Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Laboratorio de Bioquímica General
PRÁCTICAS 12 Y 13
“AISLAMIENTO DE DNA, HIDRÓLISIS DE RNA Y DNA E
IDENTIFICACIÓN DE BASES PÚRICAS Y PIRIMÍDICAS POR
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA”
Integrantes: Macias Rivera Guadalupe Lizbeth y Ramírez Martínez Alessandra Denise.
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INTRODUCCIÓN
Los ácidos nucleicos son los responsables de almacenar la
información genética. Hay dos tipos de ácidos nucleicos: el
ácido desoxirribonucleico (DNA o DNA) y el ácido ribonucleico
(RNA o RNA). Sus monómeros son los nucleótidos. Los
nucleótidos se diferencian en el tipo de base nitrogenada que
contienen. Hay dos tipos de bases nitrogenadas; las purinas
son: adenina y guanina y ambas pueden formar parte tanto del
DNA como del RNA. Las pirimidinas son: citocina, timina y
uracilo. La citocina también puede formar parte de ambos
ácidos nucleicos. Pero la timina solo puede formar DNA y Figura 2. Cromatoplaca del Figura 3. Cromatoplaca de
mientras que el uracilo solo está presente en el RNA. (Moreno, DNA hidrolizado. la técnica de pull.
S., s.f.) Tabla 1. Rf obtenidos de la cromatografía en capa fina.
Muestra Hidrolizado Pull
OBJETIVOS Adenina 0.714 0.66
Guanina 0.657 0.6
• Llevar a cabo la extracción del DNA vegetal utilizando Citosina 0.614 0.55
detergentes. Timina 0.842 0.802
• Utilizar los métodos espectrofotométricos para Uracilo - 0.75
determinar la pureza del extracto de DNA obtenido de DNA 0.6 0.57
una muestra vegetal, en este caso, tabaco. RNA 0.771 0.605
• Realizar la determinación cuantitativa de la
concentración de DNA de una muestra de tabaco. DISCUSIÓN
• Llevar a cabo la hidrólisis del DNA y del RNA para Para determinar la pureza de una muestra de DNA, la relación
comparar las bases nitrogenadas que contienen sus A260/280 es muy estable y se considera que un ADN de pureza
nucleótidos. óptima tiene un valor entre 1.8-2.0. Un valor A260/280 < 1.6
• Comparar por cromatografía en capa fina una muestra indica una posible contaminación por compuestos aromáticos
hidrolizada de RNA y de DNA con una placa de control como fenoles y proteínas. (Banco ADN, s.f.) Cómo la muestra
elaborada con la técnica del pull. de DNA fue recuperada de las hojas de tabaco que tenían
mucho tiempo guardades, es posible que la presencia de lignina
RESULTADOS (polifenoles) sean los responsables de el valor tan bajo
obtenido. Por otro lado, se realizó el análisis de las bases
4
nitrogenadas que conforman tanto al DNA como al RNA, por
3 medio de una cromatografía en capa fina, usando como fase
2 móvil butanol: ácido acético: agua (5:2;3 v/v/v). Podemos
observar que en la placa de hidrolizado no hay ninguna mancha
1 que corresponda al uracilo, lo que indica una mala técnica y un
0 descuido técnico aplicando los estándares a la placa. Los
0 100 200 300 400 resultados de la Tabla 1 se pueden comparar con los resultados
obtenidos por Markham y Smith, quienes usaron cómo fase
Figura 1. Espectro de longitud de onda contra absorbancia para el cálculo móvil una mezcla de butanol: ácido fórmico; agua (7.7:1:1.3
de pureza y concentración del DNA. v/v/v) y se reflejan en la tabla 2:
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑎 260 𝑛𝑚 Tabla 2. Comparativo de los Rf obtenidos experimentalmente con los
𝑃𝑢𝑟𝑒𝑧𝑎 =
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑎 280 𝑛𝑚 reportados por la bibliografía.
Muestra Hidrolizado Pull M. & S.
2.614
𝑃𝑢𝑟𝑒𝑧𝑎 = = 1.1643 Adenina 0.714 0.66 0.18
2.245 Guanina 0.657 0.6 0
µ𝑔 Citosina 0.614 0.55 0.16
[𝐷𝑁𝐴] = (𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑎 260 𝑛𝑚)(𝐹𝐷)(50 ) Timina 0.842 0.802 0.51
𝑚𝐿 Uracilo - 0.75 0.42
µ𝑔
[𝐷𝑁𝐴] = (2.614)(30)(50 ) La diferencia de los valores obtenidos puede variar por la
𝑚𝐿
polaridad de la fase móvil, ya que el ácido acético posee un
µ𝑔
[𝐷𝑁𝐴] = 3921 carbono más, lo que le confiere un carácter menos polar,
𝑚𝐿 además, en su trabajo, Masamune y Sakamoto proponen que
el ácido fórmico es más adecuado para liberar las bases
cuantitativamente de los ácidos nucleicos. (Masamune &
Sakamoto, 1955).

