Desenho de Primers

O objetivo deste trabalho é identificar se existe ou não o nosso SNP nas diferentes
amostras então temos de primeiro definir os primers.
Para isso, vamos procurar o gene onde este SNP está presente, ITGB3, e encontrar este
SNP e a sua região flanqueadora.
Assim obtemos a região flaqueadora do SNP
TTTACAGAGGACAGTATTTGTGGGGAGGGATTTGGGGCTCAGAGTGGGGTAGGTTGGGAGAATGTCAG
TATGTGGAAGTGTGGGTCTGTGTGTGTGTATGTGGGGGTCTGTGTGTTTATGTGTGTGTGTTGTGTGTGG
GAGTGTGTAATTTAAAATTGTGATGTGTCCTGATAAGCTGAGCTCCTTAGCCTTTGTCCCAGAATGCCTC
CTGCAGGGATTCTTCCTGCTTAGCTTGAGGGTGACTATGGAGCTGAGCAGGTGTTCTTCATTACCTCAGT
GAGAAGCCAGCTTTCCTCATCAGGCCATTGTCCCTGAAGAGAAGGGCAGGGCTGAGGCCTCTCATTCCA
GAGGAAGGGACACCAAGCCTTGGCTCTACCCTGAGTTCATAAATTTATGGTTCTCAGGCCTGACTCTCA
GCAGCTATGGTAGGAACTGCTGGGCTTGGCAGCCCGGGTCATCTGTACCTCTGCCTCCTTTCCCCTCCCT
CAGGCCGAAGGAGGAGTCAGGGAGAGCTGAACTATTAGAGCTGCCTGTGCCTTTTGCCATCCCCTCAAC
CCAGCTATGGTTCTCTCGCAAGGGAAGTCCTTGCAAGCTAATTCTTTGACCTGTTGGGAGTGAGGATGT
CTGGGCCACTCAGGGGTCATTCATGGCCTGGGGGATGTACCAGCATCTCCCAGTTCATAATCACAACCC
TTCAGATTTGCCTTATTGGCAGCTCTACTCTGGAGGTTTGTTTAGAAGAAGTGTGTCACCCTTAGGCCAG
CACCATCTCTTTACCTCCTAATTCCACACCCTCACTGCTGTAGACATTTGCTATGAGCTGGGGATGTCTC
TCATGACCAAATGCTTTTCCTCAAAGGGAGAGAGTGCTATTGTAGAGCCAGAGGTCTGGCCCTATGCTT
CCGGCCTCCTGTCCCTCATCCATAGCACCTCCACATACCTGGCCCTGTGCCTTGGTGTGCTGTATCCATC
CATGGGGCTGATTGTATTTACCTTCTACCTCTTGGCTGCCTGTGAAGGAATTATTCCCATGAGTTGGCTG
GGAATAAGTGCCAGGATGGAATGATGGGTCAGTTGTATCAGCACGTGTGGCCTGTTCTTCTATGGGTTG
GACAACCTCATTTTAACTCAGTCTTTAATCTGAGAGGCCACAGTGCAATTTTATTTTATTTTTCTCATGA
TGAGGTTTTCTTAACTTAAAAGAACATGTATATAAACATGCTTGCATTATATTTGTAAATTTATGTGATG
GCAAAGAAGGAGAGCATAGGAAACCACACAGACTTGGGCAGGGTACAGACACTCCCACTTGGCATCAT
TCACAGCAAGTCACTGGCCAGTGGCTGGATCTGTGAGGGGCTCTCTCATGATAGAAGGCTATGGGGAT
AGATGTGTGGACACATTGGACCTTTCCTGAGGAAGAGGGACTGTTCTTTTGTCCCAGAAAAGCAGTGGC
TCCATTGGTGTTGACATACATCCAACATTAAAAGCCACCCCCAAATGCCCAAGAAAAAAAGAAAGACT
TATCAACATTTGTTCCATGAGCAGAAAACTGGAGCTCTGGCCTCAGTGTTACAGCTAAATAATCTTTAA
TTAAGGCAAGTCACTTTCTTCTTCTTAAAGCTGTTTTCTAGTTTGAGAAATGATGGGATTTTAGCAGCCA
GTCTTGAAGGTCTCTTTCAGTATCAACATTCTAAGATGCTGGGACTTACTGTGTCATCAAATGTGCGGTT
AAGATTCTCTGGGATATTGATACTGTTTGTGTTTTTAGTTGGGAGATCTGAGAGACCTGGCTTTGGCAAG
AGCAGATGTCATTCCATATCACCTTTCTCAATGAAAGTCTCATTCTATCCTCTCTCCAAACCCGTTTTCC
AACATTTGTTAATAGTTACGTCTCTCCTGATGTAGCACTTAAGCTTCATTTAGTTATTATTTCTTTCTTCA
CTTTGCACACATTTGCATCCACATATTAGGGAAGAGGAATCCATAAGTAGCTGAAATATCTATTCTGTA
TTATTGTGTTAACATTGAGAATAAGCCTTGGAATTAGATATGGGGCAATGACTGAGCCCTGTCTCACCC
ATGGATTACTCCTTACTGTAGGGAATGGCAGTATGGTAGAGGGATAAATAGGGGGCGGGGAGGGATAG
TCATGGATCCAAGAAGTCCTTAGAAATAGTGGCAGGGAACAGGTGTGGAAGCTCATGCCTGTAATTAT
AACCTTCAGCTACTAAGACAGGTGTGGTGGCTCACGCCTGTGATTATAATCTTCAGTTACTAAGACAGA
GTCCATGAGAGTGTTAATGGGACATTTTCTTTAGATAAGATGTTTTATATGAAGAAACTGTATCAAAGG
GGGAAGAAAATGTATTTAACAGGTGAATCAAATCAGGAATCTTGTCTGAGCTACTGGAATGAAGTTCA
CAGGTCTTGAAGACCAATATTATTTGTCAATATGTGGGGATAACCTGTAGCTGCATTCATGAGGTAGCA
AATAGCAGTTTTGGCCTGTGGGGTGAACAGCTAAACAGTGTTCTGGCATCAGATAACACGGCACAAAG
GGATTGTGTCTAGCTCTTTTGGAGAAAATTTATGTCCAGTCTCAGGATCTGTGGACAATAACGGAAAAC
TTTGAATATTCCTGACAAGTTGCCATATTAGGAGTCAGTTCTTTACTTCTCTGAGATTCCCAGGTCATCC
ATGATTTTTTTTTTAATTTGAGACAAAGCCTCACTCTTGTTGCCCAAGCTGGAATGCAATGGCAAGATCT
CAGTTCACTGCAATCTCTGCCTCTCAGGTTCAAGCCATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCCAGTAGCCGGGAT
TACAGGCACCCGCCACCACACCCGGCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGACGGGGTTTCACCATGTTGG
CCAGGCTGGTCTCGAACTCCTGACCTTAGGCGATCCACCTTCCTCGGCCTCCCACAGTGCTGGGATTAC
AAGTGTGAAGCACTGTGCCCGGCCAGTCATCCATGATTTTAATGGGGTCCAAAGGCCTCTTTTTCTTTGT
TAAGTATTCCTGGTTGAAATTTCTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGACAGAGTCTTGCTCTATCACCCAG
GCTGGAGTGCAGTGGCACGATCTCTGCTCACTGCAAGCTTCGCCTCCCGGGTTCACGCCATTCTCCTGCC
TCAGCCTCCCGAGTAGCTGGGATTACAGGCACCTGCCACCACGCCCGGCTAATTTCTTTTTGTATTTTTA
GTAGAGACGGGGTTTCACGGTGTTAGCCAGGAAGGTCTCGATCTCCTGACCTCGTGATCCTCCCGCCTC
GGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGAGCCACTGCCCCCGGCTGTGGTTGAAATTTCTTAAGTG
CCTTCCTCACTTCCTAACCACCTTCTCTGTTTGGGTTTGTGCAACAGTAAATTAAATGTACTTTCCAAAA
AGAA

