HỘI CÁC TRƯỜNG CHUYÊN KHU VỰC DUYÊN HẢI VÀ ĐỒNG BẰNG BẮC BỘ

CHUYÊN ĐỀ:

ỨNG DỤNG DI RUYỀN HỌC

– CÔNG NGHỆ GEN

1
 MỤC LỤC
Trang
A. PHẦN MỞ ĐẦU 3
1. Lý do chọn đề tài 3
2. Mục đích của đề tài 3
B. PHẦN NỘI DUNG 4
I. Lý thuyết 4
1. Các khái niệm cơ bản trong công nghệ gen 4
2. Các kĩ thuật cơ bản trong công nghệ gen 4
3. Công nghệ ADN tái tổ hợp 15
4. Ứng dụng công nghệ gen với sản xuất và đời sống 33
II. Câu hỏi, bài tập vận dụng 35
C. KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

2
 A. PHẦN MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Trong chương trình Sinh học phổ thông, Di truyền học là chuyên đề quan trọng nhất và khó
nhất. Trong chuyên đề Di truyền học được chia làm 5 phần nhỏ, bao gồm:
- Cơ chế di truyền và biến dị.
- Tính quy luật của hiện tượng di truyền.
- Di truyền học quần thể.
- Ứng dụng di truyền học.
- Di truyền học người.
Trong 5 phần này thì Ứng dụng di truyền học là phần có nhiều kiến thức mới, thực tiễn và
trừu tượng. Kiến thức trong sách giáo khoa về phần này chỉ là những kiến thức rất cơ bản, đơn
giản, không đáp ứng đủ cho các kì thi học sinh giỏi các cấp, đặc biệt là thi chọn HSG Quốc gia.
Vì vậy, để đáp ứng cho yêu cầu nâng cao, chuyên sâu giáo viên và học sinh cần tham khảo thêm
nhiều tài liệu khác.
Nhận thấy những khó khăn đó, tôi đã tiến hành viết đề tài về “ỨNG DỤNG DI TRUYỀN
HỌC – CÔNG NGHỆ GEN”.
2. Mục đích của đề tài:
- Biên soạn hệ thống lí thuyết về chuyên đề Ứng dụng di truyền học – Công nghệ gen.
- Biên soạn hệ thống câu hỏi vận dụng lí thuyết, bài tập.
- Cung cấp cho học sinh những kiến thức chuyên sâu, nâng cao về Ứng dụng di truyền học –
Công nghệ gen phục vụ cho thi HSG các cấp, đặc biệt là kì thi chọn HSG Quốc gia.
- Rèn luyện tư duy, khả năng vận dụng kiến thức đã học để giải quyết các vấn đề khó đặt ra.

3
 B. PHẦN NỘI DUNG
I. LÝ THUYẾT
1. CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN TRONG CÔNG NGHỆ GEN
1.1. Công nghệ gen
Công nghệ gen là một quy trình công nghệ dùng để tạo ra những tế bào hoặc sinh vật
có gen bị biến đổi hoặc có thêm gen mới
1.2. Kĩ thuật chuyển gen
Là các thao tác tác động lên ADN để chuyển một đoạn ADN mang một hoặc một
cụm gen từ tế bào của loài cho sang tế bào nhận.
1.3. Kĩ thuật PCR
Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để
khuếch đại một hoặc một vài bản sao của một đoạn AND theo cấp lũy thừa, tạo ra hàng ngàn đến
hàng triệu bản sao của một trình tự ADN nào đó.
1.4. Kĩ thuật điện di
Điện di trên gel (gel electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử là một kĩ thuật để
phân tích các phân tử ADN, ARN hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích
thước, hình dạng hay điểm đẳng điện tích (isoelectric point).
1.5. ADN tái tổ hợp
ADN tái tổ hợp (recombinant ADN) là phân tử ADN được tạo ra trong ống nghiệm bằng
cách kết hợp các ADN từ các nguồn (loài) khác nhau, theo một quy trình kỹ thuật nhất định, gọi
là kỹ thuật tái tổ hợp ADN.
Thông thường một phân tử DNA tái tổ hợp bao gồm một phân tử ADN có bản chất là
plasmid hoặc phage nguyên vẹn gọi là vector (thể tải) và một đoạn ADN từ nguồn khác mang
một gene hoặc yếu tố điều hòa mong muốn được cho xen vào; nó được gọi là ADN ngoại lai
(foreign ADN).
1.6. Sinh vật chuyển gen
Sinh vật biến đổi gen (Genetically Modified Organism) là một sinh vật mà vật liệu di
truyền của nó đã bị biến đổi theo ý muốn chủ quan của con người. Ngoài ra cũng có thể có những
sinh vật được tạo ra do quá trình lan truyền của gen trong tự nhiên. Ví dụ quá trình lai xa giữa cỏ
dại với cây trồng biến đổi gen có cùng họ hàng có thể tạo ra loài cỏ dại mang gen biến đổi.

2. CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN TRONG CÔNG NGHỆ GEN

2.1. Tách chiết axit nucleic
2.1.1. Tách chiết ADN
a. Nguyên tắc chung:
- ADN có kích thước lớn, tan trong nước hoặc đệm, kết tủa trắng trong dung môi cồn. Ở
trạng thái kết tủa rất dễ đứt gãy, vì thế mẫu ADN được thường bảo quản ở dạng dung dịch. Nếu
4
mẫu ADN sử dụng ngay, thường được hòa tan vào nước khử ion. Ngược lại, để bảo quản lâu,
mẫu ADN thường được bảo quản trong đệm TE (Tris – EDTA) nhằm tránh sự nhiễm nuclease.
- Độ sạch của mẫu ADN sau khi tách chiết được xác định theo tỷ lệ giá trị đo huỳnh quang
ở bước sóng A260 và A280. Mẫu ADN được xem là đủ sạch khi tỷ lệ A260/A280 ≈ 2,0.
- ADN được nhìn thấy trong bản gel điện di dưới ánh sáng UV sau khi đã nhuộm ethidium
bromide.
- Phương pháp tách chiết ADN gồm 5 bước chính sau:
+ Bước 1: Phá vỡ thành tế bào bằng biện pháp cơ học enzyme. Ở tế bào thực vật hoặc
động vật, cần có bước tách tế bào ra khỏi mô của chúng.
+ Bước 2: Sử dụng chất tẩy rửa (SDS, hoặc sarcosyl) để phá vỡ lớp phospholipid của
màng tế bào và màng nhân. Trong một số trường hợp, người ta bổ sung thêm protenase K.
+ Bước 3: Loại bỏ thành phần không mong muốn trong mẫu, như các protein,
polysaccharide. Mẫu được bổ sung hỗn hợp dung dịch (phenol: chloroform: isoamyl alcohol tỉ lệ
(25:24:1). Sau ly tâm cao tốc hỗn hợp dung dịch chia làm 3 pha: Pha trên cùng là pha nước chứa
ADN, ARN; Pha giữa là pha chứa protein và các chất thứ cấp bị kết tủa; Pha dưới là dung dịch
phenol: chloroform: isoamyl alcohol.
Việc loại bỏ ARN bằng được thực hiện bằng cách thêm ARNase vào dung dịch hỗn hợp
và ủ khoảng 5 – 10 phút.
+ Bước 4: Kết tủa ADN bằng isopropanol (ở nhiệt độ -20oC, khoảng 20 phút) hoặc ethanol
(ở -80oC, qua đêm) để loại bỏ hoàn toàn các chất không mong muốn còn hòa tan trong dịch mẫu.
Sau khi ly tâm, loại bỏ dung dịch lỏng chứa tạp chất, ta sẽ thu được cặn ADN kết tủa.
+ Bước 5: Hòa tan cặn ADN bằng nước khử ion hoặc dung dịch đệm TE.
b. Một số quá trình tách chiết ADN ở các đối tượng khác nhau
* Tách chiết ADN động vật
- Có thể tách chiết ADN từ các nguyên liệu khác nhau như máu, nước bọt, mô lông, tóc
(còn nguyên chân tóc, chân lông) và các loại mô khác.
- Nguyên tắc chung:
+ Tách tế bào có nhân ra khỏi mô.
+ Phá vỡ màng tế bào, màng nguyên sinh chất và phân hủy protein, giải phóng ADN ra
khỏi nhân.
+ Tách ADN ra khỏi đệm chiết và bảo quản ADN đến -20oC.
* Tách chiết ADN thực vật
- Tế bào thực vật có vách cellulose rất bền vững, do đó việc tách chiết ADN từ tế bào thực
vật gặp phải những khó khăn nhất định.
- Nguyên tắc chung:
+ Nghiền các mô, tế bào bằng biện pháp cơ học: Nghiền mô trong đá khô, nitơ lỏng bằng
cối, chày sứ để phá vỡ thành cellulose, giải phóng các thành phần bên trong tế bào. Trong một số
trường hợp, người ta có thể dùng thêm enzyme cellulase để phân hủy thành cellulose.
5
 + Sử dụng đệm có chất tẩy rửa (CATB) để phá vỡ màng tế bào, giải phóng ADN
+ Sử dụng hóa chất ức chế nuclease (EDTA) nhằm bảo vệ sự nguyên vẹn của ADN trước
sự tác động của nuclease nội bào.
+ Tách bỏ các tạp chất, protein ra khỏi hỗn hợp nhờ li tâm phân đoạn nhờ hỗn hợp các hóa
chất chloroform, isoamyl alkohol, phenol…
+ Thu hồi ADN bằng cách tạo kết tủa với ethanol hoặc isopropanol. Sau đó li tâm loại bỏ
dịch lỏng và thu hồi cặn ADN trong hỗn hợp.
+ Hòa tan ADN bằng nước ( sử dụng ngay sau đó) hoặc dung dịch đệm (bảo quản lâu dài).
* Tách chiết ADN vi khuẩn
Về nguyên tắc chung, việc tách chiết ADN từ vi khuẩn cũng giống tách chiết ADN từ thực
vật hay động vật. Điều khác cơ bản là phải nuôi vi khuẩn để thu sinh khối tế bào và phương pháp
để phá vỡ màng peptidoglycan của vi khuẩn. Có thể sử dụng biện pháp cơ học để phá vỡ thành tế
bào vi khuẩn như nghiền, sóng siêu âm… Người ta cũng có thể enzyme lisozym để phá vỡ màng.
Quy trình tách chiết ADN plasmid
Quy trình bao gồm 6 bước như sau:
- Bước 1: Dịch nuôi cấy vi khuẩn được li tâm ở 5000 vòng/ phút, thu cặn, loại bỏ dịch nổi.
- Bước 2: Hòa tan cặn bằng dịch thủy giải GET. Sau đó thêm vào 1,5 thể tích Alkaline
SDS (200 mM NaOH và 1% SDS) và ủ hỗn hợp 5p ở nhiệt độ thường. Trung hòa hỗn hợp dung
dịch bằng dung dịch trung hòa (3 mM CH3COONa). Lắc đều tuýp cho đến khi xuất hiện màu
trắng đục, đem li tâm và loại bỏ cặn.
- Bước 3: Làm lạnh tuýp và thêm Rnase (3 �1). Đảo ngược Eppendorf 2-3 lần cho trộn
đều và ủ nhiệt độ 30oC.
- Bước 4: Kết tủa protein bằng hỗn hợp chloroform và phenol.
- Bước 5: Kết tủa ADN bằng ethanol hoặc isopropanol.
- Bước 6: Hòa tan ADN trong dung dịch đệm, kiểm tra và cất giữ.
2.1.2. Tách chiết ARN
Các phân tử ARN không bền, dễ bị phân hủy bởi các enzyme RNase. Mặt khác, RNase có
mặt khắp nơi, có hoạt tính cao và rất bền với các tác nhân thường dùng để loại bỏ hoạt tính
RNase (xử lí nhiệt ở 90oC trong 1 giờ không làm mất hoạt tính RNase). Vì vậy, việc tách chiết
ARN đòi hỏi nhiều biện pháp thận trọng để tránh mọi tạp nhiễm bởi các ARNse từ môi trường.
Mặt khác, khi tách chiết ARN, để tránh lẫn lộn người ta thường loại bỏ ADN bằng enzyme
nuclease.
Như ta đã biết, 90-99% tổng số ARN trong tế bào là rARN (80-85%) và tARN (15-20%).
Các ARN này có kích thước và trình tự xác định và có thể tách riêng dễ ràng bằng điện di, li tâm.
Riêng đối với mARN rất đa dạng nên để tách chiết riêng mARN, người ta tiến hành sắc ký ái lực
trên cột oligo T-celulose dựa vào cấu trúc đuôi polyA trên mARN.
2.2. Điện di

6
 Phương pháp này được sử dụng để phân tích định tính và thu nhận mẫu axit nucleic.
Nguyên tắc của nó dựa vào đặc tính cấu trúc của các axit nucleic. Các nguyên tố phospho đã tạo
điện tích âm trên toàn diện bề mặt, nên khi chịu tác động của điện trường, các phân tử axit
nucleic sẽ di chuyển về phía cực dương. Tốc độ di chuyển của các phân tử axit nucleic trong gel
phụ thuộc vào kích thước, độ đậm đặc của gel và cả đặc tính của phân tử (dạng kép, dạng đơn,
dạng vòng, dạng siêu xoắn…).
- Điện di trên gel (gel electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử là một kĩ thuật để
phân tích các phân tử ADN, ARN hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích
thước, hình dạng hay điểm đẳng điện tích (isoelectric point). Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch
đệm (buffer) để dẫn diện và tạo điện trường đều, một bản gel (thường là agarose hay
polyacrylamide) đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử, và các chất nhuộm khác nhau
(ethidium bromide, bạc, xanh Coomassie) để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di.
Kĩ thuật điện di hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trường tác động vào các phân tử tích điện và
kích thước lỗ của thể nền (gel). Gel cấu tạo bởi các chuỗi cao phân tử (polymer) được liên kết
chéo với nhau tạo thành một hệ thống mạng lưới với kích thước các mắc lưới tùy thuộc vào nồng
độ chất cao phân tử (agarose, polyacrylamide) và phản ứng tạo liên kết chéo.
Các phân tử được phân tách khi di chuyển trong gel với vận tốc khác nhau nhờ vào sự
khác nhau của:
(a) lực của điện trường tác động lên chúng (nếu các phân tử tích điện khác nhau).
(b) kích thước của phân tử so với kích thước lỗ của gel.
(c) hình dạng, độ cồng kềnh của phân tử.
- Gel agarose: Là một polysaccharide, thường được chiết xuất từ rong biển đỏ nhất định.
Nó là một polymer tuyến tính được tạo thành từ đơn vị lặp đi lặp lại của agarobiose, là một
disaccharide tạo thành từ D -galactose và 3,6-anhydro- L -galactopyranose. Agarose là một trong
hai thành phần chính của thạch, và được tinh chế từ thạch bằng cách loại bỏ thành phần khác của
agar, agaropectin. Agarose có cấu trúc dạng lưới ba chiều các kênh có đường kính từ 50 nm đến>
200 nm tùy thuộc vào nồng độ agarose được sử dụng - nồng độ cao hơn mang lại đường kính lỗ
chân lông trung bình thấp hơn. Cấu trúc 3-D được tổ chức cùng với liên kết hydro và do đó có
thể bị gián đoạn do làm nóng trở lại trạng thái lỏng.
Vì có cấu trúc dạng lưới phù hợp nên agarose thường được sử dụng trong sinh học phân tử
để tách các phân tử lớn, đặc biệt là ADN, bằng điện di. Các tấm gel agarose (thường là 0,7 - 2%)
đối với điện di được chuẩn bị dễ dàng bằng cách đổ dung dịch ấm, lỏng vào khuôn. Một loạt các
agaroses khác nhau của trọng lượng phân tử khác nhau và tài sản là thương mại có sẵn cho mục
đích này. Agarose cũng có thể được hình thành thành các hạt và được sử dụng trong một số
phương pháp sắc ký để làm sạch protein.
- Gel polyacrylamide: Hydrat hóa acrylonitrile dẫn đến sự hình thành các phân tử
acrylamide (C3H5NO) bởi nitrile hydratase. Acrylamide monome ở trạng thái bột trước khi bổ
sung nước. Acrylamide là độc hại đối với hệ thần kinh của con người, do đó tất cả các biện pháp
an toàn phải được tuân theo khi làm việc với nó.
Acrylamide hòa tan trong nước và khi bổ sung nước, nó polyme hóa dẫn đến sự hình
thành polyacrylamit. Nó rất hữu ích để làm cho gel polyacrylamide thông qua acrylmide
hydration vì kích thước lỗ chân lông có thể được điều chỉnh. Tăng nồng độ acrylamide dẫn đến
7
giảm kích thước lỗ chân lông sau khi trùng hợp. Polyacrylamide gel có lỗ chân lông nhỏ giúp
kiểm tra các phân tử nhỏ hơn tốt hơn vì các phân tử nhỏ có thể đi vào lỗ chân lông và di chuyển
qua gel trong khi các phân tử lớn bị mắc kẹt tại các lỗ hở.
- Điện di trên gel agarose: Điện di trên gel agarose là phương pháp thông thường để giải
quyết ADN trong phòng thí nghiệm. Gel agarose có thấp hơn năng suất phân giải cho ADN hơn
gel acrylamide, nhưng họ có phạm vi lớn hơn của tách, và do đó thường được sử dụng cho các
đoạn ADN với độ dài của 50-20,000 bp (cặp base), mặc dù độ phân giải của hơn 6 Mb có thể với
xung điện di gel trường (PFGE). Nó cũng có thể được sử dụng để tách các phân tử protein lớn, và
nó là ma trận ưu tiên cho điện di gel của các hạt có bán kính hiệu quả lớn hơn 5-10 nm.
Kích thước lỗ chân lông của gel ảnh hưởng đến kích thước của ADN có thể được thuyên
giảm. Nồng độ gel càng thấp thì kích thước lỗ càng lớn, và ADN càng lớn thì càng tốt. Tuy nhiên,
gel có nồng độ thấp (0,1 - 0,2%) rất mỏng manh và do đó khó xử lý, và điện di của các phân tử
ADN lớn có thể mất vài ngày. Giới hạn độ phân giải của điện di gel agarose chuẩn là khoảng 750
kb. Giới hạn này có thể được khắc phục bởi PFGE, nơi mà các trường điện trực giao xen kẽ được
áp dụng cho gel. Các mảnh ADN định hướng lại bản thân khi trường ứng dụng chuyển hướng,
nhưng các phân tử ADN lớn hơn mất nhiều thời gian hơn để tự điều chỉnh khi điện trường bị thay
đổi, trong khi điện trường nhỏ hơn, và DNA có thể được phân chia theo kích thước.
Gel agarose được đúc trong khuôn, và khi được đặt, thường chạy theo chiều ngang ngập
trong dung dịch đệm. Bộ đệm Tris-acetate-EDTA và Tris-Borate-EDTA thường được sử dụng,
nhưng các bộ đệm khác như Tris-phosphate, barbituric acid-sodium barbiturate hoặc Tris-
barbiturate buffer có thể được sử dụng trong các ứng dụng khác. ADN thường được hình dung
bằng cách nhuộm với ethidium bromide và sau đó được xem dưới ánh sáng tia cực tím, nhưng
các phương pháp nhuộm màu khác có sẵn, chẳng hạn như SYBR Green, GelRed, xanh methylen
và tinh thể tím. Nếu các đoạn ADN tách rời là cần thiết cho thí nghiệm tiếp tục ở hạ lưu, chúng
có thể được cắt ra từ gel trong lát để thao tác tiếp theo.
2.3. Kỹ thuật PCR
PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm nhân bản một đoạn ADN trong
ống nghiệm dựa trên sự mô phỏng bộ máy sinh tổng hợp của ADN tế bào sống.
2.3.1. Nguyên lí của kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR là một phương pháp tổng hợp ADN dựa trên mạch khuôn là một trình tự
đích ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ
hoạt động của enzyme polymerase. Tất cả các ADN polymerase khi hoạt động tổng hợp một
mạch ADN mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của mồi chuyên biệt, liên kết bổ sung với
mạch khuôn. Đoạn mồi trong phản ứng PCR là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ
sung với một mạch ADN khuôn.
Thông thường, PCR bao gồm một chuỗi khoảng 20-40 lần biến đổi nhiệt độ lặp đi lặp lại,
gọi chu kỳ, mỗi chu kỳ thường gồm 2-3 giai đoạn nhiệt độ riêng biệt, thường là ba. Các chu
kỳ thường bắt đầu bằng giai đoạn nhiệt độ cao (>90°C), và sẽ dừng lại khi sản phẩm cuối cùng
được tổng hợp hoặc dừng lại ở nhiệt độ thấp để lưu trữ sản phẩm PCR trong thời ngắn. Nhiệt độ
và thời gian thực hiện của mỗi chu kỳ phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Những yếu tố này gồm
enzyme tổng hợp ADN, nồng độ ion hóa trị hai, dNTPs dùng trong phản ứng, và nhiệt độ nóng
chảy (Tm) của mồi.

