1

Trình bày được

• Định nghĩa & Phân loại tannin

• Cấu trúc của 2 loại tannin chính

• Các tính chất lý hóa chính của tannin

• Các phương pháp chiết xuất tannin
• Các phương pháp định tính, định lượng tannin
• Tác dụng và Công dụng của tannin

• Ba* dược liệu tiêu biểu có tannin

(Ngũ bội tử, Măng cụt, Ổi)

2
1. Khái niệm & Định nghĩa về tannin
2. Phân loại các tannin
2.1. Theo tính thuộc da (tannin thực & pseudo)
2.2. Theo cấu trúc hóa học
2.3. Theo khả năng thủy phân*
3. Cấu trúc hóa học
3.1. Tannin pyrogallic (TG)
3.2. Tannin pyrocatechic (TC)
3.3. Tannin phức hợp
4. Tính chất của Tannin
4.1. Lý tính
4.2. Hóa tính
5. Chiết xuất Tannin
3
6. Định tính Tannin
6.1. Định tính vật lý
6.2. Định tính hóa học
6.3. Định tính sắc ký
7. Định lượng Tannin
7.1. Phương pháp dùng bột da
7.2. Phương pháp oxy-hóa (Lowenthal)
7.3. Phương pháp dùng Đồng acetat
7.4. Phương pháp đo màu với thuốc thử Folin
7.5. Phương pháp đo màu với thuốc thử Folin-Ciocalteu
7.6. Phương pháp dùng HPLC
8. Tác dụng & Công dụng của Tannin

4
5
 Đến 12/2014:
160 K hợp chất tự nhiên Phenol đơn giản
Phenylpropanoid
30 K Flavonoid
Lignanoid
Tanninoid ★
42 K
72 K
Stilbenoid
Xanthonoid
Quinonoid
... ... ... ...
16 K

6
• Về nguồn gốc, tannin là những hợp chất biến dưỡng thứ cấp

của các thực vật bậc cao, có bản chất polyphenol.

• Về cấu tạo, tannin có thể là

- các ester của galloyl (và dẫn chất) với nhiều loại polyol khác

nhau (glucose, acid quinic, catechin,...).

- các oligomer hoặc polymer của PAC* (và dẫn chất từ PAC),

với các liên kết flavanyl (C − C)

• Về từ nguyên, tanna = gỗ Sồi (Oak, Fir) trong tiếng Đức cổ.

Tiếng Anh: to tan, tanning (Pháp: tanner) = (sự) thuộc da...

7
A. Theo E.C. Bate-Smith (1962): Tannin là
- các hợp chất phenol, MW # 500 − 3.000 đvC
- cho các phản ứng thông thường của phenolic.
- tạo tủa với alkaloid, gelatin và các protein khác.

B. Theo Edwin Haslam (1989): Tannin là

- các hợp chất polyphenol, MW # 500 – 20.000 đvC
- cho các phản ứng thông thường của phenolic.
- tạo tủa với alk., gelatin, protein khác và 1 số polysaccharid.

C. Theo Peter Horvath (1981): Tannin là

- các hợp chất polyphenol, MW lớn.
- chứa n × φOH & các nhóm thích hợp khác (carboxyl)
- tạo phức với protein & nhiều đại phân tử khác trong đk. đặc biệt.
8
Có nhiều cách phân loại tannin:

2.1. Theo khả năng kết hợp với protein (≈ tính thuộc da)
→ Tannin thực (true) và tannin giả (pseudo-tannin; ψT)

2.2. Theo cấu trúc hóa học (≈ cách tổ hợp phân tử)
→ Tannin pyrogallic (TG) và tannin pyrocatechic (TC)

2.3. Theo tính thủy phân (trong tannase hoặc acid loãng)
→ Tannin thủy phân được và tannin ko thủy phân được
= Tannin ngưng tụ = condensed tannin
9
(Goldbeater's skin test)

10
Có thể chia các “tannin thực” thành 4 nhóm chính
A1. Tannin gallic (= gallo-tannin)*
Thường là polyester của vài mono-, di-, tri-galloyl (hay Δ’ của
chúng) với 01 phân tử polyol (glucose*, acid quinic...)
A2. Tannin ellagic (= ellagi-tannin)*
Thường là polyester của acid ellagic, luteolic, HHDP (hay Δ’ của
chúng) với 01 phân tử polyol (glucose*, acid quinic...)

B. Tannin [pyro]catechic (= tannin ngưng tụ, condensed tannin)

= PAC, là các oligomer, polymer của Flavan-3-ol (nối C → C)
thường gặp kiểu liên kết (C4 → C8) hay (C4 → C6). . .

C. Tannin phức hợp (complex tannin)

Là các glycosid phức hợp từ 3 nhóm trên.
11
T T
G C

12
 Dựa vào tính thủy phân, tannin có 2 loại chính:
• Tannin thủy phân được (gồm gallo-tannin & ellagi-tannin).
• Tannin ko thủy phân được (= tannin ng. tụ, pyrocatechic).

thủy phân được gallo-tannin ( acid gallic)n

(tanin pyrogallic) ellagi-tannin ellagic, luteolic

ko thủy phân được

(tanin pyrocatechic) n x catechin (flavan 3-ol; 3,4-diol)n

Điều kiện thủy phân: enzym tannase hay acid loãng

13
3.1. Cấu tạo các pseudo-tannin: thuộc da (−)

3.2. Cấ́u tạo các tannin thực: thuộc da (+)

3.2.1. Tannin pyrogallic (TG) = Tannin thủy phân được.
a. Gallo-tannin (polyol + Δ’ acid n-gallic)
b. Ellagi-tannin (polyol + Δ’ acid ellagic)
c. hỗn hợp (polyol + acid n-gallic + acid ellagic)
3.2.2. Tannin pyrocatechic (TC): Không thủy phân được.
3.2.3. Tannin phức hợp: (catechin − polyol − gallic/ellagic)

14
Tiếng Hy lạp: phloios (φλoιὀς) = vỏ cây (bark)
baphe (βαφή) = chất nhuộm màu (dye)
Hai định nghĩa thông dụng về phlobaphen:

• Trong hóa thực vật học:

Phlobaphen là các hợp chất phenol có màu đỏ chiết từ thực vật.
Các hợp chất này tan trong cồn nhưng không tan được / nước.

• Trong công nghệ thuộc da:

Phlobaphen là những sản phẩm có màu đỏ (= đỏ tannin) được
tạo thành khi xử lý các dịch chiết có tannin với các acid vô cơ.
Các hợp chất này không tan được trong nước.

15
acid gallic galloyl acid m-digallic digalloyl

depsid + OH/glc
G G
1 2 ★

+ OH/glc

depsid
G
3 ★
★
depsid + OH/glc

acid m-trigallic trigalloyl

16
 Là các polyphenol đơn giản, phân tử (và MW) nhỏ. Tính chất:
• cho các ph.ứng chung của polyphenol (ph.ứng của vòng thơm,
diazo-hóa, phản ứng của -OH như tạo phức với Pb2+, Fe3+...)
• không cho phản ứng thuộc da; Chỉ khi ở nồng độ cao, đôi khi
chúng mới có thể tạo tủa với dung dịch protein (khác tannin).
• khả năng tạo phức với các đại phân tử thì rất kém (khác tannin)

• Về cấu trúc hóa học, thường gặp chúng ở dạng:

- các dẫn chất acid phenol đơn giản.
- các tổ hợp (n-caffeoyl−acid quinic); các flavo-lignan...
- mono và dimer, trimer của acid gallic.
- mono và dimer của catechin và Δ’-catechin.
(≥ trimer được xếp vào nhóm PAC/ tannin ngưng tụ)
17
 1

pyrocatechin phloroglucinol pyrogallol

acid pyrocatechic acid m-digallic acid gallic

acid cinnamic acid hydroxycinnamic acid caffeic 18

 2

acid chlorogenic acid quinic cynarin

(3-caffeoyl quinic) (1,3-dicaffeoyl quinic)

acid iso-chlorogenic = (5-caffeoyl quinic)

19
 3

Δ’ flavan-3-ol flavo-lignan (silybin)

dimer-(epi)catechin epi-gallocatechin-3-O-gallat 20
a. Các gallo-tannin
Vị trí trung tâm là 1 glycon (★) có cấu trúc polyol.
Polyol - thường gặp nhất là βD-glucopyranose (βD-Glc)
- ít khi là Δ’ acid quinic, acid caffeic, shikimic...
- rất ít khi là Δ’ glucitol, hamamelose...
Mỗi -OH/polyol này có thể nối ester với 1 nhóm -COOH
của phần acid n-gallic (thường thì n = 1 → 3).

