Sciimmunol Abc2934

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CIENCIA INMUNOLOGÍA | ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN
De
htt
de
TUBERCULOSIS Copyright © 2021
Los autores, algunos
La BCG pulmonar induce la activación de los macrófagos Derechos reservados;

licenciatario exclusivo
residentes en los pulmones y confiere protección a Asociación Estadounidense
s2l
para el Avance de la Ciencia.
w
largo plazo contra la tuberculosis
d
Sin reclamación
a los EE. UU. originales
Obras gubernamentales
Elena Mata1,2†, Raquel Tarancón1,2‡, Claudia Guerrero1,2, Eduardo Moreo1,2, Flavie Moreau3,
e
Santiago Uranga1,2 , Ana Belén Gómez1,2, Dessislava Marinova1,2, Miriam Doménech2,4,
Fernando GonzálezCamacho2,4, Marta Monzón5, Juan Badiola5, Jorge DomínguezAndrés6 ,
José Yuste2,4, Alberto Anel7, Antonio Peixoto5, Carlos Martín1,2,8§, Nacho Aguilo1,2 *§
Bacillus CalmetteGuerin (BCG) es una vacuna bacteriana atenuada que se utiliza para proteger contra Mycobacterium tuberculosis (Mtb) en
regiones donde las infecciones son altamente prevalentes. Actualmente, el BCG se administra por vía intradérmica, pero las vías alternativas de
administración son de gran interés, incluida la administración intrapulmonar para imitar más fielmente la infección respiratoria por Mtb . En este
estudio, ratones sometidos a administración pulmonar de proteína verde fluorescente:
Se estudiaron cepas marcadas de micobacterias virulentas (Mtb) y atenuadas (BCG) para caracterizar mejor los subconjuntos de células
pulmonares infectadas. Se detectaron profundas diferencias en los patrones de diseminación entre Mtb y BCG, con una fuerte tendencia de Mtb
a diseminarse desde los macrófagos alveolares (MA) a otros subconjuntos mieloides, principalmente neutrófilos y macrófagos reclutados. La
mayoría de los BCG permanecieron en los AM, lo que promovió su activación. Estos macrófagos preactivados fueron muy eficaces para contener
los bacilos de Mtb tras la exposición e interrumpir la diseminación bacteriana temprana, lo que sugiere un posible mecanismo de protección
asociado con la vacunación pulmonar con BCG. El BCG respiratorio también protegió a los ratones contra un desafío letal de Streptococcus
pneumoniae , lo que sugiere que la activación innata inducida por BCG podría conferir protección heteróloga contra patógenos respiratorios
diferentes de Mtb. BCG impulsó la activación a largo plazo de los AM, incluso después de la autorización de la vacuna, y estos AM reaccionaron
eficientemente ante la exposición posterior. Estos resultados sugieren la generación de una respuesta similar a la memoria innata entrenada en
los MA inducida por la vacunación pulmonar con BCG.
INTRODUCCIÓN mejoras sustanciales en la protección conferida por la vacunación pulmonar en

La vacuna Bacillus CalmetteGuérin (BCG) se utiliza desde hace casi un siglo, pero comparación con la inmunización subcutánea o intradérmica (4, 5). La mayoría de
la tuberculosis (TB) sigue siendo una de las principales causas de mortalidad causada los estudios que describen las respuestas inmunes de las mucosas provocadas
por un solo patógeno y fue responsable de ~1,4 millones de muertes en todo el específicamente por el BCG pulmonar se han centrado en las respuestas adaptativas.
mundo en 2019 (1) . Además, la creciente amenaza de cepas multirresistentes y Se ha informado que las células T auxiliares 17 y las inmunoglobulinas mucosas
extremadamente resistentes a los medicamentos convierte a la tuberculosis en un específicas de la tuberculosis se inducen después de la inmunización pulmonar con
problema de salud mundial urgente y destaca la necesidad de un enfoque de vacuna BCG tanto en ratones (6) como en NHP (7). Sin embargo, se sabe poco sobre la
contra la tuberculosis más eficaz. contribución de la inmunidad innata local a la protección inducida por la vacuna.
Existe un interés renovado en estrategias basadas en la administración de BCG
por vías de administración no canónicas y recientemente se ha demostrado que la La entrada de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) en las vías respiratorias produce
vacunación con BCG intravenosa induce protección en primates no humanos (NHP). interacciones de los bacilos con las células fagocíticas del pulmón, y estas
La vacunación con BCG por vía pulmonar se describió por primera vez en estudios interacciones dictan los resultados de la infección que pueden variar desde la
clínicos realizados hace varias décadas (2, 3), y los resultados en múltiples modelos esterilización hasta la diseminación bacteriana. Las micobacterias son engullidas por
preclínicos demostraron macrófagos alveolares (MA) ubicados en las vías respiratorias durante las etapas
iniciales de la infección, y las células infectadas migran rápidamente al intersticio
pulmonar donde los bacilos pueden diseminarse a otras células fagocíticas,
1
Grupo de Genética de Micobacterias, IIS Aragón, Facultad de Medicina, Universidad principalmente macrófagos intersticiales (IM) diferenciados y neutrófilos (8) . ). Estas
2
de Zaragoza, C/ Domingo Miral s/n, 50009 Zaragoza, España. CIBER Enfermedades
Respiratorias, Instituto de Salud Carlos III, Madrid, España.
3
Institut de Pharmacologie et de
poblaciones celulares presentan tolerabilidad diferencial a Mtb
Biologie Structurale (IPBS), Université de Toulouse, CNRS, UPS, Toulouse, Francia. replicación. Los MI son altamente inflamatorios y alteran eficazmente la replicación
4 5
Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, Madrid, España. buscar Centro de Re
bacteriana (9, 10), aunque algunos subconjuntos de macrófagos parecen ser más
Encefalopatías y Enfermedades Emergentes Transmisibles, Universidad de Zaragoza, Zaragoza, España.
6 susceptibles a la infección (11). Los neutrófilos suelen ser más permisivos a la
Departamento de Medicina Interna y Centro Radboud de
Enfermedades Infecciosas (RCI), Centro Médico de la Universidad Radboud de Nijmegen, Nijmegen, infección y se han asociado con la diseminación bacteriana durante la tuberculosis
7
Países Bajos. Grupo Apoptosis, Inmunidad y Cáncer, IIS Aragón, Dpto. activa (1214).
Bioquímica y Biología Molecular y Celular, Fac. Ciencias, Universidad de Zaragoza, Zaragoza, España.
8 En el presente estudio, caracterizamos la activación de los macrófagos
Servicio de Microbiología, Hospital Universitario Miguel Servet, ISS Aragón,
Paseo, Isabel la Católica 13, 50009 Zaragoza, España.
pulmonares inducida por la vacunación pulmonar con BCG y la contribución de
*Autor correspondiente. Correo electrónico: naguilo@unizar.es estos macrófagos a la protección contra la tuberculosis. Nuestros resultados sugieren
†Dirección actual: Certest Biotec, San Mateo de Gállego, 50840 Zaragoza, España. un papel clave de la propagación de célula a célula por Mtb durante la infección
‡Dirección actual: Laboratorios MeakinsChristie, Departamento de Medicina, Centro de Salud de la
temprana y cómo la interrupción de este proceso de diseminación puede adaptarse
Universidad McGill, Universidad McGill, Montreal, QC, Canadá.
§Estos autores compartieron la autoría principal de este trabajo. a un enfoque de vacunación protectora.
Mata et al., Sci. Inmunol. 6, eabc2934 (2021) 24 de septiembre de 2021 1 de 13