CONCLUSIONES

• La separación de DNA usando detergentes es un

método conveniente por el alto rendimiento que
presenta, sin embargo, genera muchos
contaminantes.
• La pureza del ADN extraído de una planta madura
puede presentar alteraciones gracias a la presencia de
polifenoles naturales, como la lignina o algunos
metabolitos secundarios.
• Se puede calcular la concentración de DNA en una
muestra por métodos espectrofotométricos, en el caso
de la hoja de tabaco con la que se trabajó fue de
3921 µg/mL
• Es posible obtener los nucleótidos de los ácidos
nucleicos con ayuda de una hidrólisis ácida, y es
posible caracterizarlos gracias a la base nitrogenada
que poseen.
• La timina es una base nitrogenada que el DNA posee,
pero el RNA no, por lo que el Rf del DNA será mayor
cuándo la fase móvil sea poco polar respecto al agua.
• El uracilo es una base nitrogenada que el RNA posee,
pero el DNA no, gracias a este, el Rf del RNA será
menor siempre que se use una fase móvil poco polar
respecto al agua.
• La técnica de pull nos da una idea de como tendría que
ser la cromatografía de una muestra de DNA
hidrolizado, por lo que se puede usar como referencia
o control.

BIBLIOGRAFÍA

• Banco ADN. (s.f.). PROGRAMA CONTROL DE CALIDAD DE

MUESTRAS DE ADN Y ARN PROGRAMA DE CONTROL DE
CALIDAD DE MUESTRAS DE ADN Y ARN.
https://www.bancoadn.org/docs/programa-control-calidad-
muestras.pdf
• Kellner, S., Burhenne, J., & Helm, M. (2010). Detection of RNA
modifications. RNA Biology, 7(2), 237–247.
https://doi.org/10.4161/rna.7.2.11468
• Masamune, H., & Sakamoto, M. (1955). A Combination of Several
Methods for Determination of Purine and Pyrimidine Bases in DNA
with Minor Modifications. The Tohoku Journal of Experimental
Medlcine, 61(4).
https://www.jstage.jst.go.jp/article/tjem1920/61/4/61_4_353/_pdf
• Moreno, S. (s.f.). “Ácidos nucleicos”. Temas selectos de
Bioquímica General. UNISON. Recuperado de:
https://dagus.unison.mx/smoreno/6%20%C3%81cidos%20Nuclei
cos.pdf
ANEXO 1. NOMOGRAMA DE ADN HIDROLIZADO

ANEXO 2. TABLA DE ABSORVANCIAS

Longitud de Absorbancia
onda (nm)
200 0.242
210 0.321
220 1.024
230 1.031
240 0.77
250 0.576
260 0.514
270 0,505
280 0.497
290 0.387
300 0.317