Laboratorium – Mikrobiologia 1

Ćwiczenie 5 : Wzrost bakterii

Część praktyczna
Ćwiczenie 1, część 2: Określenie ilości mikroorganizmów w badanej próbce metodą
turbidymetryczną. Sporządzenie krzywej wzorcowej.

Cel ćwiczenia: celem ćwiczenia jest sporządzenie krzywej wzorcowej metodą turbidymetryczną.

Sprzęt i odczynniki: pięć szalek Petriego z wyrosłymi koloniami bakteryjnymi z poprzednich zajęć

Instrukcja wykonania:

1. Policz kolonie, które wyrosły na płytkach z odpowiednich rozcieńczeń (5, 8, 10, 20 i 50-
krotnego).
2. Wykreśl krzywą standardową będącą zależnością absorbancji od liczby komórek w 1 ml.

Ćwiczenie 2, część 1: Weryfikacja krzywej wzorcowej.

Cel ćwiczenia: celem ćwiczenia jest weryfikacja krzywej wzorcowej sporządzonej przez studenta.

Sprzęt i odczynniki: hodowla płynna danego szczepu bakteryjnego (zwróć uwagę, aby był to ten sam
szczep, który został użyty w poprzednim ćwiczeniu), sterylne probówki Eppendorfa i sterylne tipsy,
płyn fizjologiczny, trzy szalki Petriego z agarem odżywczym, spektrofotometr, plastikowe kuwety

Instrukcja wykonania:

1. Przygotuj rozcieńczenia 9, 18 i 36-krotne badanej hodowli bakteryjnej.

2. Z uzyskanych roztworów (9, 18 i 36-krotne), przygotuj rozcieńczenia 10-6.
3. Wykonaj posiew dywanowy przygotowanych rozcieńczeń 10-6.
4. Pozostaw płytki do inkubacji do kolejnych zajęć.
5. Zmierz gęstość optyczną przy długości fali 550 nm dla rozcieńczeń 9, 18 i 36-krotnych badanej
hodowli bakteryjnej.
6. Zweryfikowaną krzywą standardową oddaj prowadzącemu w formie sprawozdania na 7
zajęciach.
Ćwiczenie 3: Wzrost bakterii w hodowlach płynnych

Cel ćwiczenia: celem ćwiczenia jest nauka prowadzenia hodowli bakteryjnych na podłożu płynnym.

Sprzęt i odczynniki: hodowla płynna szczepu bakteryjnego, sterylny bulion odżywczy, Tween 80, dwie
jałowe probówki, pipety automatyczne, sterylne tipsy

Instrukcja wykonania:

1. Przygotuj dwie sterylne probówki i umieść je w statywie w pobliżu palnika, podpisz ją nazwą
szczepu, swoimi inicjałami i datą.
2. Postaw kolbę ze sterylnym bulionem odżywczym w pobliżu palnika.
3. Złap jedną ręką kolbę u podstawy, drugą ręką wyciągnij korek i opal wlot kolby.
4. Z kolby ze sterylnym bulionem odżywczym pobierz 5 ml pipetą ze sterylnym tipsem.
5. Przed zamknięciem korkiem ponownie opal wlot kolby.
6. Wyjmij korek z pierwszej probówki i opal jej wlot.
7. Przenieś pobrany bulion odżywczy do sterylnej probówki.
8. Przed zamknięciem korkiem ponownie opal wlot probówki.
9. Analogicznie postępuj w przypadku drugiej probówki.
10. Postaw kolbę z bulionową hodowlą bakteryjną w pobliżu palnika.
11. Złap jedną ręką kolbę u podstawy, drugą ręką wyciągnij korek i opal wlot kolby.
12. Z kolby z bulionową hodowlą bakteryjną pobierz 0,1 ml pipetą ze sterylnym tipsem.
13. Przed zamknięciem korkiem ponownie opal wlot kolby.
14. Wyjmij korek z pierwszej probówki i opal jej wlot.
15. Przenieś pobraną hodowlę bakteryjną do sterylnej probówki.
16. Przed zamknięciem korkiem ponownie opal wlot probówki.
17. Analogicznie postępuj w przypadku drugiej probówki.
18. Do jednej (oznaczonej) probówki dodaj 0,5 ml Tweenu 80.
19. Pozostaw probówki do inkubacji.
20. Po inkubacji określ i zapisz rodzaj wzrostu mikroorganizmu.