8
 - Giai đoạn khởi đầu: (Chỉ cần đối với những enzyme ADN polymerase bắt buộc phải
kích hoạt bằng nhiệt độ). Giai đoạn cần tăng nhiệt độ lên 94-96°C (hay 98°C nếu sử dụng
polymerases cực kỳ bền nhiệt) và được tiến hành trong 1-9 phút.
- Giai đoạn biến tính: đây là bước đầu tiên của chu kỳ và là quá trình tăng nhiệt độ
lên 94-98°C trong 20-30 giây. ADN được biến tính bằng cách phá vỡ liên kết hydro giữa các
bazo, tạo thành phân tử ADN sợi đơn.
- Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ phản ứng giảm xuống còn 50-65°C trong 20-40 giây để
mồi gắn vào sợi ADN đơn. Nhiệt độ này cần phải đủ thấp để cho phép mồi bắt cặp với sợi ADN,
nhưng cũng đủ cao cho quá trình bắt cặp đặc hiệu, nghĩa là, mồi chỉ nên gắn hoàn toàn với phần
trình tự bổ sung trên mạch khuôn. Nếu nhiệt độ quá thấp, mồi sẽ gắn không đặc hiệu. Nếu quá
cao, mồi có thể không gắn. Thông thường nhiệt độ gắn mồi thường thấp hơn 3-5 °C so với Tm
của mồi dùng trong phản ứng. Liên kết hydro bền giữa phân tử ADN- ADN chỉ được hình thành
khi mồi bổ sung hoàn toàn với khuôn. Polymerase liên kết với các phân tử lai ADN mồi – khuôn
và bắt đầu tổng hợp ADN.
- Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ trong giai đoạn này phụ thuộc vào các ADN polymerase sử
dụng; Taq polymerase có nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 75-80°C , và nhiệt độ 72°C thường được sử
dụng với enzyme này. Tại giai đoạn này ADN polymerase tổng hợp sợi ADN mới bổ sung với
ADN khuôn bằng cách thêm dNTP theo nguyên tắc bổ sung theo chiều 5′ đến 3′, phản ứng trùng
ngưng xảy ra giữa nhóm 5′ – phosphate của dNTP với nhóm 3′ – hydroxyl phía cuối của sợi
ADN vừa mới được hình thành. Thời gian của giai đoạn kéo dài phụ thuộc vào ADN polymerase
và độ dài của đoạn DNA cần khuếch đại. Thông thường, các ADN polymerase có khả năng
khuếch đại được hàng nghìn bazo nito trên một phút. Trong điều kiện tối ưu, tức là, nếu không có
hạn chế do giới hạn của cơ chất hoặc chất phản ứng thì sau mỗi giai đoạn kéo dài, số lượng ADN
được khuếch đại sau mỗi chu kì tuần theo hàm mũ.
- Giai đoạn kết thúc kéo dài: Giai đoạn này đôi khi được thực hiện ở nhiệt độ 70-74 °C
(đây là nhiệt độ cần thiết cho hoạt động tối ưu của hầu hết các enzyme polymerase dùng trong
phản ứng PCR), với thời gian 5-15 phút sau chu kỳ PCR cuối cùng để đảm bảo rằng tất cả ADN
sợi đơn còn lại đều được tổng hợp hoàn toàn.
- Giai đoạn bảo quản: Giai đoạn này thực hiện ở nhiệt độ 4-15°C trong một thời gian để
bảo quản ngắn hạn sản phẩm của phản ứng.
Bảng 1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Bước Nhiệt độ Thời gian
Biến tính khởi đầu 95oC 1 - 5 phút
Biến tính 90 - 95oC 15 - 60 giây
Số
chu Bắt cặp mồi 40 - 70oC 15 - 60 giây
kỳ
Kéo dài 72oC 1 phút/1 kb
Kéo dài kết thúc 72oC (60oC) 0 - 30 phút
Như vậy, theo tính toán lý thuyết, chỉ một bản sao ban đầu qua 35 chu kỳ khuếch đại bằng
PCR sẽ có 236 bản sao, tương đương 68 719 476 736 (7.1010), có khối lượng thực tế khoảng 1�g.

9
 Hình 1: Sơ đồ minh họa các bản sao được hình thành qua các chu kỳ phản ứng PCR
Trong kỹ thuật PCR, sự khuếch đại tối ưu sẽ đạt đượng trong điều kiện sợi khuôn được
tinh sạch. Tuy nhiên, ngày nay người ta vẫn tiến hành PCR với dịch chiết thô. Lượng ADN mẫu
cho một phản ứng thường đạt ngưỡng tối thiểu là 100ng. Mặt khác, primer là chìa khóa của sự
thành công hay thất bại của phản ứng. Vì thế, tiêu chuẩn của primer cần được kiểm soát chặt chẽ
trong bước thiết kế.
Hiện nay, thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử với nhiều ứng
dụng trong sinh học, y khoa, nông nghiệp, kiểm nghiệm thực phẩm, kiểm nghiệm vi sinh vật gây
bệnh, phát hiện pháp y, xác định huyết thống…
2.4. Đọc trình tự
Hiện nay có 3 phương pháp đọc trình tự phổ biến, bao gồm:
2.4.1. Phương pháp hóa học: Phương pháp Maxam-Gillbert
Phương pháp này dựa vào sự thủy giải đặc trưng phân tử ADN cần xác định trình tự bằng
phương pháp hóa học. Nguyên lí của phương pháp như sau:
Trước hết các phân tử ADN được đánh dấu một đầu bằng P32 hoặc S35 . Sau đó, chúng
được chia thành năm phân đoạn, mỗi phân đoạn chịu một xử lí hóa học chuyên biệt có khả năng
làm biến đổi đặc trưng một loại nucleotide và cắt phân đoạn ADN tại nucleotide đó. Năm nhóm
nucleotide bị tác động là: G, A, C, G+A, T+C.
Bảng 2. Các hóa chất sử dụng để biến tính các nucleotide
(Maxam-Gillbert)
Hóa chất Nucleotide bị tác động
Dimethyl sulfate pH = 8 G
Piperidine formate pH = 2 A+G
Hydrazine A+T
Hydrazine + 1,5 M NaCl C
Nhiệt độ cao (90oC), 1,2 M NaOH A>C

10
 Kết quả của các xử lí hóa học là sự hình thành nên năm tập hợp oligonucleotide, các
oligonucleotide trong một tập hợp có kích thước khác nhau nhưng đều chấm dứt tại cùng một
loại nucleotide. Cuối cùng, năm phân đoạn trên được đm phân tách trên gel polyacrylamide. Vị
trí của các oligonucleotide trên gel tương ứng với kích thước của chúng và được phát hiện nhờ
đầu có đánh dấu phóng xạ. Kết quả được đọc trên bản phóng xạ tự ghi.
2.4.2. Phương pháp enzyme học: Phương pháp Sanger
Phương pháp này dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự mạch đơn cần xác định
trình tự nhờ enzyme ADN polymerase. Nguyên lí của phương pháp là ngoài các nucleotide đã bị
biến tính nhóm OH ở vị trí 3' bằng H. Điều này khiến các dideoxynucleotide không còn khả năng
hình thành liên kết phosphodiester và dẫn đến hiện tượng dừng tổng hợp.
Trình tự ADN cần xác định phải được tạo dòng trên vector mạch đơn (thường là phage
M13). Phản ứng tổng hợp được tiến hành trong bốn phân đoạn riêng. Người ta lần lượt cho vào
mỗi phân đoạn một trong bốn loại dideoxynucleotide với hàm lượng thấp. Như vậy, với một
ADN khuôn duy nhất với bốn ống phản ứng khách nhau, mỗi ống có bổ sung chỉ một loại ddNTP
và với một mồi trên thì sau khi phản ứng, quá trình tổng hợp sẽ tạo ra các đoạn oligonucleotide
được kết thúc bởi các dideoxynucleotide. Tiến hành điện di trên bốn giếng gel polycarylamid
khác nhau và kết quả được đọc trên bản phóng xạ tự ghi.
2.4.3. Giải trình tự bằng máy tự động
Các phòng thí nghiệm hiện nay đều dùng phản ứng giải trình tự bằng phương pháp
enzyme, nhưng khi tiến hành giải trình tự thường dùng các máy tự động chứ không dùng kỹ thuật
phóng xạ tự ghi như trước đây. Để thực hiện giải trình tự bằng máy tự động thì các mạch ADN
đơn sản sinh trong ống giải trình tự phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của các
mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia laser. Cấu tạo của một máy tự động giải trình tự
gồm hai phần chính yếu, là phần điện di gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di.
Phần điện di polyacrylamide có thể là một phần bản gel hay là một ống mao quản chứa gel. Phần
phát hiện vạch điện di là những con mắt cảm quang và một chùm tia laser đi qua trước nó.
Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một chùm vạch điện di
đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm
quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh
cường độ ánh sáng này, máy sẽ đo dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân
tích thành trình tự của đoạn ADN.
Số mẫu chạy một lần phụ thuộc vào số mao quản của máy. Tùy thuộc vào quy mô phòng
thí nghiệm cùng với số mẫu giải trình tự mà phòng thí nghiệm có thể trang bị giải trình tự ít hay
nhiều mao quản.
Ví dụ: Máy ABI có nhiều loại: 1, 4, 8, 16, 48 hay 96 mao quản.
Một số thế hệ máy mới có những chương trình đi kèm để chẳng những có thể hiển thị tự
động các ký tự hóa học của trình tự ADN mà còn giúp các nhà nghiên cứu có thể phát hiện được
các chi tiết cần thiết trên trình tự như mã khởi đầu, mã kết thúc, vùng đọc mở, trình tự nhận biết
của enzyme cắt giới hạn, phiên dịch trình tự axit amin trong vùng đọc mở, tự động so sánh trình
tự ADN trong phòng thí nghiệm hay một trình tự ADN nạp vào máy…
2.5. Lai phân tử
2.5.1. Lai axit nucleic
11
 Sau khi hai mạch đơn của sợi ADN kép tách ra dưới tác dụng của tác nhân nhân tạo (nhiệt
độ hoặc NaOH) gây biến tính loại bỏ liên kết hyđro. Thông thường, người ta dùng tác nhân nhiệt
độ để biến tính và sử dụng chỉ số nhiệt độ nóng chảy của ADN để xác định thời điểm tách mạch.
Khả năng bắt cặp lại của mạch kép theo nguyên tắc bổ sung được thực hiện khi ADN hồi tính.
Lợi dụng đặc tính này, người ta tiến hành lai các phân tử ADN sợi đơn với các đoạn đánh dấu.
Hiện tượng này được gọi là sự lai phân tử (molecular hybridization).
Do cấu tạo phân tử ADN gồm 2 mạch đơn, mỗi mạch bao gồm trình tự của bốn nucleotide
đối xứng với nucleotide mạch kia theo nguyên tắc A = T (2 liên kết hydro), G = C (3 liên kết
hydro). Nhiệt độ nóng chảy (Tm) là nhiệt độ tại đó có một nửa số phân tử ADN kép được tách ra
thành 2 sợi đơn. Quá trình chuyển mạch từ kép thành đơn có đặc điểm xảy ra đột ngột, lúc đầu
chưa đên Tm thì việc tách sợi kép khó hơn. Tuy nhiên, khi nhiệt độ gần Tm, do tính cộng hưởng
của phản ứng, giống như ta kéo tách sợi dây thừng, lúc đầu tác động một lực vào nhưng vẫn khó
tách ra, khi đã tách ra rồi thì lại nhanh và dễ.
Phân tử ADN nào có tỷ lệ C≡G lớn tức là phân tử đó bền vững và nhiệt độ nóng chảy
phải cao và ngược lại. Trong điều kiện chuẩn, Tm thường được tính theo công thức: Tm = 69,3 +
0,41 (%GC).
Đoạn ADN càng dài thì số cặp nucleotide lớn tức số liên kết hydro lớn nên Tm sẽ cao. Sự
thay đổi Tm theo chiều dài phân tử ADN được tính theo công thức sau:
∆Tm = -500/ số lượng cặp nucleotide.
Những đoạn có bắt cặp sai lệch như A với C và G với T chẳng hạn sẽ làm mất liên kết
hydro dẫn đến làm giảm tính ổn định của phân tử lai. Theo ước tính thông thường, cứ có 1%
nucleotide ghép cặp sai thì Tm sẽ giảm đi 1oC. Tuy nhiên, bắt cặp sai chỉ có ảnh hưởng trong
trường hợp đối với đoạn ADN ngắn.
Lai axit nucleic có 2 đặc điểm sau:
- Đặc thù tuyệt đối, tức sự bắt cặp trở lại chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung,
cho dù chúng chỉ có hai bản sao nằm lẫn lộn giữa hàng triệu trình tự khác.
- Các trình tự bổ sung có thể là ADN hoặc ARN dẫn đến tạo thành phân tử lại dưới các
dạng có thể sau: ADN/ADN; ARN/ARN và ADN/ARN.
2.5.2. Lai ptotein – Phương pháp Western blotting
Western blotting là phương pháp được sử dụng để nhận diện một kháng nguyên đặc hiệu
nhờ các kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng tương ứng. Dựa trên cơ sở mối liên kết giữa enzyme
với kháng thể có liên quan đến việc hình thành liên kết cộng hóa trị bền vững giữa một nhóm
chức hóa học gắn vào enzyme (horseradish peroxidase – HRPO, urease hay alkaline phosphatase)
với một kháng thể đơn hoặc đa dòng đặc thù, làm cho vị trí kết hợp kháng nguyên của kháng thể
và vị trí hoạt động của enzyme bị thay đổi về chức năng. Phương pháp này có 4 giai đoạn phản
ứng hóa học để nhận biết mối liên kết giữa kháng thể và kháng nguyên đặc thù. Đó là:
- Hoạt hóa HRPO bằng cách oxy hóa gốc đường bằng NaIO4.
- Hình thành cầu nối giữa enzyme peroxidase hoạt hóa với gốc amino của kháng thể để tạo
thành vị trí Schiff base.

