8 Resistencia A Virus

BIOTECNOLOGIA VEGETAL
Resistencia a virus de plantas

mediante ingeniería genética
Departamento de Ciencia y Tecnologia

Universidad Nacional de Quilmes
1
Sumario
Estrategias de protección antiviral en plantas
Resistencia derivada del patógeno mediada

por la expresión de proteínas virales

por ARN viral
Ejemplos de resistencia a virus de plantas por

ingeniería genética
Resistencia derivada de la expresión de genes

no virales
Resistencia a virus
Referencias
vegetales mediante
2
Estrategias de protección antiviral
en plantas
Resistencia a virus
vegetales mediante
3
Interacciones
Planta No huésped
entre plantas
Huésped
y virus
Si el virus infecta y se replica normalmente
se dice que es virulento y la planta susceptible
La interacción se denomina compatible
Si el virus es reconocido y la infección no prospera,
la cepa es avirulenta la planta es resistente
La interacción se denomina incompatible
Local and systemic resistance mediated by resistance (R) genes. a |

Picture of an N-containing plant showing typical hypersensitive response (HR)
necrotic lesions upon tobacco mosaic virus infection. The uninfected upper
leaves are symptom-free and do not contain virus. b | During resistance,
several signalling molecules are locally induced. c | Subsequent to the HR,
systemic acquired resistance is induced in distal uninfected tissue. The
systemic signal is currently unknown, but is thought to be lipid-derived. JA,
jasmonic acid; NO, nitric oxide; SA, salicylic acid; ROS, reactive oxygen
species.
The receptor−ligand hypothesis versus the guard hypothesis. a | The

receptor−ligand hypothesis predicts that resistance proteins detect pathogen
infection by directly interacting with avirulence proteins, triggering defence
signalling. b | In the guard hypothesis, resistance proteins 'guard' cellular
proteins, 'guardees'. These guardees are the targets of avirulence proteins and
are posited to be required for successful infection by the pathogen. The guard
and the guardee dynamically interact and there might be other protein(s) in the
complex. c | Upon modification of the guardee by the avirulence protein, the
interaction between the guard and guardee is altered and the guard triggers a
signalling cascade that leads to defence.
4
Tradicional
Estrategias
de control de Eliminar la fuente de infección (zona de cultivo, tiempo de
virosis cultivo)
en plantas Eliminar los vectores (uso de insecticidas, fungicidas,
etc.)
Obtención de plantas resistentes mediante mejoramiento
clásico
Métodos biotecnológicos
Uso de plantas libres de virus (cultivo de tejidos, cultivo de

meristemas, termoterapia)
Protección cruzada
Resistencia a virus
vegetales mediante
Plantas Transgénicas
5
La protección
cruzada es • La introducción de resistencia mediante genes
. obtenidos del patógeno reconoce antecedentes
una estrategia
. en los métodos tradicionales de manejo agrícola.
de protección
antiviral
Protección cruzada:
• La inoculación de una planta con una cepa viral

. atenuada previene la acumulación viral de una
; cepa virulenta que ataque posteriormente.
• Se utilizó para:
- Tomates / TMV
Resistencia a virus
- Papas / PSTV
vegetales mediante
ingeniería genética - Citrus / CTV
En la década del 30 se observó que la inoculación previa de una planta con un virus
la protegía contra la inoculación posterior con un virus relacionado. Este fenómeno
se denominó “protección cruzada”. Utilizando este procedimiento se ha logrado
protección de numerosos cultivos, como tomate, tabaco, citrus, papaya, vid,
cucurbitáceas etc. Los casos más conocidos se describen en la transparencia. Sin
embargo, el uso de la protección cruzada tiene varias desventajas, que se
mencionan en la siguiente diapositiva.
TMV: Tomato mosaic virus.

PSTV: Potato spindle tuber viroid.
CTV: Citrus tristeza virus.
Referencias:
Niblett, C.L., Dickson, E., Fernow, K.H., Horst, R.K., Zaitlin, M. Cross protection
among four viroids. Virology, 91:198-203, 1978.
Hamilton, R.I. Viruses. Plant disease: an advanced treatise. Academic Press, 1980.
Pennazio, S., Roggero, P., Conti, M. A history of plant virology. Cross protection.
New Microbiology, 24:99-114, 2001.
Valkonen, J.P., Rajamaki, M.L., Kekarainen, T. Mapping of viral genomic regions
important in cross-protection between strains of a potyvirus. Molecular Plant-
Microbe Interactions, 15:683-692, 2002.
6
Desventajas
de la • La cepa atenuada (o protectiva) puede mutar
protección y volverse virulenta.
cruzada clásica
• La cepa protectiva puede tener sinergismo
con un tercer virus que esté en el campo
y causar una enfermedad severa.
• Una misma cepa puede ser protectiva

en una especie y virulenta en otra especie.
• La cepa protectiva puede causar pérdidas

pequeñas pero significativas en el rendimiento.
Todos estos inconvenientes se solucionarían

si se lograra desencadenar protección cruzada
Resistencia a virus
vegetales mediante
por la expresión de un único gen viral en
ingeniería genética plantas transgénicas.
En la transparencia se mencionan algunas de las desventajas que

presenta el uso de la protección cruzada.
Referencias:
Pennazio, S., Roggero, P. and Conti, M. A history of plant virology.
Cross protection. New Microbiology, 24:99-114, 2001.
7
por la expresión de proteínas virales
Resistencia a virus
vegetales mediante
8
En 1985,
Sanford
y Johnston
enuncian sus
postulados
sobre la “Puede derivarse resistencia del parásito
resistencia expresando funciones del patógeno
derivada del en el huésped, de forma tal que ésta ocurra
patógeno en forma disfuncional, en exceso o en un
momento inadecuado del desarrollo.”
Sandford and Johnston, 1985.
Resistencia a virus
vegetales mediante
En 1985 Sanford y Johnston enunciaron por primera vez el concepto de resistencia

