11/8/2022

Enzyme Technology Baøi 1

COÂNG NGHEÄ ENZYME KHAÛO SAÙT AÛNH HÖÔÛNG CUÛA

THỰC HÀNH YEÁU TOÁ NGOAÏI CAÛNH ÑEÁN
HOAÏT TÍNH CUÛA ENZYME
TS. Nguyễn Minh Xuân Hồng
Khoa Công Nghệ Hóa Học và Thực Phẩm
Trường Đại Học Nông Lâm TpHCM
nmxhong@hcmuaf.edu.vn

1 2

1. Tính Ñaëc Hieäu Cuûa Enzyme 1. Tính Ñaëc Hieäu Cuûa Enzyme

1.1. Nguyeân taéc 1.2. Hoùa chaát

• Tính ñaëc hieäu cuûa enzyme theå hieän ôû ñieåm moãi -dung dòch saccharose 1%
-dung dòch tinh boät 1%
enzyme chæ taùc duïng leân moät cô chaát nhaát ñònh. Chaúng -dung dòch Fehling A vaø B
haïn amylase chæ thuûy phaân polysaccharide maø khoâng -dung dịch amylase
taùc duïng leân disaccharide. Cho vaøo hai oáng nghieäm, moãi oáng 0,5 ml dung dịch amylase.
Theâm 1 ml dung dòch tinh boät 1% vaøo oáng thöù nhaát vaø 1 ml dung
• Saccharose khoâng cho phaûn öùng vôùi Fehling vì trong
dòch saccharose 1% vaøo oáng thöù hai. Ñaët 2 oáng vaøo boàn oån nhieät
phaân töû khoâng coù nhoùm cetose hoaëc aldehide töï do. ôû 37oC trong 5-10 phuùt.
Phaûn öùng naøy chæ döông tính khi saccharose ñaõ ñöôïc Sau ñoù ñem hai oáng ra laøm phaûn öùng Fehling. So saùnh keát quaû
thuûy phaân thaønh glucose vaø fructose. giöõa 2 oáng. Nhận xét.

3 4

Phaûn öùng Fehling
1 ml Fehling A + 1 ml Fehling B
 Trộn đều
 Hút 1 ml hỗn hợp Fehling đã trộn cho
vào 2 ống đã chuẩn bị ở phần trước.
 Ngâm ống trong nước nóng cho đến
khi thấy 1 trong 2 ống đổi màu.
5 6
2. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán hoaït tính cuûa enzyme
2.2. Hóa chất
- dung dịch hồ tinh bột 1%
- dung dịch amylase đã pha loãng
2.3. Tiến hành
Lấy 2 ống nghiệm, cho vào:
- ống 1: 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1%
- ống 2: 0,5 ml dung dịch amylase đã pha loãng
Đặt cả 2 ống vào bình ổn nhiệt ở 30oC trong 5 phút. Sau
đó trộn 2 ống vào nhau và tiến hành khảo sát hoạt tính của
enzyme dưới ảnh hưởng của nhiệt độ bằng cách xác định
thời gian thủy giải của amylase.
7 8
11/8/2022
2. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán hoaït tính cuûa enzyme
2.1. Nguyeân taéc
Vaän toác cuûa phaûn öùng enzyme thöôøng taêng khoaûng
hai laàn khi nhieät ñoä taêng khoaûng 100C. ÔÛ nhieät ñoä thaáp,
ví duï khoaûng 0oC, vaän toác xuùc taùc cuûa men raát thaáp, coi
nhö khoâng ñaùng keå. Nhöng ôû nhieät ñoä naøy, enzyme
ñöôïc baûo quaûn toát. ÔÛ 40-50oC, enzyme hoaït ñoäng maïnh
nhaát, cao hôn 50oC, enzyme baét ñaàu bieán tính, vaän toác
xuùc taùc giaûm daàn. Ñeán 60-80oC, enzyme maát khaû naêng
hoaït ñoäng. ÔÛ 100oC, enzyme baét ñaàu maát taùc duïng.
2. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán hoaït tính cuûa enzyme
Phương pháp xác định thời gian thủy giải của amylase:
Cứ sau mỗi 1 phút, nhỏ 1 giọt dung dịch lugol (hoặc iod)
lên mặt kiếng, sau đó nhỏ vào đó 1 giọt hỗn hợp dung
dịch. Khi nào không thấy màu xanh xuất hiện nữa là lúc
tinh bột đã bị thủy phân hoàn toàn bởi amylase.
Tương tự như vậy, khảo sát ở các mức nhiệt độ khác như:
60oC, 90oC
Vẽ đường biểu diễn sự biến thiên của thời gian thủy giải
(phút) đối với nhiệt độ. Nhận xét. Giải thích.
 11/8/2022

Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ thủy phân
tinh bột của enzyme alpha-amylase

9 10

3. AÛnh höôûng cuûa pH ñeán hoaït tính cuûa enzyme 3. AÛnh höôûng cuûa pH ñeán hoaït tính cuûa enzyme
3.1. Nguyên tắc 3.3. Tieán haønh

Hoạt tính của enzyme thể hiện trong vùng pH tương đối hẹp Lấy 3 ống nghiệm, cho vào:
là pH tối ưu. pH tối ưu của một số enzyme như pepsin là - ống 1: 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1% và 1 ml dung dịch đệm pH 4
1,2-2,5; catalase 7,0; trypsin 8,0-9,0… - ống 2: 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1% và 1 ml dung dịch đệm pH 6

Mức độ ion hóa của các enzyme phụ thuộc vào môi trường. - ống 3: 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1% và 1 ml dung dịch đệm pH 8
Enzyme có thể có hoạt tính cao khi ở dạng tích điện dương Sau đó cho vào mỗi ống 0,5 ml dd enzyme amylase đã pha loãng.
hay tích điện âm hoặc ở trạng thái đẳng điện. Tiến hành khảo sát hoạt tính của enzyme dưới ảnh hưởng của pH bằng
cách xác định thời gian thủy giải của amylase (tương tự thí nghiệm 2).
3.2. Hóa chất
Vẽ đường biểu diễn sự biến thiên của thời gian thủy giải (phút) đối với
-dung dịch tinh bột 1% pH. Nhận xét. Giải thích.
-dung dịch amylase
-dung dịch lugol (KI 2,65g; I2 0,05g; nước cất vừa đủ
100ml)
11 12
 11/8/2022

4. AÛnh höôûng cuûa chaát hoaït hoùa vaø chaát öùc cheá
ñeán hoaït tính cuûa enzyme
Chất hoạt hóa là chất có khả năng làm tăng cường tác
dụng của enzyme. Chúng có bản chất hóa học khác nhau.
Thí dụ ion Cl- đối với - amylase, glutathion đối với nhiều
protease thực vật, cystein đối với nhiều loại enzyme có
nhóm –SH hoạt động….
Chất ức chế là chất kìm hãm phản ứng xúc tác của
enzyme, làm giảm ái lực của enzyme đối với cơ chất hoặc
làm enzyme mất khả năng kết hợp với cơ chất. Thí dụ các
ion Ag2+, Hg2+, Pb2+… là chất ức chế của hầu hết các
enzyme.
4. AÛnh höôûng cuûa chaát hoaït hoùa vaø chaát öùc cheá
ñeán hoaït tính cuûa enzyme
4.1. Nguyên tắc
Amylase của nước bọt (-amylase) sẽ tăng hoạt động trong
môi trường có NaCl, ngược lại CuSO4 sẽ ức chế tác dụng
của enzyme này.
Trong 3 ống nghiệm có chứa - amylase và tinh bột. Nếu ta
cho NaCl vào ống thứ nhất, CuSO4 vào ống thứ hai, và
nước vào ống thứ 3 thì sau cùng một thời gian tác dụng ta
sẽ thấy:
ống 1: tinh bột được thủy giải hoàn toàn
ống 2: không có sự thủy phân tinh bột
ống 3: tinh bột chỉ được thủy giải đến dextrin

13 14

4. AÛnh höôûng cuûa chaát hoaït hoùa vaø chaát öùc cheá
ñeán hoaït tính cuûa enzyme 5. Baøi töôøng trình:
4.2. Hoùa chaát
- dung dòch tinh boät 1%
- dung dòch amylase ñaõ pha loaõng - Töôøng trình quaù trình thöïc hieän.
- dung dòch NaCl 10% - Kết quả ghi nhận được
- dung dòch CuSO4 10%
- Nhận xét kết quả
4.3. Tiến hành
Lấy 3 ống nghiệm, cho vào: - Giải thích kết quả.
- ống 1: 0,5 ml dd amylase đã pha loãng và 0,5 ml NaCl 1%
- ống 2: 0,5 ml dd amylase đã pha loãng và 0,5 ml CuSO4 1%
- ống 3: 0,5 ml dd amylase đã pha loãng và 0,5 ml nước cất
Tiếp tục cho vào mỗi ống 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1%. Để cả 3 ống
ở nhiệt độ phòng khoảng 3-5 phút. Sau đó nhỏ 1 giọt Iod vào mỗi ống
nghiệm. Quan sát kết quả. Nhận xét. Giải thích.