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RESULTADOS y los macrófagos son positivos para CFP, mientras que los neutrófilos maduros son
Patrón diferencial de diseminación celular temprana entre positivos para GFP pero negativos para CFP, y esto permite la visualización de bacterias
MTB y BCG por parte de los neutrófilos en los pulmones infectados. Nuestros resultados mostraron
Primero caracterizamos las poblaciones de células pulmonares infectadas en diferentes que se reclutó una mayor cantidad de neutrófilos (GFP+ CFP− ) en el pulmón infectado
s2l
momentos de la infección pulmonar después de una exposición intranasal con la cepa después de la infección por H37Rv en comparación con BCG (Fig. 1J).
w
virulenta de Mtb H37Rv que expresa la proteína verde fluorescente (GFP) (fig. S1). Una De acuerdo con nuestros datos de citometría de flujo, los neutrófilos (GFP+ CFP− )
d
exposición intranasal a dosis bajas de Mtb representa uno de los modelos fisiológicos adquirieron H37Rv tan pronto como 24 horas (3%) después de la infección, con un
más relevantes de infección por tuberculosis en ratones, pero una baja carga bacteriana porcentaje mayor (20%) observado el día 13 después de la infección (Fig. 1K). Por el
dificulta la discriminación de las células infectadas de la fluorescencia inicial de las células contrario, el BCG rara vez, o nunca, se detectó en los neutrófilos (GFP+ CFP− ).
e
no infectadas (15).
Por esta razón, realizamos experimentos de desafío con una dosis alta de 106 unidades Realizamos un experimento de desafío con H37Rv después del agotamiento de los
formadoras de colonias (UFC) H37Rv para evaluar las poblaciones infectadas en los días neutrófilos para definir mejor el papel de los neutrófilos durante la infección temprana. El
1 y 7 después de la infección. En los días 13 y 24, utilizamos 105 y 104 UFC, agotamiento de los neutrófilos se llevó a cabo utilizando una combinación del anticuerpo
respectivamente, para limitar los síntomas asociados a la enfermedad y la mortalidad monoclonal antiLy6G (clon 1A8) con un anticuerpo secundario antiIgG de rata de
prematura en estos momentos posteriores (Fig. 1A). ratón (fig. S4A) (20). Para evaluar el agotamiento celular, se detectaron neutrófilos como
Como se esperaba, se descubrió que los AM (CD11chighCD64+ SiglecF+ ) eran el células CD11c CD11b+ Ly6cdim (fig. S4B), ya que el anticuerpo neutralizante
principal subconjunto infectado en los primeros momentos después de la exposición intranasal.
supuestamente utilizado en este protocolo enmascara la unión del anticuerpo antiLy6G
Sin embargo, en momentos posteriores, una fracción mayor de células infectadas tenía utilizado para la detección por citometría de flujo (20). Obtuvimos una reducción
un fenotipo compatible con neutrófilos (CD11c CD64 SiglecF promedio de aproximadamente el 65 % de los neutrófilos en los pulmones medida el día
CD11b+ Ly6G+ ) (Fig. 1, B y C, y fig. S2A), y este resultado se correlaciona con un 19 después de la infección (fig. S4B), y observamos una fuerte disminución de los
aumento de la neutrofilia en los pulmones durante todo el curso de la infección (fig. S2B). neutrófilos infectados con Mtb en relación con los ratones no agotados (una reducción
Un análisis adicional indicó que los IM (CD11cdimCD64+ SiglecF ) se reclutaron en el del 60 al 20 % de las células infectadas) en este momento. En estas condiciones de
pulmón desde el día 13 después de la infección (fig. S2B) y que Mtb se propaga de los neutrofilia reducida, encontramos que las bacterias no se retenían dentro de los AM
AM a los IM durante el curso de la infección (Fig. 1, B y D, y fig. S2A), que confirma independientemente de la eliminación de neutrófilos, y en su mayoría migraban a los IM
observaciones publicadas anteriormente (8). (fig. S4C).
Inesperadamente, los niveles más bajos de infección por neutrófilos no se correlacionaron
A continuación, examinamos si la diseminación temprana de Mtb estaba asociada con las diferencias en la carga bacteriana o la proporción de células infectadas, que no
con la virulencia o si servía como una estrategia para combatir la infección. Evaluamos difirieron notablemente entre los grupos agotados y no agotados (fig. S4, D y E). Esta
los patrones de diseminación bacteriana de una vacuna BCG que expresa GFP porque observación sugiere que la colonización de neutrófilos podría no ser un determinante
se trata de una cepa atenuada que puede ser controlada por el sistema inmunológico del crucial para la tuberculosis.
huésped en caso de infección respiratoria (16). Analizamos las poblaciones de células La replicación in vivo y la infección bacteriana podrían progresar con éxito en otros
infectadas después de la administración intranasal de BCG, en los mismos momentos compartimentos celulares, como los IM. Encontramos que tanto los IM infectados como
estudiados para H37Rv (Fig. 1E). La deficiencia de RD1 (región de diferencia 1) en BCG los totales mostraron una menor expresión del marcador de activación del complejo
representa la principal causa de atenuación y deterioro de la capacidad infectiva (17), por mayor de histocompatibilidad II (MHCII) en el grupo agotado (fig. S4F). Esta observación
lo que incluimos una cepa de BCG complementada con RD1 (BCG::RD1), que sugirió que los neutrófilos pueden contribuir a la activación óptima de los IM
previamente se había informado que restablecía la virulencia (16 ). La misma dosis de espectadores, lo que puede explicar la permisibilidad de estas células para permitir la
106 replicación de Mtb en estas condiciones.
Se utilizaron UFC tanto para BCG como para BCG::RD1 (Fig. 1E), ya que no se detectó
toxicidad adicional con BCG::RD1 en momentos posteriores. Aunque se observó un
aumento en los neutrófilos no infectados el día 24 en los pulmones de ratones infectados La vacunación BCG pulmonar pero no subcutánea induce la activación de los
con BCG (fig. S2B), la cepa de la vacuna apenas se propagó a los neutrófilos y macrófagos pulmonares
permaneció asociada con los macrófagos en todos los momentos medidos (Fig. 1F y A continuación, estudiamos la expresión de marcadores de activación conocidos en
fig. . S2A), a diferencia de la diseminación observada de H37Rv. Se detectó un macrófagos infectados con BCG. Observamos un aumento dependiente del tiempo en
subconjunto de neutrófilos infectados con BCG::RD1 el día 13 después de la infección MHCII, CD86 y óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) en las células que contienen BCG
(Fig. 1G), y esto se correlacionó con el fenotipo virulento restaurado de la cepa BCG (GFP+ ) (Fig. 2A). La BCG pulmonar también desencadenó la activación de macrófagos
complementada definida por una mayor proporción de BCG::RD1 total. no infectados (GFP )
(Fig. 2B), lo que concuerda con estudios previos (21). Se observó una tendencia similar
células infectadas y una mayor carga bacteriana en los pulmones de los ratones cuando los macrófagos se infectaron con GFP que expresaba H37Rv (fig. S5), aunque
infectados en relación con el grupo BCG (fig.S3). En los días 13 y 24, BCG::RD1 pasó a con una cinética más rápida, lo que sugiere que la activación de los macrófagos se
IM (Fig. 1I), similar a lo observado con Mtb produce independientemente de los niveles de virulencia bacteriana.
(Figura 1D). Este patrón de diseminación bacteriana no se observó con BCG, que se
limitó principalmente a los AM y tuvo una propagación limitada a los IM en el día 24 (Fig. Evaluamos la activación de macrófagos inducida por vacunación intranasal o
1H y fig. S2A). subcutánea inmunizando ratones con 106 UFC de BCG y analizando la activación de
Para confirmar la propagación de Mtb in situ, utilizamos microscopía confocal para macrófagos a las cuatro u 8 semanas después de la vacunación (Fig. 2C). Se detectaron
visualizar la adquisición de Mtb y BCG por parte de las células pulmonares en los días 1 bacterias BCG en los pulmones en ambos momentos después de la inmunización
y 13 después de la infección. Infectamos una línea de ratón transgénico obtenida del intranasal, pero no se encontraron colonias de BCG detectables en ratones que recibieron
cruce de Csf1reCFP (proteína fluorescente cian mejorada) BCG subcutáneo.
(MacBlue) (18) y ratones LysMGFP (19) con H37RVRFP (proteína fluorescente roja) o (Figura 2D). El BCG intranasal, pero no el BCG subcutáneo, indujo la activación de los
BCGRFP. En esta línea de ratones, los monocitos macrófagos a las 4 y 8 semanas después de la vacunación (Fig. 2E).

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Fig. 1. Patrones diferenciales de diseminación de célula
a célula entre cepas virulentas y atenuadas. (A) Esquema
de infección respiratoria por Mtb .
Se infectaron ratones adultos C57BL/6 por vía intranasal
con Mtb etiquetado con GFP (H37Rv::gfp). (B) Gráficos
s2l
de puntos representativos que muestran células infectadas
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d
con Mtb en los días 1, 7, 13 y 24 después de la infección,
y proporciones de poblaciones controladas por GFP+
determinadas mediante análisis de marcadores CD64 y
SiglecF. Los cuadros corresponden a AM (azul), IM
e
(naranja) y neutrófilos (rosa). SSC, luz de dispersión
lateral. (C) Frecuencias de macrófagos y neutrófilos infectados por Mtb.
(D) Frecuencias de AM e IM infectados por Mtb.
(E) Esquema de administración intranasal (in) de BCG y
BCG::RD1 etiquetados con GFP en ratones. (F)
Frecuencias de macrófagos infectados con BCG y BCG::RD1.
(G) Frecuencias de BCG y BCG :: neutrófilos infectados
con RD1. (H) Frecuencias de AM e IM infectados con
BCG. (I) Frecuencias de AM e IM infectados con BCG ::
RD1. (J) Proyección de intensidad máxima de pilas de
microscopía confocal de secciones de tejido pulmonar de
ratones infectados con Csf1reCFP × LysMGFP en los
días 1 y 13 después de la infección. Los neutrófilos son
GFP+ y CFP−, mientras que los macrófagos y monocitos
son CFP+ . Las flechas rojas resaltan
ejemplos de células infectadas. (K) Cuantificación de
neutrófilos totales (arriba) e infectados (abajo) a partir de
imágenes de microscopía confocal. (C a H) Datos
agrupados de dos experimentos independientes (n = 6
ratones por grupo). Los gráficos se presentan como
medias ± DE. **P<0,01, ***P<0,001 y ****P<0,0001
mediante pruebas t de Student no apareadas múltiples
(C, D y F a H) y ANOVA unidireccional con prueba
posterior de Bonferroni (K).
lo que sugiere que puede ser necesaria la

presencia física de BCG para desencadenar la
activación de los macrófagos, pero esta
comparación no se pudo hacer aquí ya que el
BCG subcutáneo no resultó en la colonización pulmonar.
Analizamos las diferencias en los perfiles de
expresión génica de los AM a las 8 semanas
después de la vacunación con BCG intranasal.
Se siguieron genes diana seleccionados en
función de su papel en la inflamación y el
metabolismo, incluida la glucólisis, porque la
expresión de estos genes se ha asociado con la
activación celular innata a largo plazo (22).
Observamos la regulación positiva sostenida de
varios genes asociados con un perfil inflamatorio de macrófagos, incluidos Nos2, Los macrófagos activados por BCG contienen una infección temprana
Ifng, Irf8 o Ccl2 (Fig. 2F). y previenen la propagación de Mtb desde los AM
Varios de los genes más regulados están relacionados con una mayor función Estas observaciones nos llevaron a plantear la hipótesis de que el BCG intranasal–
metabólica en estas células, como Hk2, Ldlr, G6pdx o Ldha. Los AM preactivados podrían representar una barrera de contención primaria contra
La regulación positiva de estas vías se ha descrito como un sello distintivo de la una infección posterior por Mtb . Para probar esta hipótesis, inmunizamos ratones
inducción de inmunidad entrenada tanto a nivel central como en los AM (23, 24). con BCG no fluorescente (106 UFC) por vía intranasal o subcutánea y los
desafiamos 8 semanas después mediante