Điển hình là các polygalloyl glucose và acid tannic có

trong Ngũ bội tử (Galla chinensis), Sồi (Quercus spp.)...

21
 penta-galloyl glucose (PGG*) penta-digalloyl glucose (PDGG*)
M = 180 + 5(152) = 940 M = 180 + 10(152) = 1700

aceri-tannin hamameli-tannin
(2,6-digalloyl-1,5-anhydro-D-glucitol) (Δ’-hamamelose)
22
 βD-glc
(G = galloyl)

acid meta-trigallic

Nhóm -COOH / acid meta n-gallic nối ester với 1 nhóm -OH / glc.
Các đơn vị acid gallic nối meta với nhau bằng đường nối depsid.

23
b. Các ellagi-tannin

Là các tannin pyrogallic có phần aglycon là acid ellagic

hay acid luteolic, hexahydroxy diphenic acid (HHDP).
Vị trí trung tâm thường là βD-Glc (4C1 & 1C4)

4 1
C1 C4

Khi aglycon là HHDP, nó sẽ ưu tiên nối với glucose ở dạng 1C4

Các ellagi tannin thường có M = 2000 → 5000.
Ellagitannin có trong quả Chiêu liêu (Terminalia chebula),
vỏ quả Lựu, vỏ Sồi (Quercus spp.), lá Trà...
24
• Khi không mở vòng: nhóm -OH (♥) của acid ellagic có thể
nối với -OH của polyol (như glucose…) và tạo 1 O-glycosid.

↑ ↑ ↑
( (
♥ ♥
) )
(★ (★ (★
) ) )
acid ellagic acid luteolic HHDP

• Khi mở 1 vòng (→ acid luteolic): tạo 1 nhóm COOH mới (★)

• Khi mở cả 2 vòng lacton (→ HHDP): tạo 2 nhóm COOH mới (★)

Các nhóm -COOH (★) này sẽ nối ester với các nhóm -OH của
polyol (như glucose…), tạo pseudo-glycosid (# ellagi-tannin).
25
 ★
★

★
★
(G = galloyl)

• Trong phân tử acid ellagic : nối ester kiểu depsid (kém bền nhất)
• Giữa acid ellagic và glucose : nối acetal (tạo O-glycosid; kém bền)
• Giữa acid monogallic và glc : nối ester (tạo ψ-glycosid; kém bền)
• Giữa 2 vòng thơm : nối C − C (★, rất bền!)

26
 (Tham khảo)
Mỗi ph. tử HHDP có 2 nhóm -COOH. Chúng có khuynh hướng tạo
một diester với 2 nhóm -OH/glc gần nhau trong không gian, ví dụ:
- dạng 4C1-glc → diester ở (2 + 3), ở (4 + 6), hay ở (3 + 4)...
- dạng 1C4-glc → diester ở (6 + 1), ở (6 + 3), hay ở (2 + 4)...

(kém bền)

4 1
C1 C4

hai dạng ghế của D-glucopyranose

Enzym tannase (ví dụ từ môi trường nuối cấy Aspergillus niger)

thì không cắt (thủy phân) được nối ester giữa HHDP & glucose.
27
 (Tham khảo)

Khi thủy phân các ellagi-tannin (nước nóng, acid yếu...) thì:

• Các liên kết ester giữa HHDP với glucose (kém bền) dễ bị cắt đứt.

• Liên kết C − C (★) giữa 2 vòng thơm (rất bền) không bị cắt.
Sản phẩm thủy phân ngừng ở acid ellagic (ko tới được acid gallic!)

• Phần HHDP sau thủy phân sẽ nhanh chóng sắp xếp lại cấu trúc
(xoay và đóng vòng) để tạo acid ellagic (ko tới được acid gallic!)
28
Phần aglycon vừa có acid gallic, vừa có acid ellagic / luteolic / HHDP

HHDP

glucose
HHDP

HHDP acid gallic

• Gallic có thể là mono, di, hoặc tri-galloyl

• Ellagic có thể là ellagyl, luteolyl, HHDP-yl...
• Có thể có liên kết giữa các đơn vị gallic & ellagic gần nhau
29
 Còn gọi là tannin catechic (TC), tannin ngưng tụ (condensed tannin),
hay proanthocyanidin (PAC), phlobatanin (ít dùng).
Là tổ hợp nhiều đơn vị [flavan-3(4)-ol] nhờ liên kết (C−C) rất bền (★).
PAC có thể thẳng (★ nối 4/8) hoặc tạo nhánh (★ nối 4/6)...

extension

★
n
terminal
★

30
n

31
Lưu ý: Tuy chỉ là monomer, nhưng cả epigallocatechin-gallat (EGCG),
epicatechin-gallat (ECG) vẫn được gọi là “tannin catechic” / Trà xanh.
Do mật độ [-OH] cao, chúng có khả năng tạo tủa với protein và các
hợp chất đại phân tử khác (polysaccharid...)

gallocatechin

catechin

epi epi

gallat gallat

(EGCG) (ECG)

Với d.dịch FeCl3 loãng, E(G)CG cũng → xanh đen (# tannin gallic!)
32
Tham khảo

Acid tannic là một hỗn hợp chủ yếu gồm các ester của βD-glucose*
với acid n-gallic (n = 1, 2, 3). Acid di- hay trigallic tạo bởi nối depsid.
βD-glucose đóng vai trò trung tâm, xung quanh là các acid n-gallic.

Acid tannic = poly-galloyl-βD-glucose = C6H12O6 . (C7H4O4)5→10

MW = 180 + (760→1520) = (940→1700)

Do được khai thác từ các nguồn khác nhau, công thức của acid tannic
cũng có nhiều công bố khác biệt (về giá trị n của phần acid n-gallic).
Cũng có tài liệu nói đến sự có mặt của acid quinic (thay cho một số
vị trí của glucose).
33
Tham khảo

Tannic acid is a tannin derived from plants and in general prepared from Chinese
gall or nut gall. Although tannic acid has long been used, its structure has not yet
been well-defined and hence it varies depending on articles.

Shoji Tomoda (1982), Plant Pharm. Chem., p. 93, discloses that the structural
formula of the principal component of tannic acid is as follows:

Σ.G = 7 → 9 units galloyl

2
MW = (1244 → 1548) Da
Mm = *1396* Da

Tannic acid (theo S. Tomoda, 1982)

34
 Tác giả mô tả Gn (nối với các OH glucosyl) Σ galloyl MW

rất nhiều (2010s) 5 × digalloyl = (PDGG) = 10 1700

S. Tomoda (1982) 7 → 9 galloyl =8±1 *1396*

Brewster (1948) 5 × digalloyl = (PDGG) = 10 1700

Britton (1966) 4 × galloyl + trigalloyl / G2 =7 1244
E. Fisher (1912) 5 × galloyl = (PGG) =5 940

Hagerman (2002) = (22/3) *1294*

Dung dịch acid tannic 10% / nước có pH = (2,3 ± 0,1) 35

 Tham khảo

Acid tannic có trong các tổ chức sùi ra (galls) ở lá & cành non của
- một số loài Sồi, Sến (Quercus infectoria, Q. lusitanica...)
- một số loài Muối tạo Ngũ bội tử (Rhus chinensis = R. semialata...)
Sản phẩm này có thành phần chủ yếu là digalloyl và βD-glucose.

Acid tannic còn có trong hạt cây Caesalpinia spinosa Fabaceae.

Sản phẩm này có thành phần chủ yếu là digalloyl và acid quinic.

βD-glucose acid quinic acid quinic

36
Cấu trúc rất phức tạp. Có thể có hoặc không có polyol (glucose...).
Phần aglycon đa dạng (các Δ’ catechin, các Δ’ acid gallic, ellagic...).
Vd: Các guavin / lá Ổi, camellia-tannin / lá Trà, stenophyllanin A / Sồi...

catechin Δ’ acid caffeic

galloyl

HHDP

Stenophyllanin A Cinchonain
(trong Quercus stenophylla) (trong Cinchona spp.)

