Perhitungan Kadarluarsa Reagent

BIOLYSIS Cholesterol MR secara Real-

Time
1. Pendahuluan

1.1. Latar Belakang

Reagen Chollesterol MR. adalah jenis reagent yang dipergunakan dalam mendeteksi
kandungan kolesterol pada sampel. Dalam kondisi yang ideal, reagen bersifat stabil dan
tidak beraksi dengan zat apapun. Namun demikian, di dalam pengemasannya, terdapat
udara yang memungkinkan reagent bereaksi dengan zat yang terdapat di udara seperti
peroksida dan oksigen[1]. Terdapat pula kemungkinan beberapa jenis mikroba tak
terlihat seperti Chlorella Sp. mengandung minyak organic tercampur dalam kemasan[2].
Mikroorganisme ini juga dapat memicu reaksi pada reagent yang memungkinkan ragent
tidak bisa dipergunakan.

1.2. Teori Dasar

Ada tiga macam enzim yang terdapat pada Reagent Cholesterol biolysis, yaitu
cholesterol esterase (CE), cholesterol oxidase (CO) and peroxidase (POD)[3]. Ketiganya
berfungsi dalam sederet reaksi kimia yang pada akhirnya mengahasilkan air dan
Quinone-imine sebagai indicator kandungan cholesterol pada sampel[4]. Quinone-imine
adalah zat pewarna yang nantinya dapat mengindikasikan kandungan cholesterol
menggunakan pancaran warna setelah dicampurkan dengan sampel uji [5].
Cholesterol esterase (CE) adalah enzim reversible yang dapat menghidrolisis dan
mensintesis asam lemak esters dari cholesterol dan jenis sterol lainnya[6]. Nantinya
cholesterol bereaksi dengan oksigen dengan bantuan enzim cholesterol oxidase (CO)
menjadi cholestenone dan hydrogen peroksida[7]. Hal yang menarik adalah, secara
natural cholesterol juga terdapat pada mikroorganisme sebagai bahan pembentuk
membran selnya[8]. Mikroorganisme ini sangat mungkin terbawa oleh uap air dan angin
dan tersebar di udara[9]. Hal ini juga memungkinkan terdapat udara yang terbawa pada
kemasan reagent cholesterol MR bilolysis.
Membran cell dan strukur sel lainnya pada mikroorganisme berikutnya dapat hancur
secara alami oleh proses fisika seperti pemanasan, pendinginan, ozonisasi dengan sinar
ultraviolet maupun reaksi kimia menggunakan senyawa dan unsur kimia yang terdapat
pada udara[10]. Hal ini pada akhirnya memungkinkan terdapat cholesterol bebas
berserakan di udara meskipun jumlahnya relatif kecil. Meskipun jumlahnya relatif kecil,
namun dapat memicu reaksi kimia pada reagent. Dikarenakan secara natural
mikroorganisme dapat berkembang biak maka akan sangat memungkinkan reaksi kimia
ini dapat berlangsung sedikit demi sedikit sampai batas waktu tertentu hingga akhirnya
reagent tidak dapat berfungsi sebagaimana mestinya. Reaksi ini tentunya juga
memanfaatkan oksigen yang ikut terbawa pada kemasan reagent.
Hasil oksidasi cholesterol dibantu oleh enzim cholesterol oxydase membentuk
cholestenone dan hydrogen peroksida. Dibantu oleh enzim peroxidase (POD) yang
terdapat pada reagent, nantinya akan dihasilkan air dan zat pewarna Quinone-imine.
Intensitas rona warna Quinone-imine yang merah keunguan inilah merupakan indicator
level cholesterol yang dideteksi menggunakan methode fotometri.
Secara natural Hidrogen peroksida juga terdapat pada udara secara alami[11]. Meskipun
jumlahnya relative kecil namun tentunya dapat mengurangi efisiensi dari enzim POD
yang terdapat pada reagent sehingga merugikan reagent itu sendiri. Waktu kadarluarsa
reagent menjadi lebih pendek disebabkan oleh peroksida alami ini.
Sinar Ultraviolet pada dasarnya juga dapat memicu pembentukan hydrogen
peroksida[12]. Sinar ini memiliki tingkat penetrasi tertentu yang memungkinkannya
menembus material[13]. Fakta diatas memungkinkan secara natural hydrogen peroksida
dapat terbentuk menggunakan oksigen bebas yang terdapat pada udara. Hal ini
memungkinkan penurunan fungsi POD secara perlahan sampai batas waktu tertentu.
Penurunan ini tentunya akan membuat reagent juga mengalami disfungsi secara perlahan.
Pada dasarnya setiap reaksi kimia yang melibatkan oksigen dan hydrogen berpotensi
untuk membentuk senyawa asam dan basa dalam kondisi tertentu. Dimana dalam kondisi
kesetimbangan, asam dan basa akan membentuk senyawa netral. Senyawa asam
memiliki nilai dari 0 sampai 7. sedangkan diatasnya, (hingga 14) senyawa tersebut di
katakana basa.
Pada reagent cholesterol MR hasil akhir reaksi menghasilkan senyawa air dan pewarna
Quinone-imine (C23H27N3O8) dengan perbandingan 4:1. Disandingkan dengan air murni
(H2O), Quinone-imine adalah senyawa yang bersifat stabil meskipun terdapat gugus OH
di dalamnya. Dikarenakan kestabilan inilah akan memudahkan reaksi fotometri
melakukan pendeteksian warna pada proses pengukuran kadar kolesterol.
Pada alinea diatas telah disebutkan bahwa, secara natural terdapat cholesterol bertebaran
di udara dan begitu juga pada kemasan reagent. Hal ini juga menyebabkan terdapat reaksi
kimia irreversible secara berantai dan perlahan pada reagent yang telah dikemas secara
perlahan. Dikarenakan hasil akhir dari reaksi reagent secara natural sebagian besar
merupakan air, membuat kecenderungan pH reagent yang telah bereaksi bernilai 7.
Reaksi berantai pada sebuah reaksi kimiawi secara matematis memenuhi formula sebagai
berikut

