- FACULTAD DE: CIENCIAS VETERINARIAS Y BIOLÓGICAS

- CARRERA DE: MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

- PRODUCTO FINAL: DISEÑO DE PRIMERS PARA DIAGNOSTICAR

HIPERTERMIA MALIGNA EN PORCINOS

- CURSO: BIOLOGÍA MOLECULAR Y GENÉTICA

- DOCENTE: BARAHONA PADILLA, SERGIO PAOLO

- INTEGRANTES:

● ALVAREZ DEL VILLAR, ANGELA

● DEPAZ DEL AGUILA, SOFIA
● SALINAS BOLAÑOS, YERALIN

- SECCIÓN: 3D

PERÚ - LIMA

2022-02

AÑO 2022
 HIPERTERMIA MALIGNA EN PORCINOS - HM EN SCROFA
DOMESTICA

I. INTRODUCCIÓN:

La hipertermia maligna (HM) es una miopatía que ha sido catalogada como una enfermedad
farmacogenética de la musculatura esquelética ocasionado por relajantes musculares
despolarizantes y anestésicos inhalatorios, lo cual produce un estado hipermetabólico agudo e
incontrolado del músculo esquelético (García Muro,Cristina et al.,2020). Esta miopatía es una
enfermedad hereditaria monogénica y autosómica recesiva, debido a una alteración del
metabolismo del Calcio a nivel muscular (Acosta, 2021). Este es generado a partir de una
mutación en el gen del Receptor 1 de rianodina (RYR1), comúnmente conocido como gen del
halotano, dicha mutación se evidencia cuando el animal es sometido a la anestesia con
halotano, estableciendo una contracción muscular sometida y elevación brusca de la
temperatura corporal. Además, esta enfermedad puede llegar a provocar el fallecimiento,
síndrome de estrés porcina y/o síndrome de carnes pálidas, blandas y exudativas (Smith &
Bampton,1977). El gen de la MH en porcinos, se denomina RYR1 y se localiza en el
cromosoma 6 - NC_010448.4 y su CDS del gen está constituido por 15100 pares de bases, lo
cual fue comprobado copiando la secuencia por el programa Bioedit. Este gen codifica a una
proteína denominada canal liberador de calcio del retículo sarcoplásmico del músculo
esquelético por otra parte también sirve para conectar el retículo sarcoplásmico (Online
Mendelian Inheritance in Animal ,1991).

La HM ha provocado rápidos cambios post-morten en el músculo, en este caso se observará

una carne pálida y blanda (PSE).Esta enfermedad puede ser desencadenada por un estrés
menor, como por ejemplo : El transporte , las relaciones sexuales, temperaturas ambientales
elevadas o la exposición al anestésico mencionado anteriormente llamado
halotano(OMIA,1991).Por otra parte, los individuos portadores, presentan un cambio de C a
T en el nucleótido 1843 (c.1843C>T), generando una sustitución de arginina por cisteína en
la posición 615 de la secuencia aminoácido (p. Arg615Cys), produciendo así una proteína
anormal (Bonelli & Schifferli,2001). Debido a la sustitución de C por T el tipo de mutación
que presenta es una mutación transicional por el cambio de una pirimidina a otra pirimidina y
según el impacto que tiene en la proteína el tipo de mutación que presenta será una mutación
missense o mutación sin sentido no conservativa, lo denominamos no conservativa por el
simple hecho de que estos aminoácidos no pertenecen a la misma clase (Anexo 1). Para
finalizar, este se ubica en el exón 17 del gen RYR1 y en base a esos datos estaremos
realizando nuestro trabajo.
Como fue mencionado esta enfermedad es causada por una mutación que trae como
consecuencia una alteración del flujo de calcio. Inclinándonos desde un aspecto fisiológico la
hipertermia maligna está asociada a un trastorno de homeostasis del calcio en el interior de la
célula muscular. Los canales que se van a encargar del movimiento de calcio entre el retículo
sarcoplasmático y mioplasma se abren de manera precoz o prolongada en presencia de un
agente halogenado. La elevación de concentración de Ca+ es un elemento que produce la
reacción bioquímica en cadena de destrucción de la célula muscular, ocasionando de esta
manera un estado de contracción permanente, liberación de calor y aceleración de la actividad
mitocondrial que conlleva a un elevado consumo de oxígeno y un aumento de producción de
CO2, este aumento de CO2 provoca una acidosis respiratoria precoz lo cual tiene que ser
tratada correctamente (Carrillo-Esper R et al,.2013). Las principales manifestaciones clínicas
observados en los cerdos afectados por (HM) son: Temblor rápido de la cola, rigidez
muscular, disnea hasta el punto de respirar por la boca, la temperatura corporal se eleva hasta
45 °C, presentan eritema, etc. Hasta este punto el animal afectado sufre colapsos y muere.
(Blood y col., 1988; Brien, 1995).