derivada del patógeno y propusieron una estrategia general para obtener
resistencia a un parásito expresando en el huésped productos clave del parásito en
una proporción inadecuada, en forma disfuncional o en un estadio de desarrollo
inadecuado. Para ilustrar esta teoría los autores utilizaron al bacteriófago Q como
modelo ya que se conocía bien su genoma y ciclo de vida. Este virus codifica tres
proteínas: una proteína de cápside viral, una proteína que constituye una subunidad
de la replicasa viral (el huésped provee las otras tres subunidades) y una proteína
de maduración (involucrada en la unión a los pili y a la lisis posterior de la bacteria
huésped). La proteína de cápside tiene un rol regulatorio además de un rol
estructural. En una etapa tardía del ciclo de multiplicación viral, ésta proteína se une
al cistrón que codifica la replicasa viral, arrestando así la transcripción de éste gen y
la multiplicación viral y permitiendo el ensamblaje viral. Estos autores propusieron
colocar el gen de la cápside viral bajo el control de un promotor constitutivo de E.
coli de manera que, al ingresar el bacteriófago a la célula, la abundancia de cápside
viral provoque la represión de la replicasa y con ello resistencia al virus. Por otro
lado, la replicasa viral tiene afinidad por el genoma viral y por tres subunidades de
la replicasa del huésped. Como alternativa, los autores propusieron expresar en
bacterias versiones mutadas de la polimerasa viral que posean una afinidad normal
por el genoma viral, pero que sean incapaces de unirse a las subunidades del
huésped, lo que inhibiría así la replicación viral.
9
Referencias:
Sandford, J.C. and Johnston, S.A. The concept of parasite-derived resistance:
deriving resistance genes from the parasite's own genome. Journal of
Theoretical Biology, 113:395-405, 1985.
9
Estrategias 1. Resistencia derivada del patógeno (PDR)
de protección • Mediada por proteínas: cápside viral (CP)
antiviral nucleocápside viral (N)
en plantas replicasas virales (RP)
por técnicas de proteínas de movimiento (MP)
transformación • Mediada por ARN:
genética Silenciamiento génico Postranscripcional
(PTGS)
ARN antisentido
ARN sentido
2. Resistencia derivada de transgenes no virales
- Anticuerpos antivirales
- Proteínas inhibidoras del ribosoma (RIPs)
- Factores del sistema del interferón
- Ribozimas
Resistencia a virus
vegetales mediante
3. Genes R de resistencia naturales
La transparencia resume las estrategias de resistencia a virus que es posible

implementar utilizando ingeniería genética. Otras estrategias de resistencia
derivada del patógeno que no se mencionan en la transparencia son: 1)
protección mediada por secuencias genómicas en cis; 2) protección mediada
por satélites; 3) protección a partir de secuencias obtenidas al azar; 4)
protección mediada por partículas virales defectivas. Para una revisión de las
estrategias disponibles pueden consultarse las revisiones que se mencionan
en las referencias. Las estrategias señaladas en color amarillo se
desarrollarán en detalle durante esta clase.
Referencias:
Wilson, T.M.A. Strategies to protect crop plants against viruses: pathogen-
derived resistance blossoms. Proceedings of the National Academy of
Sciences, U.S.A., 90:3134-3141, 1993.
Beachy, R.N. Coat-protein-mediated resistance to tobacco mosaic virus:
discovery mechanisms and exploitation. Philosophical Transactions Royal
Society and London Series B Biological Sciences, 354:659-664, 1999.
Goldbach, R., Bucher, E. and Prins, M. Resistance mechanisms to plant
viruses: an overview. Virus Research, 92:207-212, 2003.
10
Posibles puntos de interferencia en el ciclo de multiplicación
viral de virus a ARNsc de polaridad positiva
La transparencia muestra un ciclo de vida generalizado de un virus a ARN. Se

señalan en distintos colores las etapas que pueden ser alteradas por técnicas
de ingeniería genética con el propósito de desarrollar resistencia. Todos los
pasos señalados resultan críticos para el normal desarrollo del ciclo viral; un
bloqueo en estos niveles promovería la pérdida de virulencia total o
parcialmente. El desensamblaje del virión que acaba de ingresar a una célula
es generalmente afectado por la expresión de la proteína de cápside viral a
partir de un transgén (en amarillo). La replicación del genoma viral es
generalmente afectada por la expresión transgénica de replicasas virales (en
rojo). El movimiento del virus de célula a célula puede ser afectado por la
expresión de proteínas de movimiento virales disfuncionales (en anaranjado).
11
Resistencia A B
a Tobacco
mosaic virus
mediada
por la proteína
de cápside
viral
Tomado de: Powel Abel P. et al., Science, 1986.
A: La expresión de proteína de la cápside (CP) causó un retraso en la

aparición de los síntomas en tres líneas transgénicas independientes.
Resistencia a virus
vegetales mediante B: La eficacia del mecanismo de resistencia fue inversamente
ingeniería genética proporcional a la concentración del inóculo viral.
CP - : progenie que no expresa al gen de cápside de TMV.
CP +: progenie que expresa al gen de cápside de TMV.
La transparencia muestra ensayos tomados del trabajo en que se describió

