Universidad Nacional de Colombia Bogotá-Colombia

VERIFICACION DE ESPECTROFOTOMETRO UV-VIS, THERMO SCIENTIFIC 600 EVOLUTION™

Y DETERMINACION DE pKa DEL COMPUESTO AZUL DE BROMOTIMOL (BTB), MEDIANTE
ESPECTROSCOPIA UV-VIS.
Carlos Hernando Tapia Bastidas1
1
Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, Colombia, Facultad de Ciencias, Departamento de
Química, Laboratorio de Análisis Químico Instrumental.
2
Email de autor: chtapiab@unal.edu.co
14 de junio de 2023

Resumen
Se realizó la verificación de un equipo de espectroscopia Uv-Vis, Thermo Scientific 600 Evolution™.
Se realizaron análisis de señal ruido, exactitud y precisión en la longitud de onda y exactitud y
precisión fotométrica. Se determina la relación señal ruido S/N de 323, 96 un error relativo de 0.003
en % . Se usó celdas de plástico, vidrio y cuarzo con el objeto de analizar absorbancias de los
materiales donde el cuarzo absorben menor energía y abarcan un rango espectral de análisis Uv-
Vis.. Las pruebas de exactitud y precisión de longitud de onda muestran error relativo menor a 0,7 y
desviaciones estándar cercanas a cero. La exactitud y precisión fotométrica revela valores de
errores absolutos de 0,02 y coeficientes de determinación del 97% asociado a un error relativo de
2,06% relativo a un coeficiente de determinación de 1 esperado. El equipo se encuentra en
condiciones óptimas de trabajo con variaciones menores al 0,1 respecto a valores esperados y
buena reproducibilidad en la medida de los datos. Se determina pKa de “azul de bromotimol (BTB)”
mediante espectroscopia Uv-Vis en un rango espectral de 200nm a 800nm. Se preparan dos curvas
de calibración el pH se mantiene fijo y se lleva a volumen final de (20 ± 0,04) mL . A pH 13 se usa
(1,3,4,5,6,7,9,)mL de stock BTB de 6,406x10-5 M y se obtienen concentraciones de (3.20x10-6,
9.61x10-6, 1.28x10-5, 1.60x10-5, 1.92x10-5, 2.24x10-5, 2.88x10-5 )M color azul, absorben en
615nm y 394nm. En pH 1 se usó (2,6,9,12,15)mL de stock BTB y se obtienen concentraciones de
(6,41x10-6, 1,92x10-5, 2,88x10-5, 3,84x10-5, 4,80x10-5)M color amarillo, absorbe en 433nm. El pH
se ajustó con NaOH 1M y HCl 1M a un volumen (50 ± 0,06) mL de stock BTB de trabajo. Se
construye una recta por mínimos cuadrados absorbancia en función de concentración y se determina
coeficientes de absortividad (ε616nm básico de 39894,7 y ε393nm básico de 8611,1) y medio ácido
(ε433nm ácido de 17290,4). Se preparan 4 muestras a pH de 6.7, 6.9, 7.1 y 7.3 color verde con
ecuación de Henderson Hasselbach con 10mL de stock BTB a volumen de (20 ± 0,04) mL ajustando
el pH con buffer de K2HPO4 y KH2PO4 y HCl y NaOH muy diluidos mediante pHmetro. Se gráfica
absorbancia en función de longitud de onda, se determina rango de máximo solapamiento entre
450nm y 550nm. Se construye un modelo lineal por regresión de mínimos cuadrados, método de
adición. Se determina el valor de pKa de 6,94 con un error relativo de 2,28% respecto al esperado
7,1 punto isobestico a 498nm.
Palabras clave. pKa, concentración, isosbestico, especie, equilibrio, pH, absorción, buffer, absortividad,
espectro, BTB, regresión, verificación, señal ruido, precisión, exactitud.

Objetivo
 Verificar el correcto funcionamiento del espectrofotómetro Uv-Vis ,Thermo Scientific 600
Evolution™ usando valores de referencia según fabricantes mediante análisis de exactitud,
precisión, linealidad, ruido entre otros.