pH  A  ect (1.1)[14]

Dimana t adalah waktu pengukuran, A, B dan C dapat diketahui melalui

eksperimen/praktik pengukuran langsung. Pada pengukuran kadar luarsa, dengan
berdsarakan asumsi ilmiah yang telah kita bangun di atas, maka persamaan tersebut dapat
dimodifikasi menjadi.

1 7
tex   ln (1.2)
c A
 Dimana tex adalah waktu perkiraaan kadar luarsa reagent dengan satuan unit sekon. Pada
pengukuran tiap 10 milisekon, maka persamaan diatas menjadi:

100 7
tex   ln (1.3)
c A

Berdasarkan Analisa tersebut, tulisan kali ini akan memuat metode pengukuran
kadarluarsa reagent Biolysis cholesterol MR secara realtime menggunakan metode
pendektesian nilai PH menggunakan persamaan 1.1, 1.2 dan 1.3.

2. ALat dan Bahan

1. Air Aquades (PH 7.0) atau Stetrile lab water 1000ml.

2. Reagent Cholesterol M.R 100 ml
3. Gelas reaksi diameter 10-20cm tinggi 25cm 2 buah
4. Module Sensor pH Gravity analog 1 buah
5. Kabel jumper 5 warna sebanyak 8 buah untuk jenis male to male dan 3 buah male to
female
6. Module sensor temperatur dan stailess stell probe ds18b20
7. Resistor 4,7kOhm
8. Microcontroller Arduino Uno R3
9. Lap kering tidak berserat / Kanebo halus
10. Sealer/penutup kedap udara

3. Metoda

1. Sebelum menuangkan cairan apapun, rangkaikan alat dan bahan seperti gambar 3.1
dibawah ini
2. Tuangkan air aquades murni sebanyak 400mL dengan Ph 7 ke dalam wadah cairan yang
telah disediakan dan tutup wadah dan sensor menggunakan sealer/penutup kedap udara
3. Kalibrasikan sensor Ph dan analog reading pada Arduino menggunakan air aquades
tersebut
4. Jika kalibrasi telah selesai, angkat kedua sensor tersebut dari wadah kemudian bersihkan
hingga kering dengan lap tak berserat seperti kanebo secara perlahan
5. Masukan 100 ml cairan reagent cholesterol MR yang akan diuji kedalam wadah kering
yang baru
6. Masukan kedua sensor tersebut kembali sebagaimana gambar 3.1 diatas dan tutup wadah
dan sensor menggunakan sealer/penutup kedap udara.
7. Tunggu hingga pembacaan temperature stabil
8. Menggunakan program Arduino IDE, rekam setiap data yang muncul dari sensor dengan
interval waktu 10 mili sekon.
9. Masukan data tersebut ke dalam sebuah table Analisa.
10. Dengan persamaan 1.3 didapatkanlah waktu kadar luarsa dari produk yang diinginkan.
 Gambar 3.1. Skematik pengukuran Ph secara realtime dengan Arduino uno R3 sebagai papan microcontroller

4. Hasil Pengukuran

Dari pengukuran secara realtime tiap 10ms setelah temperature sudah sangat stabil,
didapatkan ribuan data yang diplot menjadi grafik pada gambar 4.1 di bawah ini

Nilai pH

Gambar 4.1. Nilai kadar keasaman (pH) tiap 10 milisekon

 Pengukuran tersebut kemudian dimuat dalam sebuah table lampiran 1, kemudian dilakukan
curve fitting sehingga menghasilkan persamaan dimana setelah mencocokan dengan
persamaan 1.1 diketahui bahwa nilai A = 6,4374 dan C = 3*10-7. Kedua nilai tersebut
disubtitusikan sehingga akan didapatkan waktu kadarluarsa yaitu:

109 7
tex   ln
3 6, 4374

tex  27928472,39 detik

Nilai ini kemudian dikonversi kedalam satuan harian, dimana 1 hari adalah 86400. Dari sini
didapatkan waktu kadarluarsanya adalah 323,2462082 hari atau sekitar 1 tahun.
Catatan: Pada pengujian di atas suhu stabil pada nilai 20,7 derajat Celsius.