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Fig. 2. La presencia de BCG en el pulmón desencadena
la activación de los macrófagos pulmonares. (A)
Histogramas representativos e intensidad de fluorescencia
de la expresión de MHCII, CD86 e iNOS activada en
macrófagos infectados con BCG (GFP+ ) en los días 1
s2l
(gris), 13 (azul) y 20 (rosa) después de la inoculación de
w
d
ratones adultos C57BL/6 con BCG etiquetado con GFP. PE, ficoeritrina.
(B) Expresión de MHCII, CD86 e iNOS por macrófagos
no infectados (GFP ). (C) Esquema de la vacunación
con BCG de ratones marcada con GFP por vía intranasal
e
y subcutánea (sc). (D) UFC de BCG en los pulmones a
las 4 y 8 semanas después de la administración de la
vacuna. (E) Expresión de MHCII, CD86 e iNOS por
macrófagos pulmonares totales de grupos de BCG
subcutáneo (púrpura) y BCG intranasal (azul) o ratones
no vacunados (gris). (F) Expresión genética relativa de
AM clasificados de ratones vacunados con BCG intranasal
8 semanas después de la vacunación. Los datos son
representativos de dos experimentos independientes (n
= 6 ratones por grupo). Los gráficos se presentan como
media ± DE. **P<0,01, ***P<0,001 y ****P<0,0001
mediante ANOVA unidireccional con prueba posterior de
Bonferroni (A, B, D, E, F).
Los ratones vacunados (Fig. 3C y Fig. S6A) y las

micobacterias virulentas generalmente se
localizaron en el compartimento de los macrófagos
en ambos momentos (Fig. 3D). En el BCG
transnasal se asoció con menos
neutrófilos no infectados en los pulmones en

comparación con los controles no vacunados (fig. S6B).
Estas observaciones se correlacionaron con una
fuerte efecto protector inducido por la vacuna,

demostrado por una carga bacteriana reducida en
los pulmones (Fig. 3E) en el grupo de BCG
intranasal en comparación con los controles no
vacunados. BCG subcutáneo
la vacunación resultó en una enfermedad similar
perfil de seminación al de los controles no
vacunados, con una mayor proporción de neutrófilos
infectados en comparación con el grupo de BCG
intranasal. Hubo una disminución sustancial de
los neutrófilos infectados hacia el día 24 (Fig. 3C y
administración intranasal de una cepa H37Rv que expresa GFP (Fig. 3A). Comparamos fig. S6A), que se correlacionó con el control de la infección (Fig. 3E).
marcadores de activación de células infectadas con Mtb en ratones ingenuos versus
vacunados. Nuestros datos revelaron que los AM infectados con Mtb El análisis de los subconjuntos de macrófagos indicó que Mtb estaba restringido
(GFP+ ) en el día 1 después de la exposición ya están presentes en un estado activado principalmente a AM en los ratones vacunados con BCG intranasal, lo que sugiere que
en el grupo de BCG intranasal y son positivos para los tres marcadores inflamatorios los AM previamente activados limitaban notablemente la capacidad de Mtb.
analizados (MHCII, CD86 e iNOS) (Fig. 3B). extenderse a otros compartimentos celulares (Fig. 3F y fig. S6A).
Por el contrario, el estado de activación de los AM infectados con Mtb de ratones Tanto los ratones no vacunados como los vacunados por vía subcutánea mostraron
inmunizados con BCG subcutáneo fue menor y similar al de la ONU. una propagación bacteriana progresiva de MA a IM a lo largo de la infección. Se
controles vacunados. detectó una mayor proporción de IM infectados el día 7 después de la exposición en el
El análisis de células infectadas (GFP+ ) reveló una diseminación restringida (baja) grupo vacunado por vía subcutánea en comparación con los ratones no vacunados
de Mtb a los neutrófilos en los pulmones por vía intranasal. (Fig. 3F), lo que concuerda con estudios previos.

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Fig. 3. Los macrófagos pulmonares de ratones vacunados
con BCG pulmonar, pero no subcutánea, protegen contra
la Mtb. (A) Esquema de vacunación intranasal y subcutánea
de ratones con BCG no fluorescente y posterior desafío
intranasal con H37Rv que expresa GFP medido en días
s2l
después de la infección (pi). (B) Histogramas representativos
w
d
e intensidad de fluorescencia de la expresión de MHCII,
CD86 e iNOS activada en macrófagos infectados con
H37Rv el día 1 después del desafío, en ratones vacunados
con BCG subcutáneo (púrpura) no vacunados (gris) y
e
vacunados con BCG intranasal (azul). (C) Frecuencias de
neutrófilos infectados por Mtb en BCG subcutáneo no
vacunado (gris).
ratones vacunados (púrpura) y vacunados con BCG

intranasal (azul). (D) Frecuencias de macrófagos infectados
con Mtb en ratones no vacunados (gris), vacunados con
BCG subcutáneo (púrpura) y vacunados con BCG intranasal
(azul). (E) Cargas bacterianas de Mtb en los pulmones de
ratones no vacunados, vacunados con BCG subcutáneo y
vacunados con BCG intranasal. (F) Frecuencias de AM e
IM infectados con Mtb en ratones no vacunados, vacunados
con BCG subcutáneo y vacunados con BCG intranasal. (G)
Esquema de vacunación intranasal y subcutánea de ratones
con BCG y posterior exposición intranasal con S.
pneumoniae. (H) Curva de supervivencia de ratones no

vacunados, vacunados con BCG subcutáneo y vacunados
con BCG intranasal después de S. pneumoniae
desafío. (I) Cargas bacterianas de S. pneumoniae en

sangre en BCG subcutáneo no vacunado.
ratones vacunados y vacunados con BCG intranasal a las
24, 48 y 72 horas después de la infección. (B) Los datos
son representativos de dos experimentos independientes
(n = 3 ratones por grupo). (C a F) Datos agrupados de dos
experimentos independientes (n = 6 ratones por grupo). (I)
Datos agrupados de dos experimentos independientes (n
= 4 a 5 ratones por grupo).
Los gráficos se presentan como medias ± DE. *P < 0,05,
**P < 0,01, ***P < 0,001 y ****P < 0,0001 mediante ANOVA
unidireccional con prueba posterior de Bonferroni (B) y
ANOVA bidireccional con prueba posterior de Bonferroni (C
a I) . La supervivencia se analizó mediante la prueba de
rango logarítmico (MantelCox).
estudios y puede ser un mecanismo potencial de protección inducido por BCG Entrada de neutrófilos desde la circulación a los pulmones. De manera similar,
subcutáneo (25). la presencia de IM CD45+ reflejó el reclutamiento de estas células desde la
Evaluamos la compartimentación de las células mieloides pulmonares sangre al parénquima pulmonar, aunque se encontró que la proporción de
que fueron infectadas in vivo. El anticuerpo antiCD45 se administró por vía células circulantes era mayor poco después de la exposición, disminuyendo
intravenosa antes de la eutanasia para distinguir las células inmunitarias progresivamente a lo largo de la infección (fig. S7B). No se encontraron
células GFP+ en las células circulantes CD45+, lo que indica que la infección
reclutadas de la circulación frente a las células residentes en el tejido pulmonar (fig.
S7A). Como se esperaba, no se encontraron AM CD45+ en los pulmones de se produce una vez que las células se extravasan de la circulación a los
ratones vacunados o no vacunados, lo que indica que esta población celular tejidos pulmonares (fig. S7, C y D).
reside en el tejido pulmonar (fig. S7B). Por el contrario, encontramos una gran Analizamos el marcador de proliferación Ki67 en macrófagos pulmonares
proporción de neutrófilos CD45+ (alrededor del 50%), sin observarse infectados y no infectados después del desafío. Se observó una proporción
diferencias entre los diferentes grupos, lo que indica una constante notablemente mayor de AM infectados que expresan Ki67 (GFP+ ) en