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 Determinar el pKa de un compuesto comercial usado como indicador de pH, azul de

bromotimol (BTB) mediante espectroscopia UV-VIS, usando método de adición.
Materiales y métodos
Equipo UV-VIS
- Cary 50 Spectrophotometer, versión 3, scan rate 600 nm/s, intervalo de datos 1nm, modo
dual beam, intervalo de medida de 200nm a 800nm, © Agilent Technologies, Inc. 1998 to
2011, Santa Clara, California, EEUU.
Reactivos
- Solución de Sulfato de cobre (CuSO4) en ácido sulfúrico (H2SO4) al 1%, en diferentes
concentraciones (0.02, 0.04, 0.06, 0.08,0.1, y 0.12)M, la sal debe ser de grado analítico de
alta pureza.
- Blanco ácido sulfúrico (H2SO4) al 1%.
- Agua desionizada
- - Hidróxido de sodio (NaOH), 0,05M y 1M, preparado a partir de sólido grado analítico, CAS
1310-73-2 - PanReac AppliChemcompanies, Barcelona (Spain).
- - Ácido clorhídrico 0,01M y 1M, preparado a partir de: EMSURE, ACS ISO, Reag, Ph EUR.
Hidrocloric acid fuming 37%, MERK.
Materiales
- Bureta clase B de teflón kimax de (25 ± 0,05) mL con subdivisión de 0,02 mL
- Pipeta aforada clase A de (1,2,5,10,)mL
- Balón aforado de (20 ± 0,04)mL y (50 ± 0,06)mL
- Celda de plástico, Celda de vidrio, Celda de cuarzo, Celda de holmio
Muestra de análisis
- Indicador de pH, azul de bromotimol (BTB), grado analítico, 0,04% en NaOH al 0,01M.
- Azul de bromotimol indicador ACS,Reag. Ph Eur, Millipore, CAS 76-59-5, MERCK S.A. Av.Carrera
9a No. 101-67.Piso 5.Edificio NAOS.Officina 501 A 110111 BOGOTA D.C COLOMBIA.

Análisis y resultados
- La verificación de estos equipos se basa en la interacción radiación- materia teniendo en
cuenta la ley de Beer y sus ecuaciones de absorbancia y transmitancia.
Resultados y análisis

Gráfico señal ruido S/N

% Transmitancia

100.2
99.2
190 290 390 490 590 690 790
Longitud de onda λnm

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Figura 1. Espectro de %Transmitancia en función de longitud de onda nm.

Podemos ver que representa el ruido o línea de fondo, con su promedio podemos determinar la línea
base para realizar correcciones a las mediciones que hagamos. Se espera que los valores de
interferencia sean mínimos lo cual indica una menor absorbancia o mayor transmitancia.
Tabla1. Resultados de análisis señal-Ruido
Descripción %Transmitancia
Promedio 100,010
SD 0,309
Max 100,886
Min 99,218
(P-P) 1,668
Error relativo 0,003
S/N 323,955
*SD desviación estándar, *PMAX pico máximo, *PMIN pico mínimo, *Δ(P-P) diferencia pico máximo y pico
mínimo, *ER Error relativo, *S/N Señal ruido.

Como parámetro de aceptación se toma en cuenta la desviación estándar o error relativo en %

transmitancia ya que la S/N es lo mismo que el reciproco del error relativo de la señal [2]. Si
analizamos por desviación estándar se desvía de 0,1 que seria el esperado, pero es aceptable y si
analizamos el error relativo esta por debajo de 0,01 al esperado lo cual cumple, aunque puede variar
algunos valores según el criterio del experimentador.

Podemos ver en la gráfica siguiente que el mejor material que no absorbe en Uv-Vis es el cuarzo, los
demás absorben en mayor proporción y en la región Uv, por lo cual se debe tener en cuenta en las
diferentes mediciones y análisis.
TRANSMITANCIA EN DIFRENTES MATERIALES DE CELDAS

Materiales de celda y transmitancia

99
79
% Transmitancia

59
39
19
-1
196 246 296 346 396 446 496 546 596 646 696 746 796
Longitud de onda λnm

plastico vidrio cuarzo

Figura 2. Transmitancia en diferentes materiales de celdas

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DETERMINACION DE EXACTIUD Y PRECISION DE LONGITUD DE ONDA USANDO CELDA DE

HOLMIO
Se tiene en cuenta longitudes de onda λnm como referencias reportadas en literatura y se comparan
las longitudes de onda obtenidas experimentalmente comparando su error absoluto y la desviación
estándar usando una celda de holmio.
MEDIDA DE %TRANSMITANCIA EN DISTINTOS MATERIALES DE CELDAS