37
4.1. Lý tính
4.1.1. Chung của TG và TC
4.1.2. Riêng của TG
4.1.3. Riêng của TC

4.2. Hóa tính

4.2.1. Chung của TG và TC
4.2.2. Riêng của TG
4.2.3. Riêng của TC

38
4.1.1. Lý tính chung của 2 loại tannin TG & TC

- thường là bột vô định hình, màu vàng ngà đến nâu sáng.
- không mùi hoặc mùi rất nhẹ; có vị chát.
- gây săn se niêm mạc, kích ứng niêm mạc dạ dày.
- MW # 500 → 5.000+ (TG); 900 → 20.000+ (TC).
- tính chất thay đổi tùy xuất xứ, tùy cách chiết.
- dễ tan / kiềm loãng, cồn-nước, aceton-nước.
- tan được* / EtOAc, glycerin, propylen glycon.
- không tan / d.môi kém ph.cực (hexan, EP, Bz, Cf, Et2O)

39
• Độ tan của các tannin
- (epi)-catechin monomer và dimer: dễ tan / EtOAc.
- các PAC oligomer: kém tan / EtOAc.
- các PAC polymer có MW quá lớn: rất khó tan / EtOAc.

• Với các dung dịch nước của protein (albumin, gelatin...):

- tạo phức tủa bền → có tính thuộc da
làm da bền, ít thấm nước, không bị thối rữa
(khả năng tạo tủa sẽ tối ưu tại pHi của protein)

Khi thử nghiệm tính tạo tủa của tannin với protein:
cần điều chỉnh pH của môi trường!
40
 4.1.1. Lý tính chung của 2 loại tannin TG & TC (cont.)
Nói chung, tannin là những hợp chất rất phân cực, phân tử lớn.

• Sắc ký hấp phụ (ví dụ với Si-gel NP): Tannin thường bị hấp phụ chặt
vào pha tĩnh và rất khó giải hấp (≠ cơ chế phân bố trên Si-gel RP).

→ SKC si-gel NP: tannin di chuyển rất chậm; SKLM: Rf thấp + kéo vệt.

• Sắc ký rây phân tử: ví dụ với Sephadex (Pharmacia*)

- với Sephadex LH-20: Rửa giải tannin với (aceton + nước).
EtOH không rửa giải các tannin được (nên dùng để loại tạp!)
- với Sephadex G-25: Rửa giải bằng nước hoặc cồn + nước. 41
 4.1.2. Lý tính của Tannin thủy phân được (TG)

- dễ tan trong nước *, cồn-nước, aceton-nước.

- MW trung bình: có thể kết tinh được.
- MW càng lớn thì càng kém tan trong nước.
- MW thường 900 – 5000, hàm lượng / cây: thường lớn.
- chưng cất khô ở # 200 oC → các pyrogallol* (tri-OH).
- khả năng tạo tủa với protein: rõ rệt với ≥ triester của
[≥ 3 nhóm OH / glc] & [≥ 5 đơn vị galloyl] (MW ≥ 940)

(n) x galloyl (2) = 304 (3) = 456 (5) = 760 (8) = 1216 (10) = 1520

+ 180 = MW 484 636 940 1396 1700

(glucose = 180; acid gallic = 170; galloyl = 152 Da)

42
 4.1.3. Lý tính của các tannin ngưng tụ (TC)

- tan trong cồn, trong aceton (giống TG).

- khó tan / nước, khó kết tinh (khác TG).
- các TC có MW thấp: tan được / EtOAc.
- MW = 500 − 20.000 (lớn hơn tannin gallic).
- Cất khô → phloroglucinol (A), pyrocatechin (B)
Lưu ý: TC không → glucose (khác TG)
- các trimer trở lên (n ≥ 3) mới có tính thuộc da
(mới được coi là Tannin Catechic chính thức)

- Tính thuộc da của các TC >> TG.

- TC chiếm # 90% tổng sản lượng tannin toàn cầu.
- TC có trong lá Trà, vỏ Canhkina, hạt Nho, vỏ Thông, Quebracho,
cây Dẻ, Keo Acacia & nhiều cây gỗ vùng nhiệt đới.

43
 4.1.4. Phổ UV & Phổ IR của tannin

• Phổ UV (và phổ IR) của tannin thực tế ít được khai thác.
Nếu có, chỉ là 1 trong các tiêu chuẩn kiểm nghiệm tannin.

• Với các tannin catechic, nếu vòng B có nhóm -OH ở

- 3’,4’ sẽ có λmax ~ vùng 280 nm, ví dụ (epi)catechin.
- 3’,4’,5’ sẽ có λmax ~ vùng 270 nm, ví dụ (epi)gallocatechin.

• Phổ UV của các phức màu [tannin + thuốc thử] thường

được khai thác hơn để định lượng tannin, polyphenol
(PP so màu th. thử vanillin-HCl, DMACA, Folin-Ciocalteu...)

44
 MeOH/HCl
Catechin Cyanidin
PAC Δ +
(ko màu) (màu đỏ)

45
Phổ UV của phức màu [Polyphenol + Folin-Ciocalteu Reagent]

46
47
48
A. Chung của 2 loại tannin TG và TC
4.2.1. Ph.ứng tạo tủa với protein
4.2.2. Ph.ứng kiềm phân
4.2.3. Ph.ứng thủy phân
4.2.4. Ph.ứng Oxy hóa
4.2.5. Ph.ứng với muối kim loại

B. Riêng của tannin catechic (TC)

C. Riêng của tannin gallic (TG)

49
B. Riêng của tannin catechic (TC)
4.2.6. Ph.ứng với ROH / H+
4.2.7. Ph.ứng với aldehyd / H+
4.2.8. Ph.ứng với aldehyd / OH−
4.2.9. Ph.ứng với dung dịch Brom.
4.2.0. Ph.ứng với

C. Riêng của tannin gallic (TG)

4.2.a. Ph.ứng v
4.2.b. Ph.ứng v
4.2.c. Ph.ứng v
4.2.d. Ph.ứng v
50
4.2.1. Phản ứng của polyphenol/tannin với protein

protein tannin

protein
polyphenol

protein

51
52
• Phức tủa [protein − tannin] sẽ dễ hình thành khi môi trường
có pH # pHi (đẳng điện) của protein tương ứng.

• Trong m. trường kiềm, các -OH → (O−); protein cũng ở dạng

anion: tủa phức [protein − tannin] không được tạo thành.

• Để tạo tủa với protein, k’ thước (và MW) của các tannin phải:
- đủ bé để xâm nhập được vào khe của các sợi protein.
- đủ lớn để liên kết với chuỗi peptid ở nhiều vị trí.

53
4.2.2. Phản ứng kiềm phân
Với kiềm đặc và nóng, tannin → các mảnh đơn giản.
(dùng để nghiên cứu cấu trúc tannin)

acid n-gallic, ellagic, luteolic, HHDP (gallo)catechin

pyrogallol pyrocatechol
acid gallic phloroglucinol
54
 4.2.3. Phản ứng thủy phân (bởi acid loãng, tannase)
- PG bị thủy phân → acid phenol + (glucose, acid quinic...)
- PC bị trùng hiệp → các phlobaphen màu đỏ

Lưu ý:
Tuy thuộc nhóm tannin ko thủy phân được, nhưng các PAC có nhóm
ester ở C-3 (như EGCG, ECG...) vẫn có thể bị cắt tại vị trí ester này;
nhưng tannase, acid/kiềm loãng ko cắt được nối C − C (C4 → C6/8).
55
 ♥

♥ ♦
ester depsid (kém bền) nối ester (khá bền) nối ester (khá bền)

nối glycosid (khá bền) nối (C − C) flavanyl (♠, rất bền)

56
thủy phân ko hoàn toàn

MeOH/đệm acetat

pentagalloyl glucose 4 x methyl gallat

MeOH H2SO4

MeOH/H2SO4

thủy phân hoàn toàn

glucose 9 x methyl gallat

57
• Nếu dùng MeOH: acid gallic thành methyl gallat
• Nếu dùng EtOH: acid gallic thành ethyl gallat

58
 HHDP acid ellagic
X acid gallic

★ ★
acid / base

βD-glucose

Trong m.trường acid hay base, ellagi-tannin sẽ bị cắt liên kết ester → HHDP.
HHDP nhanh chóng được sắp xếp lại, đóng vòng và chuyển thành acid ellagic.
Acid ellagic này sẽ tan / môi trường (nước) và không tiếp tục cho ra acid gallic.

