por
separado en este libro. Aunque no está directamente relacionado con la
microbiología, también se examina la pureza q u í m i c a d e los sistemas de agua.
Podría decirse que el examen más importante es el del carbono orgánico total (COT)
[21]. El COT es la cantidad de carbono ligado a un compuesto orgánico y a menudo
se utiliza como indicador inespecífico de la calidad del agua o de la limpieza de los
equipos de fabricación farmacéutica. Aunque no existe una relación directa con los
microorganismos, los niveles elevados de COT pueden inferir un crecimiento
bacteriano dentro del sistema de agua.

10.8 Límites de acción y alerta

Para la vigilancia de los sistemas hídricos, deben establecerse niveles de alerta y
acción adecuados tanto para la evaluación de la carga biológica como para los
niveles de endotoxinas bacterianas. Los niveles de actuación, en su caso, suelen
extraerse de la farmacopea o de las normas nacionales sobre el agua, mientras que
los niveles de alerta son evaluados por las organizaciones farmacéuticas, basándose en
una revisión de los datos históricos. Las monografías farmacopeicas europeas y de la
Organización Mundial de la Salud para cada tipo de agua incluyen declaraciones
sobre los límites de acción, mientras que los capítulos equivalentes de la USP
recomiendan que se establezcan límites de control "apropiados". Para establecer
niveles a partir de datos históricos, lo ideal es analizar un año de datos (o más) para
tener en cuenta las variaciones estacionales. Existen diferentes formas de calcular los
niveles de alerta; un ejemplo es tomar el percentil 95.
Los niveles de alerta y acción pueden definirse del siguiente modo:
●
Los límites de alerta son niveles que, cuando se superan, indican que un proceso puede
haberse desviado de sus condiciones normales de funcionamiento. Los límites de alerta
constituyen una advertencia y no requieren necesariamente una acción correctiva.
●
Los límites de intervención son niveles que, cuando se superan, indican que un proceso se
ha desviado de su rango de funcionamiento normal. La superación de un límite de acción
indica que deben tomarse medidas correctoras para devolver el proceso a su rango de
funcionamiento normal. Los límites de alerta deben fijarse por debajo de los límites de
acción.

Si se ha superado un límite de actuación, es necesario investigar y evaluar

detenidamente el impacto sobre el producto o productos implicados. Además, los
niveles de acción y alerta son marcadores útiles para el análisis de tendencias. Para
evaluar la microbiología de los sistemas de agua d e forma significativa, los datos
132 Microbiología farmacéutica

recogidos deben examinarse en busca de tendencias; lo ideal es hacerlo mensual,

trimestral y anualmente (esto último permite evaluar la estacionalidad). Hay que
tener cuidado al evaluar los recuentos microbianos mediante gráficos tradicionales.
Evaluación de los sistemas de aguas 133
farmacéuticas

ya que dichos gráficos de control se establecen sobre la base de que los datos
trazados se distribuyen normalmente. Los microorganismos presentes en el agua
tienden a seguir una distribución de Poisson. Por lo tanto, los recuentos microbianos
deben transformarse antes de representar los resultados en gráficos de tendencias
(por ejemplo, sacando la raíz cuadrada o calculando el logaritmo en base 10) [22].
Cuando se registren tendencias al alza o desviaciones del nivel de actuación,
d e b e r á n realizarse investigaciones. La investigación debe determinar la causa de
la desviación y, si es posible, e l i m i n a r l a . La evaluación debe examinar el
impacto en el producto y su capacidad para resistir el desafío microbiano, así como
el grupo de pacientes y su susceptibilidad a la infección (esta evaluación requiere la
identificación del microorganismo contaminante). En caso de superación de los
límites de actuación, la investigación y la evaluación deben documentarse
cuidadosamente, y debe prepararse una justificación para la liberación o el rechazo
del producto. En el cuadro 10.1 se muestran algunas áreas de investigación.