12
 - Khử Schiff base bằng NaBH4 nhằm biến N thành NH để tạo thành phức hợp bền vững
giữa HRPO với kháng thể IgG.
- Phát hiện ra kết tủa màu vàng của MUP (4-methylumbellieryl phospate) hay NPP (p-
nitrophenyl phosphate). Có 2 phương pháp xác định lai giữa kháng nguyên với kháng thể, trên
pha lỏng gọi là phương pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) và trên pha rắn là
Western blotting.
Đầu tiên các mẫu protein kiểm tra được biến tính, phân giải thành các tiểu cấu tử. Các hóa
chất thường sử dụng là SDS (sodium dodecyl sulfate), DTT (dithiothreitol) hoặc 2-ME (2-
mercaptoethanol). Sau đó các mẫu protein này được phân tách nhờ điện di SDS-PAGE, hoặc
bằng điện di 2 chiều trong một số trường hợp. Các vệt vạch protein được chuyển lên và gắn chặt
trên bề mặt màng nilon, nitrocelulose hoặc PVDF rồi tiến hành phản ứng lai với phức enzyme
kháng thể bền vững đã chuẩn bị trước. Tất cả các vị trí kháng nguyên tồn tại trên màng được cố
định bằng cách cho màng lai chìm ngập trong môi trường chứa một số chất tăng khả năng cố
định. Sau đó cho lai với kháng thể kết gắn enzyme bền vững, màng lai được rửa sạch nhằm loại
bỏ những kháng nguyên không lai hoặc lai không đặc thù thì sẽ phát sáng màu tùy việc chúng ta
sử dụng enzyme horseradish peroxidase (HRPO), alkaline photphatase hay urease cặp đôi với
kháng thể.
2.5.3. Lai tại chỗ (In situ hybridization)
Lai tại chỗ là một kỹ thuật được sử dụng để định vị những đoạn axit nucleic bổ sung với
mẫu dò được đánh dấu đặc thù trên nhiễm sắc thể trong tế bào sinh vật nhân thật hoặc tế bào vi
khuẩn. Để tiến hành định vị những trình tự ADN đặc thù, người ta tiến hành xử lý mẫu vật để
làm biến tính ADN và loại bỏ những ARN và protein trong mẫu. Đoạn ADN quan tâm sau đó
được phát hiện bằng cách lai với mẫu dò axit nucleic đánh dấu. Phân bố của những ARN đặc thù
trong một số tế bào nhiễm sắc thể, có thể được định vị bằng cách lai với những mẫu thử ( chứa
những ARN hoặc ADN mẫu dò thích hợp) được tách cắt thành từng phần hoặc được ép nén.
Lai tại chỗ là một kiểu lai phân tử đó trình tự axit nucleic cần tìm (trình tự đính) nằm
nguyên ngay trong tế bào hay trong mô. Như vậy phương pháp này không cần khâu tách chiết
axit nucleic ra khỏi mô và tế bào. Phương pháp được ứng dụng trong việc định vị gen trên nhiễm
sắc thể, trong lai khuẩn lạc có chứa plasmid tái tổ hợp hoặc nghiên cứu quá trình phiên mã từng
mARN trong mô chuyên biệt trong tế bào và mô.
a. Lai khuẩn lạc (colony hybridization)
Là kỹ thuật được dùng để phát hiện những dòng vi khuẩn có mang vector tái tổ hợp cần
tìm trong một ngân hàng gen. Để lai khuẩn lạc, người ta tiến hành nuôi cấy tế bào vi khuẩn trên
đĩa petri chứa nền agar để tạo các khuẩn lạc (colony). Sau đó chuyển các khuẩn lạc sang bám
chặt vào màng nitrocellulose hoặc nylon bằng cách áp màng lai, màng lai sau đó được xử lí bằng
NaOH để làm phá vỡ tế bào vi khuẩn, đồng thời làm biến tính ADN giải phóng ADN và ADN
này được cố định trên màng bằng cách nhúng vào nước nhiệt độ 800C. Các bước lai tiến hành
như đã làm trên pha rắn. Sau khi lai với mẫu dò đánh dấu, vị trí của những khuẩn lạc chứa trình
tự mục tiêu được xác định bằng phóng xạ tự ghi không bằng phương pháp không dùng phóng xạ,
ta sẽ biết và thu được những dòng vi khuẩn có chứa gen mục tiêu mong muốn.
b. Lai nhiễm sắc thể (chromosome hybridization)

13
 Sử dụng phương pháp này để định vị nuôi cấy chính xác và sự phân bố của một trình tự
ADN mục tiêu trên nhiễm sắc thể nhờ một mẫu dò chuyên biệt. Để tiến hành, người ta thường
dùng nhiễm sắc thể ở giai đoạn kỳ giữa (thường lấy nhiễm sắc thể của tế bào bạch cầu) được xử
lý bằng các phương pháp tế bào học trên lam kính. Đó là công đoạn loại bỏ ARN bằng cách xử lý
enzyme ARNse, loại bỏ protein bằng cách xử lý proteinase K.
Sau đó, nhiễm sắc thể cố định trên lam kính được lai với mẫu dò đánh dấu. Dùng các
phương pháp phát hiện phân tử lai tùy theo phương thức đánh dấu được sử dụng, chúng ta có thể
quan sát và phát hiện được vị trí của phân tử lai trên nhiễm sắc thể bằng kính hiển vi.
c. Lai trên bào và mô (Cell ADN tissues hybridization)
Trong cơ thể, ở các tế bào và mô khác nhau, các ARN (đặc biệt là các mARN) có sự phân
bố về thời gian và sự khác nhau giữa các tế bào và mô. Sự phân bố về thời gian này có liên quan
đến chức năng và sự điều hòa biểu hiện của gen cũng như tương tác giữa mARN với các thành
phần khác nhau của tế bào và mô. Nếu nghiên cứu các ARN tách chiết thì không thể nắm được
các thông tin kể trên, muốn hiểu được phải tiến hành sử dụng phương pháp lai trên tế bào và mô.
Để tiến hành, người ta xử lý mô qua các bước như: Cố định mẫu, khử nước, tẩm paraffin,
cắt thành từng lát mỏng (7-10μm), trải chúng trên lame. Cuối cùng thực hiện các thao tác xử lý
mẫu, lai và phát hiện ra phân tử có trong mô tế bào cũng tương tự như trong phương pháp lai trên
nhiễm sắc thể. Kết quả được đọc trên lame bằng kính hiển vi.
Phương pháp này thường được sử dụng trong các trường hợp đối tượng nghiên cứu có tổ
chức phức tạp, bao gồm nhiều tập hợp tế bào khác nhau như não bộ. Thông tin này có ý nghĩa
quan trọng trong việc xác định vai trò và chức năng của mARN đối với tình hình hiện trạng mô.
Trong phương pháp miễn dịch tế bào có thể phát hiện được một protein chuyên biệt có
trong một tế bào thông qua kháng thể đặc trưng của nó. Khi phối hợp giữa các phương pháp miễn
dịch (lai protein) với phương pháp lai tại chỗ ARN, người ta có thể phát hiện sự tồn tại đồng thời
giữa mARN và protein trong mô. Từ đó xác định được mối tương quan giữa hoạt động phiên mã
và dịch mã của một gen.
Bằng cách lai nhiều lát cắt liên tục của một mô (các cấu trúc của lát cắt gần như đồng
nhất) với nhiều mẫu dò khác nhau, người ta có thể xác định được vị trí, sự phân bố và tương quan
giữa nhiều mARN cùng tham gia vào một quá trình sống.
Hiện nay, nhờ sự tiến bộ rất nhanh trong kỹ thuật đánh dấu mẫu dò bằng hóa chất phát
quang, đã giúp đỡ nhiều cho phương pháp lai tại chỗ. Đặc biệt giúp chúng ta có thể quan sát đồng
thời một lúc nhiều tập hợp các phân tử lai khác nhau nếu ta sử dụng các mẫu dò được đánh dấu
bằng các hóa chất biểu hiện nhiều màu khác nhau.
2.6. Kỹ thuật tạo cADN – Xây dựng thư viện gen
Thư viện gen thực chất là một tập hợp toàn bộ các dòng tế bào mang vector tái tổ hợp mà
mỗi loại mang các bản sao của đoạn nhất định trong bộ gen ban đầu. Mỗi dòng tái tổ hợp trong
bộ gen giống như một cuốn sách chứa đựng thông tin đặc thù.
Trong kỹ thuật xây dựng thư viện gen, người ta có hai phương pháp đó là:
- Phương pháp 1: nhân dòng ngẫu nhiên (shotgun) từ các đoạn cắt của enzyme cắt giới hạn
và lưu trữ cADN. Trong phương pháp nhân dòng ngẫu nhiên, mỗi một đoạn cắt sẽ được nhân
dòng vào một vector, sau đó chọn lọc và lưu giữ. Phương pháp này cũng được sử dụng nhiều,
14
song đối với bộ gen của sinh vật nhân thực sẽ gặp khó khăn khi biểu hiện vì sự xuất hiện của gen
phân mảnh. Bộ gen của sinh vật nhân thực có kích thước rất lớn, gồm nhiều gen và cấu trúc rất
phức tạp. Sự phân mảnh của các đoạn ADN ở sinh vật nhân thực gây khó khăn cho việc tạo dòng
từ phân tử ADN gốc. Người ta sẽ rất khó xác định các đoạn ADN không chứa intron để nhân
dòng, tạo lập một sản phẩm protein hoàn chỉnh.
- Phương pháp 2: dùng mARN để tạo và lưu trữ cADN bằng kỹ thuật tạo thư viện của
cADN của bộ gen.Người ta thường phải theo cơ chế sao mã ngược từ phân tử mARN trưởng
thành. Các phân tử ADN tạo ra theo cách này được gọi là cADN (complementary ADN). Tổng
số các đoạn cADN thu được từ một tế bào, ở các giai đoạn khác nhau tạo thành thư viện cADN.
Trình tự các bước tạo cADN có thể được tóm tắt như sau:
+ Tách chiết ARN tổng số, sau đó tách riêng mARN. Thông thường người ta dùng sắc ký
với màng cellulose – oligoT do phân tử mARN trưởng thành ở sinh vật nhân thực có đuôi polyA.
Sau khi rửa trôi các loại ARN khác trong hỗn hợp, mARN được tách ra khỏi màng nhờ phức chất
Tris-EDTA.
+ Sử dụng mARN làm khuôn cùng với enzyme sao mã ngược reverse transcriptase nhằm
lắp ghép các nucleotide theo khuôn mARN để tạo phân tử cADN.
+ Tạo dòng cADN, lưu giữ để xây dựng thư viện cADN.
+ Chọn lọc dòng bằng lai phân tử.
Ưu thế của kỹ thuật này là tạo được dòng phân tử không chứa intron, chủ động tạo ra sản
phẩm protein mong muốn nhờ biến nạp vector tạo dòng và vật chủ mới, từ đó có thể sản xuất
sinh khối protein mong muốn. Tuy nhiên, kỹ thuật tạo cADN cho ta nhiều gen khác nhau. Mặt
khác, mỗi giai đoạn phát triển khác nhau của cơ thể thì sự phiên mã của bộ gen là khác nhau, vì
vậy sự thiết lập ngân hàng cADN và chọn lọc gen mong muốn đòi hỏi công phu, tỉ mỉ và tốn
nhiều thời gian.

3. CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP

3.1. Các enzyme và vector chủ yếu dùng trong kĩ thuật ADN tái tổ hợp
3.1.1. Các enzyme cắt giới hạn
Enzyme cắt giới hạn (restriction endonuclease) hay gọi tắt là enzyme giới hạn (restrictase)
là loại enzyme có khả năng nhận biết đoạn trình tự nucleotide đặc hiệu trên các phân tử ADNvà
cắt cả hai sợi ADN bổ sung tại các vị trí đặc thù.
a. Vai trò của các enzyme cắt giới hạn
Từ 1953 người ta đã phát hiện thấy rằng, khi đưa ADN vào, gọi là ADN ngoại lai hay
ADN lạ, mất hẳn hoạt tính di truyền và hầu như bao giờ cũng bị phân cắt thành các đoạn ngắn.
Chỉ trong một số ít trường hợp ADN lạ đó mới không bị phân cắt và do đó nó có thể tái bản trong
tế bào chủ. Điều đó chứng tỏ ADN lạ được sửa đổi bằng cách nào đó dưới sự kiếm soát của tế
bào chủ. Các hiện tượng nói trên xảy ra chủ yếu khi các thể thực khuẩn (phage) xâm nhiễm các
tế bào vi khuẩn. Cho đến đầu thập niên 1970 người ta mới biết rõ rằng các tế bào vi khuẩn là
những hệ thống chứa cả hai loại enzyme: các enzyme sửa đổi và các enzyme cắt giới hạn. Chúng
đều có đối tượng nhận biết là các đoạn trình tự của ADN vật chủ và ADN ngoại lai, nhưng có vai
15
trò khác nhau. Cụ thể, các enzyme sửa đổi (methylase) đóng vai trò bảo vệ DNA vật chủ bằng
cách gắn thêm nhóm methyl (-CH3) ở một số base nhất định trong đoạn nhận biết (recognition
sequence) hay đoạn đích (target sequence). Hiện tượng methyl hoá (methylation) này thường xảy
ra đối với adenine và biến đổi nó thành N-6 methyladenine. Trong khi đó, các enzyme giới hạn
lại đóng vai trò vô hiệu hoá hoạt tính di truyền của các ADN lạ bằng cách phân cắt ở các vị trí
đặc thù chừng nào nó chưa được sửa đổi cho giống với ADN vật chủ. Như vậy, các enzyme giới
hạn đóng vai trò là hàng rào bảo vệ tự nhiên của các vi khuẩn nhằm chống lại sự xâm nhập của
các phage lạ.
b. Tính chất chung của các enzyme giới hạn
Trước tiên, cần lưu ý rằng các enzyme giới hạn chỉ phát hiện thấy ở các vi khuẩn mà không có ở
các eukaryote. Vì vậy, tên gọi của các enzyme giới hạn thông dụng là tên hệ thống, được biểu thị
bằng ba hoặc bốn chữ cái viết tắt của vi khuẩn mà từ đó enzyme được chiết xuất. Chữ cái đầu
tiên được viết hoa để chỉ chi (genus) và hai chữ cái tiếp theo viết thường để chỉ loài (species), và
khi cần thiết thêm chữ cái thứ tư để chỉ nòi hoặc chủng (strain, type). Ngoài ra, để phân biệt các
enzyme cùng một nòi người ta dùng số La Mã kèm theo sau tên hệ thống.