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el grupo de BCG intranasal en comparación con el grupo de BCG subcutáneo y los Los marcadores de activación en los AM podrían desencadenarse por interacciones con
controles no vacunados el día 1 después de la exposición. Esta mayor expresión de células T CD4+. La diseminación bacteriana hacia los neutrófilos en el día 13 (Fig. 4C)
Ki67 se mantuvo en todos los momentos analizados y se restringió a las células y la carga bacilar de Mtb pulmonar fueron menores en el grupo con depleción de células
infectadas. Este resultado sugiere que los AM preparados con BCG intranasal proliferan T CD4+ vacunado con BCG intranasal (Fig. 4E) en comparación con los controles no
s2l
tras la infección por Mtb , lo que podría representar un mecanismo que contribuye a la vacunados, lo que sugiere que los macrófagos activados por BCG indujeron protección.
w
protección temprana asociada con la vacunación con BCG intranasal (fig. S8). incluso en ausencia de células T CD4+. Realizamos un experimento de supervivencia
d
utilizando una dosis baja de Mtb intranasal.
Los macrófagos pueden reconocer una amplia gama de patógenos. Por lo tanto, ratones expuestos y tratados con anticuerpos antiCD4 semanalmente durante la fase
planteamos la hipótesis de que los macrófagos pulmonares activados por BCG pueden de exposición, y el agotamiento comienza antes de Mtb
e
proteger contra una infección bacteriana respiratoria diferente a la tuberculosis. inoculación. Observamos una supervivencia reducida en ratones no vacunados con
Ocho semanas después de la vacunación con BCG intranasal o subcutánea, los ratones células T CD4+ agotadas, mientras que la supervivencia no se vio afectada en los
fueron expuestos por vía intranasal a una dosis letal de Streptococcus pneumoniae y se animales inmunizados con BCG, independientemente de la presencia de células T CD4+
evaluó la supervivencia de los animales (Fig. 3H). Cinco de 10 ratones del grupo (Fig. 4F). Estos resultados sugieren que la protección temprana conferida por las
vacunado por vía intranasal no mostraron ningún síntoma asociado a la enfermedad al células innatas activadas por BCG puede ser eficaz durante períodos de tiempo más prolongados.
final del experimento (7 días después del desafío), mientras que todos los animales del Evaluamos el efecto del agotamiento de las células T CD4+ durante las fases de
grupo no vacunado alcanzaron los criterios de valoración y fueron sacrificados (Fig. 3H). vacunación y provocación (Fig. 4G). La ausencia de células T CD4+ durante la
Se encontró una protección leve pero no significativa en el grupo vacunado por vía vacunación condujo a una activación deficiente de los AM, que internalizaron Mtb tras
subcutánea, con 2 de 10 supervivientes al final del estudio. la exposición y tuvieron una menor expresión de los marcadores MHCII, CD86 e iNOS
(Fig. 4H). El análisis de las poblaciones de células infectadas el día 13 después de la
Los ratones vacunados por vía intranasal también mostraron un menor grado de exposición indicó una menor retención de Mtb en los macrófagos del grupo con células
bacterias diseminadas en la sangre a las 24, 48 y 72 horas después de la exposición en T CD4+ agotadas en comparación con los ratones de control vacunados (Fig. 4I) y una
comparación con los controles no vacunados y con el grupo vacunado por vía subcutánea mayor diseminación hacia los neutrófilos (Fig. 4J) a niveles similares. a controles no
(Fig. 3I). vacunados. Además, la carga de Mtb en el día 13 fue comparable en las células T CD4+.
Las células T CD4+ contribuyen a la activación de macrófagos grupo agotado y ratones no vacunados (Fig. 4K), lo que sugiere la necesidad de
inducida por la vacuna activación de macrófagos mediada por células T CD4+ para la protección inducida por
La producción de interferón (IFN ) por parte de las células T CD8+ se ha descrito la vacuna.
como una citoquina clave para el cebado y la activación de los MA en respuesta a una Evaluamos la contribución de las células T CD8+ a la activación de macrófagos
infección viral respiratoria (24). Anteriormente hemos informado que el BCG intranasal inducida por BCG (fig. S11). La ausencia de células T CD8+ durante las fases de
induce una fuerte respuesta local de células T específicas de antígeno (4, 6). En el vacunación y/o exposición no tuvo ningún efecto significativo sobre la activación de AM
presente trabajo, nuestro objetivo fue evaluar la importancia de las células T en la y la carga bacteriana en los pulmones.
activación de macrófagos inducida por BCG y la protección temprana contra Mtb.
BCG pulmonar induce la activación a largo plazo de los AM
Evaluamos las respuestas de las células T específicas de antígeno inducidas por la Examinamos los efectos de la activación de macrófagos a largo plazo después de la
vacuna en diferentes momentos antes y después de la exposición mediante el análisis eliminación de la vacuna BCG, ya que esto es fundamental para identificar la adquisición
de células CD4+ y CD8+ de pulmón productoras de IFN en ratones vacunados y no de un fenotipo similar a la memoria por parte de poblaciones de células innatas (26).
vacunados. La inducción de IFN específica de las células T CD4+ fue sustancialmente Nuestra hipótesis es que las respuestas mejoradas en un Mtb secundario
mayor que la de las células T CD8+, lo que confirma que las micobacterias desencadenan El desafío puede deberse a la adquisición de la memoria y no a la presencia de los
preferentemente respuestas dependientes de las células T CD4+. Nuestros datos estímulos primarios. Vacunamos ratones con BCG intranasal y evaluamos la eliminación
revelaron que el BCG intranasal indujo células CD4+ productoras de IFN en todos los bacteriana en diferentes momentos después de la inmunización (Fig. 5A). Se encontraron
momentos analizados, incluido el día 1 antes de la exposición (fig. S9, A a C). Por el algunas bacterias BCG en los pulmones a los 5 meses, pero no a los 7 meses (Fig. 5B).
contrario, las respuestas pulmonares inducidas por BCG subcutáneo se retrasaron hasta También caracterizamos diferentes poblaciones mieloides con el objetivo de evaluar los
el día 7 después de la exposición. Además, medimos IFN eventos de infiltración celular que acompañan a la eliminación bacteriana (Fig. 5C).
concentración de proteínas en suspensiones pulmonares de BCG intranasal– Nuestros datos revelaron una fuerte correlación entre la cantidad de BCG pulmonar y el
ratones vacunados después del agotamiento de las células T CD4+ o CD8+ , lo que fue nivel de IM infiltrados (Fig. 5, C y D). El número de neutrófilos se elevó en el grupo
muy eficaz para ambas poblaciones (>95%) (fig. S10). Los niveles de IFN se redujeron vacunado 1 mes después de la vacunación (Fig. 5D). La infiltración IM y de neutrófilos
profundamente en ausencia de células CD4+ y no de CD8+ , desapareció a los 7 meses (criterio de valoración fijo del experimento), lo que sugiere
lo que sugirió que los linfocitos T CD4+ eran los principales productores de esta citocina que el estado inflamatorio inducido por la vacuna se resolvió tras la eliminación bacteriana
después de la vacunación pulmonar con BCG (fig. S9, D y E). y el entorno inmunológico pulmonar volvió a la homeostasis.
Sobre la base de estos resultados, evaluamos el papel de las células T CD4+ en la
activación de los macrófagos pulmonares. Los ratones fueron vacunados con BCG
intranasal y las células T CD4+ se agotaron en el momento de la infección por Mtb .
El agotamiento de las células T CD4+ mediado por anticuerpos se inició 1 semana antes Los AM detectados 7 meses después de la vacunación mostraron una alta
de la exposición (Fig. 4A), lo que permitió que estas células estuvieran presentes durante expresión de MHCII y CD86, lo que indica que estas células mantuvieron cierto grado
la fase de vacunación. Nuestros resultados revelaron que los AM infectados con Mtb de activación después de la eliminación de la vacuna en comparación con los controles
(células GFP+ ) analizados 1 día después de la exposición intranasal permanecieron no vacunados de la misma edad (Fig. 5E). La expresión de iNOS no fue significativamente
activados en ausencia de células T CD4+, confirmado por la expresión de MHCII y diferente entre los grupos vacunados y sin tratamiento previo, lo que difirió de las
CD86 (Fig. 4B). Encontramos una menor expresión de iNOS en el grupo con células T observaciones en la vacunación a corto plazo.
CD4+ agotadas, lo que sugiere que experimentos. Evaluamos la expresión de los genes estudiados en 2 meses.

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de
Fig. 4. Las células T CD4+ contribuyen a la activación de
macrófagos inducida por la vacuna. (A) Esquema de
vacunación intranasal con BCG no fluorescente en ratones
y posterior desafío intranasal con GFP que expresa H37Rv,

con tratamiento de agotamiento de células T CD4+ mediante
s2l
administración intraperitoneal de anticuerpos neutralizantes
w
d
antiCD4, comenzando 7 días antes del desafío intranasal
con H37Rv. (B) Histogramas representativos e intensidad
de fluorescencia de la expresión de MHCII, CD86 e iNOS
activada en macrófagos infectados con H37Rv el día 1
e
después de la exposición, en BCG intranasal no vacunado
(gris).
grupos vacunados (azul) y vacunados con BCG intranasal
con células T CD4+ empobrecidas (rojo). (C) Frecuencias
de neutrófilos infectados con Mtb en ratones no vacunados
(gris), vacunados con BCG intranasal (azul) y vacunados
con BCG intranasal con células T CD4+ empobrecidas
(rojo). (D) Frecuencias de macrófagos infectados con Mtb
en células T CD4+ no vacunadas (gris), vacunadas con
BCG (azul) y vacunadas con BCG intranasal .
ratones agotados (rojos). (E) Cargas bacterianas de Mtb en
los pulmones de células T no vacunadas, vacunadas con
BCG intranasal y vacunadas con BCG intranasal/CD4+ .
ratones agotados. (F) Curva de supervivencia utilizando
una exposición a Mtb en dosis bajas de 500 UFC y
agotamiento de células T CD4+ a partir de la exposición.
(G) Esquema de vacunación intranasal de ratones con
BCG no fluorescente y posterior desafío intranasal con