Ćwiczenie 4 : Wzrost bakterii wysianych powierzchniowo na podłoże stałe - posiew redukcyjny

Cel ćwiczenia: celem ćwiczenia jest doskonalenie techniki posiewu redukcyjnego.

Sprzęt i odczynniki: hodowla płynna badanego szczepu bakteryjnego, jedna szalka Petriego z
agarem odżywczym, eza.

Instrukcja wykonania:

1. Połóż płytkę w pobliżu palnika i odwróć ją denkiem do góry. Opisz ją podając: nazwę szczepu,
datę oraz swoje inicjały.
 2. Podziel płytkę na trzy sektory zgodnie z przerywaną linią na rysunku. Odwróć płytkę
wieczkiem do góry.

3. Wysterylizuj ezę poprzez wyżarzenie w płomieniu palnika.

4. Złap jedną ręką kolbę u podstawy, drugą ręką wyciągnij korek i opal wlot kolby.
5. Pobierz (sterylnie) ezą hodowlę bulionową danego szczepu.
6. Przed zamknięciem korkiem ponownie opal wlot kolby.
7. Delikatnie uchyl wieczko szalki na której będzie wykonywany posiew i oczkiem ezy rysuj
delikatnie zygzak w pierwszym sektorze (krok 1), a następnie zamknij płytkę.
8. Wyżarz ezę w płomieniu palnika i ostudź ją. Nie zanurzaj ponownie ezy w bakteryjnej
hodowli bulionowej.
9. Płytkę przekręć o 90°C.
10. Delikatnie uchyl wieczko szalki i ponownie prowadź ezę po powierzchni agaru
zbierając punktowo materiał bakteryjny z dolnej linii poprzedniego posiewu (2).
11. Ponownie wyżarz ezę i po ostudzeniu powtórz całą procedurę, prowadząc ezę po
ostatniej ćwiartce płytki (3).
12. Ponownie wyżarz ezę.
13. Płytkę pozostaw do inkubacji do kolejnych zajęć.

Ćwiczenie 5 : Wzrost bakterii wyizolowanych z gleby na agarze odżywczym

Cel ćwiczenia: celem ćwiczenia jest izolacja bakterii glebowych.

Sprzęt i odczynniki: dwie szalki Petriego z agarem odżywczym, próbka gleby (każdy student
przynosi niewielką próbkę gleby), płyn fizjologiczny, jałowa probówka, pipeta automatyczna,
sterylne tipsy

Instrukcja wykonania:

1. Wszystkie czynności wykonuj w pobliżu palnika.

2. Do probówki przenieś 2 ml płynu fizjologicznego, zawieś w nim próbkę gleby.
3. Energicznie wytrząsaj przez dwie minuty.
 4. Po opadnięciu osadu przygotuj rozcieńczenie 10-1 oraz 10-2.
5. Pobierz po 100 µl z rozcieńczenia 10-1 oraz 10-2 sterylnym tipsem. Wykonaj standardowe
posiewy dywanowe z przygotowanych rozcieńczeń na szalki Petriego z zestalonym agarem
odżywczym.
6. Pozostaw płytki do inkubacji do kolejnych zajęć.

Ćwiczenie 6 : Wzrost bakterii wyizolowanych z powietrza na agarze odżywczym

Cel ćwiczenia: celem ćwiczenia jest izolacja bakterii obecnych w powietrzu.

Sprzęt i odczynniki: jedna szalka Petriego z agarem odżywczym

Instrukcja wykonania:

1. Płytkę pozostaw otwartą na stole laboratoryjnym przez 10 minut.

2. Pozostaw płytkę do inkubacji do kolejnych zajęć.