por primera vez la resistencia mediada por proteína de la cápside. En el
panel A se midió el porcentaje de plantas de tabaco que mostraban
síntomas a distintos días luego de la inoculación con Tobacco mosaic virus
(TMV) en tres líneas transgénicas (llamadas 3646, 3773 y 3404;
representadas en los tres paneles inferiores) que expresan (barras verdes)
o no expresan (barras violetas) el gen de cápside del mismo virus. El
número entre paréntesis indica el número de plantas evaluadas de cada
tipo. Como control (panel superior) se analizó la evolución de los síntomas
en plantas de tabaco no transgénicas de dos cultivares de tabaco, Xanthi
(barra verde) y Samsun (barra celeste). Mediante estos ensayos se
concluyó que las plantas que expresan el gen de la proteína de cápside del
TMV muestran un retraso en la aparición de los síntomas debidos a este
virus. En el panel B se midió el porcentaje de plantas de tabaco que
mostraban síntomas, a distintos días de la inoculación con concentraciones
variables de inóculo viral (2 μg/ml, 0,8 μg/ml y 0,4 μg/ml), en plantas que
expresan (barras verdes) o no expresan (barras violetas) el gen de cápside
del mismo virus. El número entre paréntesis indica el número de plantas
evaluadas de cada tipo. Mediante este ensayo se concluyó que la eficacia
del mecanismo de resistencia es inversamente proporcional al nivel de
inóculo viral.
12
Referencias:
Powel Abel, P., Nelson, R.S., De, B., Hoffmann, N., Rogers, S.G., Fraley, R.T.
and Beachy, R.N. Delay of disease development in transgenic plants that
express the tobacco mosaic virus coat protein gene. Science, 232:738-743,
1986.
12
La resistencia Resistencia a Tobacco mosaic virus en plantas de tabaco CP-
y CP +, inoculadas con viriones (A y B) o con ARN viral (C y D)
derivada
de la cápside
del Tobacco
mosaic virus
requiere la
presencia
de la
proteína viral
Resistencia a virus Tomado de: Register and Beachy, Virology, 1988.

vegetales mediante
ingeniería genética La resistencia se ve sobrepasada por la inoculación con ARN viral.
Esto no ocurre en otros casos de protección mediada por cápside
(Potato virus X o Alfalfa mosaic virus).
La transparencia muestra resultados de un trabajo realizado para intentar

determinar el mecanismo que origina la resistencia mediada por la cápside a
nivel molecular. Los paneles A y C muestran la acumulación de proteína de
cápside de Tobacco mosaic virus (TMV) en pg por célula en protoplastos
infectados con TMV (panel A) o con ARN de TMV (panel C). Los protoplastos
obtenidos a partir de plantas que expresan el gen de cápside del TMV (CP+)
se muestran en anaranjado y protoplastos que no la expresan (CP-) se
muestran en azul. Los paneles B y D muestran la acumulación de ARN de
TMV en pg por cada 5.000 protoplastos de tabaco infectados con TMV (B) o
con ARN de TMV (D) en protoplastos obtenidos a partir de plantas que
expresan (en naranja) o no expresan (en azul) el gen de cápside del mismo
virus. La comparación de los paneles A con C y B con D muestra que si el
inóculo es ARN viral, no se desarrolla resistencia. En C y D las plantas CP+
se comportan igual que las plantas CP-, es decir no resisten a la infección,
con la consecuente acumulación de CP (B) y ARN viral (D). Es importante
destacar que este fenómeno no ocurre en otros casos de resistencia
mediada por cápside, como por ejemplo, en el caso de resistencia al Potato
virus X (PVX) y al Alfalfa mosaic virus (AIMV). Este hecho depende
probablemente de la localización de la secuencia genómica responsable de
la encapsidación, la cual determina también las características del
mecanismo de decapsidación.
Referencias:
Tumer, N., O'Connell, K., Nelson, R., Sanders, P. and Beachy, R. Expression
of alfalfa mosaic virus coat protein gene confers cross-protection in 13
1988.
Hemenway, C., Fang, R., Kaniewski, W., Chua, N. and Tumer, N. Analysis of
the mechanism of protection in transgenic plants expressing the potato virus X
coat protein or its antisense RNA. The EMBO Journal, 7:1273-1280, 1988.
13
La resistencia
mediada por la
cápside
es sobrepasada
si se infecta con
viriones de
Tobacco mosaic
virus
desestabilizados
Tomado de: Register and Beachy, Virology, 1988.
• La decapsidación de la partícula viral comienza junto con la traducción:

los ribosomas desplazan a la proteína de cápside.
• A pH 8, las partículas se desestabilizan y exponen los primeros 200 nt del

Resistencia a virus genoma, desnudándolo parcialmente.
vegetales mediante
En otros trabajos realizados para explorar el mecanismo actuante en la