H37Rv que expresa GFP, con tratamiento intraperitoneal
de agotamiento de células T CD4+, comenzando 7 días
antes de la vacunación con BCG intranasal. (H)
Histogramas representativos e intensidad de fluorescencia
de la expresión de MHCII, CD86 e iNOS activada en
macrófagos infectados con H37Rv el día 1 después de la
exposición, en BCG intranasal no vacunado (gris).
grupos de ratones vacunados (azul) y vacunados con BCG
intranasal con células T CD4+ empobrecidas (rojo). (I)
Frecuencias de macrófagos infectados con Mtb en células
T CD4+ no vacunadas (gris), vacunadas con BCG intranasal
(azul) y vacunadas con BCG intranasal .
ratones agotados (rojos). (J) Frecuencias de neutrófilos
infectados con Mtb en ratones no vacunados (gris),
vacunados con BCG intranasal (azul) y vacunados con
BCG intranasal, con células T CD4+ empobrecidas (rojo).
(K) Cargas bacterianas de Mtb en pulmones de grupos no
vacunados, vacunados con BCG intranasal y vacunados
con BCG intranasal con células T CD4+ empobrecidas.
Los datos son representativos de dos experimentos
independientes (n = 6 ratones por grupo). Los gráficos se
presentan como medias ± DE. ns, no significativo.
*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 y ****P<0,0001 mediante
ANOVA unidireccional con prueba posterior de Bonferroni
(B y H) y ANOVA de dos vías con prueba posterior de
Bonferroni (C a F y I a K). La supervivencia se analizó
mediante la prueba de rango logarítmico (MantelCox).
experimentos de vacunación (Fig. 2F) en AM clasificados desde el mes siete. mayor capacidad de respuesta a la estimulación secundaria (24, 27, 28). Los
En este caso, solo los niveles de expresión de Ldlr, Irf8 e Il1b estuvieron ratones fueron desafiados con H37Rv que expresa GFP como estímulo
notablemente regulados en los AM clasificados, de modo que la expresión secundario 7 meses después de la vacunación con BCG intranasal (Fig. 5F), y
basal de los marcadores inflamatorios detectados 2 meses después de la el nivel de expresión de los marcadores de activación se midió en AM infectados
vacunación casi había desaparecido en el séptimo mes (fig. S12). (GFP+) y no infectados (GFP) el día 1 después del desafío . . Supusimos que
Se ha demostrado que ciertos subconjuntos de células innatas experimentan no era probable que las células GFP tanto en los grupos vacunados como en
un cambio hacia un fenotipo similar a la memoria, que se caracteriza por los no vacunados desencadenaran una respuesta secundaria ya que no habían interactuado

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de
directamente con bacterias de desafío. Nuestros datos
demostraron que los AM por vía intranasal
El grupo BCG se comportó como se predijo para una

respuesta similar a la memoria, con un aumento
s2l
sustancial en el marcador de activación.
w
expresión en células infectadas en relación con células
d
no infectadas (Fig. 5G). Esto fue particularmente
notable para iNOS, porque los AM activados a largo
plazo tenían una expresión reducida de este marcador
e
(Fig. 5E) que aumentó rápidamente con la estimulación
secundaria.
Como habíamos demostrado para las vacunas a corto plazo.
En los experimentos de vacunación, la diseminación

bacteriana de neutrófilos el día 13 después de la
exposición se redujo notablemente en estas
condiciones (Fig. 5H), con las micobacterias
contenidas principalmente en macrófagos (Fig. 5I).
Las cargas bacilares (UFC) en los pulmones de los
ratones vacunados también fueron menores en
comparación con los controles no vacunados (Fig.
5J), lo que sugiere que los macrófagos preparados
con BCG mantuvieron su capacidad para restringir la
replicación de Mtb a largo plazo después de la
vacunación.
DISCUSIÓN
La administración pulmonar de BCG es un tema de
renovado interés en términos de su viabilidad para su
uso en la clínica y su capacidad potencial para conferir
una protección local más específica y duradera en los
pulmones contra la tuberculosis pulmonar. Un estudio
clínico reciente sobre la vacunación pulmonar con
BCG en voluntarios adultos sanos no informó
problemas importantes de seguridad después de la
administración de la vacuna con
un broncoscopio (29). Además, recientemente se

completaron dos ensayos clínicos realizados por la
Universidad de Oxford para evaluar la seguridad y la
inmunogenicidad de BCG por vía de aerosol en adultos
del Reino Unido (NCT02709278 y NCT03912207), y
hasta la fecha no se han informado problemas
importantes de seguridad. Desde la perspectiva de la
eficacia protectora, datos sólidos tanto en ratones
como en cobayas indican una mejor protección
Fig. 5. Los macrófagos activados por BCG conservan la capacidad protectora después de la eliminación de la vacuna. (A) Esquema de
vacunación BCG marcada con GFP por vía intranasal. (B) UFC de BCG en los pulmones. (C) Gráficos de puntos representativos que conferida por el BCG intranasal en comparación con
analizan poblaciones pulmonares mediante la expresión de marcadores CD11c, CD64 y SiglecF. (D) Número de AM pulmonares totales, el BCG subcutáneo (5, 6).
IM y neutrófilos. Los controles corresponden a ratones no vacunados. (E) Histogramas representativos e intensidad de fluorescencia de la
expresión de MHCII, CD86 e iNOS en macrófagos totales en el mes 7 después de la vacunación, en grupos de ratones no vacunados Más recientemente, se demostró que el BCG pulmonar
(gris) y vacunados con BCG intranasal (púrpura). (F) Esquema de vacunación intranasal con BCG no fluorescente en ratones y posterior podría prevenir no sólo la enfermedad de tuberculosis
desafío intranasal con H37Rv que expresa GFP (H37Rv::gfp). (G) Histogramas representativos de expresión de MHCII, CD86 e iNOS en sino también la infección por tuberculosis en los PNH.
personas no infectadas (gris) e infectadas con Mtb, (GFP+).
verde) macrófagos pulmonares de ratones no vacunados y vacunados con BCG
(7). Sin embargo, los mecanismos inmunológicos
intranasal medidos 1 día después de la infección con H37Rv etiquetado con GFP. El gráfico muestra las proporciones de intensidades de
detrás de este efecto protector no se comprenden
fluorescencia entre las células GFP+ y GFP para cada marcador y estado de vacunación. (H) Frecuencias de neutrófilos infectados con
completamente y los estudios disponibles se centraron
Mtb en grupos de ratones no vacunados y vacunados con BCG. (I) Frecuencias de macrófagos infectados con Mtb en grupos no
en las respuestas adaptativas de la mucosa con pocos
vacunados y vacunados con BCG. (J) Cargas bacterianas de Mtb en pulmones en ratones no vacunados y vacunados con BCG. Los
datos son representativos de dos experimentos (n = 2 a 6 ratones por grupo). Los gráficos se presentan como medias ± DE. *P < 0,05, datos sobre la interacción y la modulación de las
**P < 0,01, ***P < 0,001 y ****P < 0,0001 mediante ANOVA unidireccional con prueba posterior de Bonferroni (B y D), prueba t de Student poblaciones mieloides pulmonares por parte del BCG.
no apareada múltiple (E y G) y ANOVA de dos vías con postprueba de Bonferroni (H a J).