59
4.2.4. Phản ứng Oxy hóa
- oxy hóa yếu (không khí, dung dịch Fehling…),
luôn kèm theo sự trùng hiệp, tạo các sản phẩm
có phân tử lớn không tan / nước.
- oxy hóa mạnh (K2Cr2O7, KMnO4)
kèm phá vỡ cấu trúc → mảnh phân tử nhỏ hơn

60
4.2.5. Phản ứng tạo phức với muối kim loại (của 2 loại tannin)

Tannin tạo phức tủa màu với các muối Pb2+, Cu2+, Fe3+, Al3+...
Màu phức sẽ thay đổi tùy theo
* loại muối: muối sắt → xanh rêu đến xanh đen.
muối chì → trắng ngà đến vàng.
* số lượng nhóm OH phản ứng (ortho-di-OH, gallo-tri-OH)
• Ứng dụng
- loại bỏ tannin (+ tạp polyphenol) khỏi dịch chiết.
- sơ bộ nhận định số lượng nhóm –OH.
• Chú ý
- các phức [polyphenol - kim loại] có thể tan lại / cồn cao độ.
Do đó muốn loại tạp polyphenol bằng dung dịch chì acetat
(tr. tính hoặc kiềm) thì dịch cần loại tạp phải có độ cồn < 25%.
- phản ứng này không đặc hiệu cho tannin.
61
 3+

−
F F
3 − e
e

Càng nhiều nhóm -OH lân cận, màu phức sẽ càng xanh đen. Ví dụ:
• Các gallo-tannin (nhóm tannin thủy phân được)
• Các gallo-catechin (nhóm tannin ngưng tụ, 3 nhóm OH / vòng B)
hay ester 3-galloyl

62
 3+

Fe3+

Fe3+

( ) ( )

63
4.2.6. Phản ứng với ROH / H+ (quan trọng / TC)

4.2.7. Phản ứng với th’ thử Stiasny (Formol + HCl đđ; 2 : 1)

- catechin & TC → sản phẩm trùng hợp không tan / nước

- TG → không tạo tủa (ph. biệt với tannin TC).

4.2.8. Phản ứng thế trên nhân thơm (của TC)

- TC + halogen (nước brom …) → sản phẩm thế khó tan

4.2.9. Phản ứng với formaldehyd/kiềm (của TC)

- TC + HCHO/OH− → phức keo (làm keo dán gỗ!)

64
4.2.6. Phản ứng với ROH / H+ (quan trọng / TC)
Với MeOH, EtOH, n-BuOH trong môi trường acid (HCl...)
a. ở nhiệt độ phòng là đủ
Catechin (flavan 3-ol và Δ’) → AC (màu đỏ/H+)
b. ở nhiệt độ nóng (phải đun vài giờ)
Tannin catechic (PAC) → → AC (màu đỏ/H+).

Đây còn được gọi là phản ứng alcol-phân (≠ thủy phân),

là một phản ứng oxy-hóa cắt mạch (oxidative cleavage).
* MeOH + acid yếu (hay dd. đệm): chỉ cắt được nối depsid
(ko cắt được nối ester bình thường) trong tannin gallic.
* MeOH + acid vô cơ mạnh: cắt được cả nối depsid & ester.
65
 ⊕

Trong môi trường (MeOH + HCl) hay (BuOH + HCl) nóng,

các PAC (ko màu) sẽ bị cắt đứt nối C − C (★) để cho ra:
1. các AC⊕ có màu đỏ (từ phần “ngọn” = extension) và
2. Δ’ catechin không màu (từ phần “gốc” = terminal)

1
cyanidin
ROH/H+ Δ
(ngọn) (280; 535 nm)

★ 2
2
(gốc)
ROH/H+ Δ

procyanidin (λmax 280 nm) catechin (277 nm)

66
 4.2.7. Phản ứng với thuốc thử Stiasny* 1905, (HCHO + HCl)

[Dịch TC loãng] + [th’.thử Stiasny] → tủa vón nặng, màu đỏ gạch.

- Các catechin monomer, dimer... cũng cho tủa (rất lưu ý!).
- Các tannin pyrogallic (TG) thì không cho tủa vón nặng.
- Đây là 1 phản ứng đơn giản để phân biệt TG và TC.

TC (+) là do vòng thơm A còn có H tự do (H-6 và/hay H-8):

(a). các vị trí H-6 / H-8 này sẽ cộng hợp với phân tử H-CHO,
(b). sau đó ngưng tụ lại theo nhiều cách khác nhau
(c). để cho nhiều tổ hợp phức polymer có màu nâu đỏ gạch.

Thuốc thử Stiasny (Formaldehyd 37% + HCl đđ.)

được mô tả với 2 tỉ lệ (2 : 1) hay (1 : 1) tùy tài liệu. 67
 ★ ★

★
★
+
+ HCHO / H
catechin 8-methylol + 6-methylol
methylolation

condensation

8/8-dimer 8/6-dimer 6/6-dimer

polymerization

↓ tổ hợp sản phẩm ↓

ví dụ: 8/8-dimer
68
Theo T. Takano et als (2008), J. Wood Sci., 54, 329-331
Tham khảo: Phổ 1H-NMR (MeOD, 300 MHz)
của [catechin − HCHO] và [catechin].

catechin

HCHO

A
catechin-HCHO

69
Các aldehyd thơm thường dùng: dimethyl-amino-cinnamaldehyd
(DMACA) hay vanillin. Phản ứng xảy ra trong môi trường acid.
Các catechin (và PAC, TC) có H tự do ở 6/8 sẽ tạo phức với
adehyd thơm này.

DMACA: : VANILLIN

−H2O

70
 V + A

−H2O
−H2O

71
 h ảo
k
am
Th

p-dimethylamino-cinnamaldehyd = DMACA

72
 h ảo
k
ham
T
DMACA is a dye particularly useful for localization of PACs in plant
histology. The use of the reagent results in blue staining.
It can also be used to titrate PACs. A colorimetric assay based upon
the reaction of A-rings with the chromogen.
DMACA has been developed for flavanoids (monomer) in beer that
can be compared with the vanillin procedure.
The DMACA reagent may be superior to the vanillin procedure for
the detection of catechins (monomer!).
DMACA (+) to monomer & polymer of catechins!
The DMACA reagent changes color over several days when exposed
to air but when refrigerated can be stored for up to 2 weeks.
The DMACA reagent # the Renz & Loew reagent.

73
 h ảo
k
ham
T p-Dimethylaminocinnamaldehyd = DMACA

74
4.2.a. Phản ứng cồn-phân + oxy hóa bằng KIO3
Với [MeOH + H2SO4], các TG sẽ cho glucose và methyl gallat.
Methyl gallat tiếp tục bị oxy hóa bởi KIO3 → phức màu đỏ.
(đo màu ở 525 – 550 nm).
Tham khảo: methalolysis

4.2.b. Phản ứng với Rhodanin (của acid gallic tự do)

Sau thủy phân, acid gallic tự do được tác dụng với dung dịch
rhodanin/MeOH, trong môi trường kiềm, để cho các sản phẩm
có màu hồng đỏ. (đo màu ở 520 nm).

75
4.2.a. Phản ứng cồn-phân + oxy hóa bằng KIO3

LOD = 1,5 μg methyl gallat

76
4.2.b. Phản ứng với Rhodanin (của acid gallic tự do)

77
Lưu ý chung: Do có nhiều nhóm -OH nên tannin rất phân cực !
Nên chọn dung môi chiết, rửa tạp theo hướng sau:

Nói chung, hiệu suất chiết tannin sẽ:

- tăng theo to và pH, theo độ mịn của bột dược liệu.
- tăng nếu được hỗ trợ bởi siêu âm, vi ba (microwave).
- tăng khi có mặt # (5 – 10%) Na2CO3
- giảm khi có mặt của NaCl, NH4SO4

Nếu chiết bằng CO2 siêu tới hạn, cần phải có thêm EtOH, MeOH.
78
Trong nghiên cứu, việc chiết xuất / phân lập tannin nhằm mục đích:

A. Loại bỏ tannin như 1 tạp phân cực

Phương pháp: Kết tủa tannin với protein, muối kim loại, NH4SO4...

