Регулација

експресије гена
код Еукариота
20. Претранскрипциони и
посттранскрипциони ниво регулације
експресије гена у еукариота.
Регулаторне РНК.
Проф. др Стево Најман
stevo.najman.nastava@gmail.com
stevo.najman@medfak.ni.ac.rs
 PRETRANSKRIPCIONI NIVO
regulacije aktivnosti gena
Na pretranskripcionom nivou nekoliko mehanizama je uključeno u
regulaciju aktivnosti gena:
1.Amplifikacija gena
2.Rearanžiranje DNK
3.Dekondenzacija hromatina
4.Hemijske modifikacije DNK (metilacija) i histona (metilacija i
acetilacija)
Genom je kod eukraiota konstantan po količini i strukturi u svim ćelijama
organizma. Izuzeci od ovog pravila su dva tipa regulatornih promena u genomu
eukariota – amplifikacija gena i rearanžiranje DNK, koji su mehanizmi regulacije
gena na pretranskripcionom nivou.
Važan uslov za transkripciju je da hromatin mora da bude “otvoren”, tj.
dekondenzovan.
Izvesne hemijske modifikacije, kao što su acetilacija histona i metilacija
citozina imaju ulogu olakšavanja inicijacije transkripcije ili inaktivacije transkripcije
gena, što takođe predstavlja pretranskripcioni nivo regulacije.
Stevo Najman Regulacija ekspresije gena 2
 Amplifikacija gena
 To je umnožavanje broja gena, a time i uvećanje količine
produkta gena (RNK i proteina).
 Karakterističan je fenomen za oogenezu (500 gena za rRNK u
oocitama vodozemaca umnoži se do 4000 puta) → formira se
ekstrahromozomska DNK (četkast oblik hromozoma i više stotina
nukleolusa) → akumuliranje velike količine RNK koja će
funkcionisati u mladom embrionu.

Rearanžiranje DNK
 To je preuređenje nekih gena pre njegove transkripcije.
 Primer su geni za imunoglobuline koji se preuređuju
nasumičnom rekombinacijom genskih segmenata.

Stevo Najman Regulacija ekspresije gena 3

 Dekondenzacija hromatina
 Dekondenzacija je neophodan uslov u aktivaciji gena za transkripciju
 To je uslov da DNK (genu) pristupe regulatorni proteini i RNK
polimeraza.
 Hromatinske struktura se tokom dekondenzacije svede do nivoa perlastog
vlakna, posle čega sledi disocijacija nukleozoma.
 Regioni nekondenzovanog hromatina su hipersenzitivna mesta i nalaze se
na regulatornim regionima gena.

Stevo Najman 4
 Dekondenzacija hromatina
• Dekondenzacija hromozoma je uslov za pristup regulatornih proteina i RNK
polimeraze molukulu DNK. Time se svede hromatinska struktura na nivo perlastog
vlakna, posle čega sledi disocijacija nukleozoma. Na hromozomima, inače, postoje
stalno nekondenzovani regioni u kojima se vežu transkripcioni faktori. U njima ne
postoje nukleozomi. Pošto su ovi delovi hromozoma osetljivi na DNazu, jer su bez
zaštite histona, nazivaju se hipersenzitivna mesta. Ali, nekondenzovana forma
hromatina nije i obavezan znak transkripcije hromatina, jer su za transkripciju potrebni
i određeni stimulatorni faktori.
• Dekondenzacija hromatina je neophodna pojava u aktivaciji transkripcije
tkivno-specifičnih gena, koji su se pre toga nalazili u represiranom stanju zbog vrlo
kompaktne (kondenovane) forme hromatina. U humanom genomu postoji velika grupa
gena koji su specifično aktivni samo u nekim od tkiva, a u ostalim tkivima su neaktivni.
To znači da je “difolt” (uobičajeno, zadato) stanje ovih gena represirano. U mehanizmu
dekondenzacije hromatina učestvuje jedan regulatorni proteinski kompleks čija
aktivnost zavisi od ATP (tzv. NURF – eng. nucleosome remodeling factors), a koji
menja strukturu nukleozoma, tako da se omogući pristup RNK polimerazi. Pri tome
se ekstranukleozomski H1 sklanja. Pokazano je da disocijaciji nukleozoma pogoduje
acetilacija nukleozomskog histona H4. Posle inicijacije transkripcije ponovo se
uspostavlja normalna nukleozomska struktura. Dekondenzacijom nastaju
hipersenzitivna mesta na regulatornim regionima gena (promotorima, enhenserima,
reagujućim elementima), a to omogućuje vezivanje regulatornih proteina na te
regione. 5
 Metilacija DNK
 U Vertebrata metilacija citozina dovodi do inaktivacije gena.