98 3.9
88 3.4
78 Figura
2.9
% Transmitancia

68 3.
2.4

Absorbancia
58
48 1.9
38 1.4
28
0.9
18
8 0.4
-2 -0.1
200 300 400 500 600 700 800 197 297 397 497 597 697
-0.6
Holf... Longitud de onda λnm HolfmioLongitud de onda λnm

Espectro de %transmitancia (a) usando celda de holmio,

Espectro de absorbancia (b) usando celda de holmio fondo aire [4]
Tabla 2. Resumen de datos, medida de picos y comparación con referencia, como criterio error
absoluto en longitud de onda.
Referencia Medida
Pico nm nm %Transmitancia Error absoluto Cumple
2 279,3 278,7 25,815 0,6 si
3 287,6 287 30,019 0,6 si
4 333,8 333,3 57,076 0,5 si
5 360,8 360,2 7,878 0,6 si
6 385,8 385 253 0,8 si
7 418,5 417,9 49,012 0,6 si
8 453,4 452,7 8,484 0,7 si
9 459,9 459,1 6,318 0,8 si
10 536,4 535,8 40,22 0,6 si
11 637,5 637,3 62,752 0,2 si

Podemos ver que el error absoluto está por debajo de 1 por lo tanto es razonable que los valores
son aceptables ya que su desviación no es significativa, además los valores de error absoluto se
mantienen a un valor de 0,6 en promedio.

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Tabla 3. Resumen de datos para exactitud, comparación de medidas como criterio error absoluto de
longitud de onda en absorbancia.
Referencia Medida
Pico nm nm Absorbancia Error absoluto Cumple
2 279,3 279,2 0,551 0,1 si
3 287,6 287,6 0,458 0 si
4 333,8 334,1 0,214 0,3 si
5 360,8 359,9 1,029 0,9 si
6 385,8 386,8 0,155 1 si
7 418,5 419,2 0,259 0,7 si
8 453,4 453,5 1,004 0,1 si
9 459,9 458,8 1,156 1,1 no
10 536,4 537,6 0,34 1,2 no
11 637,5 638,8 0,183 1,3 no

Podemos ver que al comparar las posiciones de longitud de onda de referencia y medidas la mayor
parte de estos valores de los picos se encuentran por debajo de 1 de error absoluto, la variación de
la posición del pico no es significativa y la mayoría de las posiciones de longitudes de onda medida
corresponden al valor esperado la variación será mínima en cuanto a las medidas que hagamos al
valor esperado.
PRECISION
Se toman dos picos para comparar 360,8nm y 536,4nm de la tabla de referencia de picos
característicos usando celda de holmio figura 3 y se comparan frente a absorbancia y transmitancia
experimentales.
Tabla 4. Resumen de datos longitud de onda de 360,8nm criterio de precisión desviación estándar
en %transmitancia y absorbancia.
Referen Medid Referencia Medida
cia a Transmita ID nm nm Absorbancia
ID nm nm ncia PICO 5 360,8 360,20 1,11
PICO PICO 5 360,8 360,20 1,10
5 360,8 360,20 8,01 PICO 5 360,8 360,20 1,11
PICO PICO 5 360,8 360,30 1,10
5 360,8 360,30 7,96 PICO 5 360,8 360,10 1,11
PICO promedio 360,20
5 360,8 360,20 7,69
PICO SD 0,07
5 360,8 360,10 7,80
PICO
5 360,8 360,20 7,84
prome 360,20

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dio
SD 0,07

Tabla 5. Resumen de datos longitud de onda de 536,4nm criterio de precisión desviación estándar
en Absorbancia y transmitancia.
Referencia Medida Referencia Medida
ID nm nm Absorbancia
ID nm nm %Transmitancia
PICO 10 536,4 535,7 0,397
PICO 10 536,4 535,7 40,05
PICO 10 536,4 535,7 0,398
PICO 10 536,4 535,7 40,06
PICO 10 536,4 535,8 0,397
PICO 10 536,4 535,7 40,01
PICO 10 536,4 535,7 0,397
PICO 10 536,4 535,7 40,02
PICO 10 536,4 535,8 0,398
PICO 10 536,4 535,7 40,01
promedio 535,74 promedio 535,70
SD 0,05 SD 0,00

