a) Acido nalidixico. Agregar 0.489 de acido naliixico y 0.4mL de NaOH 10N a 10mL de agua destilada y mezclar. Esterilizar la solucin por ftracién y adicione 5.2mL por cada L de medio. b) Cloruro de trifenlttrazolium (TTC): Agregar 0.1g de TTC a 10mL de agua destilada y calentar para disolver. Estorlizar la solucién por fitracién y adicione 2mL por cada L de medio. ) Vaciar en cajas de Smm x 50mm aproximadamente de 4m a 8mL y dejar soldiicar. El pH final del madio debera estar entre 7.1 £ 0.2. Conservar en refrigeracién. Apéndice H Normative. Método aprobado para la estimacién de la densidad de Coliformes totales, fecales y E. coli por la técnica del NMP presentes en muestras de alimentos para consumo humano y agua. Este método es aplicable para la estimacién de la densidad de coliformes tolales, colformes fecales y E. coll por la técnica del NMP presentes en muestras de alimentos para consumo humano y agua, Este método es aplicable para la deteccién de coliformes fecales y E. col, especialmente en productos que se encuentran en bajas concentraciones de microrganismos, H.1 INTRODUCCION. ‘Actualmente se utilzan 3 grupos de indicadores microbianos con diferentes aplicaciones. La deteccién de bacterias del grupo coliforme se usan como indicador de la calidad sanitaria del agua 0 como indicador de las condiciones sanitarias en el procesamiento de alimentos. Los colformes totales, fecales y E. coll contindan siendo el indicador de eleccién que manifesta Contaminacién fecal reciente o condiciones higiénicas inadecuadas. El método del NMP consiste de una prueba presuntiva y Confirmativa. El uso de las series de tres, cinco y diez tubos va a depender de la contaminacién esperada y el grado de exactitud deseada, El principio de la técnica se basa en la dilucién de la muestra en tubos miliples, de tal forma que todos los tubos de la menor diucién sean positvos y todos los tubos de la dilucién mayor sean negativos. El resultado positivo se demuestra por la presencia de gas y crecimiento microbiano propiedad de los microorganismos coliformes para producir gas a partir de la fermentacion de '£0.2°C (para alimentos) 44.5 °C + 0.2 °C (para agua) dentro de las 48h de incubacién (coliformes fecales y E. Para obtener el NMP en los resultados se aplica la teorla de la probabildad, lo cual tiene como condicion lo siguiente: - Una distibucién aleatoria de las bacterias que existen en fa muestra. - Las bacterias se encuentran como entidades no agrupadas, Los microorganismas presentes en la muestra crecerdn en el medio cuando son incubados y se mantengan en las condiciones adecuadas para su desartallo. ‘Alrededor del 96% de las cepas de E. coll incluso las cepas anaerogénicas producen la enzima beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato especifico 4-metilumbelifery-beta-D-glucurénido (MUG) en 4-metiumbelliferona (MU), que al ser expuesto ‘una fuente de luz UV de onda larga (365nm) produce una fluorescencia azul, facil de observar cuando el MUG es incorporado al caaldo EC o al caldo lauril Una excepcién es la E-coll enterohemorragica serotipo 0157:H7, que es GUD negativa: por lo que es comin que esta prueba 0 utlice para diferenciar este serotipe de las demas E, col. La produccién de GUD por otras bacterias de la familia Enterobacteriacoao es rara, Algunas copas 0 especies de Shigella (44%-58%) y Salmonella spp (20%-29%) son GUD positivas, sin embargo no se considera una desventaja de esta prueba para su Uso en salud piblica Si se espera una cuenta microbiana alta, la muestra debera diluirse para dar cumplimiento a las condiciones. La forma mas comin de realizar esta prueba es mediante diluciones decimales y usando un inéculo en series de tubos. A medida que el numero de tubos inoculados para cada dilucién aumenta, se reducen los limites de confianza. H.2 EQUIPO. H.2.1 Bafio de agua con cubierta y recirculacién constante que alcance una temperatura de 44.5 °C, 45.5 °C +0.2° H.2.2 Lampara de luz UY de 365nm longitud de onda: H.2.3 Incubadora de aire que mantenga una temperatura de 35 °C £0.5 °C; H.2.4 Balanza con capacidad adecuada y sonsibilidad do 0.14; H.2.5 Motor de licuadora u homogenizador peristatco H.26 Potenciémetro con sensibilidad de 0.1 de unidad de pH; H.2.7 Mecheros Bunsen, y H.2.8 Autoclave que mantenga una temperatura intema de 121 "C bajo una presién de 15 psi (1 bar), equipado con termémetro calibrado y manémetro de presién calibrado, previamente calificada H.3 MATERIALES, H.3.1 Tubos de cultiv de 18mm x 150mm, 18mm x 200mm, 18mm x 160mm, 16mm x 160mm, 22 x 175mm con tapén deH.3.2 Tubos de fermentacion (campanas de Durham): 1.3.3 Gradillas de pléstico y metal; H.3.4 Asas bacteriol6gicas; 1.3.5 Lentes protectores; H.3.6 Termémetro de maximas para autoclave con divisién minima de 0.5 °C calibrado. Se deberd registrar la inspeccién trimestral de la columna de mercurio del termémetro con una lupa en bisqueda de rupturas de la misma, si se observa éste deverd salir de uso; H.3,7 Termémetro de inmersién total de 379mm de longitud de 25 °C a 55 °C, una escala auxliar a 0 °C con subdivisiones de 0.1 °G con una precision y