Esta enfermedad al ser de origen hereditario, la medicina veterinaria juega un rol muy
importante; ya que es el resultado de una mutación en el ADN del animal y las consecuencias
que trae afecta gravemente al bienestar de este animal, de esta manera el médico veterinario
al estar capacitado podrá diagnosticar, prevenir y tratar a tiempo las sintomatologías que
presenta. Con respecto, a la frecuencia poblacional la enfermedad probablemente ocurra en
todas las razas porcinas, pero es más frecuente en las seleccionadas por una fuerte
musculatura, con escasa grasa dorsal y más carne, estas razas serían: Pietrain, Poland China y
Landrace, de este modo en razas europeas la prevalencia varía de 0 a 88% y hasta 100% en
Pietrain. Por otro lado, según una nueva investigación en poblaciones de cerdos de Quebec el
porcentaje de aparición del genotipo heterocigota por test de ADN (C/T) fué de 14.9% y el
del homocigota recesivo (T/T) 0.6% (Blood y col., 1988).

- IMPORTANCIA DE DISEÑAR PRIMERS PARA EL DIAGNÓSTICO MOLECULAR

Los primers o también llamados cebadores, oligos o partidores, son secuencias de ADN de
cadena simple, que especifica el segmento de interés que se desea ampliar, encargados de
proveer en el extremo 3’-OH para que la taq polimerasa sepa de dónde debe empezar a
polimerizar. Generalmente, el tamaño de estos cebadores oscila entre 15-30 pares de base en
promedio, la cantidad de G-C debe ser de 40-60% para que se de una mejor estabilidad de
alineamiento y su temperatura de melting (Tm) debe ser de 55-70ºC esto permitirá encontrar
la temperatura de annealing correcta para la PCR; sin embargo, si estas reglas no se respetan
existe la posibilidad de la formación de dímeros y hairpins, lo cual repercutirá en el
rendimiento de la reacción, así como en la especificidad del producto esperado. Además, es
importante saber que existen dos secuencias diferentes de primers que se utilizan en la PCR
una denominada forward o sentido y otra reverse o antisentido; ambas deben estar diseñadas
para que hibriden con el templado y las cadenas de ADN puedan ser extendidas por la Taq
polimerasa en dirección 5’-3. (Tamay de Dios et al., 2013)
- IMPORTANCIA DE DISEÑAR PRIMERS PARA EL DIAGNÓSTICO MOLECULAR
DE LA ENFERMEDAD:

El diseñar primers para el diagnóstico de alguna enfermedad, ya sea hereditaria o bacteriana es de

gran importancia; ya que, ayudará en las pruebas de PCR a definir la región del ADN que será
amplificada y posteriormente ser copiada millones de veces en un segmento de ADN de interés,
donde se podrá identificar ciertos patógenos de enfermedades infecciosas y en caso de cambios
genéticos (mutaciones); en este caso ayudará identificar un cambio genético en la secuencia de ADN
que puede causar la Hipertermia Maligna de esta manera estaría jugando un papel crucial en la
prevención de la propagación de esta enfermedad.

I. METODOLOGÍA Y RESULTADOS:

Para realizar nuestro primer nos hemos basado en algunos archivos científicos de la
enfermedad que podrán ser observados en nuestras bibliografías y todos nuestros
conocimientos bioinformáticos adquiridos en clase.

Paso 1:
Nos dirigimos al Oline Mendelian Inheritance in Animals (OMIA). Al ingresar a la página
buscaremos nuestro gen de estudio que es el RYR1 debido a que en este gen se encuentra la
mutación, para la realización de nuestro primer escogeremos a la especie Sus scrofa. En esta
raza la mutación ocurre en el codón 615 y en el nucleótido 143.

Figura 1: OMIA

Figura 1: OMIA- Búsqueda del gen

OMIA - Online Mendelian Inheritance in Animals

Figura 2: OMIA

Figura 2: OMIA- Especie seleccionada

OMIA - Online Mendelian Inheritance in Animals
Paso 2:
Después de seleccionar nuestra especie nos dirigiremos al Centro Nacional para Información
Biotecnológica (NCBI) desde el OMIA, con el fin de extraer nuestro gen de intereses. La
información obtenida anteriormente en la página OMIA con respecto a la mutación, nos
ayudará a encontrar la secuencia del gen en el NCBI, nuestro campo de trabajo no debe
excederse de 1000 pares de bases, por ello decidimos trabajar con unos 993 pares de bases
(Figura 3). Para poder seleccionar el tamaño del primer tanto para Forwards como para
Reverse, es importante dejar 50 pares de bases desde el exón de interés

Figura 3: Target

Paso 3:

Figura 3: NCBI, Target del exón 17

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/396718

Figura 4: NCB - Dejar 50 pb

Figura 4: NCB, Selección de los 50pb

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/396718
Paso 3:
A partir de los 50 pb seleccionamos nuestro amplicón de un total de 490 lo cual es aceptable
porque recordemos que no debe pasar de 1000pb, luego nos dirigiremos al Primer BLAST
para diseñar nuestro primer en base a los criterios.