B. Thu được dịch chiết / phân đoạn giàu tannin (hỗn hợp)
Phương pháp: Chiết xuất bằng dung môi phân cực &
Loại bỏ tạp kém ph.cực bằng dung môi kém ph.cực.

C. Thu được 1 hợp chất tinh khiết thuộc nhóm tannin

Phương pháp: Chiết lấy phân đoạn giàu tannin,
Kết tủa hoặc kết tinh phân đoạn.
Có thể kết hợp với sắc ký (hấp phụ, rây phân tử...)
Đôi khi: Sắc ký HPLC-chế hóa.

79
 Có thể “thử & sai” theo 1 số cách sau

1. Kết tủa tannin bằng dung dịch protein (gelatin, BSA...)

Cho dd. protein vào dịch chiết giàu nước, khuấy đều, đun nóng,
rồi để nguội. Tannin sẽ bị vón lại (nổi lên khi dùng lòng trắng trứng)
và dễ dàng được tách khỏi dịch chiết.
Khuyết điểm: chỉ loại được 1 phần tannin.

2. Hấp phụ tannin vào diatomite (= diatomaceous earth, Kieselguhr)

Với Celite® 545 (Sigma-Aldrich): Dịch chiết + 5% bột Celite (w/w)
Khuấy đều, để lắng, gạn và lọc thu dịch.
Khuyết điểm: chỉ loại được 1 phần tannin.
Nếu tăng % Celite®: có thể bị hấp phụ mất 1 phần chất nghiên cứu.

80
 3. Kết tủa tannin (và polyphenol) bằng dd. Chì acetat
• Chì acetat kỹ thuật (= đường chì) thường còn lẫn 1 ít PbO.

• Khi hòa tan / nước (max 30%) sẽ tạo Pb(OH)2 làm dung dịch đục
và có tính kiềm (gọi là dung dịch chì acetat kiềm, CAK).
• CAK + AcOH đến khi trong suốt → dd. chì acetat trung tính (CAT).

• CAK có thể kết tủa với hầu hết các polyphenol (CAK ít chọn lọc).
• CAT ưu tiên kết tủa các polyphenol có nhiều nhóm OH kế cận nhau
như o-diphenol, Δ’ catechin, Δ’ galloyl, gallat... (CAT chọn lọc hơn).

81
3. Kết tủa tannin (và polyphenol) bằng dd. Chì acetat (cont.)
Tùy mức độ chọn lọc cần thiết, cho 1 lượng thừa CAK (hay CAT) vào
dịch chiết (có độ cồn < 25%, vì tủa polyphenol-chì có thể tan lại 1
phần trong môi trường chứa nhiều cồn).
Khuấy kỹ, để lắng > 12 giờ. Gạn, rồi lọc bỏ tủa bùn (polyphenol-chì)
Dịch lọc tiếp tục được loại bỏ chì thừa bằng dd. Na2SO4 15%...
......

☠
Chú ý:
- Muối chì rất độc! Nên thận trọng & rất hạn chế sử dụng.
- Dịch chiết cồn thường được cô thu hồi bớt cồn, rồi thêm nước.

82
4. Kết tủa tannin bằng (NH4)2SO4

5. Các phương pháp loại bỏ tannin khác

Có thể kết tủa tannin bằng dung dịch PVPP ở pH ~ 3

83
 Không có 1 quy trình chung để chiết xuất các tannin từ mọi
dược liệu. Tuy nhiên, có thể dựa vào sơ đồ chung như sau:

- Chiết tannin = nước nóng, MeOH/EtOH-nước, aceton-nước

- Cô thu hồi bớt dung môi.
- Kết tủa tannin với d. dịch ammoni sulfat bão hòa, lọc lấy tủa.
- Chiết tannin từ tủa này với aceton, lọc lấy dịch aceton,
cô thu hồi aceton → cắn tannin thô.
- rửa cắn tannin thô với Et2O → tannin tinh khiết hơn.

84
Trên thực tế, hay sử dụng ammonium sulfat dưới dạng phân hóa học
SA (phân muối diêm), dạng rắn, để kết tủa tannin...

85
HPLC
86
(PAC)
87
1

88
2

89
3

90
Trên thực tế, rất ít khi phân lập 1 tannin tinh khiết (acid tannic).
Rất khó phân lập tannin thành từng cấu tử tinh khiết riêng biệt,
ngay cả khi dùng các kỹ thuật như pHPLC...

Thường sử dụng nhất: Hỗn hợp toàn phần, chứa khoảng < 50%
tannin (công nghiệp thuộc da, keo dán gỗ, nước giải khát...).
Có khi sử dụng ph.đoạn giàu tannin tách từ hỗn hợp dịch chiết.

Có thể tham khảo một sơ đồ nguyên tắc chung như sau:

91
92
6.1. Định tính chung

6.1.1. Phản ứng với muối kim loại (không chuyên biệt)
- với d.dịch FeCl3 loãng → xanh rêu / lá / xanh đen
- với d.dịch chì acetat → tủa trắng ngà / vàng
dd. chì acetat tr.tính → (+) với các ortho-diphenol,
dd. chì acetat kiềm → (+) với mọi -OH phenol
(chì acetat kiềm mạnh hơn chì acetat trung tính).

6.1.2. Phản ứng với d.dịch muối alkaloid (quinin ...)

- dịch tannin + d.dịch muối alkaloid → tủa bông trắng.

93
6.1.3. Phản ứng với dung dịch gelatin-muối
- 2 loại tannin + d.dịch gelatin-muối → đều cho tủa
(dùng để loại bỏ cả 2 loại tannin TC + TG ra khỏi dịch chiết)

6.1.4. Phản ứng thuộc da (Goldbeater’s skin test)

- ngâm da sống vào HCl 2%, rửa = H2O
- nhúng da vào dung dịch tannin trong 5 phút, rửa = H2O
- + d.dịch FeSO4 loãng → màu nâu, đen (có TG hay TC)

6.1.5. Phản ứng với dung dịch Phenazon (ít thông dụng)
- d.dịch tannin + Na2HPO4 + Phenazon 2% → tủa màu
94
6.2. Định tính phân biệt (tannin gallic vs tannin catechic)

Tính chất TG TC

thủy phân được không

độ tan/nước dễ tan kém tan

kiềm chảy → pyrogallol pyrocatechin

+ FeCl3 xanh đen xanh lá *

+ Stiasny không ↓ vón nặng

+ nước Brom không ↓

95
Nhận diện các pseudo-tannin

96
Nhận diện tannin gallic & acid (di)gallic tự do

(G1) (G2) 97
 Nhận diện catechin tự do, tannin catechic

Thường dùng phản ứng trên gỗ của que diêm (có lignin):
• Nhúng 1 que diêm gỗ (có lignin) vào 1 d.dịch tannin catechic (TC).
• Nhúng tiếp vào d.dịch HCl, hơ nóng kế ngọn lửa → màu hồng pink.
Cơ chế: TC, catechin bị phá vỡ cấu trúc bởi HCl nóng → phloroglucinol.
phloroglucinol + Lignin (của gỗ que diêm) → màu hồng

+ HCl Δ + lignin
màu đỏ hồng

98
 6.3. Sắc ký các tannin (SKLM)
Tannin rất phân cực → khó sắc ký / silica gel NP.
• Chuẩn bị mẫu: chiết mẫu bằng aceton-H2O, (ROH-H2O), cô.
Loại chlorophyll & chất béo (thêm nước, lắc với EP, CF, DCM).
Chiết lấy phần tan trong EtOAc (mono & oligomer TC...).
Có thể hòa trong AcCN (acid ellagic sẽ không tan)
• Dung môi khai triển
- với PG: Bz – aceton (6:1)
- với (PG + PC): Bz – HCOOEt – formic (2:7:1)
CF – HCOOEt – formic (1:7:1)
Toluen – CF – aceton (1:1:1)
• Hiện màu: với PG + PC → phun FeCl3 1% (xanh, xanh đen)
với PC → dùng thuốc thử AS (→ đỏ gạch)
99
 chebulinic acid
chebulagic acid