Observamos las desviaciones estándar de las diferentes tablas obtenidas en comparación con sus
referencias que están por debajo de 0,1 lo que indica que la reproducibilidad es buena o aceptable
en las condiciones de medida por lo tanto las variaciones de medidas repetitivas serán constantes lo
que indica una buena precisión.
DETERMINACION DE EXACTITUD Y PRECISION FOTOMETRICA
Se prepara diferentes concentraciones de sulfato de cobre (0.02, 0.04, 0.06, 0.08,0.1, y 0.12)M y se
procede a medir absorbancia a diferentes longitudes de onda (600, 650, 700 y 750)nm y se obtiene
la siguiente gráfica.
EXACTITUD FOTOMETRICA
Tabla 6. Resumen de datos a una concentración de sulfato de cobre de 0,08M se lee absorbancias a
una longitud fija de 750nm.
Longitud Absorbancia Absorbancia
equipo Referencia Medida Error
nm Absoluto Cumple
750 0,817 0,8 0,02 si
750 0,817 0,796 0,02 si
750 0,817 0,794 0,02 si
Promedio 0,817 0,797 0,02 si
*Comparación de absorbancias de referencia y medidas criterio de exactitud error absoluto

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PRECISION FOTOMETRICA
Tabla 7. Resumen de datos se mide absorbancias a diferentes longitudes de onda para diferentes
concentraciones de sulfato de cobre (M).
Concentración
M λ600nm λ650nm λ700nm λ750nm
0,080 0,043 0,205 0,507 0,800
0,080 0,043 0,206 0,507 0,796
0,080 0,044 0,208 0,509 0,794
0,100 0,051 0,241 0,592 0,937
0,100 0,051 0,240 0,596 0,937
0,100 0,051 0,242 0,594 0,936
0,120 0,073 0,320 0,778 1,226
0,120 0,074 0,320 0,780 1,230
0,120 0,073 0,321 0,782 1,233
*Los valores debajo de las longitudes de onda de medida corresponden a absorbancias

Figura 4. Curvas a partir de regresión mínimos cuadrados y concentraciones de sulfato de cobre

(Cu(SO4)) en 1% de ácido sulfúrico. (H2SO4).
Tabla 8. Obtención de coeficientes de determinación de sulfato de cobre como criterio de precisión a
diferentes concentraciones de (Cu(SO4)) en 1% de ácido sulfúrico. (H2SO4). Valor de referencia 1.
R2 Valor
1 0,9794
2 0,9796
3 0,9791
Promedio 0,9794
%Error Relativo 2,060
CONCLUSIONES
Los resultados que se obtuvieron respecto a la verificación del equipo de espectroscopia Uv-Vis,
muestran que el equipo se encuentra en condiciones óptimas de trabajo, con un mínimo de error que
no altera significativamente los resultados de medida. Se debe tener en cuenta otras fuentes de

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ruido y variables que puedan generar un aumento de estos errores sean instrumentales,
perturbativas o experimentales. Las pruebas de exactitud muestran que las diferentes medidas no se
alejan significativamente del valor esperado y en cuanto a las pruebas de precisión indican una alta
reproducibilidad de las medidas realizadas con variaciones mínimas.
Metodología determinación de Pka
Cálculo de la concentración de BTB en la solución de NaOH 0,01M.
Determinación de la concentración de BTB

( )
−1
624 ,38 g −1
∗( 1 x 10 L ) =6,406 x 10 M BTB
−4 −3 −4
4 x 10 g BTB∗
mol
Posteriormente se calcula la absortividad molar de la muestra para preparar las concentraciones
adecuadas.
Cálculo de concentración dilución en 100mL.
Ecuación (1)
−4
1mL∗6,406 x 10 M BTB −6
=6,406 x 10 M BTB
100 mL

absorbancia 0,24

Determinación concentración stock BTB

Ecuación (2)
[ 5 mL∗(6,406 x 10 −4
M BTB ) ] =6,406 x 10 −5
M BTB
50 mL

Stock BTBbásico 6,406x10-5 M

Construcción de una curva de calibración medio básico

Se adiciona a un balón de 50mL un volumen de 5mL de BTB en una solución de NaOH al 0,01M,
Para garantizar un pH de 13 se usa 5mL de solución de NaOH de 1M y se lleva a volumen final de
50mL.

Determinación de la concentración de [OH-] despejando y reemplazando.