exactitud de + 0.4 °C. Se deberd registrar la inspeccién anual de la columna de mercurio del termémetro con una lupa en busqueda de rupturas de la misma, sise observa éste deberd salir de uso; H.3.8 Cinta testigo para procesos de esteriizacién por calor himedo; H.39 Vasos do licuadora estéril o bolsas estérlas para homogeneizador peristaltico; 1.3.10 Pipetas graduadas bacteriolégicas de 0.tmL, mL, 2mL, SmL y 10mL; H.3.11 Probetas de 100ml, 500mL y 1000mL; H.3.12 Frascos de dilucién de vidrio de borosilicate con tapén esmerilado; H.3.13 Frascos con capacidad 500mL con tapa de rosca, y 1.3.14 Espatulas, cucharas, cuchillos, pinzas. H.4, MEDIOS DE CULTIVO. H.4.1 Caldo At H.4.2 Caldo lauril Triptosa; H.4.3 Caldo EC; 44 EMBL; H.4.5 Caldo triptona al 1%; H.4.6 Caldo RM a VP; H.4,7 Caldo Citrato de Koser 1.4.8 Citrato de Simmon; H.49. Caldo Lauri triptosa con MUG; H.4.10 Caldo Verde Brillante Lactosa Bilis; H.4.11| Agar Me Conkey; 1.4.12 Agar Nutitvo; H.4.13 Agar Cuenta Estandar, y H.6.14 Caldo Laur con MUS, H.5. REACTIVOS, H.5.1 Regulador de fosfatos solucién concentrada; H.5.2 Diluyente de peptona al 0.1%: H.5.3 Reactivo de Kovac: H.5.4 Reactivo de VP; H.555 Indicador rojo de metlo, y. H.5.6 Reactivos para la coloracién de Gram. H.6 CEPAS DE REFERENCIA H.6.1 E. coll ATCC 25922, y H.6.2 Enterobacter aerogenes ATCC 13048. H.7 PROCEDIMIENTO ANALITICO, H.7.1 Procedimiento para determinar colformes Totales, Fecales y E. coll en agua y hielo. H.7.1.1 Prueba presuntiva, Agitarvigorosamente la muestra veinticinco veces en un arco de 30 ° por 7s, la cantidad necesaria para el andlisis deberd ser de 100mL como minimo e inocular el caldo laurl triptosa a la concentracién adecuada, como se describe en el punto H.14.1.2 H.7.1.1.1 Agua para uso y consumo humano y envasada. Transferir 5 porciones de 20mL, 10 mL o una porcién de 100mL. Consilar la tabla H.14.1.2, para seleccionar las diferentes concentraciones de caldo laurll de acuerdo a los diferentes voldmenes de muestra a inocularH.7.1.1.2 Agua para uso recreativo. Utilzar cinco tubos de caldo lauril por cada porcién de 10mL, imL y 0.1mL, hacer diuciones decimales cuando se espere una densidad microbiana alta. Consultar las Tablas H.14.1.2. H.7.1.4.3 Hilo. Fundir por completo el hielo a 45 °C y realizar el andlisis como agua para uso y consumo humano. Incubar los tubos de’ caldo lauril inoculados a 35 °C + 0.5 °C por 24h a 48 h. Examinar los tubos a las 24h y observar si hay evidento formacién de gas. Sino se observa la formacién de gas, incubar 24h mas y anotar los resultados. H.7.1.2 Prueba confirmativa, De cada tubo que muestre formacién de gas, tomar una asada y sembrar en un mero igual de tubos de Caldo EC para la prueba confirmativa; inocular en tubos de EC un control positive de E. coli y un control negativo de Enterobacter aerogenes e incubar con las muestras. H.7.1.3 Incubar los tubos para prueba de coliformes totales a 35 °C £ 0.5 °C por 48h + 2h y para la prueba de califormes fecales a 45.5 °C # 0.2 °C en bafo do agua con recirculacién continua durante 24h, observar si hay formacién de gas, registrar la lectura, en caso de no haber formacién de gas, incubar 24h mas. Uslizar estos resultados para calcular el NMP de Coliformes. totales y coliformes fecales respetivamente, Consular la seccién de calaulos. Nota: Para todos los alimentos que se les determine coliforms fecales, la incubacién debe ser a 45.5 °C #.0.2 °C por 24h a 48h, excepto para muestras de agua que deberdn incubarse a 44.5 °C 0.2 °C durante 24h a 48h. H.7.1.4 Agua de mar para el cultivo de moluscos bivalvos. Agitar la muestra vigorosamento vointicinco veces en un arco de 30cm por 7s. Para la prueba de coliformes fecales, inocular la muestra de agua de mar directamente en cinco tubos conteniendo «1 Caldo A-1, por dllucién en porciones de 10mL, tmL y 0.1 ml en Medio A-1 Incubar por 3h a 35 °C 4 0.5 °C para un periodo de resucitacién, pasado este tiempo de incubacién colocar los tubos en un bafo de agua a44.5 °C £0.2°C por 21h # 2h, La produccién de gas ylo efervescencia manifestada por una agitacién suave de los tubos de Caldo A-1 incubados dentro de las 24h, indica una reaccién positva a coliformes de origen fecal. Para calcular el NMP/100mL consultar la Tabla correspondiente 1.8.4.2 (TABLA 2), 1.7.1.5 Prue! complementar H.7.1.5-1 Esta es una prueba optativa de calidad para todas las muestras de agua que tiene como objetivo confirmar el 10% de Ios tubos positives de colformes totales en caldo verde brillante. Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos de caldo verde brillante y sembrar por estria cruzada en agar Mc Conkey. Incubar a 35 °C + 0.5 °C por 24h + 2h. Observar las colonias tipicas fermentadoras de color rosa intenso que pueden estar rodeadas de un halo opaco de precipitacion de las sales biliares. H.7.1.8.2 Seleccionar 1.0 més colonias aisladas con las caracteristicas anteriores o lo mas parecido a esta descripcién © inocula igual ntimero de tubos de fermentacién con caldo lautiltrstosa y a tubos con agar nutriva inclinado. Incubar a 35°C + 0.5 °C examinar los tubos a las 24n y observar si hay formacion de gas. Anotar los resultados. Si la formacién de gas no so observa, incubar 24h mas y anotar los resultados. H.7.1.5.3 Realizar tincién de Gram a partir del crecimiento en el agar nutrtivo para observacién dela ‘morfologia microscépica de las colonias. H.7.1.5.4 La formacién de gas en los tubos de caldo lauril sulfato dentro de las 48h # 3h y Ia observacién de bacterias Gram negativas, en forma de baciios no esporulados constituyen una prueba positiva a la presencia del grupo coliforms. H.7.1.6 Prueba confirmativa para E. coli (por identficacion bioquimica), H.7.1.6-1 Prusba presuntiva, H.7.1.6.1.1 Tomar una asada de cada uno de los tubos positives de caldo EC ylo Caldo A-1 y sembrar por esiria cruzada en agar EMB-L para su aislamiento, Incubar las placas invertidas a 95 °C + 1 °C por 18 °C - 24h. Seleccionar 2 colonias de cada placa con la morfologia colonial tipica: colonias con centro negro, planas con 0 sin brilo metalico y sembratlas en agar cuenta ‘estandar (placa 0 agar inclinado), para realizar las pruebas de morfologia microscdpica y pruebas bioqulmicas. Incubar las placas © tubos a 35°C +1 °C por 1@h-a 24h H.7.1.6.1.2 Sino hay colonias con morfologia tipica, probar 1.0 mas colonias lo més parecido a E, coll de cada placa. Realizar un fratis y tefirlo por Gram. Observar al microscopic la presencia de bacilos cortos Gram negativos, H.7.1.6.1.3 Pruebas bioquimicas: Indol, Rojo de metilo, VP, ctrato, H.7.1.6.1.3.4 Produccién de indol, Inocular un tubo con caldo triptona @ incubarlo a 35 °C + 0.5 °C por 24h + 2h. Adicionar 0.2mL. a 0.3ml. de reactive de Kovac, dejando caer las gotas del reactivo por las paredes del tubo y no agitar los tubos para observacién del anillo rojo en la supertice, La presencia de una coloracién roja en la superficie del tubo se considera una prueba positiva, H.71.6.1.3.2 VP. Inocular un tubo con caldo MR-VP e incubar a 35 °C + 0.5 °C por 48h + 2h. Transferir tml a un tubo de ‘19mm x 100mm, Adicionar 0.6mL. de solucién I -naftol y 0.2mL de KOH al 40% y agitar. Cuando se desarrola un color de rosa a rojo en 15min a 30min, se considera una prueba positva, H.7.1.6.1.3.3 Rojo de metilo, Ala otra parte del caldo MR-VP inocular adicionar cinco gotas de solucién de rojo de metilo, Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color amarillo definido es una prueba negativa H.7.1.6.1.3.4 Gitrato. Sembrar con inéculo igero un tubo con caldo citrato de Koser, evitar turbiedad en el tubo, Incubar a 35 *C # 0.5 °C por 96h, Una reaccién postiva se observa mediante el desarrollo de turbiedad detectable, Se puede utilizar como alternativa citrato de Simmon el cual se debe inocular por estria. Incubar 35 °C + 0.5 °C por 48h. Una prueba positva se observa ‘mediante crecimiento yio cambio @ una coloracién azul; la ausencia de crecimiento se considera tina prueba negativa H.7.1.6.1.4 Interpretacién de resultados de las pruebas bioquimicas.H.7.1.6.1.4.1 Todos los cultivos que fermenten Ia lactosa con produccién de gas dentro de las 48h a 35 °C, sean bacilos 0 bacilos cortos Gram negativos no esporulados y se obtengan las siguientes combinaciones para el IMVIC: Prustas Biatipo Biotipo Tndot > 7 RM + + ve Citrate * Son consideradas como E coll H.7.1.6.1.4.2 Calcular el NMP de E, coll basada en la proporcién de los tubos positives de caldo EC confirmados. Consultar el punto H.8 Céleulos. H.7.2 Prueba para detectar E. coll en alimentos refrigerados © congelados. H.7.24 Prueba Presuntiva. Seguir lo indicado en el punto H.7.3. Uilizando caldo lauril con MUG en vez de caldo lau Inocular un tubo con una cepa de E. coli GUD positva como control (ATCC 25922). Adamés inacular otro tubo con una copa do Enterobacter aerogenes (ATCC13048) como control negativo, para faciitar la diferenciacién entre los tubos que presenten sélo crecimiento y erecimiento con fuorescencia, Inocular los tubos por 24h a 48h + 2h a 35 °C. Examinar cada tubo con crecimiento (Qurbiedad y gas), después, observar los tubos en la oscuridad con una lémpara de luz UV, Una prueba positiva para E. coll es la presencia de fluorescenca en el tubo, La lectura a las 24h de incubacién, identifica a E.coli en un 83%-95%, mientras que a las 448n de incubacién la identifica en un 96%-100%. H.7.2.2 Prueba confirmativa. Confirmar todos los tubos positives estriando en una placa de agar L-EMB, incubar a 35°C + 1 "C por 26h y continuar como se ingica en el punto H.7.1.6.1.1 H.7.2.2.1 Prusba confirmativa para E. col (por identificacién bioquimica), Caleular el NMP de E. coll basada en la confirmacién de tubos en las tres diluciones consecutivas. H.7.3 Procedimi i H.7.3.1 Prueba Presuntiva. Pesar 25g del alimento en 225mL de regulador de fostates o diluyente de peptona y moler por 2 min en vaso de licuadora u homogeneizador peristatica, el volumen total en el vaso debe cubrir totalmente las aspas. Las muestras congeladas deben mantenerse en refrigeracién (2 °C-5 °C) un maximo de 18h antes de su andlisis, sin legar a la descongelacién. En caso de que la cantidad de muestra disponible sea menor a 25g y el andlisis necesite ser efectuado (por denuncia o queja ante