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Se ha descrito que los MA representan una población permisiva para la Una población restrictiva de la tuberculosis, con una fuerte capacidad para contener
replicación de Mtb , como se ha informado para las primeras etapas de la infección la infección, y el escape de la tuberculosis de los MA podrían representar un paso
(8). Según nuestros datos, una pregunta relevante debería ser ¿por qué las clave de virulencia.
micobacterias virulentas habrían evolucionado para adquirir la capacidad de escapar Se ha especulado que el éxito de Mtb en la colonización de los pulmones se
s2l
de este nicho celular y extenderse a otros subconjuntos celulares? Una explicación debe al retraso en el desarrollo de una respuesta celular eficaz antes de la entrada
plausible podría ser que los AM ingenuos pero los AM no activados representan un del patógeno en las vías respiratorias (33). Durante este tiempo, los MA no
w
d
reservorio permisivo de Mtb . Un estudio previo demostró que la infección por activados que contienen bacilos de Mtb migran al parénquima pulmonar y permiten
micobacterias in vivo inducía la reprogramación transcriptómica en los MA poco la replicación y diseminación bacteriana, lo cual es fundamental para el
después de la infección, que fue desencadenada por el factor nuclear eritroide 2 establecimiento de la infección (8). El control de la replicación por parte del huésped
e
relacionado con el factor 2 (NRF2) y condujo a la adquisición de un fenotipo se correlaciona con la migración de células T CD4+ específicas de antígeno a los
proinflamatorio (21) . Además, una publicación reciente que describe las poblaciones pulmones que se habían activado en los ganglios linfáticos de drenaje (34).
de células pulmonares asociadas con la tuberculosis activa o latente en los PNH En el caso de la inmunización subcutánea con BCG, el tiempo entre el encuentro
mostró una fuerte correlación entre los altos niveles de MA y el control de la bacteriano y la generación de la respuesta celular se reduce con la vacunación,
infección, mientras que los MA están casi ausentes en personas con tuberculosis pero existe una ventana en la que las bacterias pueden replicarse y establecer la
activa (30) . De acuerdo con estos estudios, observamos una regulación positiva de infección en ausencia de respuestas inmunes mediadas por células ( 33 ). Se ha
los marcadores de activación en los AM de ratones infectados con Mtb en demostrado que la reducción de esta ventana es una estrategia prometedora para
comparación con los controles no infectados, y los AM expresaron moléculas con aumentar la eficacia protectora de la vacuna (35).
funciones bactericidas, incluida iNOS. En el momento en que detectamos AM Nuestros datos con la vacunación BCG intranasal indican que las enfermedades virulentas
activados, sólo una pequeña fracción de Mtb Las micobacterias son internalizadas por un subconjunto celular restrictivo de la
Los bacilos estaban contenidos dentro de estas células. Estos hallazgos sugieren tuberculosis en los primeros momentos de la infección, y la ventana de oportunidad
que los bacilos de Mtb están bajo presión para escapar de los AM ingenuos antes para que Mtb se replique adecuadamente y alcance una carga bacteriana crítica o
de que este subconjunto celular adquiera atributos restrictivos de la tuberculosis. En se disemine hacia subconjuntos celulares permisivos se reduce notablemente. Esto
el caso del BCG atenuado, estos bacilos parecen haber perdido la capacidad de podría explicar una observación en NHP en la que el BCG pulmonar previno la
escapar de los MA tras la infección y probablemente estarían contenidos dentro de infección por tuberculosis en un modelo de exposición repetitiva a dosis ultrabajas,
estas células durante la activación celular, lo que podría contribuir a la eliminación lo que sugiere la inducción de inmunidad esterilizante (7).
progresiva del BCG. Nuestros resultados indican que los AM activados por BCG pueden contener tuberculosis
Nuestros datos indican que el BCG pulmonar induce la activación global de Infección en ausencia de células T CD4+ cuando estas células se agotan durante
macrófagos infectados y no infectados. Como resultado, los MA de ratones la fase de exposición. Sin embargo, se necesitan células T CD4+ durante la fase de
inmunizados con BCG intranasal que encuentran Mtb tras una infección pulmonar vacunación para desencadenar la activación protectora de los macrófagos. Estos
ya están activados, lo que parece tener consecuencias cruciales para el proceso de resultados indican que la inmunidad adaptativa desencadenada por la vacuna es
infección posterior. Uno de los efectos más notables es la interrupción de la dinámica crucial para la activación de los macrófagos. Sin embargo, una vez activados, los
de diseminación bacteriana en las poblaciones vecinas, incluidos los neutrófilos y macrófagos pueden contener la infección, e incluso prevenir la mortalidad de los
los MI reclutados, lo que se correlaciona con una reducción sustancial de la carga ratones inducida por la tuberculosis, independientemente de la presencia o ausencia
bacteriana. Esta observación, junto con la menor eficacia del BCG atenuado para de células T. Es muy probable que la contribución de las células T a la activación
abandonar los MA y colonizar otros subconjuntos celulares, sugiere la importancia de la AM se base en el suministro de IFN (24). En el caso de BCG, CD4+
de la dinámica de propagación bacteriana para la progresión de la infección por Las células T son los principales contribuyentes de IFN , con una contribución
tuberculosis. Varios otros estudios han demostrado una asociación de neutrófilos aparentemente prescindible de las células T CD8+. Por el contrario, un estudio
con la tuberculosis no contenida en modelos animales (13, 14) y la tuberculosis previo que utilizó la administración de adenovirus respiratorios describió la
activa en humanos (12). Por el contrario, nuestro estudio demostró que el necesidad de células T CD8+ como productoras de IFN y activación de AM en
agotamiento de neutrófilos después de la exposición a Mtb no condujo a una los reductores (24). La divergencia entre los estudios podría explicarse por la
reducción de la infección por tuberculosis, al menos en términos de UFC hipótesis de que la producción local de IFN por parte de los linfocitos adaptativos
pulmonares, lo que puede deberse a un agotamiento incompleto de neutrófilos. es necesaria para inducir la activación de los macrófagos, pero la fuente de IFN
Esta causa es poco probable ya que nuestros resultados mostraron una reducción depende del estímulo primario. Los virus tienden a inducir CD8+
sustancial de los neutrófilos que contienen Mtb, y deberíamos haber detectado una Activación de células T, pero las células T CD4+ suelen ser la fuente de IFN
reducción mensurable de las UFC pulmonares mediada por los neutrófilos si tras la exposición a micobacterias intracelulares como BCG, lo que confirmamos en
sirvieran como reservorio celular para la replicación bacteriana. Es más probable nuestro estudio.
que los neutrófilos contribuyan a la progresión de la tuberculosis de una manera La inmunidad entrenada se ha descrito como la capacidad de las células
diferente (31, 32). En este sentido, detectamos una disminución de la expresión de inmunes innatas de mostrar una respuesta similar a la memoria similar a la de los
MHCII en IM de ratones con escasez de neutrófilos, lo que sugiere un posible papel linfocitos adaptativos (36). BCG ha sido identificado como un potente inductor de la
de los neutrófilos para la activación óptima de los macrófagos. Un estudio previo inmunidad entrenada en monocitos periféricos (28), así como en precursores
describió que los MI reclutados infraactivados pueden representar un nicho permisivo mieloides de la médula ósea después de la administración intravenosa (27). Sin
para la replicación de Mtb (11). Esto podría explicar la falta de reducción de UFC embargo, como se revisa en una publicación reciente (26), el comportamiento de
observada en nuestros experimentos. Nuestros datos también demostraron que en las células inmunes innatas después de recibir un estímulo primario puede conducir
ausencia de neutrófilos, Mtb colonizó preferentemente los IM, lo que indica que las a diferentes fenotipos causados por diferenciación, tolerancia y priming, además de
micobacterias virulentas pueden escapar de los AM independientemente de la respuestas asociadas con la inmunidad entrenada.
ausencia de neutrófilos. Esta situación es diferente a la que observamos en BCG. El fenotipo entrenado se caracteriza por el retorno de la activación inmunológica
celular a un nivel basal tras la eliminación del estímulo primario, y quedan
ratones vacunados pulmonarmente, en los que Mtb se restringió principalmente a modificaciones epigenéticas que hacen que las células respondan más eficientemente
AM. Este resultado apoya nuestra hipótesis de que los AM activados son un a los estímulos secundarios. En

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En el caso del proceso de cebado, el estímulo primario cambia el estado funcional de Ratones
estas células y su estado inmunológico no vuelve a los niveles basales antes del estímulo Los ratones C57BL/6JR se adquirieron de Janvier Biolabs. Los ratones Csf1reCFP ×
secundario o la infección. En nuestros experimentos a largo plazo, el estado inmunológico LysMGFP se obtuvieron en las instalaciones para animales del Institut de Pharmacologie
de los AM después de la eliminación de BCG no volvió a los niveles basales como MHCII et de Biologie Structurale (IPBS; Toulouse, Francia) cruzando las cepas Csf1reCFP (18)
s2l
y CD86. y LysMGFP ( 19 ) .
w
La expresión todavía era elevada. Los genes inflamatorios, incluido Irf8, también estaban Todos los ratones fueron alojados y mantenidos en condiciones específicas libres de
d
regulados positivamente en los AM intranasales activados por BCG después de la patógenos y observados para detectar cualquier signo de enfermedad en las instalaciones
autorización de la vacuna. Teniendo en cuenta nuestra comprensión actual de la del Centro de Investigación de Encefalopatías y Enfermedades Trans misibles
inmunidad entrenada (26), no está claro si la BCG induce el entrenamiento o la preparación Emergentes (Zaragoza, España; referencia ES 50 297 0012 009) y el Centro de
e
de MA después de la vacunación local. Sin embargo, e independientemente de esta Investigaciones Biomédicas. de Aragón (Zaragoza, España; referencia ES 50 297 0012
clasificación, nuestros resultados demuestran que los AM activados por BCG tienen la 011).
capacidad de desencadenar una respuesta mejorada contra un desafío posterior. Este
estudio informa la capacidad de BCG para inducir una respuesta similar a la memoria en Cepas bacterianas
los AM y la capacidad de los AM activados por BCG a largo plazo para responder de Las cepas de micobacterias utilizadas en este estudio se cultivaron a 37 °C en caldo
manera eficiente ante un desafío con Mtb. La presencia de MI infiltrados y la neutrofilia Middlebrook 7H9 (BD Difco) suplementado con 0,05 % de Tween 80 (SigmaAldrich) y 10
desaparecieron cuando se retiró el BCG. Desde la perspectiva de la seguridad, esto % de enriquecimiento de albúmina dextrosa catalasa (ADC) de Middlebrook (BD
indicaría que la vacunación pulmonar con BCG no induce una inflamación crónica que Biosciences) o en Middlebrook sólido. Agar 7H10 (BD Difco) suplementado con 10% de
podría tener consecuencias colaterales dañinas. ADC (BD Difco).
Cuando fue necesario, el medio se complementó con kanamicina (20 µg/ml).
Una limitación de nuestros resultados debe traducirse en una versión más relevante. Se generaron cepas que expresan GFP de H37Rv, BCG Pasteur y BCG::RD1 (un regalo
El mejor escenario podría depender de la ruta de vacunación elegida para administrar de R. Brosch, Instituto Pasteur de París, Francia) mediante transformación con el plásmido
BCG en los pulmones. Es poco probable que se autorice la vía intranasal para la replicativo pJKD6 (un regalo de L. Leite, Instituto Butantan, Brasil). ). Este plásmido
administración de vacunas vivas en la clínica debido a preocupaciones de seguridad. Por transporta el gen gfp bajo el control de un fuerte promotor generado mediante la reacción
el contrario, la administración en aerosol podría ser más probable, y el BCG en aerosol en cadena de la polimerasa (PCR) propensa a errores del promotor PL5 del
con nebulizadores clínicos ya se encuentra bajo evaluación clínica temprana. Debido a micobacteriófago L5 (41). Se prepararon suspensiones bacterianas para vacunas
que no es factible probar este tipo de dispositivos en el modelo de ratón, sería importante intranasales o subcutáneas o infecciones intranasales en solución salina tamponada con
caracterizar las poblaciones mieloides en estudios en humanos (o NHP) para confirmar fosfato (PBS) a partir de soluciones madre de glicerol cuantificadas.
el papel de los MA en la protección después de la administración de aerosol de BCG.
Los investigadores que trabajan en vacunas contra la tuberculosis han estado