Ecuación (3) pH=−log ¿ ¿

Resultados y discusión
Tabla 9. Determinación de la concentración final de BTB para construir curva de calibración medio
básico.
Volumen Concentración Volumen Concentración pH
Stock Stock (M) final final básico

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(mL) Stock (mL) Stock (M)

-5
1 6,41x10 20 3,20x10-6 11,7
3 6,41x10-5 20 9,61x10-6 12,2
4 6,41x10-5 20 1,28x10-5 12,3
5 6,41x10-5 20 1,60x10-5 12,5
6 6,41x10-5 20 1,92x10-5 12,5
7 6,41x10-5 20 2,24x10-5 12,5
9 6,41x10-5 20 2,88x10-5 12,6

La solución stock BTB básica posee un pH promedio de 12,5 en la parte experimental se mantiene el
pH fijo este varia levemente al llevarlos a 20mL de cada balón, aunque no de forma significativa,
pero también debemos tener en cuenta que cuando se trata de concentraciones muy pequeñas los
cambios pueden ser significativos en las especies en equilibrio del BTB.

Absorcion BTB en medio básico

1.2
1
0.8
Absorbancia

0.6
0.4
0.2
-1.66533453693773E-16
330 380 430 480 530 580 630 680
-0.2
Longitud de onda λnm
1mL 3mL 4mL 5mL
6mL 7mL 9mL
Figura 5. Curvas de absorbancias obtenidas a partir del corrimiento de un espectro entre 200nm a
800nm en medio básico para BTB. (coloración azul)

En esta grafica nos interesa los picos máximos asociados con las longitudes de onda de: 380nm y
630nm, asociado al medio básico respectivamente. Hay una mayor absorción de energía en el
medio a longitudes de onda de 630nm, podemos encontrar el equilibrio desplazado hacia especies
desprotonadas del BTB y a un cambio de configuración electrónica del BTB, sus cromóforos
absorben cierta cantidad de energía a longitudes de onda aproximadamente de 380nm se observa
un incremento de altura de pico mínimo, debido a su complejidad estructural puede tener varios
grupos cromóforos que al ser una molécula con muchas insaturaciones o conjugada y presenta
anillos puede absorber energía en varias longitudes de onda, pero el más característico será para
630nm medio básico.
−¿ ¿
−¿exceso O H ¿

Ecuación (4) HA +O H−¿↔ H 2 O+A ¿

Construcción curva de calibración medio ácido

Se usa una solución de HCl 1M para preparar las diferentes diluciones con BTB, se construye la
curva de calibración a partir del Stock BTB acido con una concentración de 6,41x10-5MBTB.

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Determinación de la concentración de [H+]

Ecuación (5)
1 M HCl∗5 mL
=0 , 1 M HCl
50 mL
Ecuación (6)
pH=−log [ 0 ,1 M HCl ]=1

Con la concentración de iones hidronio [H +] y los volúmenes usados de BTB podemos calcular los
diferentes pH de las diferentes concentraciones de BTB en medio acido.

Stock BTBácido 6,406x10-5 M

Tabla 10. Determinación de la concentración de BTB para construir curva de calibración medio ácido
y determinación de pH.
Volumen Concentración Volumen Concentración pH
Stock Stock (M) final final ácido
(mL) Stock (mL) Stock (M)
2 6,41x10-5 20 6,41x10-6 2,19
6 6,41x10-5 20 1,92x10-5 1,72
9 6,41x10-5 20 2,88x10-5 1,54
12 6,41x10-5 20 3,84x10-5 1,41
15 6,41x10-5 20 4,80x10-5 1,32

0.9
0.8
Absorción BTB en medio ácido
0.7
0.6
Absorbancia

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
2.77555756156289E-17
-0.1250 300 350 400 450 500 550 600

Longitud de onda λnm

2mL 6mL 9mL 12mL 15mL

Figura 6. Curva de absorbancia obtenida a partir del corrimiento de un espectro entre 200nm a
800nm en medio ácido para BTB. (coloración amarilla)

Podemos ver una máxima absorción en longitudes de onda de 450nm, en este caso debido al
ambiente acido y la alta concentraciones de iones hidronio H + el equilibrio estará desplazado a
especies protonadas de la molécula de BTB, su configuración electrónica también estará sujeta a
este ambiente acido, así como su absorción. Vemos que por encima de longitudes de onda de
600nm no se evidencia absorción.

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−¿↔ HA¿
Ecuación (7) H +¿+ A ¿

Absorbancias encontradas para ambiente básico

Tabla 11. Resumen de datos medición de absorbancias medio básico a dos longitudes de onda.