Ia autoridad), utilizar una cantidad de muestra que represente una proporcién 1:10, H.7.3.2 Preparar diluciones decimales con regulador de fosfatos, La cantidad de diluciones dependerd de la densidad de colformes esperada, Agitar las diuciones veinticinco veces en un arco de 30cm por 7s transfer volimmenes de 1ml a tres tubos con 10mL. de caldo lau triptosa, por cada dllucién por lo menos tres dluciones consecutivas (el volumen que se transfiera nunca deve ser menor del 10% de la capacidad total de la pipeta). Mantener la pipeta en angulo de tal manera que descanse sobre el borde del tubo. El tiempo entre la homogeneizacién de la muestra y la inoculacién de los tubos no debe excader de 15 min a 20 H.7.3.3 Uilizar como medio de enriquecimiento caldo lauritriptosa, una vez inoculados incubar a 35 °C + 0.5 °C. Examinar los tubos a las 24h y observar si hay formacién de gas. Anotar los resultados, Sila formacién de gas no ge observa, incubar 2¢h mas y anotar los resultados. H.7.3.4 Prueba Confrmativa. Continuar como se indica en el H.7.1.2. Prueba Confirmatoria, considerando que sila formacién de gas no se observa, continuar la incubacién 24h mas, H.8, CALCULOS. H.8.1 Con frecuencia es necesario calcular el NMP con cantidades de muestra diferentes de los enlistados en las Tablas H.8.4 desde el primer nimero de la combinacién encontrada. Si la cantidad de muestra >0.01g multiplicar el NMP enlistado en Ia tabla utlizada dependiendo del procedimiento realizado por 10, H.8.2 Una determinacién de cinco tubos que dé tres tubos positives en 0.01g; dos tubos positivos en 0.001g y un tubo positive fen 0.000'1g (3-2-1) el resultado obtenido al leer en la Tabla H.8.4.2 (TABLA 2), es 17, multplicar por 10 para asi obtener 170 como el NMP final por g de muestra. De igual forma sila cantidad mas grande ullizada para la tabla de referencia es 1g en lugar de 0.1g, dividr el NMP derivado de la Tabla entre 10. Por ejemplo el resultado de la determinacion del NMP en tres ‘ubos para E. coll que 46 tres tubos positives en 1g; un tubo positvo en 0.1g y ningin positive en 0.01g (3-1- 0) el resultado abtenido al leer en la tabla H.8.4.1 (TABLA 1) 6s 43 y aivdir entre 10, lo que da 4.3 como el NMP presuntive por g de muestra. H.8.3 Un método altemativo para obtener el NMP es usando la siguiente formula: (NMPig de la tabla - 100) X factor de dilucién del tubo de en medio = NMP/g Para calcular el NMP/100 g muliplicar por 100, 8.4 Tablas. H.8.4.1 Tabla 1, NMP para 1g de muestra cuando se usan tres tubos con porciones de 0.1; 0.01 y 0.0019, ‘TubosPosivos ———=—sTubos Positives Tuas Posts bos Postivas(0.00; NWP 07 007 0.00)_NMP 01 007 0001 NMP 07 0.07 0,00) NWP O01 23 39 64 95 6 15 120 180 93 150 210 290 240 480 1100 >1100 <3 2 ra " 2% 6 73 8 2 " 2 6 8 " 92 Py a 2 8 38 2 29 38 44 6 Ey 2 1 2 24 93 2 16 9 6 2 6 19 Referoncla: Official Methods of Analysis ofAOAG International, 18 6d. 2008, Chapter 17.3, pag. 5 53 H.8.42 Tabla 2. NMP para 100mL de muestra cuando se usan § porciones en cada una de tres diluciones con sH.8.4.3 Tabla 3, NMP 100mL de muestra de agua 0 hielo e intervalos de confianza del 95% utilizando cinco tubos con 20 mL de muestra 95% de Limite de conflanca (aproximado) Tubos positive | NMP/t00mL “ae ome a aa a 30) i 7 005 cx} 2 28) 03) 96. 3 46 08 147 4 20. aT 24 5 380 40) : H.8.4.4 Tabla 4, NMP por g de muestra e intervalos de confianza del 95%, utilizando diez tubos con 10mL de muestra. bos Limite de confianza pestives | NMPH¢ML [Taste Supa o a - 33 1A 05 58 22 0.37 31 36 ost er, 5a 16 13 8 25 15 22 33 18 12 48) 28 16 38 38 8 23 on 58 70 323 12 ~ H.8.4.5 Tabla 5. NMP por g de muestra e intervalos de confianza del 95%, utilizando tres tubos con 0.19, 0.01g y 0.001g do muestra, NMP por g de muestra eInfervalos de conflanza del 95%, ulllizando res hibos con O.1g, O01gy 0.001g de muestra Tubos postves inte de contianza Tubos posivos mite do eoafianza oro [oo [ ono; | “M° interior [ Superior | oto [ 001 [ 0907 | “MPS [interior [Superior a a) a =o 95. 2 [2 ° a 45 2 oo 1 30 | 015 36. 2 [2 1 2 a7, 3% of 7 30 [048 7 23 z 35 a7. % o> o oa 72 78 2 [3 ° 29 a7 94 2 7 Bz 72 78 zs 7 3 a7 o [3 a 84 36 38 39 0 2 46 94 [3 7 36 [0.17 8 ao 7 Ed a7. To 7 [0 1 72, ta 78 a [9 2 ef 7 180) 73 z it 35 38 a a a 2 720, 1 7 a Ta ta 20 a [4 1 75 7 200 4 7 71 35 38 a 2 720, a7 220 72 a 1 35) a a [4 3 760) a 420 72 7 76 45 a a2 2 s 7 20 73 a 76 45) a a [2 1 750) 7 220 zo a a2 Ta 38 3 [2 2 210 20 230 2 [9 1 14 38) 22 3 [2 3 220 20 71000 Zo) z 20 45) a2 3 [3 0 240 a 71000 2-4 a 15 37, a2 3 [3 1 460 20 2,000 2 [4 1 20 45) a2 3 [3 z yoo | tao | 4,100 2 [4 2 27 ar 9 3 [3 3 [S110 [420 a Referencias Bacteriological Analytical Manual FDA, 6th Edicidn, RevislOn A, 1998 Actualizacion Diciombre 2003, TE. Tabla 6, NMP por g de muestra e intervalos de conflanza del 95%, utilizando cinco tubes con 0.1g, 0.019 y 0.001 g de muestra. NMP por g de muestra e intervalos de confianza del 95%, utilzando cinco tubos con 0.1g, 0.01g y 0,001 g de muestra, "Tubos posivos NWPr ites do "Tubes postives TPG Ties do ° eonfanza confanza 1] oor] 0001 Trietor | Supaier | 07 oor] 0001 Trisror | Supeto2 2 2 2 z