Hình 2. Enzyme giới hạn (EcoRI) cắt các DNA khác nhau.
Tính chất quan trọng nhất của các enzyme giới hạn là tính đặc hiệu vị trí, nghĩa là chúng
có thể nhận biết đoạn trình tự DNA đặc thù để cắt ở vị trí xác định.
Bảng 3. Trình tự nhận biết và nguồn gốc một số enzyme giới hạn phổ biến
Tên vi sinh vật Enzyme Trình tự nhận biết
Bacillus amyloliquefaciens H BamH I G/GATCC
Bacillus amyloliquefaciens H BamK I G/GATCC

16
 Escherichia coli Ry 13 EcoR I G/AATTC
Escherichia coli Ry 13 EcoR V GAT/ATC
Haemophilus influenza Rb Hind III A/AGCTT
Xanthomonas badrii Xba I T/CTAGA
Streptomyces albus G Sal I G/TCGAC
Xanthomonas malvaccarum Xma I CCC/GGG
Streptomyces achromogenes Sac I GAGCT/C
Streptomyces achromogenes Sac II CCGC/GG
c. Phân loại các enzyme giới hạn
Sau đó, tùy theo phương thức cắt và nguồn gốc của các enzyme đó, người ta đã chia nó
thành 3 nhóm là I, II và III.
(1) Enzyme giới hạn loại I có trình tự nhận biết đặc hiệu. Vị trí cắt của các enzyme loại
này nằm ngoài trình tự nhận biết của một khoảng cách không nhất định, dao động từ 1.000 đến
5.000 nucleotide. Do không có tính đặc hiệu trong các đoạn nên sản phẩm của nó không đồng
nhất và không phát hiện được bằng cách điện di trên gel. Phân tử lượng của chúng vào khoảng
300.000 D các bán đơn vị không giống nhau. Cần Mg2+ làm co-factor và ATP để cung cấp năng
lượng cho enzyme này chuyển động dọc theo phân tử ADN từ điểm nhận biết đến điểm cắt. Ví
dụ như EcoK do Meselson và Yuan tách được, cắt ở điểm cách trình tự nhận biết 1.000
nucleotide hoặc xa hơn nữa.
(2) Enzyme loại II bao gồm những enzyme có trình tự nhận biết chuỗi nucleotide đặc hiệu.
Khi nhận biết được trình tự đó, chúng cắt ngay tại vị trí nhận biết. Phân tử lượng thấp hơn loại I
và ở vào khoảng 20.000 đến 100.000 D. Chỉ cần Mg2+ là co-factor và không cần năng lượng ATP.
Do có tính đặc hiệu về cắt đoạn ADN nên sản phẩm thủy phân là tập hợp những đoạn ADN đặc
hiệu và cho phép phát hiện bằng điện di trên gel agarose. Cho đến nay trên 1.000 loại enzyme
giới hạn loại II đã được tách ra từ các tế bào sinh vật nhân sơ khác nhau và có hơn 70 loại đang
được thương mại hóa trên thị trường.
(3) Enzyme loại Loại III bao gồm những enzyme sau khi nhận biết một trình tự ADN đặc
hiệu thì cắt ở vị trí cách đó 20 nucleotide và tạo một số đầu cắt khác nhau. Tuy rằng, vị trí điểm
cắt rất gần trình tự nhận biết của chúng nhưng khó đoán trước được các điểm cắt đó. Vì vậy
enzyme giới hạn loại III cũng như enzyme giới hạn loại I không được sử dụng rộng rãi trong
công nghệ di truyền.
Trong ba loại enzyme nói trên chỉ có enzyme giới hạn loại II được ứng dụng nhiều hơn
trong công nghệ sinh học và công nghệ phân tử.
3.1.2. Các enzyme polymerase
a. ADN polymerase I của E.coli
Enzyme này dịch chuyển điểm đứt (nick) trên một sợi của ADN sợi đôi. Chức năng chính
của enzyme là sửa sai dọc theo phân tử ADN. Nếu gặp chỗ sai sót, nó sẽ đi ngược lại để cắt bỏ
sau đó mới tổng hợp ADN. ADN polymerase I của E.coli mang chuỗi polypeptide có khối lượng
phân tử (M) là 109.000 Da với ba hoạt tính riêng biệt:
17
 - Hoạt tính polymerase 5’-3’: ADN polymerase I của E.coli xúc tác cho sự tổng hợp ADN
theo chiều 5’-3’ bằng cách bổ sung các gốc nucleotide vào đầu tận cùng 3’-OH được tạo ra khi
một sợi của phân tử ADN sợi đôi bị đứt.
- Hoạt tính exonuclease 3’-5’: ADN polymerase I của E.coli cắt các chuỗi nucleotide ở
các đầu tự do của ADN , xúc tác cho sự thoái biến bậc thang từ đầu 3’ của cả ADN sợi đôi và sợi
đơn khi không có các dNTP. Trong trường hợp không có các dNTP, hoạt tính exonuclease trên
sợi đôi sẽ bị ức chế bởi hoạt tính polymerase. Trong quá trình tổng hợp ADN, hoạt tính
exonuclease thực hiện chức năng đọc sửa (proofreading) bằng cách cắt bỏ những nucleotide bị
lắp ráp sai.
- Hoạt tính exonuclease 5’-3’: ADN polymerase I của E.coli có thể chuyển chỗ các
nucleotide từ phía 5’ của điểm đứt và bổ sung tức thời các nucleotide từ phía 3’ tạo ra chuyển
động của điểm đứt dọc theo ADN.
- Ứng dụng chính:
+ Đánh dấu đoạn ADN để làm mẫu dò dịch chuyển điểm đứt.
+ Khởi đầu cho sự tổng hợp sợi thứ hai trong tạo dòng cADN.
+ Xác định trình tự ADN bằng phương pháp Sanger.
b. Đoạn Klenow của ADN polymerase I của E.coli
Enzyme này có tác dụng lấp đầy các đầu khuyết 3’ của ADN sợi đôi. Do ADN
polymerase I có ba hoạt tính, nhưng hoạt tính exonuclease 5’-3’ ít sử dụng nên Klenow đã dùng
protease để cắt bớt đoạn có hoạt tính đó. Vì vậy, khối lượng phân tử enzyme chỉ còn lại 76.000
Da (được gọi là đoạn lớn của ADN polymerase I).
- Ứng dụng chính:
+ Làm hóa đầu khuyết 3’ do enzyme hạn chế tạo ra.
+ Đánh dấu đầu tận cùng của các đoạn ADN bằng cách dùng [32P]dNTP để làm đầy đầu
khuyết 3’.
+ Đánh dấu đầu tận cùng của các phân tử ADN mang đầu lồi 3’. Đầu tiên, hoạt tính
exonuclease 3’-5’ loại bỏ đầu lồi 3’ để tạo ra đầu khuyết 3’. Sau đó, nhờ sự có mặt ở nồng độ cao
của một tiền chất được đánh dấu đồng vị phóng xạ, sự thoái tiến bậc thang được cân bằng do sự
hợp nhất của các dNTP ở đầu 3’.
+ Tổng hợp sợi thứ hai của cADN trong tạo dòng cADN.
+ Tổng hợp ADN sợi đôi từ các khuôn mẫu sợi đơn trong phát sinh đột biến in vitro.
c. ADN polymerase của bacteriophage T4 (T4-infected E.coli)
Enzyme này giống đoạn Klenow của ADN polymerase I của E.coli. ADN polymerase của
phage T4 (M=144.000 Da) có hoạt tính polymerase 5’-3’ và exonuclease 3’-5’. Tuy nhiên, hoạt
tính exonuclease của ADN polymerase phage T4 lớn hơn của ADN polymerase I đến 200 lần.
Đoạn Klenow phải có đoạn mồi mới tổng hợp ADN được, còn ADN polymerase T4 thì không
cần mồi cũng tổng hợp được ADN.
- Ứng dụng chính:

18
 + Làm đầy hoặc đánh dấu đầu khuyết 3’ do enzyme hạn chế tạo ra.
+ Đánh dấu tận cùng của các phân tử ADN mang đầu lồi 3’, tương tự như ứng dụng của
đoạn Klenow.
+ Đánh dấu các đoạn ADN để làm mẫu dò.
+ Biến đổi đầu so le của ADN sợi đôi thành đầu bằng.
d. Taq ADN polymerase
Taq ADN polymerase (Taq pol) là một loại ADN polymerase chịu nhiệt (M= 65.000 Da)
của vi khuẩn Thermus aquaticus. Enzyme này được dùng để kiểm tra sự có mặt hoặc không của
một gen bằng tìm cách xúc tác cho sự tổng hợp gen đó ở điều kiện in vitro nhờ phản ứng chuỗi
polymerase (PCR). Taq polymerase thay thế cho ADN polymerase I của E.coli do có khả năng
chịu nhiệt cao phù hợp với điều kiện phản ứng của PCR và nó có thể tổng hợp một sợi ADN dài
1kb trong vòng 30 giây ở 72oC.
Một trong những hạn chế của Taq pol là sự chính xác không cao trong quá trình sao chép
của nó do bị mất cơ chế đọc sửa (hoạt tính exonuclease 3’-5’). Enzyme Taq pol thương mại có tỷ
sao chép lỗi 1/10.000 nucleotide và có thể tạo ra 16% sản phẩm PCR dài 1 kb bị đột biến trong
phản ứng khuếch đại. Mặc dù có nhược điểm trên, Taq polymerase vẫn có thể được dùng trong
các thí nghiệm đòi hỏi một trình tự di truyền chính xác (như trong tạo dòng phân tử). Tuy nhiên,
kết quả cho ra một vector mang đoạn chèn (sản phẩm PCR) cần phải được kiểm tra bằng đọc
trình tự.
Ưu điểm của Taq polymerase là sản xuất các đoạn gen mang hai đầu lồi A. Điều này đặc
biệt hữu ích trong “TA cloning” là kỹ thuật mà vector (plasmid) được sử dụng đã có sẵn hai đầu
lồi T bổ sung với hai đầu lồi A của sản phẩm PCR, nhờ đó đã làm tăng hiệu quả của phản ứng
gắn.
Ngoài Taq polymerase, nhiều ADN polymerase chịu nhiệt khác đã được đưa ra thị trường
với các chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn. Chẳng hạn: Pfu ADN polymerase được tách
chiết từ Pyrococcus furiosus, thường được dùng thay cho hoặc kết hợp với Taq polymerase.
Enzyme này ổn nhiệt hơn và có khả năng đọc sửa, vì thế cho tỷ lệ sao chép lỗi thấp. Hoặc Tth
ADN polymerase được tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động như một
enzyme phiên mã ngược khi có mặt ARN khuôn mẫu và ion Mn2+. Tuy nhiên, trong trường hợp
có sự hiện diện của ADN khuôn mẫu và ion Mg2+, thì Tth polymerase lại xúc tác phản ứng
khuếch đại ADN. Enzyme này cho phép khuếch đại khuôn mẫu là ARN thông qua sự hình thành
của cADN.
e. ARN polymerase (ADN-dependent ARN polymerase)
Các bacteriophage SP6, T7 và T3 sản xuất enzyme ARN polymerase để khởi đầu tổng hợp
ARN trên khuôn mẫu ADN sợi đôi có mang promoter đặc trưng bacteriophage. Quá trình tổng
hợp này không cần mồi.
- Ứng dụng chính:
+ Sản xuất ARN để làm mẫu dò.
+ Xác định trình tự của một phân tử ADN được tạo dòng trong một vector có mang
promoter đặc trưng cho bacteriophage SP6, T7 hoặc T3.

19
 + Sản xuất một lượng lớn ARN từ một phân tử ADN được tạo dòng để nghiên cứu về cấu
trúc, điều hòa và các mối tương tác của phiên bản ARN.
f. Enzyme phiên mã ngược (Reverse transcriptase)
Đây là enzyme tổng hợp ADN từ khuôn mẫu ARN. Enzyme này có ở trong các virus:
AMV (avian myeloblastosis virus), Mo-MLV (moloney murine leukemia virus) thuộc nhóm
virus ngược (retrovirus: virus mang ARN) và có hoạt tính sau:
- Hoạt tính polymerase 5’-3’: Tổng hợp ADN theo chiều 5’-3’. Cơ chất của nó là ARN
hay ADN (sợi đơn hoặc sợi đôi).
- Hoạt tính Rnase H: Bao gồm hai hoạt tính exoribonuclease 5’-3’ và 3’-5’ phân hủy các
ADN hoặc ARN trong tổ hợp lai.
Enzyme này được dùng trong kỹ thuật di truyền là nhờ vào khả năng tổng hợp được
cADN của chúng.
Người ta có thể tách chiết mARN ở những tế bào tổng hợp protein mạnh, sau đó dùng
enzyme phiên mã ngược để tổng hợp cADN. Có thể tổng hợp nên oligonucleotide rồi dùng nó để
xác định trình tự ADN.
g. Teminal transferase
Hoạt tính của enzyme này là xúc tác gắn các nucleotide vào đầu 3’-OH tự do của ADN sợi
đôi làm lồi ra một đầu ở cuối sợi ADN. Phản ứng này là ngẫu nhiên, do đó thành phần nucleotide
của đầu lồi phụ thuộc vào nồng độ của bốn loại nucleotide có trong phản ứng.
-Ứng dụng chính:
+ Thêm đuôi đồng trùng hợp (homopolymer) để tạo ra đầu so le cho phân tử ADN dùng
trong tạo dòng.
+ Đánh dấu đầu 3’-OH của ADN trong kỹ thuật xác định trình tự gen theo Maxan và
Gilbert.
3.1.3. Các enzyme nối
Enzyme ligase thường dùng là của phage T4 xâm nhiễm trong E.coli. Chức năng của
enzyme này là nối các đoạn hở bằng liên kết cộng hóa trị, sử dụng năng lượng ATP.
a. Bacteriophage T4 ADN ligase
Enzyme này là một chuỗi polypeptide (M= 68.000 Da) xúc tác cho sự tạo thành liên kết
phosphodiester giữa đầu 3’-OH tự do của một phân tử ADN này với đầu cuối 5’-PO4 của một
phân tử ADN khác. ADN ligase có tác dụng cho cả trường hợp đầu so le lẫn đầu bằng, tuy nhiên
đối với đầu bằng enzyme đòi hỏi nồng độ cao hơn và điều kiện phản ứng cũng khác.
b. Bacteriophage T4 ARN ligase
Enzyme này xúc tác cho mối liên kết cộng hóa trị giữa nhóm 5’-PO4 của ADN sợi đơn
hoặc ARN với nhóm 3’-OH của ADN sợi đơn hoặc ARN.
c. Bacteriophage T4 polynucleotide kigase
Enzyme này xúc tác cho mối liên kết cộng hóa trị giữa nhóm 5’-PO4 của ADN sợi đơn
hoặc ARN. Hai loại phản ứng thường có thể xảy ra là phản ứng thuận và phản ứng trao đổi.
20
Trong phản ứng thuận, nhóm γ-phosphate được chuyển tói đầu 5’ của ADN đã được
dephosphotyl hóa (mất nhóm phosphate). Trong phản ứng trao đổi, khi có một ADP thừa,
enzyme sẽ chuyển nhóm 5’ phosphate từ ADN đã được phosphoryl hóa tới ADP, ADN sau đó sẽ
được phosphoryl hóa trở lại bằng cách nhận một nhóm γ-phosphate đã được đánh dấu đồng vị
phóng xạ từ một phân tử [γ-32P]ATP.
-Ứng dụng chính:
+ Đánh dấu phóng xạ đầu 5’ của ADN để phân tích trình tự bằng phương pháp Maxam và
Gilbert (1977), dùng làm mẫu do trong các kỹ thuật lai phân tử.
+ Phosphotyl hóa các đoạn nối (linker) và các đoạn ADN không có nhóm 5’ phosphate để
chuẩn bị cho phản ứng gắn trong phương pháp tạo dòng.
d. Alkaline phosphatase
Chức năng chính của alkaline phosphatase là xúc tác loại bỏ nhóm 5’ phosphate khỏi
ADN và ARN. Có hai loại thường được sử dụng hiện nay là enzyme alkaline của vi khuẩn và
ruột bê.
- Ứng dụng chính:
+ Loại bỏ nhóm 5’ phosphate khỏi ADN hoặc ARN trước khi đánh dấu 5’ bằng 32P .
+ Loại bỏ nhóm 5’ phosphate khỏi các đoạn ADN để ngăn cản sự tự gắn. Trong kỹ thuật
tạo dòng, khi một vector được mở vòng ADN bằng một enzyme giới hạn rồi sau đó được loại bỏ
nhóm 5’ phosphate thì nó không thể tự gắn lại (tự tái tạo lại vòng). Chỉ khi có đoạn ADN ngoại
lai mang các đầu 5’ phosphate cần thiết được đưa vào thì phản ứng gắn giữa vector và ADN
ngoại lai mới xảy ra.
3.1.4. Các enzyme cắt
Là nhóm các enzyme xúc tác thủy phân liên kết phosphodiester trong phân tử ADN hoặc
ARN, bao gồm các endonuclease (cắt bên trong phân tử axit nucleic) và exonuclease (cắt bên
ngoài phân tử axit nucleic). Các enzyme giới hạn cũng là các endonuclease, nhưng chúng có tính
đặc hiệu rất cao cho từng trình tự 4 hoặc 6 nucleotide. Dưới đây là các nuclease chính thường
được sử dụng.
a. Deoxyribonuclease I (Dnase I)
Dnase I xúc tác thủy phân ADN sợi đơn hoặc sợi đôi ở các liên kết phosphodiester nằm
bên cạnh các nucleotide pyrimidine, tạo ra các oligonucleotide và các oligonucleotide có đầu tận
cùng 5’ monophosphate. Khi có mặt Mg2+, Dnase I tác dụng độc lập trên mỗi sợi ADN và các vị
trí cắt được phân bố ngẫu nhiên. Trong công nghệ sinh học, Dnase I thường là sản phẩm tách từ
tụy bò.
Khi có mặt Mn2+, Dnase I sẽ cắt cả hai sợi ADN gần như ở cùng một vị trí để tạo ra các
đoạn ADN đầu bằng hoặc đầu lồi nhưng chỉ nhô ra một hoặc hai nucleotide.
- Ứng dụng chính:
+ Tạo ra các điểm đứt (nick) trên ADN sợi đôi để đánh dấu mẫu dò đồng vị phóng xạ bằng
phương pháp dịch chuyển điểm đứt.
+ Tạo ra các dòng ngẫu nhiên để phân tích trình tự trong bacteriophage M13 vector.
21
 + Phân tích phức hợp protein: ADN (DNase footprinting).
+ Loại bỏ ADN trong các phân đoạn ARN hay protein.
b. Nuclease S1 (Tách chiết từ Aspergillus oryzae)
Enzyme nuclease S1 cắt ADN sợi đơn hoặc ARN để tạo ra đầu 5’ monophosphate hoặc
các oligonuclease. ADN sợi đôi và thể lai ADN/ARN ít chịu tác dụng của enzyme này. Tuy
nhiên, các axit nucleic sợi đôi sẽ bị nuclease S1 cắt hoàn toàn nếu chúng bị xử lí với một lượng
rất lớn enzyme. Một lượng vừa đủ của enzyme sẽ tách các axit nucleic sợi đôi ở các điểm đứt
hoặc các lỗ hổng nhỏ thành hai hoặc nhiều đoạn.
- Ứng dụng chính
+ Phân tích cấu trúc thể lai ADN/ARN.
+ Loại bỏ các sợi đơn trên đầu so le ra khỏi đoạn ADN sợi đôi để tạo ra các đầu bằng.
+ Mở vòng cặp tóc xuất hiện trong quá trình tổng hợp cADN sợi đôi.
Một enzyme có hoạt tính tương tự nuclease S1 là mung-bean nuclease (endonuclease)
được tách chiết từ mầm đậu xanh (Phaseolus aureus).
c. Exonuclease III (Exo III) (Tách chiết từ E.coli)
Exo III xúc tác loại bỏ các 5’ mononucleotide từ đầu 3’ OH của ADN sợi đôi (ADN mạch
thẳng hoặc mạch vòng chứa các điểm đứt hoặc lỗ hổng). Hoạt tính enzyme cho kết quả tạo thành
các vùng sợi đơn dài trong ADN sợi đôi. Enzyme này có ba loại hoạt tính khác nhau:
Endonuclease đặc hiệu cho apurinic ADN, RNase H và 3’ phosphatase (loại bỏ đầu 3’ phosphate
nhưng không cắt các liên kết phosphodiester bên trong). Exo III không cắt các ADN sợi đơn hoặc
ADN sợi đôi có đầu lồi 3’.
3.1.5. Hai loại vector thông dụng trong kĩ thuật ADN tái tổ hợp
Vector là phân tử DNA có kích thước bé hoặc vừa phải, đóng vai trò l vật trung gian mang
truyền đoạn DNA ngoại lai nghiên cứu vào trong tế bào thể nhận (tế bào khả biến) bằng con
đường biến nạp (transformation) hoặc tải nạp (transduction).
Có hai loaị vector thông dụng là các plasmid hoặc các phage. Các plasmid vi khuẩn được
sử dụng rộng rãi hơn cả, bởi vì chúng có các đặc điểm sau:
- Có khả năng xâm nhập vào tế bào vật chủ mà vẫn hoạt động (tái bản, biểu hiện gene)
bình thường;
- Có trọng lượng phân tử thấp nên dễ dàng tinh chiết;
- Số bản sao trong mỗi tế bào vi khuẩn thường khá cao;
- Một số plasmid có chứa các gene kháng thuốc tiện lợi cho việc theo dõi và phát hiện sự
có mặt của plasmid tái tổ hợp trong vi khuẩn chủ.