protección mediada por la cápside viral, se midió la replicación de virus
en protoplastos derivados de plantas CP+ o CP- infectados con
partículas de Tobacco mosaic virus (TMV) pretratadas a pH 7,5 ó a pH
8. Si se las pretrataba a pH 7,5 se observaba que los protoplastos de
las plantas CP- eran susceptibles (el virus se replica en los
protoplastos) mientras que los protoplastos de las plantas CP+ son
resistentes (el virus no replica). Por lo tanto, la resistencia observada
se manifiesta a nivel celular. El pretratamiento de las partículas virales
a pH 8 causa una decapsidación (o desnudamiento) parcial de las
mismas. Cuando las partículas se pretratan de esta manera, no se
observan diferencias entre la replicación del virus en protoplastos de
plantas CP+ y CP-. Por lo tanto, cuando se desestabilizan las
partículas de esta manera, la resistencia mediada por cápside viral es
sobrepasada. Esto indicaría que en este caso la resistencia mediada
por cápside actuaría inhibiendo una etapa temprana del ciclo infectivo.
Referencias:
Register, J.C. and Beachy, R.N. Resistance to TMV in transgenic plants
results from interference with an early event in infection. Virology,
166:524-532, 1988.
14
La resistencia
mediada
por la cápside
provee
protección de
amplio rango
Tomado de: Beachy et al., Annu. Rev. Phytopatol., 1990.
Resistencia a virus
Las plantas que expresan la proteína de la cápside del Soybean
vegetales mediante mosaic virus resultan protegidas frente al desafío con virus
relacionados, tales como el Potato virus Y y el Tobacco etch virus.
Una característica importante de la protección mediada por la cápside

viral es que se trata de una resistencia de amplio rango, lo cual es
deseable desde el punto de vista agronómico porque sirve para
proteger a las plantas frente a muchas cepas de mismo virus o de virus
relacionados. En la transparencia se observa un ensayo que
comprueba este efecto. Las plantas transgénicas que expresan el gen
de cápside del Soybeam mosaic virus (SMV, un miembro de la familia
Potyviridae) resultan protegidas frente al mismo virus y frente a virus de
la misma familia, tales como el Potato virus Y (PVY) y Tobacco etch
virus (TEV).
Referencias:
Beachy, R.N., Loesch-Fries, S. and Tumer, R.N. Coat protein-mediated
resistance against virus infection. Annual Review of Phytopathology,
28:451-474, 1990.
15
Hay una relación Gradiente de sacarosa
La proteína de cápside
directa entre mutada TMV-T28W no
se auto-ensambla.
el nivel
de protección a La proteína de cápside mutada
TMV-42W se auto-ensambla
Tobacco mosaic con más eficiencia que la
proteína de cápside nativa
virus y la (TMV U1).
capacidad de la
proteína de Ensayo de protección a TMV en plantas transgénicas
que expresan proteínas de cápside nativas o mutadas
cápside La planta que expresa a TMV-T28W se comporta igual que la
expresada para no transgénica. La que expresa a TMV-42W resulta más protegida
autoensamblarse que la transgénica para proteína de cápside nativa (3646).
Resistencia a virus
vegetales mediante
Tomado de: Bendahmane et al., J. Virol., 1997.
La transparencia muestra el resultado de experimentos realizados con

el propósito de dilucidar el mecanismo actuante en el caso de la
protección mediada por la proteína de la cápside. Los experimentos
fueron realizados utilizando distintas variantes del Tobacco mosaic
virus (TMV), que fueron obtenidas introduciendo mutaciones en el gen
de la proteína de la cápside viral. Panel superior: Se muestran distintas
fracciones de una sedimentación en gradiente de sacarosa donde se
sembraron viriones con proteínas de cápside nativa o mutada. El virión
con la mutación T28W (TMV-T28W) penetra pobremente en el
gradiente ya que la mutación impide el normal ensamblaje del virión. El
virus con la mutación T42W (TMV-T42W) penetra en el gradiente más
eficientemente que el virus wild type TMV-U1 debido a que la mutación
causa una mayor eficiencia de autoensamblaje. Panel inferior: Se
muestra un ensayo de protección de plantas de tabaco transgénicas
que expresan proteínas de cápside nativa o mutadas frente a la
infección con TMV. Las plantas Xanthi-nn (no transformadas) y nn-
T28W (que llevan la mutación que impide el ensamblaje normal) no
resultaron protegidas y desarrollaron síntomas. Las plantas 3646
(transformadas con la proteína de cápside nativa), y las dos líneas de
plantas nn-T42W (portando una mutación que provoca un ensamblaje
más eficiente que el wild type) resultaron protegidas.
16
Referencias:
Bendahmane, M., Fitchen, J.H., Zhang, G. and Beachy, R.N. Studies of coat
protein-mediated resistance to tobacco mosaic tobamovirus: correlation
between assembly of mutant coat proteins and resistance. Journal of Virology,
71:7942-7950, 1997.
16
La protección mediada por la cápside viral
opera a nivel de la decapsidación viral
Planta CP -
R
El virus
se decapsida,
?
4 expresa
1 a 3
2 su genoma
b y progresa
? la infección.
Ca2+, pH, ?
R Planta CP+
?
El virus no se
1 a
2 decapsida
b y la infección
? no progresa
Ca2+, pH, ?
o progresa
lentamente.
La transparencia esquematiza el mecanismo más comúnmente

aceptado para explicar la protección mediada por la cápside viral. Este
modelo es producto de una importante serie de evidencias indirectas.
Los principales pasos del mecanismo propuesto son: 1) entrada del virus
a la célula; 2) decapsidación viral mediada por receptores celulares R
con afinidad por la proteína de cápside viral (círculos celestes) (a) o
mediada por otros factores (concentración de Ca2+, pH, factores
desconocidos) (b); 3) iniciación de la traducción (el genoma se
representa como una línea serpenteante verde y los ribosomas como
dos círculos rosados); 4) replicación del genoma viral. En las plantas
CP+ no ocurriría una efectiva decapsidación y expresión del genoma
viral debido a que los sitios de los receptores R serían bloqueados por la
CP viral (2a) o a una competencia entre la CP que forma parte del virión
y la codificada por el transgén (2b)
Referencias:
Beachy, R.N. Introduction: transgenic resistance to plant viruses.
Seminars in Virology, 4, 327-328, 1994.
17
Reportes sobre protección mediada por
proteínas de cápside viral
Tobamovirus CP TMV; ToMV; AIMV tabaco; tomate