z a a7 7 3 8 0 30) 6 10 460) 7 10 480) 1 0 20) 2 10 220) 7 © 7] 0 18 0 a] 200 2 0 joo 480 2 0 wo] 480 @ © wo] 620 2 0 350 iso] 630 2 0 aio] 280 | 7900 2 0 240 wo 480 0 220 0 2 0 350 0 6 © 20 7 7 7s © sof a0 t200 19 7 10 Too 280 | 1800 5 Ta 0 wa] sao] 7900 7 tr x] 10 zoo 420 [2400 o = a] 10 e0o| 20 2400 2 0 mp0 zoo | era | 5200, 0 >2a00| 1300 a 1.5.4.7 Tabla 7, NMP por g de muasira e Intervalos de confianza del 98%, ulllzando diez tubos con 0.1g, 0.01gy 0.0019 de muestra. TNRP por gramo de muss ntarvalos de conflanza del 5%, ullzando 10 tubes con 010.01 y 0.00% a de mueata "Tubes postives vg L_Linte de conianza Tubes postives| ig Lut 6 contanza oor [ooo | “WPS |Tinvenor [ Superor [ox | oor [ onor | “° [Tintenor [ Superor @ a 7 34 16 2 a 7 TH B7 36 7 4 20 % m7 36 7 ra 20 i 51 25 20 38 17 74 38 16 ‘43 20 a 6 7 a7 21 3 2 2 3 3 22 17 3 33 25 ° 3 2 2 2 ° 2 2 2 2 58 1 5 7 oo 7 44 20 33 18 4 2 10 20 25 33 78 28 i 20 25 20 25 2 2 28 12 22 30 5 16 25 72, 16 2 a5 7 2 2 28 1e 0 rn 73 16 10 2 a5 Ww 0 4 28 18 0 ‘7 rn 24 10 27s z B @ oe Tepes oo _[ 0 00 77 0 2 it « [wf oo 240 110 480 77 1 26 12 so {| 0] + 200 | 120 620 @[o a 13 56 2 [wo | 2 350 | 160 320 a [0 1 15 7 23 [wo | 3 20] 180 970 @ [0 2 7 so {wo | wo | 4 0 | _210 1300 a [0 3 19 x [wo] 5 700 | 240 1500 a. 0 15 2 [| w {wo | 6 20 | 350 1900 af 1 7 31 so _| 10 | 7 [1200 [ae 2400 a. 2 19 sew | wo | «| i600 | azo 3400 a. 3 23 10 sow [| w | 0 | 2500 | sto 5300 so [| wo | 2300 [1300 = HS43 Tabla 8. NMP por 100mL de muestra inoculando tubos de cada una de tres diluciones geométricas Tubes postves “Tuos positives Tubes postves Tubos postivos mm Ne mt Ne mm mt Nwe 7]? ]o re) wo] [or | we fo] a | on 7 fofoe fs Pr }feyo sa pefeloysa |sfelo] a OO 7 fo?T2fs Pi toy? | pepe, 2) = )sfol2], = 7 fefsfs f+}o;s]sye2feo,s)aysfeols] = 7 >7Poeps Pr fayo]m peti] oye)sfifoy, a OO 7 |1[2pPe2 pi tay2 |e )2fi]2) a fstiy2 | 7 >7r>s >2 Pi pays fw ye pa fs |e fs pi ys | a a TE oa Ea 7 Pape pe pi fsyo fw y2fs]o] = {spss | a 7 ts?2f,~efstey;2]"=y2fs];2),"]s sa] 2 | tw a ) Referencla: Recommended Procedures for te Examination of Sea Water and Shelfish, Fourth Edition 1970. APHA, New York H.8.5 ESTIMACION DE LA DENSIDAD MICROBIANA POR LA TECNICA DE NMP. Uso de Tablas de NMP con 95% de limite de confianza, H.8.5.1 Las Tablas H.8.4.5 (Tabla 6), H.8.4.6 (Tabla 6), H.8.4.7 (Tabla 7) presentan la estimacién estadistica de los valores del NMP que corresponden al 95% de limite de confianza cuando se utllzan tres, cinco y diez tubos. Otras combinaciones de resultados positives y negatives no encontrados en estas Tablas, tienen muy baja probabilldad de que se presenten. Si los resultados no estén incluidos en las Tablas, se deberé repetir la prueba a partic de la muestra orginal. Si no es posible, el NMP se puede obtener aplicando una ecuacién (véase H.9 y el 95% de Limite de Confianza) para tener el NMP aproximado (para las, Combinaciones de tres y cinco tubes). H.8.5.2 El intervalo del 95% de confianza se interpreta como sigue: si el analista supone que el nimero real de microorganismos cae dentro de Ios limites, entonces se asume que serd correcto el 95% de las veces. El valor del NMP tabulado representa un intervalo y no un valor absoluto. H.8.5.3 Cuando se preparan mas de tres dlluciones de una muestra, el NMP deberd determinarse a partir de los resultados de tres diluciones consecutivas. Primero, para todas las diluciones que tengan todas los tubos positivos, seleccionar la dllucion mayor. Después usar las dos siguientes diluciones mayores. Cuando en ninguna de las diluciones probadas hubiera crecimionto fn todos los tubos, seleccionar (si es posible) las primeras tres diluciones consecutivas para que la dilucién media contenga resultados positives. Cuando se presenta un resultado posiivo en la diucién mas alla no seleccionada (menor cantidad demuestra), sumar el numero de tubos positives a la dlucién mas alta seleccionada. Cuando todos los tubos de todas las diluciones son positivos seleccionar las tres diluciones mas alts. H.8.5.3.1 Ejemplo para determinar el NMP estimado en series de 3 tubos con 1g (mL) de muestra por tubo. Cantidad de muestra (g 2 mL Ejenplo Valores postves | NMP estimadoigo 04 oor | 9.001 | 0.0001 | 0.00001 reporiados mu a 38 38 28 08 08 320 930 8 38 38 38 28 08 320 9800 c on 08 1 08 08 ono 30 o ae 3 28 48 7 322 2100 E 38 38 a8, 38 38 333 3170000 aspen eos ce NDI (pr agate ome NUP (nt) H.8.5.3.2 Ejemplo para determinar el NMP estimado en series de cinco tubos con 1g (ml.) de muestra por tubo. Cantidad de muestra (go mL Fiero Valores posttves | NMP estimacoig 0 04 ‘aor [0001 | 0.0001 | 0.00001 reportados mut a 55 55 25 05 os B20 0 8 55 5S 55 28 os 520 4900 ¢ os os 48 08 05 0-0 18 ° 55 515 35 15 75 532 7400 E 56 35 55 55 5 555 >160000 ® at ocs vb NP (pr 100 pees came NMED 9 Lh H.9 CALCULO APROXIMADO DEL NMP Y EL 95% DE LIMITE DE CONFIANZA. H.9.1 Debido a la inherente complelidad para calcular los limites de conflanza del NMP lo mas comin es el uso de Tablas. Generaimente estas Tablas estén limitadas al uso de tres, cinco y diez tubos por dilucién, incluso usando un métado aceptado, pueden presentarse