 Posebni regulatorni proteini se vežu za metilisani

CG dinukleotid (u obliku CpG ostrva u regulatornim
regionima gena), čime se sprečava vezivanje
transkripcionih faktora.
 Stalno aktivni geni (‘housekeeping genes’)
nemaju metilaciju CpG dinukleotida u blizini gena.
 Metilacija stabilizuje nukleozomsku strukturu
(otežana dekondenzacija), a acetilacija deluje
suprotno.
 To je evolutivno noviji mehanizam kontrole gena
(nije poznat kod beskičmenjaka).

Stevo Najman Regulacija ekspresije gena 6

 Metilacija DNK
 Metilacija u somatskim ćelijama se nasleđuje kroz mitotske deobe, što znači da je
oblik ćelijske memorije (metilisani geni ostaju isključeni i u svim narednim generacijama
ćelija).

 Najmanje tri fenomena u nasleđivanju uključuju metilaciju: procesi ćelijske

diferencijacije, inaktivacija X hromozoma pri formiranju Barovog tela i
genomski imprinting.
ĆELIJSKA DIFERENCIJACIJA
o Embrioni sa mutacijom gena za enzim metilazu uginu vrlo rano.
o Nasleđivanje obrasca metilacije fiksira neaktivnost metilisanog gena u svim
generacijama ćelija nastalih posle metilacije, pa se ograničavaju potencijali za
razviće. To je način usmeravanja razvića nekog tipa ćelija ka određenom ćelijskom
fenotipu.
7
Stevo Najman Regulacija ekspresije gena
 Genomski imprinting (otisak)
 GENOMSKI IMPRINTING (utiskivanje) je pojava da aleli iste nukleotidne
strukture, poreklom od različitih roditelja imaju različitu ekspresiju. To znači
da aktivnost gena zavisi od kojeg roditelja se gen nasledio, jer postoji roditeljski
imprinting.
 Posledica je različitih obrazaca metilacije u spermatogenezi i oogenezi.
 Primer: Prader-Willi-jev i Angelmanov sindrom - dva sindroma koja imaju isti genetski uzrok, a
razlikuju se samo po tome od kojeg roditelja je genetski defekt (delecija) nasleđen.
 Prader-Willi: slaba mentalna retardacija, male gonade, nizak rast i dr.; nasleđuje se preko oca.
 Angelmanov sindrom: teža mentalna retardacija sa potpunom nesposobnošću govora;
nasleđuje se preko majke.

Majčin Očev
alel alel

del. 15q

Angelmanov sindrom Prader-Willi-jev sindrom

Majčin hromosom 15 ima deleciju, a očev Očev hromosom 15 ima deleciju, a majčin
hromosom sadrži metilirane, neaktivne gene hromosom sadrži metilirane, neaktivne gene
 Barovo telo
 To je inaktivan X hromozom.
 Kasnije od ostalih hromozoma se replikuje u S periodu interfaze.
 Hipermetilisan je, ali hipoacetilisan.
 Reaktivira se (postajući kao onaj drugi X) pre ulaska u mejozu tokom
oogeneze.
 Inaktivacija:
- Dešava se na stadijumu kasne blastociste ženskog embriona od 100-ak
ćelija (2-ti dan)
- Inaktivacija je nasumična, sa istom verovatnoćom da se inaktivira
očev, ako i majčin X hromozom, pa su tkiva ženki sisara mozaična.
- Nasleđuje se kroz mitotske deobe somatskih ćelija, a metilacija služi
kao memorija inaktivacije (prisutna na skoro svim CpG ostrvcima na X
hromozomu).
- Kondenzacija nije potpuna (u distalnim pseudoautozomalnim
regionima i nekim regionima u blizini centromere).
 Posttranskripciona kontrola
ekspresije gena

Posttranskripcioni nivo regulacije ekspresije gena koji je pre nivoa

translacije obuhvata regulaciju procesa u procesingu RNK, izbor zrele
iRNK koja će se transportovati iz jedra u citoplazmu i stabilnost iRNK.