Figura 5: NCBI -Amplicón

Figura 5: NCB, Amplicón

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/396718

Paso 4:
Al ingresar al Primer BLAST debemos hacer algunos ajustes para lograr obtener nuestro
primer ideal, el tamaño del producto de la PCR como máximo tiene que ser de 1000pb como
fue mencionado anteriormente, la temperatura melting (Tm) presenta un máximo de
diferenciación de 5°C, modificaremos la data base a genomas de referencia , luego
seleccionaremos nuestra especie de interés , consecuentemente nos dirigiremos a parámetros
avanzados en la cual modificaremos el tamaño del primer , este como mínimo puede ser de
20 y como máximo de 30,el porcentaje de GC como mínimo es de 40% y como máximo es
de 60% ,en las estructuras de complementariedad colocaremos rangos de 4 y 1 , en el caso de
hairpins el parámetro recomendado es de 0, pero puede variar entre 1 y 2. Después de ello le
daremos clic en Get Primers y solo será cuestión de esperar unos minutos para obtener
nuestros primers seleccionados (Figura 6).

Figura 6: NCBI- Primer

Figura 6: Primers
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/396718
 Paso 5:
Después de obtener nuestros primers comprobaremos cuales cumplen con los requisitos necesarios, para ello colocaremos toda la información de
cada uno de nuestros primers en un Excel para que nos facilite la selección de estos, a través del programa Oligoanalyzer con el modo batch que
permitirá analizar todos los primers a la vez. Donde tendremos en cuenta los siguientes criterios: La temperatura máxima aceptable de los Hairpin
es de -3, de Homodimero y Heterodimero es de -6, por lo cual hemos descartado a los pares 1,2,3,4,5,6 y 8 debido a que no cumplen con estos
criterios.

Name Sequence Length GcContent MeltTemp ΔG Hairpin Tm Harpin ΔG Selfdimer ΔG Heterodimer

S. scrofa domestica-RYR1-Ex17-Par1-Fw TGC GTC TCA CCA GAC CTT TC 20 55 57.2 -1.22 37 -4.52 -6.62
S. scrofa domestica-RYR1-Ex17-Par1-Rv CTG GCA TTA AGT CCG GGG GT 20 60 59.7 0.72 12.4 -9.75 -6.62
S. scrofa domestica-RYR1-Ex17-Par2-Fw CCG CTT TCA CCA CCT CTT CT 20 55 57.3 998.83 254555.7 -3.61 -6.68
S. scrofa domestica-RYR1-Ex17-Par2-Rv ACT GGC ATT AAG TCC GGG GG 20 60 59.7 -0.2 27.1 -9.75 -6.68
S. scrofa domestica-RYR1-Ex17-Par3-Fw CTG CGT CTC ACC AGA CCT TT 20 55 57.2 -1.22 37 -4.52 -5.09
S. scrofa domestica-RYR1-Ex17-Par3-Rv TGG CAT TAA GTC CGG GGG T 19 57.9 59 0.72 12.4 -9.75 -5.09
S. scrofa domestica-RYR1-Ex17-Par4-Fw TGG CAT TAA GTC CGG GGG TG 20 60 59.9 0.72 12.4 -9.76 -9.75
S. scrofa domestica-RYR1-Ex17-Par4-Rv CCC GTC TCT CCT TTC CTC CT 20 60 58.2 N/A N/A -3.61 -9.75
S. scrofa domestica-RYR1-Ex17-Par5-Fw TTC TCA GTC ACA TCC CCA CC 20 55 56.6 1.77 -6.1 -1.6 -8.09
S. scrofa domestica-RYR1-Ex17-Par5-Rv AGC TGG GAC AAG CAC GAC AG 20 60 60.1 -1.6 42.4 -6.34 -8.09
S. scrofa domestica-RYR1-Ex17-Par6-Fw CTT CTC AGT CAC ATC CCC ACC 21 57.1 57.3 1.48 -4.2 -1.6 -8.09
S. scrofa domestica-RYR1-Ex17-Par6-Rv AGC TGG GAC AAG CAC GAC A 19 57.9 59.5 -1.6 42.4 -6.34 -8.09
S. scrofa domestica-RYR1-Ex17-Par7-Fw CTG CGT CTC ACC AGA CCT T 19 57.9 57 -1.22 37 -4.52 -5.09
S. scrofa domestica-RYR1-Ex17-Par7-Rv ACA AGC ACG ACA GGG GT 17 58.8 56.9 0.66 7 -3.61 -5.09
S. scrofa domestica-RYR1-Ex17-Par8-Fw CGT CTC ACC AGA CCT TTC TCT 21 52.4 56.1 -1.22 37 -4.52 -6.62
S. scrofa domestica-RYR1-Ex17-Par8-Rv AGC TGG GAC AAG CAC GA 17 58.8 56.9 -1.6 42.4 -6.34 -6.62
Tabla 1. EXCEL - Sets de primers diseñados para el exón 17 del gen RYR1 en porcinos
 Paso 6:
Al finalizar solo nos quedamos con 1 primer, los cuales pasaremos por el programa
NCBI-BLAS para que pueda identificar la especificad de nuestro primer. Como se
puede observar en la (figura 7) nuestro primer número 7 es específico para la
mutación RYR1 en la raza Sus scrofa, lo cual nos indica que este primer puede ser
seleccionado para la amplificación en la PCR.