Stock BTB Concentración Absorbancia Absorbancia

(mL) (M) (615nm) (394nm)
1 3,20x10-6 0,121 0,026
3 9,61x10-6 0,376 0,080
4 1,28x10-5 0,518 0,110
5 1,60x10-5 0,631 0,135
6 1,92x10-5 0,762 0,164
7 2,24x10-5 0,887 0,190
9 2,88x10-5 1,147 0,247

*λ 615nm absorción ambiente básico

*λ 394nm absorción ambiente básico

1.4
Curva medio básico concentración vs ab-
sorbancia
1.2
1 f(x) = 39894.7329915017 x − 0.00434673606190561
R² = 0.999758297775503
Absorbancia

0.8
0.6
0.4
0.2
f(x) = 8609.52168491607 x − 0.00188127257571477
0 R² = 0.999694896481634
0 0.00001 0.00002 0.00003 0.00004
Básico 616nm Linear (Básico 616nm)
Concentración M Básico 393nm
Linear (Básico 616nm)
Linear (Básico 393nm)

Figura 7. Curva de absorbancia en función de la concentración M de BTB, en medio básico.

Determinación de coeficiente de absortividad

Estos coeficientes representan la pendiente de la curva de la gráfica anterior obtenida mediante
regresión por mínimos cuadrados. Se determinan valores de coeficiente de absortividad de:
ϵ 616 nm=m=39895 y ϵ 393 nm=m=8610 . El análisis estadístico se realiza mediante software Excel y
se hace correcciones de curva según sensibilidad.

Tabla 12. Resumen estadístico del modelo lineal a una longitud de onda de 616nm medio básico (a)
y 393nm medio básico (b).

616nm
básico Coeficientes Error típico

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393nm
básico Coeficientes Error típico
Intercepto -0,00434674 0,00494749
Intercepto
(b) (b) -0,00188127 0,00144534
Pendiente 39894,733 0,27741081
Pendiente
(m) (m) 8609,52168 0,07520365

Tabla 13. Resumen de datos medición de absorbancias medio ácido a una longitud de onda.
Stock BTB Concentración Absorbancia
(mL) (M) (433nm)

*λ 433nm absorción ambiente acido

* No presenta absorbancia por encima de longitudes de onda de 600nm

Las especies BTB prefieren estar en su forma protonada el equilibrio esta desplazada a su forma sin
disociar en medio acido se ven absorbancias máximas a longitudes de onda 433nm a pH ácidos.

Curva BTB medio ácido (433nm)

1
0.8
Absorbancia

0.6 f(x) = 17290.408610217 x − 0.00329946782140073

R² = 0.999902804727941
0.4
0.2
0
0 0.00001 0.00002 0.00003 0.00004 0.00005 0.00006
Concentración M

Figura 8. Coeficiente de absorción determinado a partir de absorbancia en función de concentración

M de BTB en medio ácido a longitudes de onda de 433nm.
Coeficiente de absortividad de ϵ 433 nm=m=17290 .
Tabla 14. Resumen estadístico del modelo lineal a una longitud de onda de 393nm. Medio ácido

433nm
acido Coeficientes Error típico
Intercepto 0,0031209
(b) -0,00329947 2

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Pendiente 98,421120
(m) 17290,4086 7

Preparación de las muestras de BTB a pH: 6.7, 6.9, 7.1, 7.3

Se toma 10mL de BTB y se lleva a volumen final de 20mL, el pH se ajusta a los valores de pH ( 6.7,
6.9, 7.1, 7.3), se usa la ecuación de Henderson Hasselbach y finalmente ajustando con un pHmetro
usando HCl o NaOH muy diluidos.
Tabla 15. Resumen de datos preparación soluciones ajustadas a pH definidos anteriormente.
Solución pH Volumen Stock Volumen final
Ajustado BTB (mL) (mL)
1 6,7 10 20
2 6,9 10 20
3 7,1 10 20
4 7,3 10 20