 Procesing:
- alternativni splajsing,
- Alternativna poliadenilacija
 Transport RNK
 Stabilnost

Stevo Najman Regulacija ekspresije gena 10

 Alternativni splajsing
 Jedna primarna RNK se splajsovana na više načina, pa zato jedan isti gen
može da proizvede različit protein.
 Različiti proteini dobijeni alternativnim splajsingom po pravilu se sintetišu u
različitim tkivima.
 Alternativni splajsing znači da ista primarna RNK može biti splajsovana na više načina.
To je mehanizam kojim se omogućije da jedan gen proizvede više različitih proteina. Različiti
proteini dobijeni alternativnim splajsingom po pravilu se proivode u različitim tkivima.
 Primer: Alternativno spajanje egzona se vrši u primarnom transkriptu gena koji kodira
kalcitonin, hormon tireodne žlezde, regulator kalcijuma, i kalcitoninu srodan peptid (CGRP) u
mozgu koji deluje kao snažan vazodilatator. Ovaj gen se transkribuje u istu primarnu RNK i u
mozgu i tireodnoj žlezdi, ali se u ovim organima kombinuju različiti egzoni, pa se dobijaju
različite iRNK i različiti peptidni produkti.

11
 Alternativni splajsing
 Prilikom sinteze IgM, na genu za teške lance imunoglobulina sintetiše se prekursorna
RNK koja se može splajsovati tako da napravi kombinaciju egzona koja će omogućiti
usidrenje teških lanaca u ćelijsku membranu formirajući membranske IgM, a druga
alternativa je da su u splajsingu uključe egzoni koji ne nose informaciju za membranski
domen IgM pa će sa takvim teškim lancima biti sintetisani sekretorni IgM.
 Ovi različiti IgM se proizvode u različitim limfocitima.

Stevo Najman 12
 Alternativna poliadenilacija
 Mnogi geni eukariota imaju više od jednog poliadenilacionog signala u 3'-kraju gena.
 Dodavanje poli A repa može biti izvršeno na različitim mestima u različitim tkivima.
 Različito poliadenilovane RNK razlikuju se u stabilnosti.
 Ovaj mehanizaam može da bude usaglašen sa alternativnim splajsingom, tako da određen
način splajsinga zahteva određeno mesto poliadenilacije (npr. gen za kalcitonin).

Kontrola transporta iRNK

 Zbog kontrole transporta samo 5% zrelih iRNK jedra stigne u citoplazmu.
 Najvažniju regulatornu ulogu u transposrtu iRNK igraju ribonukleoproteinske partikule
koje se vezuju za iRNK još na početku njene transkripcije.

Stabilnost iRNK
 Stabilnost iRNK zavisi od dužine PoliA repa. Poli A negativne iRNK žive daleko kraće
(do pola sata) nego iRNK sa 3’ repom (više sati).
 Kratkoživeće su iRNK koje nose ponovljive redoslede AG ispred Poli A repa ili dinukloetid
AU u nekodirajućem 3’-kraju. Na ove redoslede deluju nukleaze koje odvajaju Poli A rep.
 Neki hormoni (steroidni i prolaktin) utiču na stabilnost iRNK.

Stevo Najman Regulacija ekspresije gena 13

 Regulatorne RNK
Interferirajuće RNK (siRNK)
 Male interferirajuće RNK (siRNA,
od eng. small interfering RNA) (kratka
interferirajuća RNK ili utišavačka RNK)
su klasa dvostrukih RNK molekula
sa 20-27 baznih parova u dužini.
 siRNK ima mnoge uloge delujući na
više nivoa regulacije ekspresije gena:
 najznačajnija je u interferenciji
ekspresije RNK - ometa ekspresiju
određenih gena pomoću svoje
komplementarne nukleotidne sekvence.
 siRNK uzrokuje razgradnju iRNK
nakon transkripcije
 učestvuje u oblikovanju hromatinske
strukture genoma
 deluje kao antivirusni mehanizam

Stevo Najman Regulacija ekspresije gena 14

 MikroRNK (miRNK)

• MikroRNK (miRNK) je mala nekodirajuća RNK sa oko 22 nukleotida čija

je funkcija u utišavanju RNK ekspresije i post-transkripciona regulacija
ekspresije gena. Liči na siRNK.
• Humani genom kodira preko 1000 raznih miRNK, pa je vrlo obimna u
mnogim ćelijama sisara. Može da reguliše čak oko 60% humanih gena.
• miRNK funkcioniše komplementarno sparujući sekvence sa iRNK
zbog čega će iRNK biti utišana i to na jedan od sledećih načina:
1)Cepa iRNK lance u dva dela
2)Destabilizuje iRNK skraćujući poliA rep
3)Smanjuje efikasnost translacije