Potexvirus CP PVX; CyMV; WCIMV tabaco
Potyvirus CP PVY; TEV; PRV; PPV PPV; tabaco; papa; papaya; maíz
MDMV; SMV; WMV II; ZYMV
Carlavirus CP PVS tabaco; papa
Luteovirus CP PLRV papa
Comovirus CP SLRSV tabaco
Nepovirus CP ArMV Tabaco
Tobravirus CP TRV tabaco
Ilavirus CP TSV tabaco
Geminivirus CP TYLCV tomate
Tospovirus Gen N TSWV; INSV; TCSV; GRSV tabaco
Los acrónimos utilizados (en orden alfabético) son: AIMV: Alfalfa mosaic virus; ArMV: Arabis mosaic virus; CMV: Cucumber
mosaic virus; CyMV: Cymbidium mosaic virus; GRSV: Groundnut ringspot virus; INSV: Impatiens necrotic spot virus; MDMV:
Maize dwarf mosaic virus; PLRV: Potato leaf roll virus; PPV: Plum pox virus; PRV: Papaya ringspot virus; PVS: Potato virus; PVX:
Potato virus X; PVY: Potato virus Y; SMV: Soybean mosaic virus; SSLRSV: Strawberry latent ringspot virus; TCSV: Tomato
chlorotic spot virus; TEV: Tobacco etch virus; TMV: Tobacco mosaic virus; ToMV: Tomato mosaic virus; TRV: Tobacco rattle
virus; TSV: Tobacco streak virus; TSWV: Tomato spotted wilt virus; TYLCV: Tomato yellow leaf curl virus; WClMV: White clover
mosaic virus; WMV II: Watermelon mosaic virus II; ZYMV: Zucchini yellow mosaic virus.
Existen numerosos reportes de protección mediada por la cápside en

distintos patosistemas virus-planta. Como puede observarse en la
transparencia, estos ejemplos comprenden la mayoría de los grupos
virales conocidos, por lo que se pensó que este mecanismo era
potencialmente universal. Sin embargo, como se detallará más
adelante, la mayoría de los casos que se reportan en esta tabla, no
pueden ser explicados por el modelo de la transparencia anterior y
responden a lo que comúnmente se conoce como resistencia mediada
por el ARN viral (la presencia de la proteína de cápside no es necesaria
para generar resistencia, pero sí el ARN correspondiente). La
protección mediada por la proteína de la cápside en sentido estricto se
aplica a los grupos de Potexvirus, Tobamovirus y Alfamovirus.
Referencias:
Powel Abel, P., Nelson, R.S., De, B., Hoffmann, N., Rogers, S.G.,
Fraley, R.T. and Beachy, R.N. Delay of disease development in
transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein
gene. Science, 232:738-743, 1986.
Tumer, N.E., O'Connell, K.M., Nelson, R.S., Sanders, P.R., Beachy,
R.N., Fraley, R.T. and Shah, D.M. Expression of alfalfa mosaic virus
18
coat protein gene confers cross-protection in transgenic tobacco and tomato
plants. The EMBO Journal, 6:1181-1188, 1987.
Hemenway, C.L., Fang, R.X., Kaniewski, W.K., Chua, N.H. and Tumer, N.E.
Analysis of the mechanism of protection in transgenic plants expressing the
potato virus X coat protein or its antisense RNA. The EMBO Journal, 7:1273-
1280, 1988.
Lawson, C., Kaniewski, W., Haley, L., Rozman, R., Newell, C., Sanders, P. and
Tumer, N.E. Engineering resistance to mixed virus infection in a commercial
potato cultivar: resistance to potato virus X and potato virus Y in transgenic
Russet Burbank. Biotechnology, 8:127-134, 1990.
18
Protección
1. El fenotipo de resistencia se expresa como:
mediada - retardo temporal del desarrollo de síntomas
por la - atenuación de la sintomatología normal
- menor título de virus en los tejidos
cápside viral - menor número de sitios de infección
2. Se requiere la presencia de proteína viral.
3. Existe correlación entre resistencia y nivel de expresión

de la proteína de la cápside.
4. La protección es superada por altas dosis de inóculo (viriones).

En algunos casos es superada por inoculación con ARN viral.
5. La protección es más efectiva para el virus homólogo.

Sin embargo, abarca también virus y cepas del mismo grupo.
6. En algunos casos, la efectividad y/o el espectro de protección

se modificó por la expresión de versiones truncadas o quiméricas
de la proteína de la cápside.
7. Actúa a nivel celular afectando una etapa temprana del ciclo

infectivo (decapsidación) y, probablemente, a nivel
Resistencia a virus
de la dispersión sistémica.
vegetales mediante
8. Descripta principalmente en tobamo-, potex- y alfamovirus.
La transparencia resume las principales características del mecanismo de

resistencia mediado por la cápside viral. Estas características han sido
deducidas de experimentos como los mostrados en las transparencias
anteriores. Es importante aclarar que mientras en algunos casos es
necesaria la expresión de la proteína de cápside viral para que exista
protección, en otros casos esta protección se obtiene mediante la
expresión del ARN que codifica la cápside viral y no se requiere la
presencia de la misma. En este caso, la resistencia está mediada por el
ARN y su mecanismo de acción se detalla en las diapositivas 25 a 42.
19
Los virus Estructura del plasmodesmo
de plantas
se diseminan
de célula
a célula a
través de los
plasmodesmos
Resistencia a virus
vegetales mediante
Tomado de: Aaziz et al., Trends Plant Sci., 2001.
La transparencia muestra una representación esquemática de un

