CFGS Técnico Superior Laboratorio

Clínico y Biomédico
Análisis Bioquímico
Curso 2023/24

TEMA 1: APLICACIÓN DE TÉCNICAS

UTILIZADAS EN EL LABORATORIO DE
BIOQUÍMICA CLÍNICA (I)

Alberto García Bartolomé

Departamento de Sanidad
CIFP Camino de la Miranda (Palencia)
alberto.garbar@educa.jcyl.es
 ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN: FUNDAMENTOS BÁSICOS.
2. CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS.
3. FUNDAMENTOS BÁSICOS DE LAS TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS.
3.1 LEY DE LAMBERT-BEER.
3.2 COMPONENTES DE LOS EQUIPOS.
4. ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR.
4.1 ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR UV-VISIBLE.
4.2 ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR IR.
5. ESPECTROMETRÍA DE EMISIÓN MOLECULAR: ESPECTROMETRÍA DE FLUORESCENCIA O LUMINISCENCIA.
6. ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN Y DE EMISIÓN ATÓMICA.
6.1 ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA.
6.1.1 Espectrometría de absorción atómica en llama.
6.1.2 Espectrometría con atomizadores electrotérmicos.
6.2 ESPECTROMETRÍA DE EMISIÓN ATÓMICA.
6.2.1 Espectrometría de emisión atómica con llama.
6.2.2 Espectrometría de emisión atómica con plasma.
7. ESPECTROMETRÍA DE DISPERSIÓN DE LA RADIACIÓN: TURBIDIMETRÍA Y NEFELOMETRÍA.
 1. INTRODUCCIÓN
v Las técnicas analíticas instrumentales son empleadas universalmente en diversos
laboratorios.

v Dentro de las técnicas instrumentales analíticas, están las que se basan en la

interacción de la radiación electromagnética (REM) con la materia.
 1. INTRODUCCIÓN
v La REM es una forma de propagación de la energía.
1. INTRODUCCIÓN
 1. INTRODUCCIÓN
v Al conjunto de todos los tipos de ondas electromagnéticas se le denomina espectro
electromagnético.
PARA SABER MÁS....

https://www.youtube.com/watch?v=uLMulTgj-9M
 1. INTRODUCCIÓN
v Cuando un haz de REM incide o interacciona con la materia se pueden producir una
serie de fenómenos:

- Absorción

- Emisión

- Fluorescencia

- Transmisión

- Reflexión

- Dispersión

- Refracción
 1. INTRODUCCIÓN
v Cuando un haz de REM incide o interacciona con la materia se pueden producir una
serie de fenómenos:

- Absorción

- Emisión

- Transmisión

- Dispersión
 1. INTRODUCCIÓN
v Cuando un haz de REM incide o interacciona con la materia se pueden producir una
serie de fenómenos:

- Absorción

- Emisión

- Fluorescencia

- Transmisión

- Reflexión

- Dispersión
 1. INTRODUCCIÓN
v Cuando un haz de REM incide o interacciona con la materia se pueden producir una
serie de fenómenos:

- Absorción

- Emisión

- Fluorescencia

- Transmisión

- Reflexión

- Dispersión

- Refracción
 2. CLASIFICACIÓN DE LAS
TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS
v Una forma de clasificarlas es según el tipo de interacción entre la radiación y la
molécula o átomo:

- Espectrometría de absorción molecular

- Espectrometría de absorción atómica

- Espectrometría de emisión atómica

- Espectrometría de emisión molecular o espectrometría de fluorescencia

- Espectrometría de dispersión de la radiación.

- Refractometría.