Tabla 10.1 Tabla

que muestra las áreas potenciales para el examen
de los problemas del sistema de agua en caso de excursiones
microbianas
Zona principal Ámbitos de investigación
Muestreo Técnica aséptica
Contaminación adventicia (tipo de microorganismos)
Consumibles/reactivos/medios: ¿satisfactorios?
¿Había fugas en las tuberías/válvulas en el momento del
muestreo? Estado de la salida de muestreo
Rotura o fuga de tuberías
Pérdida de presión
Identificar quién tomó la muestra
Formación del personal
Integridad del
contenedor
Intervenciones
Transporte
Almacenamiento
Diseño de la válvula
de muestreo Check
Método de ensayo flushing
Almacenamiento
Consumibles-integridad/fecha de
caducidad ¿Reactivos/medios-
almacenamiento/fecha de caducidad?
Equipo-servicio/calibración Técnica
aséptica
¿Método de ensayo seguido?
Condiciones de incubación
Controles de prueba
Interpretación de los
resultados/cálculos ¿Calibración
134 Microbiología farmacéutica

UDAF/placas de sedimentación/flujo
de aire?
Tubo presente/ausente, ¿parece desgastado el tubo?

Continúa en
 Evaluación de los sistemas de aguas 135
farmacéuticas

Tabla 10.1 Continuación

Zona principal Ámbitos de investigación

Mantenimiento/ Integridad del punto: por ejemplo, fugas, estado de los valores,
problemas juntas en las conexiones tubo-salida
específicos de la Historial del punto revisado Uso
toma de corriente del punto
Temperatura de la salida y/o de la
muestra Tubo-almacenamiento
¿Cocción al vapor/desinfección
satisfactoria? ¿Problemas con el
suministro de agua?
Establecer para qué se ha utilizado el agua (por ejemplo, contacto
Utilice directo con el producto, como dilución del producto o preparación
de tampones)/revisar el uso del punto
¿Algún problema con las muestras vegetales? ¿Se ha
realizado la vaporización/sanitización con la frecuencia
Mantenimiento establecida? Revisión del registro histórico de la planta
Comprobar caudales
Comprobar la temperatura
Diseño del bucle Comprobar si hay
patas muertas
Diseño y mantenimiento de válvulas
de retención Tasa de rotación de
tareas de retención
Comprobar los niveles de tareas
Comprobar filtros y cambiar fechas

10.9 Microorganismos indeseables (objetables)

Además del examen de los recuentos microbianos, algunas instalaciones examinan
los sistemas de agua de la presencia de los llamados "microorganismos objetables".
Un microorganismo "objetable" es cualquier microorganismo que pueda causar
infecciones cuando el medicamento se utiliza según las instrucciones o cualquier
microorganismo capaz de crecer en el medicamento. En la mayoría de las
situaciones, esto puede traducirse en la ausencia de P. aeruginosa y Burkholderia
cepacia, y la ausencia de cualquier Pseudomonas spp. en preparados oftálmicos no
estériles. Ocasionalmente, se añade el cribado de E. coli como indicador de
contaminación fecal (aunque es poco probable que el agua entrante esté contaminada
con dichos organismos). Sin embargo, cada fabricante farmacéutico debe determinar
qué microorganismos se consideran "objetables" en relación con un proceso
específico. El fundamento del juicio tendrá que basarse en la aplicación del producto
y la vulnerabilidad del grupo de pacientes.
El examen de microorganismos específicos requiere el uso de medios selectivos
y/o pasos de enriquecimiento; o, alternativamente, kits de pruebas especializados. La
recuperación de microorganismos sospechosos a partir de agar de ensayo general y
su identificación no es aceptable. Esto se debe a que la sensibilidad de detección será
136 Microbiología farmacéutica