plasmodesmo. Los plasmodesmos son canales estrechos que pasan a través
de las paredes primarias de dos células adyacentes y que se encuentran en
un número de unos 20.000 por célula. A través de ellos se establece una
continuidad espacial entre los citoplasmas de dos células vecinas. Si se
observa una sección transversal de un plasmodesmo mediante microscopía
electrónica, se ve una doble membrana: la externa es la membrana
plasmática, rodeada por una delgada capa de calosa y la interna corresponde
al desmotúbulo, que es un túbulo del retículo endoplasmático compartido por
las dos células vecinas; entre ambas membranas hay una manga
citoplasmática. Los componentes de la cara interna de la membrana que
forma el desmotúbulo se fusionan entre sí, de manera que el desmotúbulo no
tiene lumen. El transporte entre célula y célula está limitado a la manga
citoplasmática que rodea al desmotúbulo. Estudios con microscopía
electrónica de alta resolución han demostrado que hay proteínas globulares
de enlace (linking proteins) localizadas en la membrana plasmática que rodea
al plasmodesmo, y en la cara externa del desmotúbulo. Estas proteínas
dividen la manga citoplasmática en microcanales que determinan el tamaño
máximo de las moléculas que pueden desplazarse por difusión y establecen el
tráfico selectivo de macromoléculas, el que parece ocurrir por un proceso
similar al trasporte entre el núcleo y el citoplasma. Se ha demostrado que
durante el movimiento de célula a célula de los virus ocurre una modificación
20
de los plasmodesmos. Los genomas de los virus codifican proteínas
implicadas en esta modificación llamadas proteínas de movimiento, cuyo
modo de acción se describe en la siguiente transparencia.
Referencias:
Aaziz, R., Dinant, S. and Epel, B.L. Plasmodesmata and plant cytoskeleton.
Trends in Plant Science, 6:326-30, 2001.
Zambryski, P. Cell-to-cell transport of proteins and fluorescent tracers via
plasmodesmata during plant development. Journal of Cell Biology, 164:165-8,
2004.
20
Las proteínas A B
Las proteínas de
movimiento (MP)
de movimiento de varios virus
de plantas (TMV,
virales modifican PVX, AIMV, CMV,
BDMV) causan
el límite de un aumento en el
exclusión de los límite exclusión
de los
plasmodesmos plasmodesmos.
A y B: se inyectó
C 4 D 5 PVX mMP-GUS.
4 C y D: se inyectó
PVX MP-GUS.
3 3 B y C: detección
de dextrano F de
10 kDa conjugado
a un ligando
fluorescente.
2 A y D: tinción GUS.
Resistencia a virus 2
vegetales mediante
ingeniería genética Tomado de: Angell et al., Virology, 1996.
La MP nativa permite el movimiento del dextrano F de 10 kDa.

La MP mutada (mMP) no lo permite.
Las fotografías que se muestran en la transparencia corresponden a un

trabajo en el que se demostró que la proteína de movimiento (MP) del
Potato virus X (PVX) causa un aumento en el límite de exclusión de los
plasmodesmos. En estos experimentos, se utilizó una versión de PVX
recombinante que portaba el gen reportero uidA (GUS) para
microinyectar células de tricomas de Nicotiana clevelandii. Por lo tanto,
la coloración azul constituye un marcador de la replicación viral. Se
observa que el virus que lleva una versión mutada de la MP (paneles A
y B) permanece confinado a la célula microinyectada (panel A). Si se
inyecta una célula con éste virus junto con dextrano F de 10 Kda de
peso molecular conjugado con un colorante fluorescente, se ve que la
fluorescencia también permanece confinada a la célula inyectada
(panel B) ya que el dextrano no es capaz de moverse a través de los
plasmodesmos debido a su tamaño. Si se realiza el mismo experimento
pero con el virus PVX-GUS que posee un gen no modificado de la MP,
se ve que la fluorescencia asociada al dextrano se mueve a las células
2, 3 y 4 del tricoma (panel C) lo que demuestra que la MP nativa
produce un aumento en el límite de exclusión de los plasmodesmos
que habilita el pasaje del dextrano fluorescente entre células
adyacentes. En el panel D, se detecta actividad GUS en las células
vecinas al sitio de inyección observándose coloración azul sólo en la
célula 2, adyacente al sitio de inyección. Es decir, en este caso, el
21
dextrano conjugado con el colorante fluorescente difundió más allá de las
células en que ocurrió replicación de PVX.
Referencias:
Angell, S.M., Davies, C. and Baulcombe, D.C. Cell-to-cell movement of potato
virus X is associated with a change in the size-exclusion limit of
plasmodesmata in trichome cells of Nicotiana clevelandii. Virology, 216:197-
201, 1996.
21
Resistencia Cinética del desarrollo de síntomas sistémicos en plantas
mediada transgénicas MP30+ y control inoculadas con TMV o TMGMV
por un gen
mutado de la
proteína
de movimiento
de Tobacco
mosaic virus Días después de la inoculación Días después de la inoculación
Días después de la inoculación Días después de la inoculación
Resistencia a virus Tomado de: Lapidot et al., Plant J., 1993.