- Fotometría de reflectancia.
 3. FUNDAMENTOS BÁSICOS
v Las técnicas espectroscópicas generalmente se basan en cuantificar la cantidad de
radiación que transmite, absorbe, emite, etc. la muestra a analizar. A partir de ello, se
hará una inferencia o afirmación.
 3. FUNDAMENTOS BÁSICOS
3.1 LEY DE LAMBERT-BEER.

v La ley de Lambert-Beer indica que la concentración de la sustancia absorbente de la

radiación es directamente proporcional a la cantidad de luz o radiación absorbida o
inversamente proporcional al logaritmo de la luz transmitida.
 3. FUNDAMENTOS BÁSICOS
3.1 LEY DE LAMBERT-BEER.

v Basándose en la relación lineal entre absorbancia y concentración, se puede conocer

la concentración de una muestra problema de dos maneras:

- Por comparación con una solución conocida o empleo de factores de

calibración
ABSORBANCIA

100
mg/dL
0,8

50
?
mg/dL 0,4
 3. FUNDAMENTOS BÁSICOS
3.1 LEY DE LAMBERT-BEER.

v Basándose en la relación lineal entre absorbancia y concentración, se puede conocer

la concentración de una muestra problema de dos maneras:

- Por comparación con una solución conocida o empleo de factores de

calibración

As / Ap = Cs / Cp à Cp = Ap * (Cs / As)
 3. FUNDAMENTOS BÁSICOS
3.1 LEY DE LAMBERT-BEER.

v Basándose en la relación lineal entre absorbancia y concentración, se puede conocer

la concentración de una muestra problema de dos maneras:

- Mediante regresión lineal o mínimos cuadrados. (Recta de calibrado).

 3. FUNDAMENTOS BÁSICOS
3.1 LEY DE LAMBERT-BEER.

v Hay que tener en cuenta:

+ Tanto las soluciones patrón como las problema han de ser leídas en idénticas
condiciones.

+ Se debe trabajar en el rango de

linealidad de la molécula a analizar (se
cumple la ley de Lambert-Beer).

La radiación incidente no es monocromática

+ Pueden existir interferencias

El solvente absorbe parte de la radiación incidente

Existen otros solutos que absorben radiación

 3. FUNDAMENTOS BÁSICOS
3.2 COMPONENTES DE LOS EQUIPOS.

v Los espectrómetros variarán en sus características en función de la técnica

espectroscópica en que se basen. De manera general constan de:

Estabilidad
Filamento de Tungsteno
Direccionalidad
- Fuente de luz o radiación. Deuterio e hidrógeno
Larga vida
Arco eléctrico o voltaico
Distribución continua
 3. FUNDAMENTOS BÁSICOS
3.2 COMPONENTES DE LOS EQUIPOS.

v Los espectrómetros variarán en sus características en función de la técnica

espectroscópica en que se basen. De manera general constan de:

- Colimadores.
 3. FUNDAMENTOS BÁSICOS
3.2 COMPONENTES DE LOS EQUIPOS.

v Los espectrómetros variarán en sus características en función de la técnica

espectroscópica en que se basen. De manera general constan de:

Filtros de interferencia
- Sistemas de selección de longitud de ondas.

Filtros de absorción
 3. FUNDAMENTOS BÁSICOS
3.2 COMPONENTES DE LOS EQUIPOS.

v Los espectrómetros variarán en sus características en función de la técnica

espectroscópica en que se basen. De manera general constan de:

- Sistemas de selección de longitud de ondas.

Monocromadores Redes de difracción

 3. FUNDAMENTOS BÁSICOS
3.2 COMPONENTES DE LOS EQUIPOS.

v Los espectrómetros variarán en sus características en función de la técnica

espectroscópica en que se basen. De manera general constan de:

- Cubetas.
 3. FUNDAMENTOS BÁSICOS
3.2 COMPONENTES DE LOS EQUIPOS.

v Los espectrómetros variarán en sus características en función de la técnica

espectroscópica en que se basen. De manera general constan de:

- Sistemas de detección.

Fotocélulas o células voltaicas semiconductoras

Fototubos multiplicadores
 3. FUNDAMENTOS BÁSICOS
3.2 COMPONENTES DE LOS EQUIPOS.

v Los espectrómetros variarán en sus características en función de la técnica

espectroscópica en que se basen. De manera general constan de:

- Dispositivos de lectura y registro.