demasiado baja.
Evaluación de los sistemas de aguas 137
farmacéuticas

10.10 Métodos microbiológicos rápidos

Los métodos microbiológicos rápidos (o alternativos) han logrado algunos avances
en el análisis del agua. La razón por la que tales métodos atraen la atención no es
sólo un menor tiempo de obtención de resultados, sino también porque detectan una
mayor proporción de los microorganismos potencialmente presentes. Si se analizaran
muestras de agua mediante recuento heterótrofo en placa y mediante métodos de
recuento directo (como la citometría de flujo), los resultados en UFC/mililitro del
recuento en placa se situarían, con toda probabilidad, entre el 0,1 y el 10% de los
recuentos directos. Esto se debe a que muchos de los microorganismos de los
sistemas acuáticos son incapaces de crecer en los medios de recuento en placa; para
algunos microorganismos, los medios son demasiado ricos, y para otros
microorganismos, las condiciones de cultivo son insatisfactorias. Sin embargo, el
fenómeno de los "microorganismos viables pero no cultivables" significa que
muchos microorganismos presentes en el agua no crecen con los métodos de cultivo.
Existe una serie de métodos rápidos para el cribado de muestras de agua en busca
de indicadores de contaminación basados en subestratos cromogénicos,
fluorogénicos o quimioluminogénicos. Por ejemplo, en el examen de coliformes, los
ensayos se basan en el supuesto de que la β-d-galactosidasa y la β-d-gluconidasa son
marcadores de coliformes y
E. coli, respectivamente [23]. Un enfoque alternativo es el de los métodos de
dispersión de luz que pueden utilizarse para la detección de patógenos acuáticos.
Con este método, a medida que el flujo pasa a través de la celda de flujo, también
pasa a través de un rayo láser.

10.11 Evaluación microbiológica

Los resultados del control microbiológico suelen ser satisfactorios a lo largo de 1 año. A
veces se registran resultados excesivos en los puntos de consumo de los usuarios; lo
más frecuente es que estos incidentes se deban a un mantenimiento deficiente de los
fregaderos (donde existe riesgo de salpicaduras) o a la gestión local de las mangueras.
Estos casos de "causas especiales" no suelen ser preocupantes a menos que se produzcan
de forma sucesiva, como demuestra la repetición del muestreo. Cuando se producen
problemas sistemáticos (incluidas causas comunes como la formación de
biopelículas), es muy importante que los microbiólogos comprendan la base del
diseño del sistema de agua. Esta es una clave para la investigación de la causa raíz.
También pueden surgir problemas con la planta de generación. En la producción de
agua de calidad farmacéutica, uno de los puntos débiles es que los lechos de resina
pueden añadir microorganismos al agua si no se mantienen adecuadamente. Otro
problema es el proceso de intercambio iónico.
existe un riesgo si el proceso de intercambio iónico no elimina los microorganismos.
Para obtener una supervisión suficiente, los microbiólogos deben revisar
periódicamente los datos del sistema de agua y examinarlos en busca de tendencias.
En la figura 10.2 se muestra un ejemplo de gráfico de tendencias que muestra una
deriva adversa.
En la figura 10.2, el gráfico indica el inicio de una tendencia adversa (enfatizada
138 Microbiología farmacéutica

por la adición de una línea de tendencia de trazado lineal), es decir, una situación
fuera de control, con una serie de puntos que se elevan por encima del nivel de
control superior. En el gráfico, el recuento medio se ha
 Evaluación de los sistemas de aguas 139
farmacéuticas

Tendencia del sistema WFI durante 62 semanas

3.5 con línea de tendencia

medio/semana
3
2.5
Raíz cuadrada del
recuento
2
1.5
1
0.5
0
-0.5
1
5
9
13
17
21
25
29
33
37
41
45
49
53
57
61
-1

Número de semanas
Figura 10.2 Trazado de un sistema microbiano del agua.

transformado mediante la raíz cuadrada del recuento medio de cada semana. Esto se
hace para aproximarse a la distribución normal.
En el gráfico del ejemplo, la organización debería haber tomado medidas en
relación con el sistema de agua y haber cerrado el sistema para investigarlo y
formular las medidas preventivas adecuadas. Por este motivo, siempre deben
investigarse las derivas adversas.

10.12 Resumen
En este capítulo se han examinado los sistemas de aguas farmacéuticas. En
consonancia con el tema del libro, el capítulo se ha centrado en los aspectos
microbiológicos de los sistemas de agua. Esta preocupación por la contaminación
microbiológica ha prevalecido a través de consideraciones sobre el diseño del
sistema, los riesgos que presentan las biopelículas y con el muestreo microbiológico.
Al examinar estas áreas, queda claro que el microbiólogo de obra debe desempeñar
un papel activo en el control y la gestión del sistema de agua. Gran parte de ello se
basa en un examen minucioso de los datos y en la comprensión de cómo influye el
ciclo de producción, incluidos los usos altos y bajos y las variaciones mar- sonales.
El agua es un problema microbiológico crítico y es importante estar alerta.

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