22
 Hình 3: Các plasmid có chứa khởi điểm tái bản (ori), các điểm cắt của một số retrictase
và các gene kháng ampicillin (AmpR), kanamycin (KanR).
Trong số các phage dùng làm vector thì phage lambda (λ) có nhiều ưu thế nhất, bởi lẽ ở
phần giữa của bộ gene có chứa một số gene không quan trọng và không liên quan với sự tái bản
của nó, nên thuận lợi cho việc xen đoạn DNA mong muốn vào đây. Các phage không chứa các
gene kháng thuốc cho nên việc theo dõi phage tái tổ hợp được xác định dựa vào các vết tan
dương tính (positive plaques) trên nền vi khuẩn.
3.2. Các công đoạn chính tạo ADN tái tổ hợp
3.2.1. Phân lập đoạn ADN/gen
a. Tách các đoạn ADN từ kiểu gen
Phương pháp này được thực hiện như sau: ADN bộ gen (kiểu gen ADN) của một sinh vật
được cắt thành các đoạn nhỏ dài khoảng 20 kb bằng enzyme cắt giới hạn rồi gắn vào vector để
xây dựng thư viện gen (kiểu genic library).
Thư viện gen là một tập hợp các đoạn ADN cùng đại diện một kiểu gen nguyên vẹn (hoặc
gần nguyên vẹn) của các cá thể mà ADN được bắt nguồn từ đó. Thông thường, ADN bộ gen
được cắt bằng enzyme giới hạn có trình tự nhận biết 4 bp. Tuy nhiên, không phải dễ dàng thu
được một gen nguyên vẹn nằm trên một đoạn ADN. Trong thực tế, một đoạn gen thường bị cắt
thành nhiều đoạn ADN do vị trí nhận biết của enzyme nằm ngay trong gen.
Có thể sử dụng ADN tách từ các loại mô khác nhau để xây dựng thư viện gen. Các thư
viện gen của một cơ thể chứa các đoạn ADN dài ngắn khác nhau nhưng thông tin di truyền
không thay đổi. Ngược lại, thư viện cADN được xây dựng từ các mARN. Trong cơ thể có những
gen chỉ hoạt động trong những loại tế bào nhất định, do đó giữa các mô khác nhau có thể thu
được các phân tử mARN khác nhau. Vì vậy, một cơ thể có thể có nhiều thư viện cADN khác
nhau đặc trưng cho từng loại tổ chức chuyên hóa.

23
 b. Sinh tổng hợp cADN từ mARN
Đoạn ADN được tổng hợp dựa trên khuôn mẫu mARN bằng sự sao mã ngược (reverse
transcription) được gọi là cADN (complementary ADN). Quá trình tổng hợp cADN trải qua 3
giai đoạn như sau:
- Tổng hợp sợi cADN thứ nhất: Tổng hợp sợi cADN thứ nhất dựa trên khuôn mẫu mARN
nhờ phản ứng phiên mã ngược. Thành phần chính của phản ứng bao gồm enzyme phiên mã
ngược, các oligo (dT) mồi sẽ liên kết với đuôi polyA của mARN, dNTPs, các đệm.
- Tổng hợp sợi cADN thứ 2: Gây biến tính (bằng nhiệt) thể lai mARN-cADN để cắt ARN
bằng RNase H của E.coli. Thông thường đầu tận cùng 3’ của các cADN sợi đơn có khả năng tạo
thành các cấu trúc vòng kẹp tóc (hairpin loop) và vì thế có thể được sử dụng để là primer cho quá
trình tổng hợp sợi cADN thứ 2 bằng ADN pholymerase I của E.coli.
- Cắt vòng kẹp tóc bằng nuclease S1: Sau khi tổng hợp xong ADN, sợi thứ nhất và thứ hai
liên kết với nhau tại vị trí kẹp tóc và được cắt bởi nuclease S1. Kết quả đầu cắt tận cùng thường
là đầu bằng. Sợi đôi cADN sau đó được tách thành các tiểu phần theo kích thước và các phân tử
lớn nhất được gắn vào các plasmid của vi khuẩn. Hoặc một tập hợp đầy đủ các kích thước của
cADN sợi đôi được tạo dòng trong bacteriophage để xây dựng thư viện cADN.
c. Phân lập đoạn ADN bằng PCR
Đây là phương pháp sử dụng rất phổ biến hiện nay. Nó ít thời gian và hiệu quả cao hơn rất
nhiều so với hai phương pháp trên. Tuy nhiên, để thực hiện phương pháp này, thông thường
trình tự nucleotide của gen nghiên cứu đã được xác định. Trên cơ sở đó, đoạn mồi được thiết kế
để bắt cặp với gen xác định và phản ứng PCR được tiến hành để phân lập đoạn gen đó.
3.2.2. Lựa chọn vector
Các gen cần chuyển thường được nhân dòng vào các vector, là các phân tử ADN nhỏ có
khả năng mang được gen cần thiết. Vector dùng trong kĩ thuật ADN tái tổ hợp thường có các đặc
điểm cơ bản sau:
- Có điểm khởi đầu sao chép để tự sao chép trong tế bào vật chủ.
- Các đoạn trình tự nhận biết cho enzyme giới hạn. Thông thường, các vector được thiết kế
các vùng MCS (Multil Cloning Sites) chứa nhiều trình tự nhận biết của nhiều enzyme cắt giới
hạn.
- Có chỉ thị chọn lọc cho phép dễ dàng phát hiện sự có mặt của chúng trong tế bào
chủ. Các chỉ thị chọn lọc có thể là một gen tổng hợp chất màu, chuyển hóa chất màu, gen gây
độc hay kháng sinh.
Các vector từ trường có nguồn gốc từ plasmid như pSC1001, pColE1, pBR322, pUC19,
pET system, Ti-plasmid… Ngoài ra, ADN của một số hàng phage cũng được thiết kế để tạo
thành một số vector như EMBL3, M13, �GEM 13, �GT 11…Trong một số trường hợp sự cần
thiết phải có vector có khả năng mang những đoạn ADN chèn kích thước lớn, người ta đã cải tạo
để hình thành một số vector nhân tạo khác như cosimd (sự kết hợp giữa plasmid và phage) hay
YAC (cải tạo từ nhiễm sắc thể nấm men) hay vector từ virus của tế bào sinh vật nhân thực.
Việc lựa chọn vector nhân dòng một gen cụ thể nào đó thường được xem xét nhiều yếu tố
kéo theo như: Trình tự nhận biết enzyme giới hạn, khả năng nhân dòng phụ, gen chỉ thị, cách

24
thức chọn lọc dòng, sự phù hợp điểm sao chép… Người nghiên cứu cần xem xét các yếu tố liên
quan trước khi chọn một vector thích hợp cho việc nhân dòng.
3.2.3. Phản ứng cắt với sự tham gia của enzyme cắt hạn chế
Có thể nói enzyme giới hạn là những công cụ thực thụ để cắt các ADN. Việc cắt này xảy
ra ở một vùng đặc biệt được nhận biết bởi enzyme. Mỗi một enzyme nhận biết một đoạn
nucleotide khác nhau rất đặc hiệu đối với nó và được gọi là trình tự nhận biết (chuỗi đích) hay
đoạn đọc ngược xuôi.
Đặc trưng quan trọng nhất của các trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc đối xứng nghịch
đảo (palindromic), nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau khi chúng được đọc theo
chiều 5’ đến 3’ ở mỗi sợi đơn. Các trình tự nhận biết của enzyme giới hạn được cấu tạo từ 4 đến
6 nucleotide.
Các kiểu cắt của enzyme cắt hạn chế:
- Cắt đầu bằng: Một số enzyme giới hạn tạo vết cắt trên phân tử ADN ngay chính giữa
trình tự đối xứng nghịch đảo, tạo ra hai đoạn ADN đầu bằng. Sau khi cắt, hai đầu khó tự kết hợp
lại.
- Cắt đầu dính (đầu lệch): Cắt bên này và bên kia của tâm đối xứng để tạo ra hai đầu lệch
nhau một vài nucleotide. Trong trường hợp này, các đầu dính bổ sung có thể bị bắt cặp trở lại.
Như vậy, khi các ADN khác nguồn nhưng cùng có chứa trình tự nhận biết đặc hiệu của một
enzyme giới hạn, sau khi bị cắt sẽ có các đầu dính bổ sung giống nhau nên các đoạn ADN khác
nguồn có thể nối lại để tạo ra những phân tử lai. Đây là cơ sở của phương pháp tạo dòng gen, một
phương pháp thúc đẩy sự phát triển của công nghệ di truyền.
- Số lượng cắt
Một enzyme giới hạn có khả năng thao tác trên toàn bộ chiều dài của một phân tử ADN.
Số lượng đoạn cắt phụ thuộc vào chuỗi đích của một enzyme giới hạn có trên phân tử ADN mà
nó thao tác. Sử dụng enzyme giới hạn khác nhau, sẽ bị cắt khác nhau và tạo ra lượng đoạn cắt
khác nhau.
Nếu trong một chuỗi ADN có năm trình tự nhận biết của một enzyme giới hạn thì enzyme
đó sẽ cắt tại năm điểm trên phân tử ADN đó. Khi đó, ta sẽ được năm đoạn nếu ADN dạng vòng
và ta sẽ được sáu đoạn nếu ADN dạng thẳng.
Các enzyme này gặp chuỗi đích của nó trên phân tử ADN và cắt ADN thành hai mảnh
dạng đầu bằng hay đầu dính. Hiệu quả cắt của enzyme giới hạn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác
nhau như hàm lượng enzyme, nhiệt độ, ion kim loại, môi trường điện, pH và độ tinh khiết của
ADN.
3.2.4. Tạo plasmid tái tổ hợp với sự có mặt của ADN ligase
Bước tiếp theo của kĩ thuật di truyền là nối các đoạn ADN vào vector chuyển gen để tạo
plasmid có mang ADN lạ. Phản ứng nối được thực hiện nhờ enzyme ADN ligase. ADN ligase là
một enzyme xúc tác các phản ứng nối thành hai mảnh ADN bằng cách tạo cầu nối
phosphodiester giữa đầu 5’(P) và đầu 3’(OH) của hai nucleotide đứng cạnh nhau. Trong sinh học
phân tử, người ta coi ADN ligase như một chất keo phân tử để kết dính các mẫu ADN lại với
nhau.

25
 - Nối đầu bằng:
Nối đầu bằng được xảy ra khi hai đoạn ADN đầu bằng đứng cạnh nhau. Dưới tác dụng của
enzyme ligase, liên kết phosphodiester giữa đầu 5’(P) và đầu 3’(OH) được hình thành và hai
nucleotide được nối lại với nhau. Khả năng nối hai đoạn ADN đầu bằng rất thấp. Để tăng hiệu
suất phản ứng, người ta thường phải tăng nồng độ của các đoạn ADN.
- Nối đầu lệch:
Đầu tiên, hai mảnh ADN đầu lệch do có những nucleotide bổ sung nên chúng tiến lại gần
nhau để tạo liên kết hydro giữa các nucleotide nitơ bổ sung. Sau đó, hai nucleotide của hai đầu
nối tạo liên kết phosphodieste giữa OH(3’) và P(5’) dưới tác dụng của enzyme ligase.
Để phản ứng nối diễn ra thuận lợi, người ta thường xử lí vector và đoạn chèn để phản ứng
nối diễn ra tối ưu nhất. Điều kiện tiên quyết là đoạn chèn và vector đều phải được cắt cùng một
loại enzyme giới hạn để tạo ra các vết giống nhau. Người ta có thể sử dụng đoạn nối (đoạn
oligonucleotide khoảng 10-15 nucleotide) để tạo đầu dính có trình tự nhân biết đối với các cADN
bằng cách ủ đoạn nối với chuỗi ADN đích, sau đó cắt ADN bằng enzyme giới hạn để tạo ra đoạn
chèn có trình tự phù hợp với vector.
Ngoài ra, các đoạn chèn và vector có thể được methyl hóa đầu cắt, giúp làm giảm khả
năng tự nối của chúng, hoặc cắt bằng hai enzyme giới hạn có trình tự nhận biết cách xa nhau.
Hiệu quả phản ứng nối còn phụ thuộc vào nồng độ enzyme, tỷ lệ giữa các đoạn chèn và
vector. Theo các nhà nghiên cứu, tỷ lệ đoạn chèn và vector để có tỷ lệ tối ưu nhất là khoảng 3:1.
- Phương pháp sử dụng enzyme terminal transferase:
Nguyên tắc: Dựa vào đặc tính của enzyme terminal transferase có khả năng gắn kết cùng
một loại nucleotide vào đầu 3’(OH) của phân tử ADN. Cách tạo ADN tái tổ hợp bằng phương
pháp này được tiến hành theo bốn bước sau:
+ Bước 1: Chọn và phân lập ADN lạ đầu bằng và plasmid, giả sử ta phân lập plasmid có
chứa chuỗi đích được nhận biết bởi enzyme BamH I (G/GATCC). Cắt ADN lạ bằng enzyme
exonulcease theo hướng 5’→ 3’ đển tạo ADN có hai đầu lệch nhau.
+ Bước 2: Ủ ADN lạ với cùng một loại nucleotide dCTP với sự có mặt của enzyme
terminal transferase để tạo đuôi polyC ở đầu 3’(OH) của ADN lạ. Ủ plasmid với cùng một loại
nucleotide dGTP với sự có mặt của enzyme terminal transferase để tạo đuôi polyG ở đầu 3’(OH)
của plasmid hở.
+ Bước 3: Đưa ADN lạ vào plasmid với sự có mặt của enzyme ADN ligase, các đầu mút
của homopolymer có trình tự bổ sung (---GGGG 3’/3’CCCC----) sẽ bắt cặp với nhau.
+ Bước 4: Bổ sung enzyme ADN-polymerase I để gắn các nucleotide tương ứng vào chỗ
trống theo nguyên tắc bổ sung. Enzyme ligase nối liên kết phosphodiester và cuối cùng tạo được
plasmid tái tổ hợp có hai chuỗi đích được nhận biết bởi enzyme BamH I.
Ưu điểm của phương pháp là ghép ADN lạ đầu bằng vào plasmid để tạo ADN tái tổ hợp
và chế tác được ADN đầu lệch từ ADN đầu bằng.
3.2.5. Đưa plasmid tái tổ hợp vào tế bào
Có các phương pháp sau:

26
 a. Biến nạp
- Hóa biến nạp:
Theo MADNel và Higa, E.coli trở nên rất dễ bị biến nạp bởi ADN ngoại lại khi chúng
được xử lí trong môi trường có CaCl2 và trước đó được sốc nhiệt ở 42oC.
Hóa biến nạp là phương pháp sử dụng chất hóa học, tạo điều kiện để đưa vector tái tổ hợp
vào tế bào chủ. Quá trình được thực hiện theo hai bước sau: Xử lí tế bào chủ trong dung dịch
CaCl2 ở nhiệt độ thấp nhằm để thay đổi màng tế bào và ủ vector tái tổ hợp với tế bào chủ đã xử lí.
Hiệu suất của phương pháp hóa biến nạp này vào khoảng 105 đến 106 tế bào nạp trên 1 mg
ADN tái tổ hợp. Qua các kết quả thực nghiệm, người ta thấy rằng các tế bào phát triển ở pha sớm
đến pha giữa dễ được biến nạp hơn. Những nghiên cứu sau này cho thấy việc xử lý tế bào bằng
các ion kim loại hóa trị hai như Mg+2, Mn+2 và Ba+2 cũng cho khả năng biến nạp lớn. Ngoài ra,
hiệu suất biến nạp còn phụ thuộc vào kích thước của plasmid, plasmid càng nhỏ thì hiệu suất biến
nạp càng cao.
- Điện biến nạp:
Nguyên tắc: Sử dụng dòng điện cao thế cục bộ theo xung để tạo điều kiện cho tế bào hấp
thụ ADN tái tổ hợp được thực hiện dễ dàng.
Hiệu suất: Từ 109 đến 1010 tế bào biến nạp cho 1 mg ADN tái tổ hợp, tuy nhiên, lượng tế
bào biến nạp bị chết nhiều khi có lên tới 70%. Hiệu suất của phương pháp này phụ thuộc vào các
yếu tố sau:
+ Độ mạnh của điện trường tác động khác nhau đối với các loại tế bào khác nhau.
+ Độ dài của hằng số thời gian (thời gian ngắt xung – ms). Theo nhiều nghiên cứu, ở phần
lớn loại tế bào sinh vật, hiệu quả biến nạp cao khi hằng số thời gian đạt được khoảng 6 ms.
+ Nồng độ tế bào chủ
+ Nồng độ ADN tái tổ hợp
+ Giai đoạn phát triển của tế bào (tế bào quá già hoặc quá non đều không thích hợp)
+ Môi trường dung dịch đệm
+ Cấu trúc màng tế bào
b. Biến nạp tế bào trần (protoplast)
Là phương pháp chuyển ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ đã được xử lý bằng polyetylen
glyco (PEG) với nồng độ 30% đến 40%. Đây là phương pháp chuyển gen có hiệu quả cao đói với
tế bào thực vật, các cây mang gen biến nạp ổn định và di truyền qua nhiều thế hệ (Potrykus và
cộng sự - 1995).
Ưu điểm: Tần số biến nạp cao. Có thể chuyển gen vào tế bào trần của bất kỳ loại cây nào.
Đặc biệt là loại cây có giá trị kinh tế cao như lúa, ngô, đại mạch,…
Nhược điểm: Việc tái sinh cây từ tế bào trần còn khó khăn ở một số loài cây.
c. Phương pháp súng bắn gen
Nguyên tắc: Người ta sử dụng hạt kim loại nặng được bao bọc trong ADN và bắn trực tiếp
vào trong tế bào.
27
 Ưu điểm: Phương pháp này có thể biến nạp cho tất cả các loài tế bào thực vật, thao tác dễ
dàng.
Nhược điểm: Hiệu suất biến nạp thấp, thường xuyên nhận được cây biến nạp khảm ( cây
có tế bào biến nạp và tế bào không biến nạp).
d. Phương pháp vi tiêm
Phương pháp vi tiêm là phương pháp sử dụng vi kim và kính hiển vi để đưa ADN tái tổ
hợp vào mỗi tế bào nhất định. Đây là quá trình lai ghép cho tế bào bậc cao hoặc tế bào hợp tử.
Tùy thuộc vào từng trường hợp cụ thể, người ta có thể chọn phương pháp sao cho việc đưa ADN
tái tổ hợp vào tế bào có hiệu quả cao.
Ưu điểm: Có thể tối ưu lượng ADN tái tổ hợp đưa vào tế bào và quyết định đưa ADN vào
loại tế bào nào. Đưa chính xác hoặc thậm chí vào tận nhân của tế bào và có thể quan sát được.
Các tế bào có cấu trúc nhỏ như hạt phấn, tế bào tiền phôi cũng có thể tiến hành một cách chính
xác. Có thể biến nạp cho mọi giống cây.
Nhược điểm: Một lần tiên chỉ được một tế bào và thao tác cần phải khéo léo tỉ mỉ.
e. Tải nạp
Tải nạp là hiện tượng chuyển vật liệu di truyền qua vector là virus từ vi khuẩn cho sang vi
khuẩn nhận, trong đó có quá trình chuyển gen và tái tổ hợp gen ở vi khuẩn nhờ thực khuẩn thể
(Bacteriophage).
Thực nghiệm đã chứng minh được tải nạp ở E.coli qua phage λ, phage P1 và ở Bacillus
subtilis qua phage SP10. So với các phương pháp trên, tải nạp có hiệu suất cao hơn. Như vậy,
đến nay đã có nhiều phương pháp hóa học, hóa lý, cơ học và sinh học để đưa ADN tái tổ hợp vào
tế bào chủ. Tùy các đối tượng và các yêu cầu cụ thể, phương pháp này hay phương pháp khác có
hiệu quả và được sử dụng nhiều hơn.
3.2.6. Chọn lọc dòng tái tổ hợp
a. Phương pháp lai axit nucleic
Để thực hiện phương pháp lai axit nucleic, người ta cần sản xuất sợi đánh dấu (probe) để
lai với gen đích nhằm chọn lọc dòng tái tổ hợp. Các sợi đánh dấu thường là các đoạn
oligonucleotide ngắn, có đánh dấu nhận biết ở một đầu để phát hiện.
Các phân tử cADN là các đoạn đánh dấu có hiệu quả, được sử dụng khá phổ biến. Nếu
chuỗi ADN chưa biết trình tự, người ta phải tinh sạch một lượng nhỏ protein tương ứng với ADN
đã nghiên cứu và từ đó tổng hợp đoạn đánh dấu. Còn nếu phân tử ADN đã biết trình tự thì công
việc dễ dàng hơn nhiều.
Dựa vào khả năng biến tính khi nhiệt độ tăng và hồi tính khi hạ nhiệt độ từ từ của ADN để
tiến hành lai.
b. Phương pháp sử dụng kháng thể
Người ta dựa vào phản ứng đặc trưng của một số protein kháng thể để có thể nhận biết
được các phân tử lai thông qua các chỉ thị màu, phản ứng kết tủa…

28
 Phương pháp này chủ yếu sử dụng trong y học với hai yêu cầu sau: ADN cần nghiên cứu
được gắn vào vector phải biểu hiện protein khi tạo dòng và đồng thời, vector tạo dòng phải là
vector biểu hiện (ví dụ như vector λgt11). Protein biểu hiện cần phải có kháng thể đặc trưng.
c. Phương pháp phát hiện nhờ mất hoạt tính do đoạn chèn
- Nguyên tắc:
Dựa vào sự mất khả năng kháng thuốc của vi khuẩn mang vector tái tổ hợp khi chúng
được nuôi cấy trong môi trường kháng sinh. Phạm vi sử dụng: Phương pháp này dùng cho vector
có từ hai gen kháng thuốc trở lên, ví dụ như vector pBR322. Trong plasmid pBR322 có hai gen
kháng thuốc AmpR và TetR. Trên các gen này có những điểm nhận biết của các enzyme giới hạn
– vị trí chèn các đoạn ADN từ vật cho (đoạn chèn). Khi gắn ADN đoạn chèn vào một trong hai
gen nói trên thì gen nhận đoạn cài mất khả năng kháng thuốc, chứng tỏ những khuẩn lạc đó có
chứa gen cần tạo dòng.
Ngoài ra, sự phân biệt dòng tái tổ hợp với dòng gốc được thực hiện bằng các kỹ thuật vi
sinh vật với các dấu hiệu chỉ thị về di truyền phân tử. Hầu hết các vector đều được thiết kế với
các tiêu chí riêng biệt để có thể chọn lọc dòng hiệu quả. Có ba kiểu chọn lọc dòng.
- Chọn lọc âm tính:
Sự chọn lọc âm tính là việc sử dụng sự mất hoạt tính kháng kháng sinh của vector. Đối với
các vector này thường được thiết kế với hai vị trí có chứa gen kháng kháng sinh khác nhau. Khi
nhân dòng gen vào vị trí có chứa gen kháng kháng sinh, đặc tính kháng của vector sẽ bị mất.
- Chọn lọc lưỡng tính:
Nhân dòng vào vector chứa gen β-galactosidase. Gen nhân dòng được nối vào vị trí chứa
gen β-galactosidase và làm mất hoạt tính của nó. Khi nuôi cấy trên môi trường, cả hai dòng tái tổ
hợp và các dạng gốc đều phát triển, tuy nhiên, ở dạng tái tổ hợp, gen tổng hợp β-galactosidase bị
đột biến và các khuẩn lạc không có màu xanh. Vì thế, các khuẩn lạc có màu xanh bị loại bỏ.
- Chọn lọc dương tính:
Trong vector có chứa gen gây độc với tế bào và quá trình nhân dòng chèn gen nghiên cứu
là biến tính gen gây độc. Từ đó, thể tái tổ hợp được phát triển, còn thể dại bị chết.
3.2.7. Phân tích dòng tái tổ hợp
Mục tiêu của bước này là chọn lọc sản phẩm tái tổ hợp có đầy đủ trình tự của gen nhân
dòng với các chức năng đầy đủ. Thông thường, đọc trình tự là giải pháp hữu hiệu cho việc xem
xét các yếu tố đi kèm với gen nhân dòng như: mã mở đầu, mã kết thúc, khung đọc mở, đột biến
điểm… Tuy nhiên, để tiết kiệm chi phí, người ta sẽ tiến hành sàng lọc sơ bộ trước khi đọc trình
tự các mẫu thu được sau quá trình chọn lọc dòng. Trình các bước phân tích dòng như sai:
- Điện di trên gel agarose: Bước này nhằm chọn được các plasmid tái tổ hợp chứa đoạn
gen chèn có kích thước tương đương với kích thước dự đoán. Dựa trên thông tin về kích thước
của đoạn chèn và kích thước của vector, chúng ta có thể chọn lọc được plasmid tái tổ hợp có kích
thước gần với thể tái tổ hợp mong đợi.
- Cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn: Các plasmid đã được chọn ở bước điện di
được cắt bằng các enzyme giới hạn đã sử dụng ở trên. Mục đích của bước này nhằm đánh giá khả

29
năng plasmid tái tổ hợp mang đầy đủ hai đầu của gen. Ở bước này, nếu gen nhân dòng được kích
hoạt bởi PCR, người ta cũng có thể sử dụng phản ứng PCR với cặp mồi đã sử dụng ở trên.
- Đọc trình tự: Như đã nói ở trên, đọc trình tự là kỹ thuật cho kết quả chính xác nhất và
nhiều thông tin nhất. Các plasmid tái tổ hợp đã chọn lọc qua hai bước trên sẽ được mang để đọc
trình tự nucleotide. Việc xác định trình tự giúp nhận biết chính xác kích thước, trình tự sắp xếp
nucleotide trong gen đích.
3.3. Ứng dụng của plasmid tái tổ hợp
3.3.1. Công nghệ DNA tái tổ hợp với việc nghiên cứu bộ gene
Việc tách dòng tái tổ hợp cho phép nhận được một số lượng lớn bất kỳ gene hoặc vùng
điều hoà nào để tiến hành phân tích trình tự nucleotide, xác định các vùng chức năng và chỉ ra
các cơ chế hoạt động của chúng. Nhờ đó đã đưa lại những hiểu biết mới về tổ chức và hoạt động
của các bộ gene prokaryote (như các khởi điểm tái bản, các vùng điều hoà phiên mã, các gene …
và ở các bộ gene eukaryote (như các centromere, telomere, các gene phân đoạn, các gene giả,
DNA lặp lại …
Bằng các thí nghiệm tạo dòng plasmid tái tổ hợp kinh điển ở vi khuẩn E. coli, và bằng
cách cải tiến sử dụng nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo này (yeast artificial chromosome = YAC;
hình 10.7), người ta đã thành lập các thư viện gene (gene library) hay thư viện bộ gene (genomic
library) để trên cơ sở đó tiến hành lập bản đồ vật lý (physical map) và xác định trình tự DNA bộ
gene của nhiều sinh vật khác nhau, kể cả bộ gene người (NHGRI 2005). Nếu như vào năm 1977,
F.Sanger xác định đầy đủ các trình tự phage φX174 (5386 nucleotide với 9 gene) và phage G4
(5577 cặp nucleotide với 10 gene), thì đến nay người ta xác định và lập bản đồ cho các DNA có
kích thước lớn hơn nhiều; ví dụ: bộ gene phage lambda gồm 48.502 cặp base với khoảng 61 gene
(1983), nhiễm sắc thể số 3 của nấm men Saccharomyces cerevisiae gồm 370.000 cặp base (1992)
v.v... Đáng kể là, Dự án Bộ gene Người (Human Genome Project = HGP; hình 10.8) đã chính
thức đi vào hoạt động từ 1990 do James Watson chủ trì cùng với sự cộng tác của nhiều nhà khoa
học trên thế giới. Việc phân tích trình tự bộ gene người đã được hoàn thành vào 4/2003, cho thấy
bộ gene (genome) của chúng ta có trình tự đầy đủ gồm 3.164.700.000 cặp base, chứa đựng
khoảng 25.000 gene mã hóa protein chịu trách nhiệm xây dựng nên một bộ protein (proteome)
gồm khoảng 50.000 protein khác nhau trong các tế bào. HGP thực sự là một trong những kỳ công
thám hiểm vĩ đại nhất trong lịch sử; lần đầu tiên HGP cho phép chúng ta đọc được toàn bộ thông
tin di truyền của tự nhiên đã làm nên con người (NHGRI 2005).
3.3.2. Sử dụng plasmid tái tổ hợp để sản xuất sinh khối
Để sản xuất sinh khối, các vector biểu hiện mang các gen ngoại lai mong muốn có thể
thực hiện sự phiên mã các bản sao tạo dòng và sự dịch mã các mARN của chúng trong tế bào vật
chủ. Những vector như thế dược dùng để biểu hiện các gen của sinh vật nhân thực trong E.coli
hoặc tăng hiệu suất các sản phẩm của gen ở sinh vật nhân sơ. Mặc dù E. coli không phải là một
vật chủ lý tưởng để biểu hiện các gen của eukaryote do chúng không có khả năng sửa đổi hậu
dịch mã cho các chuỗi polypeptide của các protein có cấu trúc phức tạp. Tuy nhiên, trong một số
trường hợp người ta vẫn có thể sử dụng vi khuẩn E. coli cho những protein có cấu trúc đơn giản
hơn. Đối với những protein có cấu trúc phức tạp, vật chủ thường được sử dụng là các sinh vật
nhân chuẩn (ví dụ: nấm men Saccharomyces cerevisiae, nấm mốc Aspergillusniger…) do chúng
có thể hậu dịch mã được.

30
 - Sản xuất các protein dung hợp: Protein dung hợp được mã hóa bởi một gen lai do sự
dung hợp in vitro hai đoạn gen khác nhau. Vì vậy, protein dung hợp sẽ mang trình tự axit amin
của hai protein khác biệt. Protein dung hợp có những đặc điểm sau:
+Thường được sản xuất với lượng lớn do sự khởi đầu phiên mã và dịch mã được điều
khiển bởi các trình tự tiêu chuẩn của vật chủ.
+ Có khối lượng phân tử lớn hơn so với hầu hết các protein của vật chủ và vì thế dễ dàng
nhận biết khi điện di bằng gel polyacrylamide. Từ đó, băng protein dung hợp có thể được cắt ra
khỏi gel, đông khô (lyophilize) sau đó nghiền thành bột và dùng như một kháng nguyên.
+ Có thể được tiết ra môi trường nhờ biểu hiện của vật chủ nếu gen của sinh vật nhân thực
được gắn với trình tự mã hóa cho peptide tín hiệu (signal peptide), khi đó, peptide sẽ này tạo ra
sự chuyển dịch qua màng. Tuy nhiên, hiện tượng này chỉ xảy ra ở một vài trường hợp.
Hiện nay, dựa vào một số gen chỉ thị riêng biệt, người ra đã thiết kế hệ thống vector biểu
hiện cùng với protein dung hợp tương ứng như họ pUR, pET system với các protein dung hợp
tương ứng như LacZ,CDB, His.tag hay GTS.
3.3.3. Sử dụng plasmid tái tổ hợp để chuyển gen
Trong chuyển gen, người ta không thể chuyền trực tiếp một gen đích từ cơ thể này sang cơ
thể khác. Quá trình đó cần có dạng trung gian, đó là plasmid tái tổ hợp. Tùy vào đối tượng vật
chủ, người ta thiết kế các vector tương ứng để tạo plasmid tái tổ hợp – làm thể truyền để chuyển
vào vật chủ.
3.3.4. Sử dụng plasmid tái tổ hợp trong liệu pháp gen
Liệu pháp gen là phương pháp chữa bệnh bằng cách đưa các gen cần thiết (gen liệu pháp)
nhằm mục đích chữa bệnh. Các gen có chức năng sử dụng vào điều trị được dùng để điều trị bệnh
cho con người. mỗi loại gen liệu pháp có đặc điểm và chức năng riêng. Các gen liệu pháp có thể
là các gen còn nguyên vẹn để thay thế gen bị hỏng. Gen liệu pháp cũng có thể là gen mã hóa cho
một protein đặc hiệu nhằm tạo ra các protein đặc hiệu giúp ức chế, kìm hãm gen gây bệnh hoặc
hìm hãm sự tăng sinh quá nhanh của tế bào, hoặc cũng có thể gây chết tế bào gây bệnh. Ngoài ra,
các gen ức chế, gen hìm hãm, gen phục hồi, gen đột biến cũng được sử dụng như là gen liệu pháp.
Liệu pháp gen có hai nhóm cơ bản đó là liệu pháp gen soma và liệu pháp gen tế bào mầm.
Các phương pháp điều trị nhằm thay tế gen bị hỏng, gen bệnh của các tế bào soma, giúp cơ thể
sống bình thường được xem là liệu pháp gen soma (somatic gene therapy). Liệu pháp gen tế bào
mầm (germline gene therapy)là phương pháp điều trị, chữa, thay thế tế bào hỏng cho các giao tử
nhằm tạo ra thế hệ sau bình thường.
Theo quy định của nhiều quốc gia thì điều trị bằng liệu pháp gen cần tuân thủ một số
nguyên tắc sau:
- Theo dõi và hiểu biết cặn kẽ quá trình phát sinh bệnh, cơ chế phát sinh bệnh và tính di
truyền của bệnh.
- Nắm vững cấu trúc và chức năng của gen gây bệnh, gen hỏng, gen đột biến… đồng thời
nắm vững cấu trúc, chức năng của gen liệu pháp dùng thay thế.
- Dự đoán hiệu quả của liệu pháp. Nếu hiệu quả cao mới được áp dụng, đặc biệt là liệu
pháp cho tế bào mầm.