 3. FUNDAMENTOS BÁSICOS
3.2 COMPONENTES DE LOS EQUIPOS.

v Los espectrómetros variarán en sus características en función de la técnica

espectroscópica en que se basen. De manera general constan de:
 3. FUNDAMENTOS BÁSICOS
3.2 COMPONENTES DE LOS EQUIPOS.

v Según la disposición de sus componentes, los espectrómetros se pueden clasificar en:

- Espectrómetro de haz simple.

- Espectrómetro de doble haz.

 4. ESPECTROMETRÍA DE
ABSORCIÓN MOLECULAR

v Las moléculas pueden absorber la radiación

incidente pasando a un estado de excitación.

v La absorción molecular se
da en varias longitudes de
onda o amplias bandas de
absorción. Por lo que se
utiliza para el análisis
cuantitativo.
 4. ESPECTROMETRÍA DE
ABSORCIÓN MOLECULAR
v La determinación de la concentración de un compuesto en una muestra puede
hacerse de tres formas:

- De forma directa, midiendo la absorbancia del compuesto.

- Si el compuesto no posee absorbancia, se le puede hacer reaccionar con

determinados reactivos para que el producto absorba radiación.

Reacciones precedentes
- De forma indirecta Cinéticas o
medidas a punto
Reacciones subsecuentes
final
 4. ESPECTROMETRÍA DE
ABSORCIÓN MOLECULAR
4.1 ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR UV-VISIBLE.

v Permite trabajar con una gran cantidad de longitudes de onda.

v Sus ventajas:

- Gran aplicabilidad.

- Elevada sensibilidad.

- Permite la automatización.

- Sistema no destructivo.

v Principal desventaja: las interferencias

 4. ESPECTROMETRÍA DE
ABSORCIÓN MOLECULAR
4.1 ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR IR.

v La mayoría de las moléculas absorben en

el espectro IR.

v Un espectro IR es como una huella dactilar

de la molécula.
 5. ESPECTROMETRÍA DE EMISIÓN
MOLECULAR
v También conocida como espectrometría de fluorescencia o luminiscencia.

v Se basa en el fenómeno de la fluorescencia molecular.

 5. ESPECTROMETRÍA DE EMISIÓN
MOLECULAR
v No todas las moléculas fluorescen y las que lo hacen lo llevan a cabo mediante
características específicas.

v Esto permite implementar una

técnica muy sensible.

v El aparato en el que se lleva a cabo es

el espectrofluorimetro o fluorímetro.
 6. ESPECTROMETRÍA DE
ABSORCIÓN Y DE EMISIÓN ATÓMICA
v Su principal característica es la atomización.

v Se obtiene información específica sobre un elemento químico en particular.

 6. ESPECTROMETRÍA DE
ABSORCIÓN Y DE EMISIÓN ATÓMICA

v Existen 3 tipos de interferencias/aspectos a tener en cuenta:

- Interferencia química.

- Interferencia por ionización.

-Interferencia de matriz.
 6. ESPECTROMETRÍA DE
ABSORCIÓN Y DE EMISIÓN ATÓMICA
6.1 ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA.

v Técnica analítica exacta y precisa con gran sensibilidad.

v La ley de Lambert-Beer es válida lo que permite efectuar determinaciones

cuantitativas.

v Utilizan lámparas de cátodo hueco.

 6. ESPECTROMETRÍA DE
ABSORCIÓN Y DE EMISIÓN ATÓMICA
6.1 ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA.

6.1.1 Espectrometría de absorción atómica en llama.

v Es el más utilizado dentro de la absorción atómica.

v Determinación de ppm de elementos metálicos en disoluciones.

v Los mecheros pueden ser de dos tipos: de consumo total o de premezclado.

 6. ESPECTROMETRÍA DE
ABSORCIÓN Y DE EMISIÓN ATÓMICA
6.1 ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA.

6.1.2 Espectrometría con atomizadores electrotérmicos.

v Consigue un mayor rendimiento en la atomización.

v Se utiliza para concentraciones de ppb de ciertos metales.