Figura 7: NCBI – Blast

Figura 7: Primer 7, específico

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

II. CONCLUSIÓN:

Para concluir nosotros escogimos nuestro primer en base a los siguientes criterios:

 Para el primer criterio consideramos la longitud que debe tener el primer que es 15 -
30 pares de base, teniendo en cuenta esto, nuestro primer 7 cumple este criterio
teniendo de longitud 19 pb en el forward y en el reverse 17 pb.
 Para el segundo criterio consideramos el contenido de GC que debe ser entre 40 -
60%, en este caso de nuestro primer 7 su contenido de GC para el forward es de
57.9% y para el reverse es de 58.8%.
 Para el tercer criterio tuvimos en cuenta la temperatura de Melting (Tm) que es de 55
- 70 ºC y que el forward y el reverse no deben tener una diferenciación de no más de 5
ºC, para este caso nuestro primer 7 tambien lo cumple.
 Para el cuarto criterio tuvimos en cuenta la energía libre de Gibbs en homodímeros y
heterodímeros que debe ser -6; ya que es el máximo negativo aceptable, aunque es
mejor si los números son positivos de esta manera la formación de estructuras
secundarias no será espontánea; sin embargo, se puede aceptar que el primer sea
 espontáneo, pero con valores pequeños. En nuestro caso con el primer 7 presenta
números negativos menores a -6 lo cual es aceptable.
 Para el quinto y último criterio, es importante saber que los primers pueden hacer
hairpin que es una estructura secundaria donde el primer se hibrida así mismo, para
esto el máximo negativo aceptable es de -3 y en nuestro caso con nuestro primer 7
está debajo de -3 que es para el forward y para el reverse llega ser positivo.
 Finalmente cabe mencionar que se escogió comprar el primer del par 7 debido a sus
bajas espontaneidades y dímeros que se formara.

III. ANEXOS:
- Anexo 1:

IV. CITAS Y LISTA DE REFERENCIA:

- Acosta, D. B., Español, L. Á., Figueroa, C. E., Marini, S. J., Mac Allister, M.
E., Carpinetti, B. N., Fernández, G. P., & Merino, M. L. (2020). Wild pigs
(Sus scrofa) population as reservoirs for deleterious mutations in the RYR1
gene associated with Porcine Stress Syndrome. Veterinary and animal science,
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- Bonelli, A. M., & Schifferli, R. C. (2001). Síndrome Estr´es Porcino. Archivos
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- BLOOD, D. C., J. A. HENDERSON, O. M. RADOSTITS. 1988 Medicina Veterinaria.
Interamericana. México, D.F. 1352-1356.
- Carrillo-Esper R, Lázaro-Santiago G, Nava-López JA. Hipertermia maligna.
Conceptos actuales. Rev Mex Anest. 2013;36(3):185-192.
- García-Muro, Cristina, Sáenz-Moreno, Isabel, Riaño-Méndez, Bibiana,
Gutiérrez-Delgado, Jesús M., Valencia-Ramos, Juan, & Esteban-Zubero,
Eduardo. (2020). Síndrome de hipertermia maligna: una patología infrecuente.
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noviembre de 2020.https://doi.org/10.24875/bmhim.20000047
- O'BRIEN, P. J. 1995. The causative mutation for porcine stress syndrome.
Food Animal. 257-269.
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- Smith, C., & Bampton, P. (1977). Inheritance of reaction to halothane
anaesthesia in pigs. Genetical Research, 29(3), 287-292. doi:
10.1017/s0016672300017365
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reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real.
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https://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2013/ir132d.pdf