tratando de identificar parámetros inmunológicos basados en respuestas celulares Infección intranasal y administración de vacunas.
adaptativas que se correlacionan con la protección inducida por la vacuna, pero existe un Nuestra experiencia en el estudio de la administración intranasal de cepas virulentas y
interés creciente en el papel de las respuestas no canónicas para la protección contra la atenuadas como vía de administración pulmonar indica que esta vía es comparable a la
tuberculosis. Se ha demostrado que los anticuerpos, las células asesinas naturales o las administración intratraqueal, y seleccionamos la administración intranasal para la
células T negativas para IFN son importantes para la protección natural contra la infección con H37Rv::gfp. Los animales fueron anestesiados y se realizó la administración
tuberculosis (37–39), y las defensas innatas se han asociado con la eliminación intranasal con dos instilaciones de 20 l (una por fosa nasal) de la suspensión bacteriana
temprana de la infección por tuberculosis (40). Aquí, hemos demostrado que es posible preparada en PBS. Las dosis de infección se optimizaron en función del número de
modular la activación de los macrófagos pulmonares mediante la vacunación local con células infectadas necesarias para el análisis posterior de poblaciones de pulmón
BCG, demostrando así que la inducción de inmunidad a largo plazo en macrófagos infectado mediante citometría de flujo en cada momento. Las dosis de infección por
residentes en tejidos podría representar un enfoque viable para las vacunas experimentales. H37Rv::gfp se definieron como 106 UFC para los días 1 y 7, 105 UFC para el día 13 y
104 UFC para el día 24.
La vacunación se realizó con 106 UFC de BCG Pasteur o BCG Pasteur::gfp por vía
MATERIALES Y MÉTODOS intranasal o subcutánea. Para la vacunación subcutánea, a los ratones se les inyectaron
Diseño del estudio por vía subcutánea 100 µl de una suspensión bacteriana preparada en PBS. Para
Este estudio tuvo como objetivo analizar la contribución de los MA a la protección contra experimentos de protección, los ratones se inmunizaron con 106 UFC de BCG Pasteur
la tuberculosis inducida por la vacuna BCG administrada por vía pulmonar. por vía intranasal o subcutánea y se expusieron intranasalmente a H37Rv::gfp en los
Los grupos de ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos de tres a seis animales momentos indicados después de la vacunación.
por jaula en cada experimento. El número de réplicas biológicas y el número de
repeticiones de cada experimento se indican en las leyendas de las figuras. Los
resultados no fueron cegados para el análisis. Preparación de suspensión unicelular de pulmón.
Los pulmones se extirparon asépticamente y se homogeneizaron en tampón Hepes
Declaración de Ética [Hepes 10 mM, NaCl 150 mM, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM y CaCl2 1,8 mM (pH 7,4)] que
El trabajo experimental se realizó de acuerdo con las directivas europeas y nacionales contenía desoxirribonucleasa I (40 UI/ml; AppliChem) y colagenasa D ( 2 mg/ml; Roche)
para la protección de animales de experimentación, y los procedimientos experimentales utilizando un disociador GentleMacs (Miltenyi Biotec) según las instrucciones del fabricante.
fueron aprobados por el Comité de Ética para Experimentos con Animales de la
Universidad de Zaragoza (PI46/18, PI33/15 y PI50/14). Para todos los experimentos se Los pulmones se incubaron a 37 °C durante 30 minutos y se homogeneizaron
utilizaron ratones machos y hembras de entre 8 y 10 semanas de edad. adicionalmente con el disociador GentleMacs. Los homogeneizados se filtraron a través
de un colador celular de 70 µm (MACS SmartStainers, Miltenyi Biotec)

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y se centrifugó a 1500 rpm durante 5 min. Los glóbulos rojos se lisaron usando tampón Se determinó la sangre de cada ratón infectado a las 24, 48 y 72 horas después de la
de lisis de glóbulos rojos (SigmaAldrich), y las células se sedimentaron y resuspendieron infección a partir de una muestra de 6 µl de sangre extraída de la vena de la cola. Los
en medio de cultivo RPMI (Gibco) para la tinción con anticuerpos. ratones fueron monitoreados durante un período de 7 días. Los experimentos se
repitieron dos veces utilizando cinco ratones en cada grupo y los resultados se
s2l
expresaron como log10 UFC/ml de bacterias recuperadas de la sangre.
w
Tinción de anticuerpos y citometría de flujo.
d
Una lista de anticuerpos utilizados para la caracterización celular se describe en Agotamiento in vivo
la tabla S1. Se sembraron suspensiones de células individuales de pulmón en placas Para agotar las células T CD4+ y CD8+ , a los ratones se les inyectó por vía
de 96 pocillos con fondo en U y se incubaron durante 15 minutos a 4 ° C con reactivo intraperitoneal 1 semana antes del desafío H37Rv::gfp o de la vacunación BCG
e
de bloqueo de FcR (Miltenyi Biotec). La tinción de la superficie se realizó durante 20 Pasteur con 300 µg de CD4 antiratón (clon GK1.5, BioXCell) o CD8 antiratón ( clon
minutos a 4 ° C utilizando diferentes combinaciones de anticuerpos para definir las 2.43, BioXCell). Se administraron dosis repetidas de 100 g de antiCD4 o 150 g de
poblaciones de células pulmonares mieloides y el estado de activación de los antiCD8 por vía intraperitoneal dos veces por semana para lograr una depleción
continua.
macrófagos. Luego, las células se lavaron y fijaron con paraformaldehído al 4% durante 30 min.
Para la tinción intracelular de iNOS e IFN , las células se fijaron y permeabilizaron Para el agotamiento de los neutrófilos, a los ratones se les inyectaron por vía
después de la tinción de la superficie con un juego de tinción FoxP3 (Miltenyi Biotec) intraperitoneal 100 µg de antiLy6G (clon 1A8, BioXCell), alternando con 100 µg de anti
durante 30 minutos a 4 ° C, se lavaron y se incubaron con aloficocianina (APC) anti IgGK de rata (clon MAR 18.5, BioXCell) (20). El tratamiento se inició antes de la
ratón iNOS (Miltenyi Biotec) o IFN –APC anti ratón (Miltenyi Biotec) durante 1 hora exposición a H37Rv::gfp y se mantuvo durante el transcurso del experimento.
a temperatura ambiente.
Para la tinción intracelular de Ki67, las células se fijaron y permeabilizaron
después de la tinción de la superficie con el conjunto de tampones de tinción FoxP3/ Microscopía
factor de transcripción (eBiosciences) durante 30 minutos a 4 °C, se lavaron y se Se recolectaron pulmones de ratones infectados con Csf1reCFP × LysMGFP y se
incubaron con antiratón Ki67PerCPVio 700 (Miltenyi). Biotec) durante 1 hora a fijaron en paraformaldehído al 4% en PBS durante 48 horas. Después de la fijación,
temperatura ambiente. Las células se adquirieron utilizando un citómetro de flujo Gallios los pulmones se sometieron a un gradiente de sacarosa (10, 20 y 30 % en PBS),
(Beckman Coulter) y los resultados se analizaron utilizando el software Weasel. seguido de su inclusión en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT)
(TissueTek) y su congelación en un baño frío (20 °C). . Las muestras se mantuvieron
Los MA pulmonares se definieron como CD45+ CD64+ CD11chighSiglecF+ , mensajes instantáneos como
a 80°C hasta su uso. La criosección se realizó en un criostato Leica y se realizaron
CD45+ CD64+ CD11cdimSiglecF− y los neutrófilos como CD45+ Ly6G+. varias secciones (30 µm) para cada pulmón. Las secciones de pulmón se lavaron tres
CD11c− CD11b+ SiglecF− . El estado de activación de los macrófagos se evaluó veces en tampón de tinción celular (BD Biosciences) y se montaron en ProLong Glass
utilizando MHCII antiratón, CD86 e iNOS. Antifade (Thermo Fisher Scientific) con un cubreobjetos. Se adquirieron pilas de
imágenes tridimensionales en un microscopio confocal Zeiss LSM710 NLO utilizando
etiquetado CD45 una apertura numérica objetiva Zeiss 20 × = 0,8 en modo de adquisición secuencial
Para el marcaje intravenoso de CD45, a los ratones se les inyectaron por vía intravenosa para minimizar la interferencia entre proteínas fluorescentes, en particular CFP y GFP.
2 µg de CD45PerCPVio 700 (Miltenyi) 10 minutos antes de la eutanasia. El análisis de imágenes se realizó en Imaris (Bitplane) para la creación de imágenes
representativas y el complemento Cell Counter de ImageJ (National Institutes of Health,
Determinación de IFN EE. UU.) para cuantificar manualmente el porcentaje de neutrófilos infectados por
Para la tinción intracelular de células T productoras de IFN , se incubaron imagen.
suspensiones de células individuales de pulmón durante la noche en placas de 96
pocillos con fondo en U con derivado proteico purificado (PPD) (10 µg/ml) a 37 °C y 5
% de CO2. Se añadió brefeldina A (Invitrogen) y las células se incubaron durante 4 Análisis de expresión genética.
horas a 37°C y 5% de CO2 antes de la tinción intracelular. Se obtuvieron suspensiones unicelulares de pulmón de ratones vacunados de 2 o 7
Para la determinación de IFN total en pulmones ex vivo, los pulmones se meses y los AM se purificaron como CD45+ CD64+ CD11c+ SiglecF+
homogeneizaron en 1 ml de H2O usando un disociador GentleMacs (Miltenyi Biotec) y células utilizando un clasificador de células Sony SH800S. El ARN se obtuvo a partir
se incubaron durante la noche en placas de 24 pocillos a 37 °C y 5 % de CO2. Se de AM clasificados utilizando un microkit RNeasy (QIAGEN). Las células clasificadas
recuperaron los sobrenadantes y se cuantificó el IFN mediante un ensayo se recogieron directamente en RLT más tampón de lisis (proporcionado por el micro kit
inmunoabsorbente ligado a enzimas utilizando un kit de detección de IFN (Mabtech RNeasy) y la purificación del ARN se realizó según las instrucciones del fabricante.
Biotech) según las instrucciones del fabricante. Se construyeron bibliotecas de ADN complementarias utilizando Prime Script RT
Master Mix (Takara) según las instrucciones del fabricante. Se utilizó TB Green Premix
Determinación de la carga bacteriana. ExTaqTM (Tli RNase H Plus) (Takara) para la reacción de PCR cuantitativa en tiempo
Para analizar la carga bacteriana, los pulmones se homogeneizaron en 1 ml de ddH2O real (qRTPCR). Cada reacción se realizó por triplicado y qRTPCR se llevó a cabo en
usando un disociador GentleMacs (Miltenyi Biotec) y las UFC se determinaron el sistema de PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems). Las secuencias
colocando diluciones en serie en medio sólido Middlebrook 7H10 (BD Difco) de cebadores se detallan en la tabla S2.
suplementado con un enriquecimiento de Middlebrook ADC al 10 % (BD Difco). .
Cuantificación y análisis estadístico.