Stevo Najman Regulacija ekspresije gena 15

 Regulacija na nivou translacije

 Ovom regulacijom je onemogućena translacija iRNK iz oocite kada

odmaknu segmentacioni procesi zigota.
 Primer takođe da pri visokoj temperaturi prestaje sinteza većine
proteina, ali se aktivira sinteza tzv. proteina toplotnog šoka.
 Na nivou translacije se vrši podešavanje sinteze globinskih lanaca prema količini
hema. Bez hema nema sinteze globina. Protein kinaza, poznata kao hemom
kontrolisani inhibitor, u prisustvu hema je inaktivna. U odsustvu hema ona se aktivira
i tada fosforiliše eIF2 (inicijalni faktor dva u translaciji) koji se zbog toga inaktivira.
Konačna posledica je blokada translacije, jer je fosforilisani eIF2 nesposoban da se
veže u kompleks sa GTP-om i metionil-tRNK.

Stevo Najman 16 Regulacija ekspresije gena

 Posttranslaciona kontrola
 U posttranslacionoj kontroli dolazi do modulacije proteinske funkcije.
 Glavni mehanizmi postranslacione kontrole su: fosforilacija, glikozilacija, proteoliza,
sklapanje proteina pomoću čaperona, usmeravanje proteina na odredišta u ćeliji i izvan
ćelije, interakcija sa regulatornim molekulima i jonima i molekulski promet.
 Primer: regulacija sinteze insulina. Primarni translacioni produkt gena za insulin je
preproinsulin. Tokom posttranslacionog procesinga preproinsulin izgubi 23 aminokiseline
pri čemu se dobije proinsulin koji se sastoji od domena A, B i C. Aktivni insulin se dobija
isecanjem domena C, tako da će u građi insulina preostali domeni A i B biti lanci A i B.
 Čaperoni su molekuli potrebni da se spreči nekorektna interakcija pri sklapanju proteina.
Oni asistiraju u formiranju složene strukture proteina, a pri tom ne postaju komponentne
proteina.
 Promet proteina: reguliše vrsta i količina sintetisanih proteina u ćeliji. Mnogi
regulatorni proteini (TF, faktori rasta, regulatori metabolizma itd.) žive kratko. Abnormalni
proteini svih vrsta moraju biti uništeni. Proteini koji moraju biti eliminisani obeleže se
malim proteinom nazvanim ubikvitin. Ubikvitin se veže za jedan ili više lizina ciljnog
proteina i na tom mestu se formira kratak ubikvitinski lanac. Ubikvitinski lanci služe da ih
prepozna enzimski kompleks proteazom koji sadrži nekoliko proteaza kojima se razgrade
obeleženi proteini.

Stevo Najman 17 Regulacija ekspresije gena

 Регулација
експресије гена
код Еукариота
21. Епигенетика

Prof. dr Stevo Najman

stevo.najman.nastava@gmail.com
stevo.najman@medfak.ni.ac.rs
 EPIGENETIKA
Proučava stabilne nasledne promene u ekspresiji gena ili
ćelijskom fenotipu, koje se događaju bez promena u rasporedu
baza DNK (primarne strukture DNK). Tj. bavi se diferencijalnom
ekspresijom gena, koja omogućava da iz istog genotipa mogu
nastati različiti fenotipovi.

EPIGENETSKE PROMENE
• To su nasledne promene u fenotipu izazvane mehanizmima različitim
od mutacija. Dakle, te promene koje dovode do različitog fenotipa se ne
dešavaju u redosledu nukleotida DNK (genetskom kodu, genotipu).
• Takve promene mogu biti vidljive nakon nekoliko generacija ćelija, ili
više generacija živih bića.
• Epigentski mehanizmi su uticaji okruženja u kojem se gen nalazi na
ekspresiju nasledne informacije, tj. način ekspresije nasledne
informacije je posledica strukture hromatina, metilacije DNK i drugih
hemijskih modifikacija hromatina, procesa na nivou
RNK (interferencija RNK), obrade proteina.
Stevo Najman Regulacija ekspresije gena 19
 Epigenetski kod i epigenom
Epigenetski kod
predstavlja obrasce
1. Metilacije DNK
2. Hemijske
modifikacije histona
(histonski kod)
• Za razliku od
genetskog koda koji se
tokom života samo čita,
epigenetski kod se “i čita
i piše i briše”.

Epigenom je zapis o
hemijskim promenama
DNK i histonskih
proteina u ćelijama
organizma.