datos irregulares 0 accidentes de laboratorio que causan pérdida de uno 0 mas tubos de dilucién. En este caso una serie de diluciones de por ejemplo: 5, 4, 4 puede dar una lectura de 5-2-0. Para estos casos se puede aplicar una ‘érmula sencilla, la cual no corresponde exactamente con los resultados obtenides teéricamente; sin embargo, las desviaciones generalmente son peque’ias, esta formula no debe ser aplicada para fines de regulacion. La formula no restringe el niimero de lubos o las diluciones y puede aplicarse para todo tipo de pruebas. El célculo aproximado de Thomas esta dado por la siguiente ecuacién: Donde: P 2s el numero de tubos positives, N es la cantidad total de muestra (g) en todos los tubos negatives y T es la cantidad total de muestra (g) en todos los tubos. Por ejemplo, considerando que se tuvieran serie de diluciones al doble: MUESTRA (g) | No.DETUBOS | No.DE TUBOS Posirivos, @ 5 3 4 5 4 2 5 2 1 5 ° os 5 1 0.25 5 ° Elnumero do tbos poslives 6s: = (6444261) =12; = (Bx0) + (xt) + (2x3) + (125) + (0.58) + (0.2545) = 18, 25: = 5 (a+442+1+0,5+0,25) = 78,75 2 N I Los limites de confianza del 95% estimados, pueden obtenerse del antilogaritmo de base 10 con la siguiente ecuacién bea +7078 Doan t2Log (NMP/g) « (1.96) (0,55) Donde: ges el radio de dllucion 2 y nes el ntimero de tubos por dllucién Para el ejemplo anterior el NMP con Sy un limite de confianza aproximado de 95% serd el siguiente: vea0se2(1o7mion san? = 0,495 2 0,265 Entonces ol limite inferior es el antilogaritmo (-0,78) = 0,17/g 0 17/100 g y el limite superior es el antlogaritmo (-0,23) = 0,59/g 059/100 g, Cuando se compara con las Tablas el NMP podria ser 0,31/g con limites de confianza de 0, 16/9 y 0,97/9, H.10 INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS, H.10.1 Expresar en NMPig o mL para alimentos y NMP/100mL para agua. H.10.2 Cuando se obtienen resultados negativos (ausencia de gas en los tubos),informar el limite de doteccién que corresponde a menos del valor mas bajo del NMP de la Tabla utlizada. Excepto en los casos de agua para uso y consumo humano que como lo indica la Modificacién a la Norma Ofcial Mexicana NOM-127-SSA1-1994, Salud Ambiental. Agua para uso y consumo humano. Limites permisibles de calidad y tratamientos a que debe someterse el agua para su potablizacién, deve expresarse como "No detectable” 0 "ND". H.11 MEDIDAS DE CONTROL DE CALIDAD. H.11.1 Veriicar la funcionalidad del procedimiento analtico mediante cultivos control con cepas de E. colly E. aerogenes para coliformas fecales y E. cally K. pneumoniae para la determinacién de E. coli con caldo EC-MUG. H.11.2 Registrarlas temperaturas de incubacién con termémetros veriicados. H.11.3 Posarla muestra en balanza calibrada y verificads. H.11.4 Veriicar el ciclo de esterlizacion de autoclaves con indicador biol6gico y termémetro de méximas callbrado 0 veriicado. H.11.5 Veriicar el ciclo de esteriizacién de horas con indicador biolégico. H.11.6 Realizar control de medios de culvo con cepas tipo (evaluacién biolégica) y evaluacion fisica H.11.7 Realizar control ambiental por el método de sedimentacién, H.12 VALIDEZ DE LA PRUEBA. H.12.4 Cuando todos los tubes de la menor dilucién sean positivos y todos los tubes de la dilueién mayor sean negatives o la combinacién de ambos, H.12.2 Siel crecimiento de los controles no es caracteristica la prueba se invalida, H.13 Diagrama de Flujo,Wosuar GaissLavilwpiom oomar az nawe205C Proaiecin de garb Sh padueske de ges a nas BA eh Neleabis nevbarordnezhasec 056 atts 21850 402 par base aguaa «a9 202 quan 2 aca, Pomecinaease | (Sr pedunsende yas ‘Supocotter Promcien oo ges, necuar al spar MacConey. PRUESACOUPIRMATIVA Ecol ‘oupocovime aunt Protein de gs acl per esa csc agar | | covausnte ‘Secovar Toms colnas ips G8 apr Maeconlay incu cle aw ipsa ya apr ntrvo ela. Sin rodienen se 930 Seeciora 2 sei tpias dl agar EMB-Lysenbrar agar ranivo weaned ‘rug caer auset Inebar ie pasa nos 9.256 2081 por 1h 22 Feat asene Feat oloeae cram oe cesmento | |] Grup coome at Saquness pas cot E cebusente Fresenca oh taoice carke Gan Fegatios no sparatos ‘Sh psueibn dogo ape ctome peste upc covleme ausene cence 6. cl cot sone H.14 PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO. H.14.1 Caldo A-t. El caldo A-1 debe propararse a partir de sus ingredientes individuales. Las férmulas comerciales no son aceptables, H.14.1.1 Férmula, Este medio se debe preparar a partir de los siguientes ingredientes: Lactosa 5.09 Triptona 20.09 Cloruro de sodio 5.09 Salina 059 tor pisoctifenil poliatilon glial (Titén X-100) 1.0mL ‘Aqua destiada 4000mL. H.14.1.2 Proparacién: Disolver los ingredientes en 1L de agua destiada hasta su disolucién, calentar suavemente sélo si es nnecesario, agregar 1mL del Trién X-100 y ajustar el pH a 6.9 + 0.1. Para allcuotas de 10mL. de muestra preparary utiizar el medio a doble concentracion (2X). Para lograr aproximadamente el mismo nivel del medio e inoculo en todos los tubos, distribuir porciones de 10mL del caldo en tubos de 18mm x 150mm, Los tubos deben contener campanas de Durham; usar tubos de 22mmx 175mm para el caldo a doble