Desafío letal con S. pneumoniae Los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando el software Weasel (versión
Se inocularon ratones por vía intranasal con 50 µl que contenían 1 × 104 UFC por ratón 3.0.2) y se presentaron como medias ± DE. Se utilizó el software GraphPad Prism
de la cepa 957/13 de serotipo 3. Se trata de un aislado clínico de S. pneumoniae de un (versión 6) para la representación gráfica y el análisis estadístico.
paciente de 57 años que padeció infección bacteriana adquirida en la comunidad. Todas las pruebas aplicadas fueron bilaterales. Para las comparaciones entre dos
neumonía. Niveles bacterianos en grupos, el análisis se realizó mediante la prueba t de Student no apareada . Por más de dos

16
De
htt
de
En los grupos, utilizamos análisis de varianza unidireccional (ANOVA) o 17. AS Pym, P. Brodin, R. Brosch, M. Huerre, ST Cole, La pérdida de RD1 contribuyó a la atenuación
de las vacunas vivas contra la tuberculosis Mycobacterium bovis BCG y Mycobacterium microti.
ANOVA bidireccional para análisis de una o dos variables, respectivamente.
Mol. Microbiol. 46, 709–717 (2002).
La supervivencia se analizó mediante la prueba de rango logarítmico (Mantel 18. DA Ovchinnikov, WJM van Zuylen, CEE DeBats, KA Alexander, S. Kellie,
Cox). Un valor de P <0,05 se consideró significativo (ns, no significativo; *P DA Hume, Expresión de transgenes dependientes de Gal4 en células del sistema de fagocitos
s2l
<0,05, **P <0,01, ***P <0,001 y ****P <0,0001). mononucleares marcadas con proteína fluorescente cian mejorada utilizando ratones doble
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transgénicos Csf1r Gal4VP16/UASECFP. J. Leukoc. Biol. 83, 430–433 (2008).
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activación de las células T supera un cuello de botella en la vacuna contra la tuberculosis Genotoul y F. Levillain por preparar micobacterias para experimentos de microscopía. Financiamiento: Este
eficacia. Nat. Comunitario. 7, 13894 (2016). trabajo fue apoyado por el Ministerio de “Ciencia, Innovación y Universidades” de España (número de subvención
36. MG Netea, J. Quintin, JW van der Meer, Inmunidad entrenada: una memoria para el huésped innato RTI2018097625BI00) y el “Gobierno de AragónFondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) 20142020:
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defensa. Microbio huésped celular 9, 355–361 (2011). Construyendo Europa Desde Aragón ”. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la
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37. LL Lu, AW Chung, TR Rosebrock, M. Ghebremichael, WH Yu, PS Grace, recopilación y análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
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MK Schoen, F. Tafesse, C. Martin, V. Leung, AE Mahan, M. Sips, MP Kumar, J. Tedesco, H. Robinson, E. Tkachenko,
M. Draghi, KJ Freedberg, H. Streeck, TJ Suscovich , DA Lauffenburger, BI Restrepo, C. Day, SM Fortune, Contribuciones de los autores: JDA., JY, AP, CM y NA diseñaron los experimentos. CM y NA supervisaron el estudio. E. Mata,
G. Alter, Un papel funcional de los anticuerpos en la tuberculosis. Celda 167, 433–443.e4 (2016). RT, CG, E. Moreo, FM, SU, ABG, MD y FGC. realizó los experimentos. MM y JB compartían instalaciones para animales
e
BSL3. E. Mata, DM, MM, JB, AA, JDA., AP, CM y NA escribieron el manuscrito. Intereses en conflicto: RT, E. Mata, SU, DM,
38. LL Lu, MT Smith, KKQ Yu, C. Luedemann, TJ Suscovich, PS Grace, A. Cain, CM y NA son coinventores de la patente titulada “Eficacia terapéutica mediante administración pulmonar de micobacterias
WH Yu, TR McKitrick, D. Lauffenburger, RD Cummings, H. MayanjaKizza, TR Hawn, WH Boom, CM Stein, SM vivas atenuadas” de la Universidad de Zaragoza. Disponibilidad de datos y materiales: todos los datos necesarios para
Fortune, C. Seshadri, G. Alter, marcadores inmunes independientes de IFN de exposición a Mycobacterium evaluar las conclusiones del artículo están presentes en el artículo o en los materiales complementarios. Los datos
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Vectores de expresión recombinantes de Mycobacterium bovis BCG: mejora del control genético sobre los Pulmonary BCG induce la activación de los macrófagos residentes en los pulmones y confiere protección a largo plazo contra
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16
De
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de
w
ds2l
La BCG pulmonar induce la activación de los macrófagos residentes en los pulmones y confiere protección a largo plazo contra la tuberculosis
e
Elena Mata, Raquel Tarancón, Claudia Guerrero, Eduardo Moreo, Flavie Moreau, Santiago Uranga, Ana Belén Gómez,
Dessislava Marinova, Miriam Doménech, Fernando GonzálezCamacho, Marta Monzón, Juan Badiola, Jorge Domínguez
Andrés, José Yuste, Alberto Anel, Antonio Peixoto, Carlos Martín y Nacho Aguilo
Ciencia. Immunol., 6 (63), eabc2934.

DOI: 10.1126/sciimmunol.abc2934
BCG entrena a los macrófagos

pulmonares El bacilo de CalmetteGuérin (BCG) es una vacuna micobacteriana atenuada utilizada históricamente para proteger
contra Mycobacterium tuberculosis (Mtb), y la vacuna BCG intradérmica tiene una eficacia modesta. Mata et al. Ahora se definen los
mecanismos inmunitarios asociados con la protección inducida por la administración pulmonar de BCG. Observaron que los ratones
vacunados con BCG mediante administración pulmonar podían limitar la diseminación temprana de Mtb tras la exposición. También se
observó protección a largo plazo y se relacionó con la activación mediada por BCG de macrófagos alveolares (MA) que se reactivaron
rápidamente tras la exposición, lo que sugiere un papel de la inmunidad entrenada. Estos resultados resaltan el potencial de la
provocación intrapulmonar con BCG y el papel de los AM en la protección contra Mtb.
Ver el artículo en línea

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Science Immunology (ISSN) es una publicación de la Asociación Estadounidense para el Avance de la Ciencia. 1200 New York Avenue NW, Washington, DC
20005. El título Science Immunology es una marca registrada de AAAS.
Copyright © 2021 Los Autores, algunos derechos reservados; Licenciatario exclusivo de la Asociación Americana para el Avance de la Ciencia. No se pueden reclamar
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La BCG pulmonar induce la activación de los macrófagos Derechos reservados;

residentes en los pulmones y confiere protección a Asociación Estadounidense

a los EE. UU. originales

INTRODUCCIÓN mejoras sustanciales en la protección conferida por la vacunación pulmonar en

Mata et al., Sci. Inmunol. 6, eabc2934 (2021) 24 de septiembre de 2021 1 de 13

Mata et al., Sci. Inmunol. 6, eabc2934 (2021) 24 de septiembre de 2021 2 de 13

lo que sugiere que puede ser necesaria la

Mata et al., Sci. Inmunol. 6, eabc2934 (2021) 24 de septiembre de 2021 3 de 13

Los ratones vacunados (Fig. 3C y Fig. S6A) y las

neutrófilos no infectados en los pulmones en

fuerte efecto protector inducido por la vacuna,

Mata et al., Sci. Inmunol. 6, eabc2934 (2021) 24 de septiembre de 2021 4 de 13

intranasal con H37Rv que expresa GFP medido en días

ratones vacunados (púrpura) y vacunados con BCG

pneumoniae. (H) Curva de supervivencia de ratones no

desafío. (I) Cargas bacterianas de S. pneumoniae en

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y posterior desafío intranasal con GFP que expresa H37Rv,

BCG no fluorescente y posterior desafío intranasal con

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El grupo BCG se comportó como se predijo para una

Como habíamos demostrado para las vacunas a corto plazo.

En los experimentos de vacunación, la diseminación

un broncoscopio (29). Además, recientemente se

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Los investigadores que trabajan en vacunas contra la tuberculosis han estado

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Cuantificación y análisis estadístico.

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Ciencia. Immunol., 6 (63), eabc2934.

BCG entrena a los macrófagos

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