Stevo Najman Regulacija ekspresije gena 20

PRIMER: identični blizanci kao dokaz epigenetskih promena
- Podaci pokazuju da je epigenom blizanaca vrlo sličan tokom prvih godina života, a da se
kasnije povećavaju razlike u njihovom epigenomu;
- Nađeno je da stariji monozigotni blizanci imaju značajne razlike u ukupnom
sadržaju i genomskoj distribuciji 5-metilcitozina i histonske acetilacije. To kod njih
uzrokuje pojavu za razlike u predispozicijama za neke bolesti, jer iako genetski ostaju
identični, epigentski se tokom života različito manjaju.
Stevo Najman 21
Regulacija ekspresije gena
 EPIGENETSKI PRIMER: Barovo telo i genomski imprinting

Majka CC Klon

• Ćelija iz koje je klonirana Carbon Copy (slika gore desno) imala je normalno
jedan X (od dva) u obliku Barovog tela, tj. Inaktiviran. Embrionalni razvoj je
reaktivirao inaktivan X (tj. tada postaju oba X aktivna), a onda se na stadijumu
blastociste desila nova nasumična inaktivacija X hromosoma (koja napravi
mozaičnu distribuciju Barovog tela u tkivima), što je rezultovalo drugačijim
rasporedom boja krzna (gen za boju krzna je na X hromozomu), iako su majka i
klon genetski identične jedinke.
• Monoalelizam je pojava da je samo jedan alel aktivan, drugi se inaktivira. To
se dešava u nastanku Barovog tela, kao i u slučaju genomskog imprintinga.
Mehanizmi nastanka monoalelizma su metilacije citozina i hemijske
modifikacije u hromatinu. (Tridesetak gena čoveka se eksprimiraju po obrascu
monoalelizma.)
Stevo Najman Regulacija ekspresije gena 22
PRIMERI: delovanje ishrane (nutrigenomika)

I) ISHRANA PROTIV BPA

Izloženost bisfenolu-A (BPA) (koristi se u proizvodnji plastike
i mnogih predmeta u svakodnevnoj upotrebi) može uticati na
fenotip potomaka (gojaznost, predispozije za dijabet i
kancere) menjajući metilaciju, odnosno epigenom. Ovaj
efekat se može sprečiti određenim sastojcima majčine
ishrane (betain, holin, folna kiselina, B12, koji su donori
metil grupa).

II) PČELE: RADILICE ILI MATICE

• Pčele radilice i matica su genetski identične, ali matica je mnogo
veća i predstavlja plodnu ženku.
• Razlike između pčele radilice i matice uzrokovane su različitom
ishranom: matice se hrane matičnim mlečom, čiji sastojci
očigledno deluju na drugačiju aktivnost gena.

III) HOLANDSKA GLAD

1944/1945. višemesečno gladovanje u holandskim porodicama (zbog rata i zime unos hrane je bio na
nivou oko 500-600 cal/dan) (u literaturi poznato kao “holandska glad”) rezultovalo je povećanon
učestalošću mentalno/metaboličkih poremećaja kod potomaka rođenih nakon toga, jer je to imalo
efakat na gametogenezu i embrionlno razviće.
23
Regulacija ekspresije gena
PRIMER: Taktilna stimulacija mladunaca

• Razlike u majčinom taktilnom ponašanju prema mladuncima u prvih 6 dana života pacova uzrokuju različite
obrasce metilacije u promotorima nekih gena, kao što je gen za glukokortikoidni receptor (GR) u hipokampusu, što
se odražava na ponašanje pacova kada odrastu. U ovim eksperimetnima je pokazano da majke koje nežno ližu mladunce
oni postaju “pitomi”, neagresivni pacovi kad odrastu, a ćerke budu takođe “nežne” majke i obrnuto – agresivne majke
prema mladuncima imaju agresivno odraslo potomstvo i iste takve ćerke koje su postale majke. Nađena je jaka
povezanost taktilnog ponašanja majki i stepena metilacije gena u hipokampusu kod mladunaca. 24
 Primeri EPIGENETSKIH LEKOVA (primena pokazuje rastući trend)

Stevo Najman Regulacija ekspresije gena 25

 EPIGENETSKI FAKTORI

• Epigenetske promene se mogu

prenositi kroz više generacija.
Epigenetski faktori koji deluju na trudnicu
pogađaju tri generacije – trudnicu, dete i
unuče, preko delovanja na primordijalne
germinativne ćelije.
• Epigenetske promene su reverzibilne.
Mnogi hemijski, fizički, biološki, nutritivni,
bihevioralni i psihosocijalni faktori mogu
delovati epigenetski (slika iznad).

Stevo Najman Regulacija ekspresije gena 26