concentracion (2X). Esteriizar en autoclave a 121 °C por 10min y guardar el medio a temperatura ambiente en un lugar oscuro por no mas de 7 dias, para evitar la formacian de precipitado o floculo, H.14.2 Caldo lauril Triptosa H.14.2.1 Férmuta, Bacto triptosa 20.09 Bacto lactosa 5.09 Fosfato potisic dibasico 2.759 Fosfato potasico monobésico 2759 Cloruro de sodio 5.09 Lauri sulfato de sodio 0.19 ‘Agua destilada 100m. PH final: 6,8 + 0,2 425°C. H.14.2.2 Preparacién: Disolver los ingredientes en 1L de agua destilada, ajustar el pH si es necesario y dstribuir en tubos de ensaye 76mm x 150mm con campanas de Durham. Adicionar el volumen de medio do acuerdo con la siguiente tabla cuando so prepare a partir de medio completo deshidratado. Esteriizar en autoclave durante 15 min a 121 ®C. Preparacién de caldo lau triptosa Cantidad de Cantidad de medio por tubo (mL) |Volumen de medio] Caldo lauril Triptosa muestra inoculada ‘mas inéculo (mL) requerido gil (mty 7 00 més Tomas 36 0 70 20 Tz 10 20 30 334 20 70 30 7068 100 50 150 7068 700 Eo 138 Tat 700 20 120 2186 H.14.3 Caldo EC. H.14.3.1 Férmut Bacto triptosa o tipticasa 20.09 Bacto lactosa 5.0g Bacto sales biliares No. 3 1.89 Fosfato dipotasico 4.09 Fosfato monopotasico 1.89 Cloruro de sodio 5.09 ‘Agua destilada ‘000m. pH final: 6.94 0.2.a25°C. H.14.3.2 Preparacién: Disoler los ingredientes en iL de agua destlada, dejar en reposo durante § min a 10 min, mezclar bien hasta que se disuelva por completo. Ajustar el pH si es necesario. Distrbuir en porciones de 10mL en tubos de ensaye de 46mm x 150mm con campanas de Durham y esterlizar en autoclave durante 15 min a 121 °C, H.14.4 EMB.t H.144.1 Férmula, Peptona 10.09 Lactosa 10.09 K2HPO4 209Eosina Y 04g ‘Azul de metileno 0.0859 Agar 15.09 ‘Agua destiada 1000mL PH final: 7,1 £02 H.14.4.2 Preparacién: Disolver la peptona, ol fosfato y ol agar en ‘L de agua, calentar hasta ebulicién para la disolucién compieta, distibuir en porciones de 100mL 0 200mL y esterlizar a no mas de 121 °C por 15 min. Fundir antes de su uso y adiclonar a cada porcién de 100ml lo siguiente: 2) SmL de solucion de lactosa al 20% estéril ) 2mL de solucién acuosa de easina y al 2%. ©) 4.3m de solucién acuosa de azul de metileno al 0.15%. Cuando se use el producto deshidratado disolver tados los ingredientes de acuerdo con las instrucciones del fabricante. H.145 Calde triptona al 1% 145.1 Férmula, Triptona o tripticasa 10g ‘Aqua destiada 000ml. pH final: 6.90.2 H.14.5.2 Preparacién: Disolver los ingredientes, distrbuir en porciones de SmL en tubos de ensaye de témm x 125mm 0 ‘16mm x 150mm y esteriizar a 121 °C por 15 min H.14. Caldo MR 4 VP. H.14.6.1 Férmuta, Peptona tamponada 79 Glucosa 59 k2HPO4 59 Agua destiada 100m, pH final: 6.920.2 Digerido Pancredtico de caseina 3.89 Digerido péptico de tejido animal 3.59 Dextrosa 59 Fosfato de potasio 59 ‘Agua destiada 1000mL, pH6.940.2 Peptona 59 Glucosa 59 Regulador de Fosfatos 8g ‘Agua destiada 1000mL pH7.5202 H.14.6.2 Preparacién: Disolver los ingredientes con calentamiento suave si es necesario, distribuir en vollmenes de 10mL en lubos de ensaye de 16mm x 150mm y esterlizar a 121 °C por 15min, H.14,7 Caldo Citrato de Keser. 14.7.4 Férmula, NaNHHPO4 420 159 kH2P04 (monobasico) 1.09Mgso4 720 029 itrato de sédio 220 3.09 ‘Agua destiada 4000mL, H.14.7.2 Preparacién: Distibuir SmL del caldo preferentemente en tubos de ensaye con tapa de rosca y esterlizar a 121 “ por 15 min Esta formulacién se recomienda en los métodos de andliss oficial de AOAC y en los Métodos Esténdares para el Analisis de ‘Aqua y Aguas de Desecho (APHA). Este differe de la composiciin del medio deshidratado disponible comercialmente y es recomendable su uso. H.14.8 Citrato de Simmon. H.14.8.1 Férmula, NaNHsHPO4ag4H20 1.09 a 1.59 kH12P04 (monobasico) 1.09 Mgso4a¢7H20 02g itrato de sédio 2420 2.09 a 3.09 Nac 5.0g Agar 139-159 ‘Azul de bromotimol 0.089 Agua destiada 1000 mi. H.14.8.2 Preparacién, Disolver las ingradiontes y calantar a ebulicién por 1 min, Distibuir en porciones de SmL, en tubos con tapén de rosca, esterlizar por 15 min a 121 °C y dejar solidifcar en una superficie lo suficientemente inclinada para tener una profundidad de Sem. H.14.9 Regulador de fosfatos solucién concentrada, H.149.1 Férmula, kH2PO4 349 ‘Agua destlada 500mL, H.14.9.2 Preparacién: Solucién concentrada: Disolver el fosfato en S00mL de agua y alustar el pH a 7.2 + 0.2, con solucién de hidréxido de socio 1.0N, levar a 1L con agua y esteriizar durante 18 min a 121 °C. Conservar en reftigeracion, Solucién de trabajo: Tomar 1.25mL de la solucién concentrada y llevar a ‘L con agua. Distribuir en porciones de 8mL, 0mL y 9mL segin se requiera. Esterlizar a 121 °C durante 15 min. Después de la esterilizacion, el pH y los volimenes finales de la Solucién de trabajo deberan ser iguales a los iniciales. H.14.10 Diluyente de peptona al 0.1%. H.14,10.1 Formula, Peptona 19 ‘Agua destiada 1000mL, pH: 7.0202 H.14,10.2 Preparacién: Disolver la peptona en el agua destilada y esteriizar @ 121 °C por 18 min. H.14.11 Reactive de Kovac. A441. Formula, p-dimetilaminobenzaldehido 59 ‘Alcohol amilico (normal) 75m. HCI concentrado 25m. H.14.11.2 Preparacién: Disolver ol p-Dimetilaminobenzaldehido en alcohol amilico normal, adicionar lentamente el HCl. ‘Almacenar a 4 °C. H.14.12 Reaetivo de VP. H.14,12.1 Formula,Solucion 1 alfa-naftol 59 ‘Alcohol Absoluto 400m Solucién 2. KOH 409 ‘Agua destiada Para llevar a 100m. H.14.12.2 Preparacién: Disolver el alfa-naftol en 100mL del alcohol absoluto; para la solucién 2, disolver el KOH en *00mL de agua destlada. H.14.13 Indicador rojo de metilo. 