31
 - Cần có thử nghiệm chặt chẽ trước khi tiến hành trên cơ thể người. Chỉ áp dụng khi có
hiệu quả cao lặp lại trên đối tượng thử nghiệm.
Thách thức của liệu pháp gen
Nhiều nhà nghiên cứu nhận thấy ưu thế của liệu pháp gen và đã nỗ lực tham gia vào phát
triển các ứng dụng liệu pháp này cho liệu trị các ca bệnh di truyền dòng mầm hiếm gặp. Tuy
nhiên, liệu pháp gen là một ngành khoa học mới, thời gian phát triển còn rất ngắn. Do kỹ thuật
đưa một gen lạ vào tế bào và cơ thể người rất phức tạp và con người vẫn chưa làm chủ hoàn toàn
được vị trí gắn của gen mới, nên có thể gây những hậu quả không mong muốn như kích hoạt gen
tiền ung thư, gen lão hóa, hoặc gây đột biến một gen bình thường khác… vì thế, các nhà nghiên
cứu về liệu pháp gen phải giải quyết ba thách thức lớn:
- Vector vận chuyển ADN: ADN là một phân tử lớn mang điện tích âm và việc vận
chuyển nó xuyên qua màng tế bào và màng nhân của tế bào động vật là không dễ dàng. Mặt khác,
nếu chuyển gen hiệu quả, việc xuất hiện một lượng lớn tế bào ở bất kỳ cơ quan mục tiêu nào
cũng đều tiếp nhận gen ngoại lai. Sự tiếp nhận bao nhiêu gen là vừa đủ đảm bảo cho tế bào tránh
stress, gây độc tính là một thách thức lớn cho các nhà khoa học. Giải pháp hiện nay là tìm các
vector chuyển gen an toàn, đặc biệt là các vỏ virus đã bị bất hoạt các gen độc để vận chuyển gen
mục tiêu. Các virus có ưu điểm là dễ dàng xâm nhập qua hệ thống tế bào chất để vào nhân, đưa
gen mục tiêu cần chuyển vào tế bào nhận.
- Truyền tải đúng chức năng: Việc đưa ADN vào tế bào đích sẽ không có giá trị trừ khi
đoạn ADN này được phiên mã thành ARN và dịch mã thành protein sản phẩm mong muốn. Nếu
vector có nguồn gốc từ virus được thiết kế để tích hợp vào một nhiễm sắc thể người (nhằm tránh
trường hợp đoạn ADN tồn tại tự do), thì vị trí tích hợp mang tính quyết định. Có nhiều trường
hợp, đoạn ADN đưa vào thành công nhưng lại bị bất hoạt bởi các cấu trúc bên cạnh, hoặc đưa
vào không đúng vị trí của các promotor hoặc enhancer… Nhưng nếu ADN không được gắn vào
nhiễm sắc thể, nồng độ ADN sẽ bị pha loãng trong quá trình phân bào, và hiệu quả liệu pháp sẽ
không có.
- Đáp ứng miễn dịch: Các vius được coi là một phương tiện hiệu quả trong việc truyền tải
ADN, nhưng cũng mã hóa cho các protein lạ và các protein này được hệ miễn dịch nhận diện rất
nhanh. Mặc dù có nhiều nỗ lực lớn trong việc cải tiến lại virus nhằm thoát khỏi sự nhận diện, tuy
nhiên hệ miễn dịch thường tìm ra quy luật và tìm để phá hủy các tế bào biểu hiện gen điều trị.
Ngày nay, liệu pháp gen thực hiện trên tế bào gốc (liệu pháp tế bào gốc), đặc biệt là quá
trình hoàn góc của tế bào soma (liệu pháp iPS) đã phần nào khắc phục được các thách thức trong
quá trình thực hiện liệu pháp gen.
Triển vọng cho tương lai
Hiện nay, liệu pháp gen đang ngày càng được ứng dụng trong điều trị và chữa bệnh có
hiệu quả. Tùy theo loại bệnh, nguyên nhân của bệnh và mức độ biểu hiện của bệnh cần sử dụng
các biện pháp cụ thể khác nhau để đảm bảo hiệu quả của liêu pháp gen. Cùng với sự xuất hiện
của tế bào gốc cảm ứng (iPS), một số chiến lược của liệ pháp gen này đang được các nhà khoa
học quan tâm là:
- Thay thế gen.
- Tăng cường hiệu quả hoạt động của gen.

32
 - Sửa chữa gen.
- Tiêu diệt các tế bào đích nhờ sản phẩm đặc hiệu của gen liệu pháp.
- Ức chế biểu hiện của các gen hỏng ở tế bào đích.
4. ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ GEN VỚI SẢN XUẤT VÀ ĐỜI SỐNG
4.1. Nhận biết cá thể bằng phân tích ADN
Nền tảng của phân tích ADN xác định cá thể là sự đặc trưng về trình tự sắp xếp các
nucleotide trên chuỗi polynucleotide. Các nhóm cá thể có chung nguốn gốc thường có sự tương
đồng nhất định về trình tự sắp xếp cũng như về thành phần và số lượng nucleotide tạo nên tính đa
hình về di truyền của sinh vật. Sự đa hình có thể xem xét dưới những khía cạnh sau:
- Đa hình theo trình tự: Các nucleotide được sắp xếp ngẫu nhiên ở các cá thể khác nhau.
Ví dụ: Ở cá thể thứ nhất có trình tự: ATTGGCCCTCTTC
Ở Cá thể thứ hai có trình tự: ATGGGCCTCTCC
Như vậy, ở vị trí thứ ba và vị trí thứ mười có sự khác biệt về loại nucleotide.
- Đa hình về chiều dài: Có một đoạn lặp lại với tần số khác nhau của một số nucleotide
trên chiều dọc của gen hoặc của phân tử ADN.
Ví dụ: Ở cá thể thứ nhất có năm đoạn lặp lại ATAT, nhưng cá thể thứ hai chỉ có ba đoạn
lặp lại ATAT.
Những trạng thái khác nhau này biểu hiện thành trạng thái alen của mỗi locus gen. Trong
điện di ADN, các alen thể hiện là các băng điện di ở vị trí khác nhau trên bảng gel. Nếu hai alen
của một locus có trình tự hoàn toàn giống nhau thì cá thể đó là đồng hợp tử và thể hiện 1 băng
trên gel và ngược lại. Trong quá trình tiến hóa của sinh vật, do xuất hiện nhiều đột biến nên dẫn
đến sự tồn tại của nhiều trình tự hoặc tần số lặp lại khác nhau, hình thành các alen khác nhau của
cùng một locus.
Do sự đa dạng của các alen trong từng locus nên người ta đã phải xây dựng thang alen cho
tùng locus. Tahnh alen là thước đo chuẩn cho các trạng thái của một locus và rất cần thiết để định
danh cho từng alen. Thang alen có tầm quan trọng lớn trong việc xác định chính xác kiểu gen của
mẫu phân tích.
4.2. Công nghệ gen trong phân loại sinh vật
Sự tổng hợp các chuỗi polypeptide trong tất cả cá hệ thống sống đều được thực hiện tại
các ribosome. Ribosome của vi khuẩn có khối lượng khoảng chừng 2.5 triệu Dalton, có hệ số
lắng 70S, trong đó protein chiếm 1/3 khối lượng, phần còn lại là acsc rARN. Tất cả ribosome
được hình thành từ hai tiểu đơn vị ribonucleoprotein có kích thước không bằng nhau. Ở vi khuẩn,
những tiển đơn vị này có hệ số lắng lần lượt là 50S và 30S. Có ba loại rARN tham gia cấu trúc
của các tiểu đơn vị là 5S,16S và 23S.
16S rARN ở E. coli có chiều dài khoảng 1.54 2ribonucleotide và tham gia cấu tạo tiểu đơn
vị nhở của ribosome. Tiểu đơn vị lớn của ribosome được cấu tạo từ hai loại rARN là 5S và 23S.
Từ năm 1967 ZuckecrkADN và Pauling đã đưa ra ý kiến cho rằng các phân tử sinh học có
thể là “tài liệu của lịch sử tiến hóa” hay “thước đo tiến hóa”. Để là một thước đo tiến hóa, phân tử
được chọn có các đặc điểm sau:
33
 - Phân tử đó phải có mặt ở tất cả các sinh vật khảo sát.
- Phân tử không được truyền qua lại giữa các loài.
- Trình tự của phân tử này phải có độ bảo toàn và biến động thích hợp trong khoảng cách
tiến hóa khảo sát.
- Phải có kích thước đủ lớn để chứa nhiều thông tin. Mặc dù, các tARN phải có mặt ở hầu
hết các vi sinh vật nhưng chúng không được chọn làm thước đo tiến hóa do kích thước của chúng
quá nhỏ (khoảng 75 ribonucleotide).
Vào năm 1977, Woese và các cộng sự đã xác định được 16S rARN là phân tử thích hợp
làm thước đo tiến hóa. 16S r ARN là phân tử cổ, là thành phần của bộ máy tổng hợp protein có từ
lâu đời . Hơn nữa, các rARN là những phân tử có chức năng không thay đổi, phân bố ở hầu hết
cá hệ thống sống và có độ bảo tồn vừa phải, cho phép phản ánh sự liên quan tiến hóa giữa các
loài sinh vật.
Ba loại rARN là thành phần của ribosome đều có một số tính chất để có thể làm thước đo
tiến hóa. Tuy nhiên, 5S rARNcó kích thước quá nhỏ (khoảng 120 ribonucleotide), mang ít thông
tin của quá trình tiến hóa nên ít được chọn. 23S rARN là phân tử lớn (khoảng 2900
ribonucleotide), có đầy đủ các tính chất để có thể làm thước đo tiến hóa. Tuy nhiên kích thước
của 23S rARN lớn nên thao tác nghiên cứu trên phân tử này không thuận lợi. Vì thế, phân tử 16S
rARN được chọn lựa như là một thước đo tiến hóa phổ biến và hiệu quả. Để tránh các rủi ro
trong thao tác với ARN, người ta đã chuyển việc so sánh 16S rARN bằng so sánh gen mã hóa
cho 16S rARN gọi là gen 16S. Cho đến nay, số lượng gen 16S đã được giải trình tự lên đến
khoảng 10.000.
4.3. Công nghệ gen trong chẩn đoán bệnh
Hiện nay có khoảng cách trên 4000 bệnh có nguồn gốc di truyền của người đã được xác
định và nhiều trong số bệnh đó đã được nghiên cứu bằng các phương pháp phân tích về biểu hiện
cấu trúc của gen liên quan đến bệnh đó. Một trong những phát hiện quan trọng là sử dụng
phương pháp đa hình chiều dài các đaon cắt giới hạn (RFLP) và giải trình tự ADN để chẩn đoán
bệnh.
4.4. Chẩn đoán bệnh rối loạn chuyển hóa
Nguyên lí của phương pháp là so sánh mẫu ADN của thai nhi với ADN của mấu bình
thường bằng phương pháp RFLP, từ đó phát hiện sai khác trong cấu trúc phân tử của mẫu phân
tích.
Ví dụ: Để chẩn đoán bệnh hồng cầu hình lưỡi liềm, người ta không lấy mẫu thửu trực tiếp
từ máu thai nhi mà dùng RFLP để phân tích đoạn ADN của tế bào dịch ối rồi so sánh với đoạn
ADN tương ứng của tế bào hồng cầu bình thường, từ đó phát hiện ra gen hỏng. Phương pháp này
an toàn mà không gây hại cho thai nhi.
4.4.1. Chẩn đoán ung thư
Ung thư là một căn bệnh nan y gây tử vong cao. Một số dạng ung thư phổ biến như:
- Carcinoma: Là dạng ung thư xuất phát từ tế bào lá phôi trong và lá phôi ngoài. Các loại
ung thư này gồm ung thư phổi, ung thư vú, ung thư thực tràng,…

34
 - Sarcoma: Là dạng ung thư xuất phát từ tế bào có nguồn gốc từ lá phôi giữa. Các loại ung
thư này là ung thư sụn, ung thư mô liên kết, ung thư cơ.
- Lymphoma: Là dạng ung thư nguy hiểm, thường biểu hiện rất sớm, xuất phát từ tế bào
máu non của hệ tủy xương. Các loại ung thư này là ung thư bạch cầu cấp tính.
Ngày nay, người ta đã phát hiện ra có 3 nhóm gen liên quan đến quá trình phát sinh và
phát triển của ung thư đó là:
- Nhóm gen gây ung thư (oncogene): Đây là dạng đột biến của nhóm gen proto-oncogene
chịu trách nhiệm mã hóa cho các yếu tố phát triển và tăng trưởng tế bào. Các gen này có vai trò
trong sự điều hòa quá trình sinh trưởng và biệt hóa của tế bào. Nếu nhóm proto-oncogene bị rối
loạn, sự tăng sinh mất kiểm soát sẽ diễn ra.
- Nhóm gen ức chế oncogene: Nhóm gen này có vai trò ức chế các gen thuộc nhóm
oncogene. Một khi nhóm gen này bị đột biến, các Oncogene mất kierm soát và thúc đẩy sự tăng
sinh tế bào liên tục.
- Nhóm gen sửa chữa ADN (ADN repair gene): Chúng có vai trò sửa chwuax sai sót trong
quá trình tái bản của ADN tế bào. Hậu quả của việc các gen này mất hoạt tính là các sai hỏng
không được sửa chữa kịp thời, làm tăng đột biến, gây rối loạn chuyển hóa và phân chia của tế
bào.
4.4.2. Chẩn đoán bệnh do vi sinh vật gây nên
Trong việc phát hiện các tác nhân như virus, vi khuẩn, ký sinh trùng… việc sử dụng các
phương pháp sinh học phân tửu có nhiều thuận lợi so với các phương pháp chẩn đoán thông
thường vì:
- Giúp chẩn đoán nhanh, không cần qua công đoạn nuôi cấy. Chẳng hạn, để phát hiện
virus HIV người ta sử dụng phương pháp PCR và lai phân tử. Thời gian tối đa để phát hiện chỉ
cần một ngày. Trong khi đó, để nuôi cấy nhằm phát hiện tế bào cần ít nhất 3 tuần.
- Là biện pháp duy nhất để chẩn đoán các bệnh do virus hoặc vi khuẩn không thể nuôi cấy
do mức độ nguy hiểm hoặc điều kiện môi trường nhân tạo không cho phép.
- Tạo mẫu dò phân tử dễ dàng hơn việc tạo lập mẫu dò bằng kháng thể đơn dòng. Ngoài ra,
tính đặc hiệu của mẫu dò phân tử mềm dẻo hơn so vói kháng thể nên có thể phát hiện được nhiều
kiểu gen tác nhân gây bệnh.

II. CÂU HỎI, BÀI TẬP VẬN DỤNG

Câu 1: Thế nào là enzyme giới hạn? Chúng có những tính chất nào mà được coi là công cụ thiết
yếu đối với công nghệ ADN tái tổ hợp? Bằng hai ví dụ về enzyme giới hạn, hãy chứng tỏ rằng ít
nhất có hai phương pháp thành lập các phân tử DNA tái tổ hợp in vitro.
Câu 2: Có thể sử dụng các chất kháng sinh để xác định xem liệu plasmid pBR322 đã nhận được
một đoạn xen ở trong vị trí EcoRI của nó hay không? Tại sao, hoặc tại sao không?
Câu 3: Giả sử bạn cắt hai ADN khác nhau, một với BamHI và một với BglII, sau đó nối chúng
lại với nhau thông qua các đầu dính tương thích. Một khi đã khâu nối rồi, bạn có thể tách hai
ADN này lần nữa bằng một trong hai enzyme giới hạn đó hay không? Tại sao, hoặc tại sao không?