15 16
 11/8/2022

Baøi 2

ỨNG DỤNG ENZYME AMYLASE

TRONG SẢN XUẤT MẠCH NHA

BAØI TÖÔØNG TRÌNH

- Töôøng trình quaù trình thöïc hieän.
- Nhaän xeùt chaát löôïng saûn phaåm

17 18

Baøi 3

ENZYME BROMELIN

19 20

1. Trích ly Bromeline töø döùa
Bromeline laø protease coù nguoàn goác thöïc vaät.
Bromeline coù nhieàu trong caùc phaàn khaùc nhau cuûa caây
döùa: quaû, choài, thaân, voû…
Bromeline coù theå ly trích nhö sau: Döùa xanh ñem
goït voû baèng dao inox, caân xaùc ñònh troïng löôïng laáy
phaàn thòt, loõi. Maét cho vaøo maùy xay sinh toá xay naùt.
Ñoå ra treân vaûi maøng, vaét thaät kyõ, ñem loïc ñeå loaïi boû
chaát xô. Ño theå tích dòch chieát.
21
3. Baøi töôøng trình
- Tường trình quá trình thực hiện.
- So sánh kết quả ứng dụng enzyme bromelin trong làm
mềm thịt
23
11/8/2022
2. Ứng dụng enzyme bromelin trong làm mềm thịt
Thịt nạc được cắt ra thành từng lát mỏng giống nhau theo chiều dọc để
có thể quan sát được sớ thịt. Chia thịt ra làm 3 phần:
•Dĩa 1: bổ sung 20 ml nước dứa, ngâm trong ít nhất 2 giờ
•Dĩa 2: bổ sung 20 ml enzyme protease đã pha loãng 100 lần, ngâm
trong ít nhất 2 giờ
•Dĩa 3: không xử lý (đối chứng)
Sau 2 giờ, đun nóng thịt trong các dĩa trên trong 5 phút ở 100oC. Quan
sát, đánh giá và so sánh mùi vị, cấu trúc của thịt giữa các mẫu.
22
Baøi 4
ENZYME PECTINASE
24
 11/8/2022

1. Giôùi thieäu chung
Pectinase laø teân goïi chung moät nhoùm enzyme coù
khaû naêng phaân giaûi pectin, moät daïng glucid cao phaân
töû coù nhieàu ôû thöïc vaät.
Trong thöïc vaät, pectin coù vai troø quan troïng taïo thaønh
vaùch teá baøo thöïc vaät, gaén keát caùc teá baøo vaøo nhau vaø
hieän dieän trong phöùc vôùi cellulose, ñoùng vai troø laø
thaønh phaàn chuû yeáu cuûa lôùp xô trong cô caáu vaùch teá
baøo thöïc vaät thöôïng ñaúng.
2. Xaùc ñònh hoaït tính enzyme pectinase baèng
phöông phaùp so maøu
2.1. Nguyeân taéc
Laø phöông phaùp döïa treân vieäc so saùnh cöôøng ñoä maøu
cuûa dung dòch nghieân cöùu vôùi cöôøng ñoä maøu cuûa dung
dòch tieâu chuaån coù noàng ñoä xaùc ñònh.
Nguyeân taéc cuûa phöông phaùp naøy laø xaùc ñònh löôïng
acid galacturonic ñöôïc taïo ra bôûi quaù trình thuûy phaân
bằng pectinase. Cô chaát pectin khoâng keát tuûa bôûi
ZnSO4.

25 26

2. Xaùc ñònh hoaït tính enzyme pectinase baèng 2. Xaùc ñònh hoaït tính enzyme pectinase baèng
phöông phaùp so maøu phöông phaùp so maøu

Ñònh nghóa ñôn vò hoaït tính: 2.2. Hoùa chaát

Moät ñôn vò hoaït tính pectinase laø löôïng enzyme trong - Dung dòch pectin 1%
ñieàu kieän tieâu chuaån (ôû nhieät ñoä 300C pH 3,9 – 4,1, - Dung dòch ZnSO4 15%
thôøi gian phaûn öùng laø 60 phuùt vôùi noàng ñoä pectin trong
moâi tröôøng phaûn öùng laø 0,66%, möùc ñoä thuûy phaân - Dung dòch Enzyme 1%
pectin laø 30%) coù khaû naêng xuùc taùc, laøm bieán ñoåi 1g - Dung dòch Anthrone 0,2% trong acid sulfuric ñaäm ñaëc
pectin sau 60 phuùt thaønh acid galacturonic.

