Laboratorium – Mikrobiologia 1

Ćwiczenie 4 : Izolacja czystych kultur bakterii

Uwaga: przypomnij sobie obsługę spektrofotometru zawartą w instrukcji do Ćwiczenia 1!

1. Wstęp teoretyczny (dotyczy ćwiczenia 4 i 5)

Hodowla drobnoustrojów, zwana kulturą, to zespół mikroorganizmów, które żyją w tym samym
środowisku. W laboratorium taką kulturą są osobniki, które posiadają zdolność do wzrostu na jednym
podłożu. Istnieją dwa rodzaje takich hodowli:
• czysta - stanowiąca zespół osobników jednakowego gatunku, potomstwo wyizolowanej bakterii;
• mieszana - w składzie której wyróżnia się kilka gatunków.

Izolacja czystych kultur

Prowadząc badania mikrobiologiczne konieczne jest posługiwanie się czystymi kulturami bakterii.
Czysta kultura to nic innego jak potomstwo pojedynczej komórki, czyli klona. Różne klony należące
do tego samego gatunku nazywane są szczepami. Izolacje czystych kultur przeprowadza się zgodnie z
zasadami sterylnej pracy, zazwyczaj na stałym podłożu. Na początku należy wyodrębnić pojedynczą
komórkę od reszty populacji. Konkretną kolonię trzeba zawiesić w odpowiednim roztworze, a
następnie dzięki wielokrotnie powtórzonej metodzie redukcyjnej można otrzymać czystą kulturę.

Metody izolacji czystych kultur dzieli się na bezpośrednie oraz pośrednie. Metoda bezpośrednia
polega na pobraniu pojedynczej komórki mikroorganizmu (np. z wykorzystaniem mikromanipulatora)
i przeniesieniu do sterylnego podłoża płynnego. Metoda pośrednia polega na izolacji pojedynczej
kolonii na stałym podłożu.
Pojedyncze kolonie uzyskuje się stosując jedną z trzech metod:
• posiew na całej powierzchni (A),
• posiew sektorowo- redukcyjny (B),
• metoda płytek lanych (C)- z wykonanego szeregu rozcieńczeń należy wykonać posiew badanego
materiału techniką wgłębną.
Wzrost bakterii
Bakterie namnażają się przez podział, dzięki czemu dochodzi do powstania dwóch komórek
potomnych. Ilość komórek wzrasta wraz z upływem czasu pewną ilość razy, która jest określana przez
stały czynnik. Nazywa się to wzrostem logarytmicznym. Przyjmując, że w jednostce objętości hodowli
okresowej znajduje się N0 komórek, można obliczyć, że po n podziałach otrzymamy N komórek.
n
Będzie to równe N 0 ∙2 . Po zlogarytmowaniu i przeliczeniu na liczbę podziałów otrzymujemy:

logN −log N 0
n=
log 2

Bakterie znajdujące się w pożywce płynnej, które są następnie inkubowane w odpowiednich

warunkach będą dzieliły się do czasu, gdy przynajmniej jeden z niezbędnych składników zostanie
wyczerpany. Staje się on wtedy czynnikiem limitującym dalszy wzrost bakterii. Jeśli w ciągu tego
czasu nie zostaną usunięte szkodliwe czynniki, ani nie będą dodawane wymagane składniki odżywcze,
powstanie układ zamknięty zwany hodowlą okresową.
 Krzywa wzrostu hodowli bakterii.