Para preparar la solución buffer se emplea fosfato monobásico y fosfato dibásico, pKa del fosfato
7,2. Los compuestos usados para la preparación del buffer a pH (6.7, 6.9, 7.1, 7.3) ajustable.
Reactivos
KH2PO4 [HA] y K2HPO4 [A-]
Se debe reemplazar el valor de pH el cual queremos alcanzar en la ecuación de Henderson
Hasselbach, teniendo en cuenta el volumen al cual se va a llevar la solución y la cantidad de fosfato
necesaria. Volumen final de 10mL. Usando esta ecuación, reemplazando la concentración deseada
se puede construir el buffer de interés, se debe tener en cuenta pKa y la concentración a preparar.
Iguales concentraciones da un log(1)= 0, entonces pKa=pH, que en este caso será de 7,2 se puede
ajustar el pH agregando HCl para medio acido y NaOH para medio básico usando un pHmetro o
ajustarlo según las concentraciones correspondientes de HA o A-.
Método de aditividad
Teniendo en cuenta que en la mezcla se debe cumplir que la absorbancia resultante será una
combinación lineal de ϵ i bi c i tenemos la ecuación de la mezcla.
Ecuación (8) Atotal =( ϵbc )acido 433 nm+ ( ϵbc )básico 616 nm+ ( ϵbc )basico 393 nm
A partir de los modelos lineales y las curvas obtenidas por regresión de mínimos cuadrados se
obtienen los coeficientes de absortividad que son las pendientes de estas rectas, la absortividad
molar (ϵ), calculadas a partir de las pendientes de las diferentes curvas en medio ácido o básico, se
graficaron usando concentración Molar (M) y milimolar (mM) , se obtienen los siguientes resultados
de las pendientes (m).
Tabla 16. Resumen de datos obtención de coeficientes de absortividad en medio ácido y básico
representados en mM.
Coeficiente de absortividad Valor Concentración
ε616 básico 40,0 mM
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ε393 básico 8,6 mM

ε433 ácido 17,3 mM

Curva de absorbancia en funcion de longitud de

0.7
onda λnm
0.6
Absorbancia 0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
-0.1360 410 460 510 560 610 660

Longitud de onda(nm)
6,7 6,9 7,1 7,3 1 13

Figura 9. Gráfica de absorbancia en función de longitud de onda en un rango de 200nm a 800nm a

pH 1 , 13, 6.7, 6.9, 7.1 y 7.3.
Podemos ver en esta gráfica que hay absorbancias mayores a pH básicos asociados a BTB
desprotonados y menor absorbancia a pH ácidos especies protonadas. Podemos ver un punto
donde se cruzan o interceptan todas las curvas denominado punto isosbéstico en este punto hay un
equilibrio donde las especies desprotonadas será igual a las protonadas en ese equilibrio vamos a
observar un color verde de la suma de la coloración amarillo medio ácido y azul medio básico como
resultado hay una mezcla de especies con diferente coloración esto ocasiona que veamos la mezcla
de los dos colores que será verde. El rango de mayor solapamiento que voy a tomar será de 450nm
a 550nm,
Tabla 17. Resumen de datos obtención de absorbancia en medio ácido y básico, en un rango de
valores de 450nm a 550nm, rango de mayor solapamiento en el punto isosbéstico.
pH 6,7 6,9 7,1 7,3 1 13
λnm Am1 Am2 Am3 Am4 Astdx Astdy
550,014 0,056 0,087 0,127 0,165 0,016 0,328
450,941 0,207 0,224 0,174 0,156 0,305 0,036
*x: HA
*y: A-
*Ami Absorbancia de cada una de las mezclas
*Astdx Absorbancia estándar x (acida)
*Astdy Absorbancia estándar y (básica)

Tabla 18. Resumen de datos, gráfica a partir de la tabla anterior en el rango de longitud de onda
desde 550nm hasta 450nm.
pH 6,7 6,9 7,1 7,3
Astdy/Astdx Am1/Astdx Am2/Astdx Am3/Astdx Am4/Astdx
0,145 0,681 0,738 0,576 0,522
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0,118 0,678 0,734 0,568 0,509

*solo se muestra dos puntos, pero el rango va desde 550nm a 450nm abarca muchos números.
En la determinación de pendientes a partir de la siguiente ecuación: y=mx+b donde m es la
pendiente y b el intercepto análogamente se aplica la siguiente ecuación.
[ y]m
∗Astdy
Ecuación (9) Ami [ y ] std [x] m
= +
Astdx Astdx [ x ] std
[ y]m
Ecuación (10) m= pendiente=
[ y ] std
[x] m
Ecuación (11) b=intercepto=
[ x ] std
A partir de los valores de la pendiente y el intercepto se puede despejar los valores de [y]std y [x]std
reemplazando los valores encontrados.
*x: HA
*y: A-
*Ami Absorbancia de cada una de las mezclas
*Astdx Absorbancia estándar x (acida)
*Astdy Absorbancia estándar y (básica)