vegetales mediante Se inocularon plantas transgénicas 3A5-SX-11 que expresan el gen de la proteína de movimiento
ingeniería genética del TMV (p30) con una deleción de los aminoácidos 3 a 5 [3A5-11(+)], plantas transgénicas que no
lo expresan [3A5-11(-)] y plantas control no transgénicas (WT). Los inóculos fueron: A) 0,25 g/ml
TMV; B) 1 g/ml TMV; C) 1,3 g/ml de ARN de TMV; D) 2 g/ml de ARN de TMGMV.
La transparencia muestra una serie de ensayos realizados con plantas

transgénicas que expresan un versión mutada de la proteína de
movimiento (p30) del Tobacco mosaic virus (TMV). Se grafica la
cinética del desarrollo de síntomas sistémicos en plantas inoculadas
con TMV o Tomato mild green mosaic virus (TMGMV). Se observa que
las plantas 3A5-11 (+), que expresan una versión de la proteína p30 de
TMV con una deleción entre los aminoácidos 3 a 5, resistieron a la
inoculación con distintas dosis de viriones del mismo virus o del virus
relacionado. Las plantas 3A5-11 (-), que no expresan esta proteína, no
resultan protegidas, como así tampoco las plantas no transgénicas. Al
igual que el TMV, el TMGMV es miembro de la familia Tobamoviridae.
Se considera que una planta está sistémicamente infectada cuando
exhibe síntomas de mosaico en más de una hoja.
Referencias:
Lapidot, M., Gafny, R., Ding, B., Wolf, S., Lucas, W.J. and Beachy, R.N.
A dysfunctional movement protein of tobacco mosaic virus that partially
modifies the plasmodesmata and limits virus spread in transgenic
plants. The Plant Journal, 4:959-970, 1993.
22
La resistencia Cinética de
derivada infección en
plantas de tabaco
de proteínas transformadas
con un gen
de movimiento mutado de la
es en general proteína de
movimiento de
de amplio 13 kDa del White
clover mosaic
espectro virus (WClMV)
inoculadas con
el mismo virus
o con un virus
diferente.
A: 250 g/ml
de viriones
de WClMV-O;
B: 50 g/ml
de viriones
de WClMV-M;
Resistencia a virus
C: 1 g/ml
vegetales mediante de PVX;
ingeniería genética D: 10 g/ml
de PVX.
Tomado de: Beck et al., PNAS, 1994.
La transparencia muestra el comportamiento de plantas transgénicas

de tabaco que expresan una versión mutada de la proteína movimiento
p13 del White clover mosaic virus (WClMV; en color) o no transgénicas
(en negro) frente a la infección con distintas cepas (O y M) del mismo
virus (paneles A y B) o con distintas dosis de un virus relacionado
(Potato virus X, paneles C y D). Las plantas transgénicas resultaron
protegidas en todos los casos ensayados, aunque la protección
disminuye ligeramente cuando se usan inóculos mayores (panel D).
Esto demuestra que la protección conferida por la proteína de
movimiento del WClMV es de amplio espectro.
Referencias:
Beck, D.L, Van Dolleweerd, C.J., Lough, T.J., Balmori, E., Voot, D.M.,
Andersen, M.T., O'Brien, I.E. and Forster, R.L. Disruption of virus
movement confers broad-spectrum resistance against systemic
infection by plant viruses with a triple gene block. Proceedings of the
National Academy of Sciences U.S.A., 91:10310-1031, 1994.
23
Protección
mediada 1. El fenotipo de resistencia se expresa como:
por proteínas - retardo temporal del desarrollo de síntomas
de movimiento - menor título de virus en los tejidos infectados -
atenuación o desaparición de la sintomatología normal
2. Se requiere la presencia de la proteína de movimiento,

generalmente en forma mutagenizada.
3. Existe correlación entre nivel de resistencia y nivel

de expresión de la proteína de movimiento.
4. Es una protección de rango amplio. Protege frente

a virus del mismo grupo y frente a virus de grupos
no relacionados.
5. La protección es superada por altas dosis de inóculo.
6. Se asume que interfiere con el mecanismo de transporte
Resistencia a virus viral, fundamentalmente sobre el pasaje célula a célula.
vegetales mediante
Es importante remarcar que en los casos reportados de protección

mediada por la expresión de proteínas de movimiento virales, se
demostró que la protección era mediada por la proteína y no por ARN.
Toda la evidencia disponible apunta a que el mecanismo de acción
actuante en estos casos afecta el normal movimiento célula a célula. La
transparencia enumera una serie de características de este tipo de
resistencia.
24
Protección
mediada 1. El fenotipo de resistencia se expresa como cuasi-inmunidad.
por replicasas 2. En muchos casos, no se requiere presencia de la proteína.

virales No existe correlación entre resistencia y nivel de expresión
de la replicasa viral. Puede obtenerse mediante la expresión
del transcripto correspondiente de ARN.
3. Tolera altas dosis de inóculo.
4. Es una protección de rango estrecho. Opera frente al virus

homólogo o cepas estrechamente relacionadas.
Es superada por virus pertenecientes al mismo grupo.
5. Se asume que, en la mayoría de los casos, la resistencia

es mediada por un mecanismo dependiente de ARN
(PVX, CyRSV, PEBV):
- se asocia a baja acumulación del transcripto de replicasa.
- opera sólo cuando existe alta homología.
Resistencia a virus - el transgén puede inactivar genes homólogos
vegetales mediante
ingeniería genética (mecanismo de silenciamiento génico).
En 1990 y 1992 se publicaron dos trabajos pioneros que demostraron