Wzrost hodowli bakteryjnej można zobrazować za pomocą wykresu zależności logarytmu liczby
komórek lub liczby żywych komórek od czasu. Taka krzywa wzrostu o kształcie sigmoidalnym jest
podzielona na fazy wzrostu:
 faza zastoju- czas od chwili zaszczepienia do ustalenia maksymalnej szybkości podziałów. Jej
całkowity czas trwania zależy przede wszystkim od składu pożywki, rodzaju hodowli oraz jej
wieku. Jeśli skład innego podłoża różni się od poprzedniego, adaptacja do zaistniałych
warunków wymaga produkcji nowych enzymów, która jest indukowana przez obecność
nowych substratów. Przykładem takiego zjawiska może być diauksja- wzrost dwufazowy na
podłożach z większą ilością substratów;
 faza logarytmiczna (wykładnicza)- czas generacji jest stały dla danego gatunku i warunków
hodowli bakterii. Wiele bakterii w tej fazie posiada również stałą zawartość białek oraz
wielkość komórek. Taka hodowla jest nazywana hodowlą zawierającą komórki standardowe.
W hodowlach okresowych podłoże stale się zmienia, dlatego zmianie ulega rozmiar komórki
oraz jej skład. Wzrasta stężenie komórek, a maleje stężenie substratu, co powoduje
gromadzenie końcowych produktów metabolizmu. Mimo wszystko jest to najwłaściwsza faza
do pomiaru szybkości wzrostu, ponieważ sam czas generacji jest stosunkowo niezmienny.
Poszukiwanie odpowiednich warunków hodowli, takich jak pH, temperatura, rodzaj
substratu, itp. Przeprowadza się z wykorzystaniem metod spektrofotometrycznych, dzięki
czemu można dokonać pomiaru liczby komórek, czy zmętnienia;
 faza stacjonarna- następuje w momencie, gdy komórki nie są już zdolne do reprodukcji.
Szybkość wzrostu hodowli spada nawet przed wyczerpaniem substratu, dlatego przejście z
fazy logarytmicznej do stacjonarnej jest stopniowe. Czynniki takie jak duża gęstość populacji,
ograniczenie ilości substratu i nagromadzenie produktów metabolizmu mogą powodować
zainicjowanie tej fazy. Jest ona głównym etapem produkcji wtórnych metabolitów (ważne np.
przy produkcji penicyliny). Wydajnością zależącą od typu substratów i warunków hodowli
 nazywa się masę bakteryjną, która została wytworzona w momencie osiągnięcia fazy
stacjonarnej;
 faza zamierania- liza komórek (autoliza) spowodowana wydzielaniem enzymów
komórkowych.

Prócz hodowli okresowej, jaką stosuje się na zajęciach laboratoryjnych, istnieje również hodowla
ciągła. Hodowla ciągła jest rozpatrywana jako układ otwarty, który osiągnął stan równowagi. Wartość
czasu została tu pominięta, a warunki hodowli są stałe, co jest łatwe do zautomatyzowania.
Przeciwnie, hodowla okresowa jest układem zamkniętym, składającym się z czterech faz. Warunki w
takiej hodowli są praktycznie cały czas inne, dlatego niemożliwe jest tutaj zastosowanie
automatyzacji.

Mikroorganizmy rosną w podłożu płynnym na różne sposoby, co służy ich identyfikacji. Wyróżnia się:
• wzrost na powierzchni podłoża- zazwyczaj w postaci kożucha lub błony (mikroorganizmy tlenowe),
 wzrost na dnie podłoża
 w postaci osadu (agregaty mikroorganizmów, które są po podziale)
 wzrost dyfuzyjny w dolnej części podłoża (urzęsione mikroorganizmy, które żyją w
warunkach niewielkiej dostępności tlenowej),
 wzrost dyfuzyjny- następuje w całej objętości podłoża (względne beztlenowce,
mikroorganizmy urzęsione).

Jedną z metod pomiaru natężenia światła przechodzącego przez roztwór koloidalny lub zawiesinę jest
metoda turbidymetryczna.

I0 1cd
3
S=log =k 4 4
=Klc , gdzie
It d +β α

S- turbidancja,
I0- natężenie światła padającego,
It- natężenie światła po przejściu przez roztwór koloidalny/zawiesinę,
l- grubość warstwy,
c- stężenie roztworu koloidalnego/zawiesiny,
d- średnica cząstek,
α- długość fali światła padającego,
k- współczynnik zależny od rodzaju zawiesiny i metody pomiaru,
β- współczynnik zależny od metody pomiaru,
K- stała uwzględniająca wszystkie współczynniki w danych warunkach.

Metoda turbidymetryczna pozwala na pomiary ilościowe przez:

• porównanie turbidancji roztworu badanego oraz wzorca w tych samych warunkach,
• zastosowanie krzywej wzorcowej.

Turbidymetryczna metoda spektrofotometryczna jest wykorzystywana w chemii analitycznej. Polega

ona na pomiarze relacji między ilością światła emitowanego przez próbkę, a ilością światła
docierającego do detektora po przejściu przez kuwetę. Zależy ona przede wszystkim od ilości
materiału powodującego dyspersję. Z racji tego, że jest to metoda mało precyzyjna, służy przede
wszystkim do analizy ilości biomasy mikroorganizmów.