Agora que temos a região flaqueadora que é a região onde vamos desenhar os primers,
vamos ao Primer Blast para então desenhá-los.
Resultados:
Nota: parâmetros a ter, para HRM, o tamanho do amplicão tem de estar entre 80-200 e a
região amplificada tem de ter o SNP
1) Este primer tem o tamanho do amplicao entre 80-200 mas não pode ser o
escolhido porque o SNP não está na região amplificada. Como sei isto? O nosso
SNP está na posição 950, o start e stop do primer forward e reverse não
abrangem esta posição.
2) Este primer não pode ser pq o amplicão não tem o tamanho certo e o SNP não
está na região amplificada

3) Este primer não pode ser pelas mesmas razões do 2)

4) Este primer não pode ser porque o amplicão é muito grande.

5) Este primer não pode ser pelos mesmos motivos de 2)

6) Este primer não pode ser pelos mesmos motivos de 2)

7) Este primer não pode ser pelos mesmo motivos de 2)

8) Este primer não pode ser pelos mesmo motivos de 2)

9) Este primer pode ser porque o amplicão está entre 80-200, é de 129. Para além
disso o SNP que está na posição 950 está inserido na região amplificada.
 10) Este primer não pode ser porque o SNP não está na região amplificada.

Então o primer escolhido será o primer 9, ponho-lo no Multiple Primer Analyzer para
avaliar a formação de estruturas secundárias e de dímeros.
Copiar para a aplicação os primers selecionados.
Este foi o resultado que se pretendia significa não se obtem dímeros nem estruturas
secundárias.
Agora resta ir ao Blastn.
Copio para la um dos primers e seleciono o organismo
O resultado que pretendemos é este pois obtemos como resultado clones do
cromossoma 17 e o nosso gene de interesse, ITGB3.
NOTA:
Mas ao descer na tabela também temos outros resultados como clones do cromossoma
18 e assim, e isso já não são bons resultados para os meus primers por isso porque é que
mesmo assim eu digo que estes são bons primers? Porque esse resultados que não são
tao validos apesar de terem alta identidade e assim, o e-value é muito alto para estes
resultados (e o e-value deve ser o mais próximo de 0 possivel), e por isso podemos
descartá-los.