100
101
6.3. Sắc ký các tannin (sắc ký phân bố)

SKG / SKLM cellulose hay polyamid: thường sắc ký 2 chiều

• Dung môi khai triển 2 chiều

- hệ 1: s-BuOH-AcOH-H2O (14:1:5) đối với TG.
t-BuOH-AcOH-H2O (3:1:1) đối với TC.
- hệ 2: AcOH 6% trong Nước

• Dung môi khai triển 1 chiều

- SKG : hệ n-BuOH-AcOH-H2O (4:1:5; ↑)
- SKLM cellulose : hệ CHCl3-AcOH-H2O (10:9:1)

102
6.3. Sắc ký các tannin (SKLM)

Hiện màu bản mỏng: Phun hoặc nhúng thuốc thử

- FeCl3 loãng, (FeCl3 + Kali Ferricyanid)
- (Vanillin + HCl); VS / AS (Vanillin / Anisaldehyd Sulfuric)
- dung dịch bão hòa KIO3
- dung dịch NaNO3 + AcOH (pha 10% / nước đá)

6.4. Sắc ký rây phân tử các tannin (Sephadex LH-20)

Pha tĩnh : Sephadex LH-20,

Dung môi: (Me2CO – H2O), (H2O – MeOH), (Me2CO – MeOH)

103
 6.5. RP-HPLC các tannin

Nghiên cứu HPLC các tannin PC khó >> tannin PG >> flavonoid
hay catechin monomer.
Đã có nhiều ng.cứu HPLC về tannin TG, TC polymer có MW lớn;
nhưng đến nay (2016) ít có công bố nào cho kết quả thật tốt.

Pha tĩnh : Silica gel RP-18,

Dung môi: (H2O – MeOH), (H2O − AcCN), (MeOH – AcCN)

104
 acid
chebulinic
acid
chebulagic

HPLC các tannin pyrogallic trong quả Chiêu liêu (Terminalia chebula)
105
106
 epicatechin

catechin
gallocatechin

C.S. Buelga, p. 107 107

 1: gallic acid
2: gallocatechin
Các catechin chuẩn EGCG
3: epigallocatechin
4: catechin

5: epicatechin
acid 6: EGCG
gallic ECG 7: GCG
8: ECG

acid ellagic

Dịch MeOH (0.5 mg/ml)

C2: acid ellagic

C1-4: chất 1-4

108
109
110
111
• Các tannin polymer có MW lớn, độ trùng hợp cao rất khó nghiên cứu
phổ NMR (kể cả tannin pyrogallic TG lẫn tannin pyrocatechic TC).
• Các oligomer (vài monomer) đỡ phức tạp hơn.
• Các monomer thường được công bố dữ liệu phổ NMR hơn, ví dụ:

4’-OH 4’3’-OH 4’3’5’-OH

3β-OH afzelechin catechin gallocatechin

3α-OH epiafzelechin epicatechin epi-gallocatechin

13
Có thể phân biệt catechin & epicatechin bằng phổ C và 1H-NMR
nhờ so sánh bộ tín hiệu của nhóm oxy-methin (>CHO−) ở C-2:
112
 Tham khảo: Sự khác biệt ở C-2 của catechin & epicatechin

(δc2 > 80 ppm: catechin 2R 3S) (δc2 < 80 ppm: epicatechin 2R 3R)

82.3 79.4

83.5 76.9

82.0 79.3

113
 Tham khảo: Sự khác biệt ở H-2 của catechin & epicatechin

catechin epicatechin
4.5 d 4.8 s

Tham khảo: Tóm tắt sự khác biệt ở H-2 và C-2 của catechin & epicatechin

(2R, 3S) catechin (H-2ax, H-3ax) (2R, 3R) epicatechin (H-2ax, H-3eq)

δC-2 > 80 ppm δH ~ 4.5 d (7-9 Hz) δC-2 < 80 ppm δH-2 ~ 4.8 s
114
 1
H-NMR, MeOD, 400 MHz

H2O MeOH

H-8 H-6 4,55 d (9 Hz) catechin

★
H-2

MeOH

H-8 H-6 H2O

epicatechin
H-2
115
★ 4,80 s
 1
H-NMR, MeOD, 400 MHz

4,52 d (9 Hz)
★
H-8 H-6

H-2

H-2
H-8 H-6

★ 4,74 s

116
 Có thể dùng phổ 1H-NMR để sơ bộ đánh giá về mức độ trùng hợp
(mDP) của PAC (tannin pyrocatechic, tannin ngưng tụ).

Nguyên tắc:
• Cường độ của tín hiệu proton thì tỉ lệ với số lượng proton tương ứng.
• H-6 và H-8 là các proton thơm, xuất hiện ở vùng δ 5,8 – 6,5 ppm
• H-4 (là CH2 của phần terminal) xuất hiện ở vùng δ 2,4 – 3,0 ppm

• Tỉ lệ giữa cường độ tín hiệu của [các H-6+8] / [H-4 terminal]

sẽ cho ta khái niệm về mức độ trùng hợp (độ lớn) của PAC.
• mDP càng lớn thì n (và MW) sẽ càng lớn.

117
 n

(2 + n) + 1 [H6 + H8] [H6 + H8]

= (n + 2) = 2 −1
2 [H4] × [H4]

(n + 2) được gọi là mức độ trùng hợp của PAC

118
 Tham khảo chơi, có thể gặp lại ở chương trình Sau đại học

MeOH

terminal

Phổ 1H-NMR (MeOD, 300 MHz) của các PAC / rễ Selliguea feei
(Trích Ph.D. Thesis của Fu Cali, 2010, p. 65)
119
Thực hiện theo Gelotte (1960)
- Hòa # 5 mg mẫu thử vào 5 ml nước. Nạp lên cột Sephadex G-25.
- Rửa giải cột bằng nước, tốc độ: 20 phút / 1 phân đoạn 5 ml.
- Theo dõi cột bằng phương pháp đo Abs. ở UV 280 nm.
- Ghi nhận thể tích dung môi rửa giải Vi (ml) của mẫu thử,
- Ước lượng MW của mẫu thử dựa vào đồ thị chuẩn log MW = k.Vi
của 3 chuẩn gồm catechin, rutin, acid tannic (M = 290, 610, 1700)
tiến hành trong cùng điều kiện.

Ref: M. Mallika, S.C. Dhar (1980), Studies on the oxidation

of tannins by Aspergillus flavus, J. Biosci., 2(1), pp. 43-48.
120
5 mg mẫu / 5 ml H2O, cột Sephadex G-25, 20 phút / ph.đoạn 5 ml.
Tannin X (VX = 60 ml; MX ~4600); tannin Y (VY = 85 ml; MY ~1280)
121
 Các nhóm phương pháp chính:

A. Phương pháp cân C. Phương pháp đo màu

1. Kết tủa với bột da * 5. Với thuốc thử Folin
2. Kết tủa với Đồng acetat 6. Với th’.thử Folin-Ciocalteu *

D. Phương pháp sắc ký

B. Phương pháp thể tích
7. Phương pháp dùng HPLC *
3. Phương pháp Löwenthal *
4. Phương pháp Sisley
E. Các phương pháp khác

122
7.1. Phương pháp kết tủa với bột da
• Nguyên tắc:
- chiết kiệt tannin bằng nước sôi.
- so sánh lượng chất chiết được của
* dịch chiết chưa loại tannin
* dịch chiết đã hết tannin (tủa = bột da).
- ΔP chính là lượng tannin cần tìm.
• Thực hiện: Xem DĐVN IV, PHỤ LỤC 12, trang PL 233.
• Sơ đồ → xem slide kế.