Wyniki mierzone spektrofotometrycznie określa wielkość zwana absorbancją lub ekstynkcją. Jest ona
równa logarytmowi dziesiętnemu stosunku intensywności światła po przejściu do intensywności
światła padającego na substancję.

Ip
A=log ⁡( )
Ik

Równoważną definicję posiada gęstość optyczna (D). D równa zeru oznacza pełną przepuszczalność
światła, D= 1 oznacza 10% przepuszczalności, D= 2 to 1%, natomiast D= 3 to 0,1%.

Tween 80- monooleinian polioksyetylenosorbitolu, niejonowy detergent będący czynnikiem

dezintegrującym. Żółta, lepka ciecz służąca również jako emulgator. Ten dodatek spożywczy jest
oznaczany jako E433 i jest wykorzystywany w przemyśle cukierniczym, mleczarskim, w substytutach
mleka i śmietany, lodach, zemulgowanych sosach, gumach do żucia. Liczba 80 w nazwie nie jest
przypadkowa i oznacza grupę lipofilową (kwas oleinowy). Zmniejsza napięcie powierzchniowe. Po
jego dodaniu mikroorganizm nie rośnie w postaci kłaczków, lecz jest zauważalny jako zmętnienie.
Część praktyczna
Ćwiczenie 1 : Posiew redukcyjny

Cel ćwiczenia: celem ćwiczenia jest wyizolowanie czystych kultur bakterii i doskonalenie techniki
posiewu redukcyjnego.

Sprzęt i odczynniki: mieszana hodowla płynna mikroorganizmów, jedna szalka Petriego z agarem
odżywczym, eza.

Instrukcja wykonania:

1. Połóż płytkę w pobliżu palnika i odwróć ją denkiem do góry. Opisz ją podając: nazwę szczepu,
datę oraz swoje inicjały.
2. Podziel płytkę na trzy sektory zgodnie z przerywaną linią na rysunku. Odwróć płytkę
wieczkiem do góry.

3. Wysterylizuj ezę poprzez wyżarzenie w płomieniu palnika.

4. Złap jedną ręką kolbę u podstawy, drugą ręką wyciągnij korek i opal wlot kolby.
5. Pobierz (sterylnie) ezą hodowlę bulionową danego szczepu.
6. Przed zamknięciem korkiem ponownie opal wlot kolby.
7. Delikatnie uchyl wieczko szalki na której będzie wykonywany posiew i oczkiem ezy rysuj
delikatnie zygzak w pierwszym sektorze (krok 1), a następnie zamknij płytkę.
8. Wyżarz ezę w płomieniu palnika i ostudź ją. Nie zanurzaj ponownie ezy w bakteryjnej
hodowli bulionowej.
9. Płytkę przekręć o 90°C.
10. Delikatnie uchyl wieczko szalki i ponownie prowadź ezę po powierzchni agaru
zbierając punktowo materiał bakteryjny z dolnej linii poprzedniego posiewu (2).
 11. Ponownie wyżarz ezę i po ostudzeniu powtórz całą procedurę, prowadząc ezę po
ostatniej ćwiartce płytki (3).
12. Ponownie wyżarz ezę.
13. Płytkę pozostaw do inkubacji do kolejnych zajęć.

Ćwiczenie 2, część 1: Określenie ilości mikroorganizmów w badanej próbce metodą

turbidymetryczną. Sporządzenie krzywej wzorcowej.

Cel ćwiczenia: celem ćwiczenia jest sporządzenie krzywej wzorcowej metodą turbidymetryczną.

Sprzęt i odczynniki: hodowla płynna danego szczepu bakteryjnego, sterylne probówki Eppendorfa i
sterylne tipsy, płyn fizjologiczny, pięć szalek Petriego z agarem odżywczym, spektrofotometr,
plastikowe kuwety

Instrukcja wykonania:

1. Przygotowując rozcieńczenia postępuj zgodnie z poniższym schematem.

2. Z uzyskanych roztworów (5, 8, 10, 20 i 50-krotne rozcieńczenie), przygotuj rozcieńczenia
10-6 (patrz schemat).
3. Wykonaj posiew dywanowy przygotowanych rozcieńczeń 10-6.
4. Pozostaw płytki do inkubacji do kolejnych zajęć.
5. Zmierz gęstość optyczną przy długości fali 550 nm dla rozcieńczeń 5, 8, 10, 20 i 50-krotnych.
6. Wykonaj krzywą wzorcową na kolejne zajęcia zgodnie ze wskazówkami prowadzącego.