Tabla 19. Resumen de datos, pendientes e intercepto obtenidos a partir de las regresiones lineales
en el rango de longitud de onda desde 550nm hasta 450nm.
pH 6,7 6,9 7,1 7,3
m 0,139 0,231 0,362 0,481
b 0,661 0,705 0,525 0,453
[y]std 1,92x10-5
[x]std 1,92x10-5
*[y]std concentración de la especie HA (acida)
*[x]std Concentración de la especie A- (básico)

Tabla 20. Resumen de datos, concentración de la especie acida[x] y básica [y], y la concentración
de [H+] en la determinación del pKa para un rango de longitud de onda de 450nm hasta 550nm.
pH 6,7 6,9 7,1 7,3
[y] 2,68X10-6 4,44X10-6 6,95X10-6 9,24X10-6
[x] 1,27X10-5 1,36X10-5 1,01X10-5 8,70X10-6
[H+] 2,00X10-7 1,26X10-7 7,94X10-8 5,01X10-8
-7 -7 -7
Ka 9,47X10 3,84X10 1,15X10 4,72X10-8
pKa 6,02 6,42 6,94 7,33
Error % 15,16 9,64 2,28 3,18

Se determina pKa de 6,94 es el mejor valor y se ajusta con un mínimo error relativo del 2,28%
medición comparada con la reportada en literatura pKa de 7,1 asociada a la solución ajustada a un
pH de 7,1.

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Conclusiones
Se determinó el pKa del indicador comercial azul de bromotimol (BTB) con un valor de 6,94 con un
error relativo según valores reportados en la literatura del 2,28% lo cual es aceptable y cercano al
esperado, teniendo en cuenta que la propagación de error por las diferentes diluciones y medidas se
evidencia que son mínimas. Las concentraciones de las especies de BTB en medio ácido presento
color amarillo debido a su absorción característica a cierta longitud de onda donde predomina BTB
protonada HA y en solución básica presento un color azul debido al equilibrio se desplaza hacia
especies desprotonadas, la configuración electrónica molecular de BTB se ven alteradas y por ende
su forma de absorber energía a la longitud de onda según el medio. En la determinación del pKa se
encontró el punto isosbestico donde las concentraciones de las especies en medio ácido y básico se
igualan a 1,92x10-5 M donde pH = pKa, la concentración de las dos especies en este punto de
equilibrio dan un color verde debido a la combinación por absorción a diferentes longitudes de onda
además el color de emisión es complementario al de absorción eso significa que si vemos el color
amarillo la molécula de BTB en medio ácido absorbe a menores longitudes de onda hacia el azul de
mayor energía caso contrario si vemos el color azul de la molécula BTB en medio básico. “La teoría
campo ligando y orbital molecular explica que según el tipo de ligando que interacciona con las
moléculas y la configuración electrónica en los orbitales moleculares enlazantes y antienlzantes, si
son de naturaleza donor π o aceptor π van a influenciar en el desdoblamiento energético y por ende
su absorción energética” [5].

Referencias
[1] Amador-Hernández, J., Rojas-Hernández, A. Madaí, E., De La Garza-Rodríguez, M., Velázquez-Manzanares, M. and
Medina-Vallejo, L.F. (2014) New Chemometric Strategies in the Spectrophotometric Determination of pKa. European
Journal of Chemistry, 5, 1-5. http://dx.doi.org/10.5155/eurjchem.5.1.1-5.901
[2] Harris, Daniel. 1991. Quantitative ChemicalAnalysis. 5ta Edicion. Freeman. USA. RubinsonK., Rubinson J. 2001.
Análisis Instrumental.Pearson Educación, S.A. Madrid, págs : 434
[3] Skoog y Holler. (2001) Principios de Análisis Instrumental. McGraw-Hill Interamericana de España, S.A.U. Madrid,
España. Capitulo 14. Página 369 – 370.
[4] Alejandro Beaza. (1998). Espectrometría de luz UV/VIS y Equilibrio químico: Punto Isosbestico. Universidad Nacional
de Mexico. Facultad de Química.
[5] Bra. Fanny Sofía Martínez Osorio.Bra. Irania de los Angeles Pérez Espinoza, Calibración de un Espectrofotómetro
UV-Visible y Evaluación de la Incertidumbre”, UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DENICARAGUA (UNAN-LEÓN),
León, Nicaragua, Noviembre 2009.

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