123
 (bột dược liệu qua rây 355)

hàm lượng tanninoid = (T1 − T2 + T0) × 10 × (100/a) %

124
 (X)

(X) là lượng tannin từ a (g) mẫu, với độ pha loãng = (250/25) = 10.
Lượng tannin từ 100 (g) mẫu, không pha loãng → T = X. 10. (100/a)%

125
• Áp dụng: định lượng (tannin catechic + catechin)

Kết hợp phản ứng với bột da, casein... (để loại ∑ tannin)
và phản ứng với TT Stiasny (để tạo tủa)

- dịch chiết còn tannin + TT Stiasny → tủa (P1)

- dịch chiết hết tannin + TT Stiasny → tủa (P2)

(tannin PC + catechin) → ΔP = (P1 – P2)

126
7.2. Phương pháp tủa với đồng acetat (tham khảo)

Nguyên tắc :
- Chiết tannin bằng cồn 60%.
- kết tủa tannin bằng một lượng thừa đồng acetat.
- lọc lấy tủa Đồng tannat, sấy và cân → (P1).
- nung tủa Đồng tannat sẽ thu được CuO → (P2).
- lượng tannin trong mẫu thử = (P1 – P2)

127
7.2. Phương pháp tủa với đồng acetat (tiếp, tham khảo)
Có thể kết hợp với ph. pháp chuẩn độ Iod bằng Na2S2O3.

- chiết tannin = nước, loại pectin (nếu có) = cồn.

- tannin + dd. Đồng acetat thừa → [Đồng tannat] ↓

- lọc bỏ tủa [Đồng tannat].

- [Đồng acetat thừa / dịch lọc] + [d. dịch KI] → Iod.

- chuẩn độ Iod mới sinh bằng dung dịch Na2S2O3.

128
 7.3. Phương pháp Löwenthal (1877) * Thực tập Dược liệu *

• Nguyên tắc chung:

- Mẫu được xay về cỡ bột qui định (rây 0,5 mm).
- Chiết kiệt tannin / mẫu bằng nước sôi + đun cách thủy.
- Oxy-hóa tannin / dịch chiết bằng dd. KMnO4 0,1 N / H+
- Chỉ thị màu: sulfo-indigo từ blue → green → màu vàng.
- Làm song song với mẫu trắng (không có mẫu).

• Thực hiện: (Tham khảo giáo trình thực tập).

• Tính kết quả: 1 ml KMnO4 0,1N # 4,157 mg acid tannic ***.

Tham khảo [1] Maynard Joslyn (1950), Methods in Food Analysis: Applied to Plant
Products, Academic Press Inc., New York, 1950. Ch. XIX: Tannins (pp. 471-482),
[2] D.N. Barua, E.A. Houghton Robert (1940) X. Slide kế. và [3] AOAC (1980).129
130
131
Chỉ thị màu Indigo

dehydro-indigo carmine
(dạng oxy-hóa, xanh lá)

indigo carmine
( màu đỏ )

leuco-indigo carmine
(dạng khử, vàng)

132
7.4a. Phương pháp thể tích SISLEY (tham khảo)
- tủa tannin bằng Kẽm acetat.
- lọc thu tủa kẽm-tannat, hòa tủa / H2SO4 loãng
- chuẩn độ bằng KMnO4 0,1N. Chỉ thị Carmin Indigo.

7.4b. Phương pháp thể tích JEAN cải tiến (tham khảo)
- mẫu tannin + lượng chính xác Iod trong 2 giờ.
- chuẩn độ lượng Iod thừa bằng dung dịch Na2S2O3.
- Làm song song với mẫu trắng.
1 g Iod # 1,37 g acid tannic.
133
7.5. Ph. pháp so màu, dùng th. thử Folin-Denis (1915)

Thuốc thử Folin (= acid Phospho-Wolframic)

Nguyên tắc : Tannin + th.thử Folin → phức xanh
Đo Abs, so với mẫu chuẩn → hàm lượng tannin
(tính quy về một tannin chuẩn, thường là acid gallic/tannic)
Phương pháp không đặc hiệu (polyphenol toàn phần)

Có thể so với 1 mẫu đã loại bỏ tannin bằng gelatin:

• dịch thử + th.thử → phức màu (đo A) → P1
• dịch đã loại tanin + th.thử → phức màu (đo A) → P2
Lượng tannin P = (P1 – P2)

134
7.6. Phương pháp so màu, dùng th. thử Folin-Ciocalteu (FCR)

• Nguyên tắc: tạo màu với th’.thử phospho-molybdo-tungstic

- Polyphenol + FCR → màu xanh (λmax 760* nm)
- Lập đường cong chuẩn của dãy d. dịch acid gallic + FCR.
- Dựa vào đường cong chuẩn, xác định hàm lượng phenol
* của d. dịch mẫu chưa loại tannin = (P1)
* của d. dịch mẫu đã loại tannin bằng casein = (P2)
- Hàm lượng taninoid toàn phần = (P1 − P2)

• Thực hiện : DĐVN IV, PHỤ LỤC 12, trang PL 234.

135
1. Chuẩn bị
(1) Thuốc thử Folin-Ciocalteu 1 N (FCR):
Pha loãng gấp đôi (từ lọ FCR 2 N, Merck) với nước cất.
Bảo quản trong chai nâu ở 4 °C.
Thuốc thử màu vàng: OK, có ánh màu xanh: đã hư.
(2) Dung dịch Na2CO3 (20% trong nước cất)
(3) Insoluble polyvinyl polypyrrolidone (PVPP, của Sigma).
(4) D.dịch chuẩn acid tannic (0.1 mg/ml H2O): Dùng loại mới pha.

2. Thiết lập đường cong chuẩn

(Với dãy dd. acid tannic TA, xem bảng & đồ thị ở 2 slides sau)

136
 Bảng số liệu đường chuẩn (FCR method)

TA (0,1 mg/ml) H2 O FCR Na2CO3 20% Abs. TA

Ống
(ml) (ml) (ml) (ml) (ở 725 nm) (μg)
chứng 0,00 0,50 0,25 1,25 0,000 0

1 0,02 0,48 0,25 1,25 0,112 2

2 0,04 0,46 0,25 1,25 0,218 4

3 0,06 0,44 0,25 1,25 0,327 6

4 0,08 0,42 0,25 1,25 0,432 8

5 0,10 0,40 0,25 1,25 0,538 10

137
 Thiết lập đường chuẩn (theo acid tannic, TA)
(Để định lượng polyphenol nói chung)

0,538

0,432

0,348

0,327
0,218

0,112

6,4 mg acid tannic

138
 3. Xác định x% phenol toàn phần (nội suy)

Pha mẫu đo: Nên bắt đầu từ 0,02 − 0,05 − 0,10 ml dịch chiết.
Sau đó tuần tự:
• (+ nước vđ 0,5 ml) rồi (+ 0,25 ml FCR) rồi (+ 1,25 ml Na2CO3).
• Lắc đều, để yên đúng 30 phút và đo Abs. ở 725 nm.
• Nội suy lượng phenol toàn phần từ đường chuẩn (theo acid tannic).
• Kết quả ghi theo x% trên dược liệu đã trừ độ ẩm.

Ví dụ:
Dùng 0,05 ml dịch thử # 1,00 mg dược liệu. Đo được Abs = 0,348.
Nội suy từ đường chuẩn: Abs 0,348 tương ứng # 6,4 µg acid tannic.
Vậy 5 ml dịch thử # 100 mg dược liệu # 0,64 mg TA → x0 = 0,64%
Nếu dược liệu có độ ẩm 10% thì kết quả x = 0,64 / 0,90 = 0,71%.

139
Polyphenols react with Folin-Ciocalteu reagent (FCR) to form a blue complex that
can be quantified by visible-light spectrophotometry.
The reaction forms a blue chromophore constituted by a phosphotungstic and
phosphomolybdic complex, where the max absorption of the chromophores
depends on the alkaline solution and the concentration of phenolic compounds.
This reagent rapidly decomposes in alkaline solutions, which makes it necessary to
use an enormous excess of the reagent to obtain a complete reaction. This excess
can result in precipitates and high turbidity, making the analysis impossible.
To solve this problem, FCR included Lithium salts, which prevented the turbidity.
The reaction generally provides accurate and specific data for several groups of
phenolic compounds, because many compounds change color differently due to
differences in unit mass and reaction kinetics.
Many studies have discussed the use of the FCR to determine polyphenols, and the
general or specific value of the method, because some specific details may be
modified.
It is named after Otto Folin, Vintilă Ciocâlteu, and Willey Glover Denis.