1.14.13. Formula, Rojo de metilo 0.109 Etanol al 95% 300mL, ‘Agua destlada Para completar 500mL H.14.13.2 Preparacién: Disolver el rojo de metio en 300mL de etanol y aforar a 500mL con agua destilada. H.14.14 Reactivos para la coloracién de Gram. H.14.144 Cristal Violeta. 14.14.11 Formula. Solucién A. Cristal violeta (colorante 90%) 29 Etanol 95% 20mL. Solucién 8, Oxalato de amonio 08g ‘Agua destiada 80mL. H.14,141.2 Preparacién: Disolver el cristal violeta en 20mL del alcohol al 95%; para la soluclén 2, disolver el Oxalato de ‘Amonio en 80mL de agua destlada, Mezclar la solucién A y B y filrr través de un papel filo. Almacenar por 24h, H.14,142 Lodo, 11.14.1424 Férmula. Jodo ‘9 loduro de potasio (KI) 29 ‘Agua Destilada 300mL H.14,14.2.2 Proparacién: Colocar el KI en un mortero, adicionar el iodo, triturar con ol pistilo por Ss a 10s, adicionar 1mL de agua triturar. Adicionar SmL de agua y titurar. Adicionar 10mL de agua y titurar. Vaciar esta solucién en una botella de reactvo, tenjuagar el mortero y el pistilo con la cantidad de agua necesaria para completar 300ml. H.14.14.3 Colorante de contraste (solucién concentrada), H.14.143.1 Formula, Safranina 289 Etanol al 95% 100m H.14,14.3.2 Preparacién: Solucién de trabajo: Adicionar Om de la solucién concentrada a 90mL de agua destilada, H.14.15 Caldo Lactosa Bilis Verde Brillante H.14,15.1 Formula, Ingredientes Cantidades Peptona 10.09 Lactosa 10.09 Sales biliares 20.09 Verde Brillante 0.0183g‘Agua 1L H.14.15.2 Preparacién: Disolver los ingredientes en el agua, calentar si es necesario. Ajustar el pH, de tal manera que después de la esteriizacién sea 7.0 + 0.2 a 25 °C. Distribuir el medio en frascos de capacidad necesaria, Esterlizar en autoclave 15min a 121°C. Apéndice | normativo. Método aprobado para la estimacién de la densidad de E. coll por la técnica del NMP, para productos de la pesca, Este método es aplicable para pescados y productos de la pesca como: pescados crudos, enteros o fletes sin piel y cabeza, pescado salado, seco, ahumado, cefalépodo entero o en rebanada, crustéce0s entero como langostas, cangrejo, gasterépodos, bivalvos, caracoles, procesados pescados y crustéceos moluscos como: secos, ahumados, marinados, troceado, homeado, pescado entero o fletes con o sin piel cocidos, surimi, crustaceos enteros y moluscas en su concha, congelados, pescado, entero, ‘iletes y piezas, cangrejo, cofalépodos, moluscos an concha cocidos y caracoles en concha, LA INTRODUCCION. Este método consta de dos etapas. La primera es un enriquecimiento mediante la inoculacién de la muestra previamente homogeneizada y diluida en cinco tubos por dlucién, en caldo glutamato con minerales modificado e incubado a 37 °C +1 °C por 24n. La segunda es la confirmacién de la presencia de E. coll mediante la resiombra de tubos en los que se observe produccion de dcido en agar que contenga 5-bromo-4-cloro-3-indol~D glucuronido y detectar la actividad de -glucuronidasa incubado a 44 °C. 41°C por 22h 22h, 12 Equipo. 12.1 Homogeneizador peristatico y bolsas: 1.2.2 Motor homogeneizador rotatorio y vasos de licuadora 1.2.3 Gabinete de flujo laminar (clase I) 12.4 Refrigerador a3 °C +2°C, 1.2.5 Material de video estérl; 1.2.6 Cuchillos desconchadores, tjeras, pinzas, espatulas estériles, 1.2.7 Mechero Bunsen, 1.2.8 Guantes de latex: 129 Incubadora a 37°C 21 "Cyaad"Ce 1" 12.10 Asas bacteriolégicas; 1.2.11 Pipetas de ‘mL, 2mL y 10mL; 12.12 Martilo, y 12.13 Desconchador. 3 MATERIALES. 1.3.1 Cajas Petri desechables 15mm x 100mm; 1.3.2 Tubos de ensaye 18mm x 200mm y de 18mm x160mm con tapén de rosca, 1.3.3 Botella do dilucién de vierio de boroslicato con tapa de rosca, 1.3.4 Botellas de 500mL esterilzables 1.3.5 Termémetros de méximas cuya precisién/exacitud no sea mayor a 1 °C.Se deberd registrar la inspeccién timestral de la columna de mercurio del termémetro con una lupa en busqueda de rupturas de la misma, si se observa alguna, éste deberé salir de.uso, y 1.3.6 Termémetro de inmersién total de 379mm de longitud de 25 °C a $5 °C, una escala auxilar 2 0 °C con subdivisiones de (0.1 °C con una precision y exactitud de + 0.1 °C. ‘Se debers registrar Ia inspeccién anual de la columna de mercutio del termémetro con una lupa en busqueda de rupturas de la misma, sise observa alguna, éste debera salir de uso. 4 REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO. 14.1 Etanol; 1.4.2 Agua peptonada al 0.1% (concentracién simple); 14.3 MMGB medio select'vo de enriquecimianto; LAA TBGA, y 14.5 Twoon 80. 15, CULTIVOS DE REFERENCIA. 15.1 E, coli ATCC 26922 0 ATCC 8739, y 15.2 E. faocalis ATCC 29212 o ATCC 19433. 6 PREPARACION DE LAS MUESTRAS.