27 28
 11/8/2022

2.3. Tieán haønh Sau đó, tính giá trị  OD = ODTN – ODÑC ñeå söû duïng vaøo coâng
 Cho 2ml dung dòch pectin 1% vaøo oáng nghieäm roài tieáp theo cho thöùc tính hoaït tính.
1ml dung dòch Enzyme 1%, laéc ñeàu cho vaøo tuû aám ôû nhieät ñoä ODTN : Giaù trò ño OD cuûa thí nghieäm
30oC (dung dòch pectin coù pH = 3,9-4,1).
ODÑC : giaù trò ño OD cuûa ñoái chöùng
 Sau 60 phuùt laáy ra theâm 2ml ZnSO4 15%, ñem loïc qua giaáy
loïc, dung dòch loïc ñöôïc ñem pha loaõng 5 laàn duøng cho phaûn öùng
vôùi Anthrone. 2.4. Tính hoaït ñoä
 Laáy 2,5 ml dung dòch loïc ñaõ pha loaõng cho vaøo oáng nghieäm roài Hoaït tính enzyme pectinase = (0,34 x OD – 0,0104) / m x df
cho 5ml Anthrone vào, laéc maïnh trong thôøi gian 10 phuùt. Sau ñoù
Trong ñoù:
ñaët trong noài thuûy ôû nhieät ñoä 70oC trong thôøi gian 12 phuùt rồi laáy
ra laøm nguoäi ñeán nhieät ñoä phoøng vaø tieán haønh ño giaù trò OD ôû • m laø löôïng enzyme laáy ñeå tieán haønh phaûn öùng (ml)
böôùc soùng X = 584 nm. • df: hệ số pha loãng enzyme
 Thực hiện tương tự đối với ống đối chứng (thay enzyme bằng
nước).

29 30

3. ÖÙng duïng enzyme pectinase laøm trong nöôùc 3. ÖÙng duïng enzyme pectinase laøm trong nöôùc
traùi caây eùp traùi caây eùp
3.2. Tieán haønh
3.1. Nguyeân liệu - Hoùa chaát - Caân 50 g nguyeân lieäu quaû, eùp laáy dòch quaû, pha loaõng thaønh
- Trái cây theo mùa (táo / ổi / xoài) 100 ml vôùi nöôùc caát.
- Huùt 18 ml dung dòch treân cho vaøo moãi oáng nghieäm cuûa 5 oáng
- Dung dịch pectinase 1% nghieäm khaùc nhau.
- Theâm dung dòch pectinase 1% vaøo töøng oáng nghieäm vôùi theå
tích tuaàn töï trong caùc oáng laø 0; 0,5; 1; 1.5; vaø 2 ml.
- Sau ñoù theâm nöôùc caát vaøo sao cho moãi oáng coù ñuû 20 ml.
- Ñeå taát caû caùc oáng nghieäm ôû 50-55oC trong 60 phuùt.
- Sau đó lọc qua giấy lọc, ngâm ống nghiệm đựng dịch sau lọc
trong nước lạnh trong 10 phút và so sánh độ trong của các mẫu.
Giải thích.

31 32

4. Baøi töôøng trình
- Töôøng trình quaù trình thöïc hieän.
- Keát quaû xác định hoaït ñoä enzyme pectinase
- Keát quaû ứng duïng enzyme pectinase laøm trong nöôùc
traùi caây eùp.
33
11/8/2022
BÀI BÁO CÁO
• Báo cáo được viết theo nhóm thực hành, mỗi nhóm 1 bài
• Cách trình bày Báo cáo: theo mẫu
• Nộp Báo cáo sau 1 tuần thực hành qua email
hoathucpham.nlu@gmail.com. Tiêu đề của file nộp và
email phải ghi rõ:
<TH ENZYME> <ngày TH> <nhóm TH>
VD: TH Enzyme 05.01.2022 Nhóm 1
• Báo cáo phải liệt kê đầy đủ tên và mã số sinh viên của các
thành viên, khi gửi cho giảng viên phải đồng thời cc cho
tất cả thành viên trong nhóm.
34