5. Kesimpulan

Pada pengukuran diatas, waktu kadarluarsa pada reagen pada suhu stabil di 20,7 derajat Celsius
adalah 323,24 hari atau sekitar satu tahun. Namun untuk rekomendasi, sebaiknya reagen tidak
dipergunakan sampai bulan ke 12. Pengukuran diatas juga mengasumsikan bahwa nilai ph final
adalah 7 dimana artinya seluruh reagent telah beraksi menjadi air. Hal ini merupakan estimasi
terburuk mengingat terdapat gugus OH pada Quinoneimine yang memungkinkan larutan reagen
bersifat basa.

6. Refrensi

[1] A. Marinoni et al., “Hydrogen peroxide in natural cloud water: Sources and
photoreactivity,” Atmos. Res., vol. 101, no. 1–2, pp. 256–263, 2011, doi:
10.1016/j.atmosres.2011.02.013.
[2] D. Kumalasari, A. G. Fasya, T. K. Adi, and A. Maunatin, “UJI AKTIVITAS
ANTIBAKTERI ASAM LEMAK HASIL HIDROLISIS MINYAK MIKROALGA
Chlorella sp.,” Alchemy, vol. 3, no. 1, pp. 163–172, 2014, doi: 10.18860/al.v0i1.2910.
[3] Linear.es, “Cholesterol Mr,” Linear.es, pp. 1–2, 2018.
[4] J. S. Moshides, “Improved method for determination of high density lipoprotein
cholesterol using a sensitive reagent and a centrifugal analyzer,” Clin. Chim. Acta,
vol. 166, no. 2–3, pp. 275–282, 1987, doi: 10.1016/0009-8981(87)90430-X.
[5] P. Trinder and D. Webster, “Determination of HDL-cholesterol using 2,4,6-tribromo-
3-hydroxybenzoic acid with a commercial CHOD-PAP reagent,” Ann. Clin.
Biochem., vol. 21, no. 5, pp. 430–433, 1984, doi: 10.1177/000456328402100516.
[6] S. Miura et al., “Cholesterol-mediated changes of neutral cholesterol esterase activity
in macrophages: Mechanism for mobilization of cholesteryl esters in lipid droplets by
HDL,” Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., vol. 17, no. 11, pp. 3033–3040, 1997, doi:
10.1161/01.ATV.17.11.3033.
[7] S. Devi and S. S. Kanwar, “Cholesterol Oxidase: Source,Properties and
Applications.,” Insights Enzym. Res., vol. 01, no. 01, 2018, doi: 10.21767/2573-
4466.100005.
 [8] L. M. Suta et al., “Thermal Characterization of Cholesterol in Air vs. Nitrogen
Atmosphere,” Rev. Chim., vol. 67, no. 1, pp. 84–86, 2016.
[9] B. M. Malliclk and P. Dse, “Atmosphere ( The layer nearest to the •.”
[10] G. J. Banwart, “Control of Microorganisms by Destruction,” Basic Food Microbiol.,
pp. 651–723, 1989, doi: 10.1007/978-1-4684-6453-5_12.
[11] D. Möller, “Atmospheric hydrogen peroxide: Evidence for aqueous-phase formation
from a historic perspective and a one-year measurement campaign,” Atmos. Environ.,
vol. 43, no. 37, pp. 5923–5936, 2009, doi: 10.1016/j.atmosenv.2009.08.013.
[12] J. C. Mierzwa, R. Rodrigues, and A. C. S. C. Teixeira, UV-Hydrogen Peroxide
Processes. 2018.
[13] E. M. Fleischmann, “The measurement and penetration of ultraviolet radiation into
tropical marine water,” Limnol. Oceanogr., vol. 34, no. 8, pp. 1623–1629, 1989, doi:
10.4319/lo.1989.34.8.1623.
[14] M. Soustelle, “An Introduction to Chemical Kinetics,” An Introd. to Chem. Kinet., pp.
1–448, 2011, doi: 10.1002/9781118604243.

7. Lampiran

Link penyimpanan daata mentah :

https://docs.google.com/spreadsheets/d/1bs4EvnJ7qrqCCtl3j7_fUo_odA46SOFY8Q2vZTdv
NHI/edit?usp=sharing