35
Câu 4: Giả sử bạn biến nạp một ADN tái tổ hợp cho một vi khuẩn và do nhầm lẫn, bạn đặt các tế
bào được biến nạp đó trên môi trường không có chất kháng sinh nào cả. Kết quả mà bạn quan sát
được là gì? Tại sao?
Câu 5: Giả sử rằng bạn chiết xuất được một enzyme cắt giới hạn từ loài vi khuẩn có tên khoa học
là Xenobacterium giganticus. Theo danh pháp đã học, bạn sẽ viết tên enzyme đó như thế nào?
Câu 6: Cho biết trình tự của một đoạn ADN có chứa một vị trí nhận biết đối xứng xuôi ngược
(palindromic recognition site) cho một enzyme giới hạn là GACGATATCAACT. Hãy tìm trình
tự của vị trí nhận biết đó.
Câu 7: Thế nào là phân tử ADN tái tổ hợp, vector tách dòng? Hãy nêu các bước của quy trình
tạo dòng gene tái tổ hợp và cho sơ đồ minh hoạ.
Câu 8: Giả sử tinh chế được plasmid pBR322 và phân tử ADN người có chứa một gene cần
nghiên cứu. Hãy phân tích kỹ thuật tạo dòng gene nói trên ở E. coli.
Câu 9: Enzyme phiên mã ngược là gì? Nó được tinh chế từ loại sinh vật nào và được ứng dụng
vào khâu nào trong công nghệ ADN tái tổ hợp? Giải thích và cho sơ đồ minh hoạ.
Câu 10: ( Đề thi HSG QG năm 2017)
Ở người, đa hình đơn nuclêôtit trong gen X, biểu hiện bởi cặp nuclêôtit A-T được thay thế
bằng G-X ở vị trí nuclêôtit 136 (kí hiệu là SNP A136G) trong vùng mã hóa, có thể được xác định
bằng phương pháp nhân bản ADN nhờ PCR kết hợp với cắt bằng enzim giới hạn. Alen kiểu dại
mang A-T ở vị trí 136 (kí hiệu là alen A) có 2 vị trí nhận biết của một enzim giới hạn (RE) tại các
vị trí nuclêôtit 136 và 240 trong vùng mã hóa. Alen đột biến mang G-X ở vị trí 136 (kí hiệu là
alen G) mất vị trí nhận biết của RE tại vị trí đó. Để nhân bản đoạn gen bằng PCR, người ta dùng
cặp đoạn mồi dài 25 bp gồm một đoạn mồi liên kết ngay trước vùng mã hóa và một đoạn mồi
liên kết sau vị trí nuclêôtit 550 (xem hình dưới).
Alen A
25 bp 136 bp 104 bp 310 bp 25 bp

Alen G

25 bp 240 bp 310 bp 25 bp

Chú thích: : Vị trí cắt của enzim cắt giới hạn.

: Cặp đoạn mồi; bp: Cặp bazơ.

Sản phẩm PCR sau đó được cắt hoàn toàn bởi RE và điện di trên gel agarôzơ để xác định
kiểu gen của mỗi cá thể.
a) Hãy nêu số lượng phân đoạn ADN và kích thước mỗi phân đoạn trên gel điện di thu được (đơn
vị bp) tương ứng với mỗi kiểu gen đồng hợp tử và dị hợp tử về các alen A và G.
b) Một nghiên cứu nhằm xác định mối liên quan giữa SNP A136G ở gen X với sự mẫn cảm dị
ứng phấn hoa cho thấy sự phân bố kiểu gen ở nhóm đối chứng và nhóm nghiên cứu như sau:
36
 Số lượng cá thể của mỗi kiểu gen
Nhóm cá thể Tổng số cá thể
AA AG GG
Nhóm đối chứng (không dị ứng phấn hoa) 108 144 48 300
Nhóm nghiên cứu (dị ứng phấn hoa) 156 212 72 440
Hãy xác định tần số kiểu gen và alen ở mỗi nhóm cá thể. Có thể kết luận gì về mối liên quan giữa
SNP A136G với sự mẫn cảm dị ứng phấn hoa? Giải thích.
Câu 11: (Đề thi HSG QG năm 2015)
Trong công nghệ tạo động vật chuyển gen, gen chuyển được gắn vào một vị trí (locut) trên
nhiễm sắc thể của tế bào động vật. Bằng phương pháp nào có thể tạo ra động vật có kiểu gen
đồng hợp về gen chuyển ?
Câu 12: Trong tế bào, hầu hết plasmid tồn tại dạng siêu xoắn. Trong khi đó, plasmid có thể trở
lại trạng thái tở xoắn khi sử dụng topoimerase IA. Người ta sử dụng enzyme cắt hạn chế R để cắt
và tạo dạng plasmid mạch thẳng. Và mạch thẳng của plasmid không được tạo vòng trở lại khi xử
lí phosphatase (AP) (Hình 1).

Trong một thí nghiệm, plasmid đã được xử lí với các loại enzyme cắt hạn chế khác nhau
(R , R và R ) dưới điều kiện như nhau. Sau đó, mẫu phản ứng được phân tách trên gel agarose
1 2 3
đồng thời với mấu không xử lí (P ) và marker chứa đựng các đoạn kích thước mạch thẳng của
0
ADN. Topoimerase IA và AP được xử lí cùng với R nhưng ống chứa mẫu bị lẫn (R +E và R
3 3 1 3
+E ) trên gel agarose. (Hình 2)
2

a) Hãy xác định các vị trí cắt hạn chế của R , R và R trên gel. Giải thích.
1 2 3

b) Xác định tên của E và E trong phản ứng xử lí cùng với R .

1 2 3

Câu 13: Một nhà nghiên cứu nhận được một plasmid tái tổ hợp từ một nhà nghiên cứu khác gửi
đến. Do thất lạc thông tin nên người nhận chỉ biết plasmid tái tổ hợp từ gen đích có kích thước
1500 cặp nucleotit và vector có kích thước là 3000 cặp nucleotit. Trên vector có chứa 3 vị trí cắt
giới hạn của 3 enzym là EcoRI, BamHI và HindIII. Để xác định vị trí nhân dòng của gen đích,
nhà nghiên cứu đã thực hiện một số phản ứng cắt và thu được kết quả như sau:
Enzym tham gia phản ứng Kích thước các đoạn thu được
EcoRI và BamHI 2000 cặp, 1500 cặp và 1000 cặp

37
EcoRI và HindIII 1800 cặp, 1500 cặp và 1200 cặp
BamHI và HindIII 3700 cặp và 800 cặp
EcoRI, BamHI và HindIII 1500 cặp, 1200 cặp, 1000 cặp và 800 cặp
Hãy xác định bản đồ cắt giới hạn của plasmid tái tổ hợp trên.
Câu 14: Dưới đây là bản gel điện di các mẫu ADN (ở hai locut thuộc 2 nhiễm sắc thể khác nhau)
của một người con, một người mẹ và bốn người đàn ông được nghi là cha của đứa bé (được kí
hiệu là A, B, C và D).

1) Giả sử locut 1 kí hiệu là M có tối đa 6 alen; locut 2 kí hiệu là N có tối đa 3 alen. Dựa
vào bản điện di này, hãy xác định số alen của mỗi locut và kiểu gen của mỗi người về 2 locut nói
trên.
2) Dựa vào hai locut gen trên, hãy cho biết những người nào không thể là cha của đứa bé?
Giải thích.
3) Giả sử ở trong quần thể người đang cân bằng di truyền, các alen trong mỗi locut nói
trên đều có tần số như nhau, việc xác định quan hệ bố con chỉ dựa vào hai locut nói trên, xác suất
để một người đàn ông bất kì thuộc quần thể này được khẳng định cha của đứa bé nói trên là bao
nhiêu?
Câu 15: Một nhà nghiên cứu được yêu cầu đánh giá độ tinh sạch của 3 enzim cắt giới hạn từ 3
công ty khác nhau (Công ty Antigen, Công ty Genomics, Công ty Expression). Các yếu tố nhiễm
bẩn của enzim EcoRI bao gồm exonuclease và phosphatase. Exonuclease cắt đoạn đầu dính từ
sản phẩm cắt giới hạn để tạo đầu bằng, trong khi đó enzim phosphatase loại bỏ nhóm phosphate
đầu 5’của sản phẩm cắt giới hạn. Sự đánh giá đã được thực hiện theo các bước sau:
Bước 1: Plasmid X chứa 2 vị trí cắt của EcoRI được ủ với EcoRI từ mỗi công ty để tạo ra
đầu cắt: 5’-G 5’-AATTC-3’
3’-CTTAA-5’ G’5’
Bước 2: Plasmid X từ bước 1 được nối lại bởi ADN ligase
Bước 3: Plasmid X đã nối lại được cắt thêm 1 lần nữa bởi EcoRI của từng công ty.
Nhà nghiên cứu chăc schawns rằng các phản ứng đã thực hiện rất tốt và không có phản ứng cắt
nào khác. Kết quả thu được ở mỗi bước trên được kiểm tra bằng điện di. Hình ảnh điện di như
hình dưới. Hãy phân tích kết quả thu được.

38
Câu 16: Một nhà nghiên cứu nhân dòng một trình tự mã hóa (coding sequence –CDS) của một
gen vào một vector rồi đặt tên plasmid tạo thành là pHB2017. CDS được chèn tại vị trí nhận biết
SacII nằm trong vùng MSC (multi cloning site) trong vùng gen lacZ của vector (Hình dưới).
CDS được chèn có vị trí cắt giới hạn PstI cách bộ ba kết thúc của nó là 0.8kb. Để xác định kích
thước và hướng của CDS đã được chèn, nhà nghiên cứu trên đã cắt plasmid này với enzym cắt
giới hạn khác nhau và sản phẩm cắt được trình bày ở hình dưới.

Nếu plassmid pHB2017 được cắt bởi hai enzym EcoRI và SpeI trong đệm Tango (EcoRI và
SpeI cắt ở mức tương ứng là 100% và 20%) thì thu được bao nhiêu đoạn cắt trên bản gel điện di?
(Giả sử không quan sát được các đoạn nhỏ hơn 50bp)
Câu 17: TP53 là gen ức chế ung thư nằm tại vị trí p13.3 của nhiễm sắc thể số 17, mã hóa protein
p53 - một protein trong nhóm điều hòa chu kỳ tế bào. Các nghiên cứu gần đây đã cho thấy một số
SNPs của gen TP53 có liên quan đến bệnh ung thư.
39
 Một trong những SNP được biết đến nhiều nhất là Arg72Pro, một SNP ở vị trí codon 72
trên exon 4 của gen TP53. Sự thay thế trình tự nucleotit tại codon 72 dẫn đến sự thay thế bộ ba
CGC (mã hóa cho arginin) thành CCC (mã hóa cho prolin). Để đánh giá sự liên quan giữa SNP
Arg72Pro với bệnh ung thư tế bào gan nguyên phát, người ta đã tiến hành khảo sát các SNP ở
một nhóm bệnh nhân. Kết quả điện di các sản phẩm cắt bằng enzym BstUI (CG CG)như hình
trên. Hãy xác định các kiểu gen của các mẫu nghiên cứu.
Câu 18: Ở người, đa hình đơn nucleotit trong gen X biểu hiện bởi cặp nucleotit A - T được thay
thế bằng G - X ở vị trí nucleotit 136 (ký hiệu là SNP A136G) trong vùng mã hóa, có thể được xác
định bằng phương pháp nhân bản ADN nhờ PCR kết hợp với cắt bằng enzym giới hạn. Alen kiểu
dại mang A - T ở vị trí 136 (kí hiệu alen A) có hai vị trí nhận biết của một enzym giới hạn tại các
vị trí nucleotit 136 và 240 trong vùng mã hóa. Alen đột biến mang G - X ở vị trí 136 (kí hiệu là
alen G) mất vị trí nhận biết của enzym giới hạn tại vị trí đó. Để nhân bản đoạn gen bằng PCR,
người ta dùng cặp đoạn mồi dài 25bp gồm một đoạn mồi liên kết ngay trước vùng mã hóa và một
đoạn mồi liên kết sau vị trí nucleotit 550 (hình dưới). Sản phẩm PCR sau đó được cắt hoàn toàn
bởi enzym giới hạn và điện di trên gel agarose để xác định kiểu gen của mỗi cá thể. Hãy cho biết
số lượng phân đoạn ADN và kích thước mỗi phân đoạn thu được trên gel điện di (đơn vị bp)
tương ứng với mỗi kiểu gen đồng hợp tử và dị hợp tử về các alen A và G.

Câu 19: Để đánh giá hiệu quả trong chuyển gen thực vật thông qua số bản sao của gen được
chuyển (gen đích), người ta thường sử dụng kỹ thuật lai ADN (lai Southern). Trong kỹ thuật này,
người ta sử dụng enzym cắt giới hạn co vị trí nhận biết không nằm trên gen đích (hay vùng thiết
kế mấu dò) để xử lí ADN tổng số của các dòng cây chuyển gen. Hình dưới đây mô phỏng kết quả
lai Southern của các mẫu nghiên cứu. Trong đó, giếng M là mẫu ADN chuẩn (marker); P
(positive control) là mẫu đối chứng dương (vector mang gen đích chưa bị cắt); các giếng từ 1 đến
40
16 là sản phẩm cắt các mẫu ADN tổng số bởi enzym cắt giới hạn của 16 dòng cây chuyển gen.
Từ kết quả thu được ở hình sau, hãy xác định dòng cây nào là dòng chuyển gen mong muốn?
Giải thích.

C. PHẦN KẾT LUẬN

41
 Qua việc viết chuyên đề Ứng dụng di truyền học – Công nghệ gen và sử dụng trong
giảng dạy đội tuyển, tôi nhận thấy:
+ Đa số các em hiểu bài, tiếp thu tốt nội dung chuyên đề.
+ Kiến thức Di truyền học phức tạp thì giờ đây các em đã hiểu sâu, nắm chắc kiến
thức, vận dụng linh hoạt trong các câu hỏi vận dụng, giải thích tốt nhiều vấn đề có tính
thực tiễn cao.
+ Các em đã liên hệ được giữa các phần kiến thức có liên quan trong giải quyết các
câu hỏi vận dụng tổng hợp.
+ Giúp học sinh hình thành kĩ năng đọc và khai thác hình, sơ đồ.
+ Giúp các em hiểu và làm tốt các bài thực hành về Di truyền học.
+ Các em hứng thú hơn trong giờ học, tích cực chủ động trong quá trình học để lĩnh
hội kiến thức.
+ Nội dung chuyên đề sử dụng tốt trong công tác bồi dưỡng học sinh giỏi các cấp.
Trong quá trình xây dựng nội dung chuyên đề khó tránh khỏi những thiếu sót. Tôi
rất mong nhận được sự quan tâm, đóng góp ý kiến của các bạn đồng nghiệp để chuyên đề
ngày càng hoàn thiện hơn nữa.
Tôi xin trân trọng cảm ơn!

TÀI LIỆU THAM KHẢO

42
1. Sách giáo khoa Sinh học 12 cơ bản. NXB Giáo dục, 2011.
2. Sách giáo khoa Sinh học 12 nâng cao. NXB Giáo dục, 2011.
3. Phạm Văn Lập (chủ biên). Tài liệu giáo khoa chuyên Sinh học phổ thông – Di truyền và
tiến hóa. NXB Giáo dục Việt Nam, 2009.
4. Phạm Văn Lập (chủ biên). Tài liệu giáo khoa chuyên Sinh học phổ thông – Bài tập Di
truyền và tiến hóa. NXB Giáo dục Việt Nam, 2009.
5. Vũ Đức Lưu (chủ biên). Bồi dưỡng học sinh giỏi Sinh học trung học phổ thông – Di
truyền và tiến hóa. NXB Giáo dục Việt Nam, 2011.
6. Vũ Đức Lưu (chủ biên). Bồi dưỡng học sinh giỏi Sinh học trung học phổ thông – Bài
tập Di truyền và tiến hóa. NXB Giáo dục Việt Nam, 2011.
7. Hoàng Vĩnh Phú (chủ biên). Giáo trình Công nghệ sinh học. NXB Đại học Vinh, 2016.
8. Đỗ Lê Thăng (chủ biên). Giáo trình Di truyền học. NXB Giáo dục Việt Nam, 2011.
9. Đinh Đoàn Long (chủ biên). Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào. NXB Đại học quốc
gia Hà Nội, 2008.
10. N.A. Campbell, J.B Reece, L.A Urry, M.L Cain, S.A Wasseman, P.V Minorsky và
R.B Jackson. Sinh học Campbell (Biology). NXB Giáo dục Việt Nam, 2011.
11. Một số địa chỉ Website: thuviensinhhoc.com
baigiang.violet.vn

43