140
Total phenolic content (TPC / FCR).

FCR = (Phosphotungstic + Phosphomolybdic + Li+ salt)

Phenolics + FCR / basic → Blue complex (λmax ~780* nm).
0.50 mL extract + 3.0 mL H2O + 0.25 mL FCR.
Immediately, add 0.75 mL of satd. Na2CO3 + 0.95 mL H2O.
Incubate 37 ºC x 30 min., read Abs. at 765 nm.
Compared to a standard curve (gallic acid solution).
The TPC was expressed as mg of gallic acid equivalents
per gram of fresh weight (mg GAE / g FW).

141
142
Tannin khá phổ biến / thực vật bậc cao (cả Ngành Hạt kín & Hạt trần).
Trong Ngành Hạt kín, tannin có ở cả 2 Lớp (Lớp Hai & Lớp Một lá mầm)

A. Lớp Hai lá mầm (đã gặp # 180 họ có chứa tannin), đáng chú ý:
Aceraceae, Actinidiaceae, Anacardiaceae, Bixaceae,
Burseraceae, Combretaceae, Ericaceae, Fabaceae,
Fagaceae, Dipterocarpaceae, Myricaceae, Myrtaceae...
Khoảng 5% các cây thuộc họ Solanaceae, Asteraceae là có chứa tannin.
Hàm lượng tannin thường thì
- không cao ở họ Boraginaceae, Cucurbitaceae, Papaveraceae
- rất cao trong các hạch lá (Sồi), hạch cành (Ngũ bội tử...)
B. Lớp Một lá mầm (đã gặp # 44 họ có chứa tannin) đáng chú ý:
Họ Najadaceae & Họ Typhaceae.

143
 Trong cây, thường gặp chủ yếu là 1 loại tannin (catechic >> gallic)
Một số cây lại chứa cả 2 loại tannin này (lá Bàng, lá Ổi, Đại hoàng...)

Có thể gặp tannin trong nhiều bộ phận của cây

• rễ, rễ củ (Đại hoàng, Hà thủ ô đỏ...)
• thân (Keo Wattle = Acacia spp., Dẻ Chestnut = Castanea spp...)
• vỏ thân (Chiêu liêu, Quebracho, Hemlock Tsuga spp., Sồi, Đước...)
• lá (Chè xanh, Bàng, Bạch đàn, Ổi, Sim, Mua...)
• quả (Chiêu liêu, Cau, Dẻ, Lựu, Măng cụt, Ổi...)
• hạt (Ca cao, Cau, Keo Wattle Acacia spp., Nho...)
• hạch lá nutgalls (Sồi Quercus spp...),
• hạch cành galls (Muối, Ngũ bội tử Rhus semialata...)

144
Tannin được khai thác duy nhất từ các nguồn thực vật tự nhiên.
Sản lượng toàn cầu hàng năm: # 200.000 tấn tannin (A. Pizzi, 2003).
Trong số này, 90% là tannin catechic.
Đáng chú ý nhất là từ các nguồn:
A. Gỗ cây Mẻ rìu Quebracho (Schinopsis balansae, S. lorentzii)
chủ yếu được sản xuất từ Argentina, Brazil
B. Vỏ cây Keo Wattle (Acacia mearnsii): chủ yếu từ Nam Phi, Brazil
C. Gỗ cây Dẻ Chestnut (Castanea spp.): từ Trung quốc, Châu Âu
D. Quả Chiêu liêu (Terminalia chebula): từ Ấn Độ, Châu Âu...
E. Vỏ Thông (Pinus maritima, Pháp; P. radiata, Úc & New Zealand),
vỏ 1 số loài Hemlock (Tsuga spp.)

145
Các lĩnh vực tiêu thụ nhiều tannin:
- Thuộc da: # 60% (tannin chiếm #30% P của da thuộc).
- Làm keo dán gỗ (ván ép), dán plastic; làm mực,
- Khoan mỏ, đánh bóng & chống ăn mòn kim loại
- Làm trong rượu bia & nước ép trái cây,
- Gây đông kết cao su

Tannin dễ phân hủy thành các phenol đơn giản rất bền,
có thể gây ô nhiễm môi trường:
- acid hóa & gây hại với vi sinh vật / đất, làm đất bạc màu,
- làm sậm màu các nguồn nước (và da sinh vật tại chỗ)
146
- tạo màng / niêm mạc → bôi ngoài làm thuốc săn da
(dạng tannoform = tannin + formol).
- trị phỏng, vết do rắn***, côn trùng cắn
- kháng khuẩn → trị loét (miệng, da; + acid picric loãng)
- cầm máu (đắp lên vết thương, xịt vào búi trĩ hậu môn).
- trị ngộ độc alkaloid, kim loại nặng (+ KMnO4 làm ddịch súc ruột)
- trị viêm ruột, trị tiêu chảy (tannat albumin, tannat gelatin)
- antioxidant (EGCG / Chè xanh), ngừa bệnh mạch vành (rượu Nho)
- trị sỏi thận (Quercus stenophylla → Urocalun®, Nhật, từ 1969)

However, to-date, neither the FDA nor the EFSA (European Food
Safety Authority) have approved any health claim for bioflavonoids
or approved them as pharmaceutical drugs. (FDA, Nov. 2013).
147
Học kỹ : Ngũ bội tử.

Đọc thêm : Ổi, Măng cụt.

148
149
150
151
Nutgalls / Sồi (Quercus infectoria, Fagaceae)

152
153
 HP-TLC CAMELLIA CHINENSIS

Trên bản si-gel 60 (HP-TLC) với 4 hệ dung môi

1. Ethyl formiat - Toluen - HCOOH - H2O (30 : 1,5 : 4 : 3)
Phân tích các flavonoid trong trà xanh
2. Toluen - Me2CO - HCOOH (9 : 9 : 2)
Phân biệt các polyphenol trong các loại trà (xanh, đen …)
3. EtOAc - MeOH - H2O (20 : 2,7 : 2)
Nghiên cứu thành phần alkaloid / Trà.
4. n-BuOH - Me2CO - AcOH - H2O (7 : 7 : 2 : 4)
Nghiên cứu các amino acid / Trà.

154
Phổ UV của acid protocatechuic (3,4-di-OH-benzoic acid)

155
 INTRODUCTION (p 109-110)
Although considerable advances have been made in the chemistry of condensed tannins, the
chemical constitution of phlobaphenes remains an enduring problem. This state of affairs is
perhaps not unexpected as the definition of phlobaphenes is highly nebulous and can
encompass many widely different plant constituents that vary from plant to plant.
Over the years, two different definitions for phlobaphenes have come into common use in the
literature.
• The first usage, preferred by many natural products chemists, refers to phlobaphenes as the
reddish-colored pheno-lic substances extracted from plants that are alcohol soluble but water
insoluble.1,2 These "natural" phlobaphenes are believed to be structurally related to
co-occurring condensed tannins. Both phlobaphenes and condensed tannins commonly occur
in woody plants. It has often been assumed that the natural phlobaphenes are formed by
oxidation and/or polymerization of condensed tannins. Extraneous materials may be
incorporated into the phlobaphene polymer during this process, which re-sults in the observed
heterogeniety of phlobaphenes from source to source.
• The second common use of the term phlobaphenes stems from the tanning industry where
phlobaphenes are identified with the red-colored water-insoluble reaction products - also
called tannin reds - that result from treatment of tannin extracts with mineral acid. 3,4

Condensed tannins are the common link between these two types of phlobaphenes, and we
are only beginning to understand some of the transformations leading to the two kinds of
phlobaphenes. A priori, one would expect some significant differences between the two types
of phlobaphenes because of the obviously different reaction circumstances. In this paper, the
literature on phlobaphenes is surveyed with emphasis centered on the research reported since
Hergert's (1962) review of this subject. In addition, our studies on Douglas-fir bark
phlobaphenes are reported. 156
 INTRODUCTION (p 109-110)

Two different definitions for phlobaphenes:

• from natural products chemists:

Phlobaphenes as the reddish-colored phenolic substances
extracted from plants that are alcohol soluble but water insoluble.

• from the tanning industry:

Phlobaphenes are the red-colored water-insoluble products
that result from treatment of tannin extracts with mineral acid.
(also called tannin reds).

157
158
from “Chemistry of Condensed Tannins” (1989)

159
160