 6. ESPECTROMETRÍA DE
ABSORCIÓN Y DE EMISIÓN ATÓMICA
6.2 ESPECTROMETRÍA DE EMISIÓN ATÓMICA.

6.2.1 Espectrometría de emisión atómica con llama.

v En esta técnica en la llama la temperatura es suficiente para que haya una

excitación atómica (con su posterior emisión).

v Es utilizada para la determinación de ppm de metales alcalinos y

alcalinotérreos (Na, K, Li, Ca, etc.
 6. ESPECTROMETRÍA DE
ABSORCIÓN Y DE EMISIÓN ATÓMICA
6.2 ESPECTROMETRÍA DE EMISIÓN ATÓMICA.

6.2.1 Espectrometría de emisión atómica con llama.

v En condiciones constantes y controladas la intensidad luminosa de la

radiación producida es directamente proporcional al número de átomos.

v Para mantener la estabilidad de la llama

se precisa un sistema de regulación de gas
de alta calidad.

v Los fotómetros de emisión en llama

pueden ser de dos tipos: directos o con
estándar interno.
 6. ESPECTROMETRÍA DE
ABSORCIÓN Y DE EMISIÓN ATÓMICA
6.2 ESPECTROMETRÍA DE EMISIÓN ATÓMICA.

6.2.1 Espectrometría de emisión atómica con llama.

v En condiciones constantes y controladas la intensidad luminosa de la

radiación producida es directamente proporcional al número de átomos.

Medida con estándar interno

v Para mantener la estabilidad de la llama
se precisa un sistema de regulación de gas Elemento a medir Patrón interno
7

Valor que da la medida

de alta calidad. 6
5
4
3
2
v Los fotómetros de emisión en llama 1
0
pueden ser de dos tipos: directos o con 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Diferentes medidas en el tiempo

estándar interno.
 6. ESPECTROMETRÍA DE
ABSORCIÓN Y DE EMISIÓN ATÓMICA
6.2 ESPECTROMETRÍA DE EMISIÓN ATÓMICA.

6.2.2 Espectrometría de emisión atómica con plasma.

v Consigue una llama con temperaturas de hasta 40000

C, lo cual permite una alta eficiencia de atomización y
excitación de los átomos

DCP
ICP
Microondas
 7. ESPECTROMETRÍA DE
DISPERSIÓN DE LA RADIACIÓN
v La dispersión de la radiación por parte de una partícula
depende de varios factores entre los que destacan:

- Tamaño y peso molecular.

-Concentración de las partículas.

- Longitud de onda de la radiación incidente.

 7. ESPECTROMETRÍA DE
DISPERSIÓN DE LA RADIACIÓN
v Los métodos de análisis que se encargan de medir los fenómenos de dispersión de la
radiación por las partículas, se denominan: turbidimetría y nefelometría.

Concentración de las partículas

v La elección entre turbidimetría
y nefelometría depende de
Tamaño de las partículas dispersantes
 7. ESPECTROMETRÍA DE
DISPERSIÓN DE LA RADIACIÓN

v Los requerimientos de la muestra para ambas técnicas son:

- Suspensión sea estable y homogénea.

- Que la dilución no provoque otro cambio que la disminución de la concentración.

- Que no existan partículas contaminantes o burbujas de aire que interfieran.

 7. ESPECTROMETRÍA DE
DISPERSIÓN DE LA RADIACIÓN
v En el laboratorio clínico mediante turbidimetría se puede determinar la cantidad de
proteínas totales en suero, líquido cefalorraquídeo u orina. También para el análisis de
fibrinógeno o triglicéridos

v La nefelometría se suele utilizar por ejemplo para medir concentraciones

específicas de colonias de bacterias en algún medio de cultivo.

v Ambas técnicas se pueden

utilizar de manera frecuente para
cuantificar proteínas concretas
en una muestra.