la obtención de plantas de tabaco resistentes a los virus Tobacco
mosaic virus (Golemboski et al.) y Cucumber mosaic virus (CMV)
(Anderson et al.) mediante la expresión del gen de la replicasa viral. En
el primer caso se expresó la replicasa completa y en el segundo caso
se utilizó una replicasa que contenía una mutación que causaba un
corrimiento en el marco de lectura que producía una replicasa trucada
que abarcaba el 75% de la replicasa wild type. Las plantas resultaron
resistentes a la multiplicación viral en el sitio de inoculación y al
movimiento del virus a larga distancia y sólo resultaron protegidas
contra cepas estrechamente relacionadas con la que dio origen al
transgén. Luego de estos trabajos se reportaron casos de resistencia
mediada por replicasas o versiones mutadas de las mismas para Alfalfa
mosaic virus (AMV), Cymbidium ringspot virus (CyRSV), Pea early
browning virus (PEBV), Potato virus Y (PVY), Potato virus X (PVX), etc.
Si la resistencia se debía a la replicasa en sí, se esperaba observar
una correlación entre el nivel de la proteína detectada en las plantas y
la resistencia. Asimismo se esperaba que las plantas transformadas
con versiones no traducibles o mutadas en el sitio activo de la enzima
no fuesen resistentes o tuvieran una resistencia disminuida. Sin
embargo esto se observó solamente en los casos del virus AMV
(Brederode et al.) y CMV (Wintermantel and Zaitlin). En el resto de los
25
casos reportados, se demostró posteriormente que la resistencia dependía de
la expresión del ARNm de la replicasa y no de la proteína; es decir se trataba
de resistencia mediada por ARN (ver transparencias 24 a 41).
Referencias:
Golemboski, D.B., Lomonossoff, G.P. and Zaitlin, M. Plants transformed with a
tobacco mosaic virus nonstructural gene sequence are resistant to the virus.
Proceedings of the National Academy of Science U.S.A., 87:6311-5, 1990.
Anderson, J.M., Palukaitis, P. and Zaitlin, M. A defective replicase gene
induces resistance to cucumber mosaic virus in transgenic tobacco plants.
Proceedings of the National Academy of Science U.S.A., 89:8759-8763, 1992.
Carr, J.P., Gal-On, A., Palukaitis, P. and Zaitlin, M. Replicase-mediated
resistance to cucumber mosaic virus in transgenic plants involves suppression
of both virus replication in the inoculated leaves and long-distance movement.
Virology, 199:439-47, 1994.
Brederode, F,T., Taschner, P.E., Posthumus, E. and Bol, J.F. Replicase-
mediated resistance to alfalfa mosaic virus. Virology, 207:467-474, 1995.
Palukaitis, P. and Zaitlin, M. Replicase-mediated resistance to plant virus
disease. Advanced Virus Research, 48:349-377, 1997.
Wintermantel, W.M., and Zaitlin, M. Transgene translatability increases
effectiveness of replicase-mediated resistance to cucumber mosaic virus.
Journal of General Virology, 81:587-595, 2000.
25
Resistencia derivada del patógeno
mediada por ARN viral
Resistencia a virus
vegetales mediante
26
En algunos
casos no
se requiere
la presencia
de proteína
de cápside
para conferir
resistencia
Tomado de: Lindbo et al., Mol. Plant Microbe Interact., 1992.
B49: Planta no transgénica.

RC#5: Planta transgénica que expresa una versión no
traducible del ARNm de proteína de cápside
de TEV.
AS#3: Planta que expresa el ARNm antisentido de
Resistencia a virus proteína de cápside de TEV.
vegetales mediante
ingeniería genética La expresión de ARN derivado del patógeno
es suficiente para conferir resistencia
En una serie de trabajos que involucraban la transformación de plantas

con los genes de proteínas de cápside o de nucleocápside de distintos
Potyvirus y Tospovirus, se observó que el grado de resistencia obtenido
no dependía de la concentración de proteína expresada y que, en
varios casos, ni siquiera se requería la expresión de la misma. Como
estas observaciones contradecían claramente al modelo de protección
mediada por la proteína de la cápside, ya que se obtenía protección en
ausencia de la proteína, y se podía desarrollar resistencia a partir de
transcriptos no traducibles, se comenzó a acuñar el término “protección
derivada del ARN”, la que se constituyó así en una nueva estrategia
basada en la protección derivada del patógeno. La transparencia
muestra un experimento del primer trabajo donde se observó
resistencia mediada por ARN. En el mismo, las plantas RC#5 expresan
una versión no traducible del gen de la proteína de cápside de un
Potyvirus, el Tobacco etch virus (TEV), y las plantas AS#3 expresan
una versión antisentido del mismo gen. Ambos tipos de plantas
transgénicas son resistentes a la infección por TEV. Como en ambos
casos las plantas producen abundante cantidad de transcriptos de
ARNm, se consideró que la resistencia está mediada por el ARN y no
por la proteína.
27
Referencias:
Lindbo, J.A. and Dougherty, W.G. Pathogen-derived resistance to a potyvirus:
immune and resistant phenotypes in transgenic tobacco expressing altered
forms of a potyvirus coat protein nucleotide sequence. Molecular Plant-
Microbe Interactions, 5:144-153, 1992.
27
Distintos
fenotipos A B
observados
en plantas
de tabaco
infectadas
con Potato C D
virus Y
Tomado de: Waterhouse et al., Nature, 2001.
A: Susceptibilidad: planta no transgénica infectada

con PVY.
B: Inmunidad: planta transgénica que expresa ARNdc de
Resistencia a virus
vegetales mediante PVY infectada con PVY.
ingeniería genética C y D: Planta transgénica mostrando el fenotipo de
resistencia/recuperación.
La transparencia ilustra los distintos fenotipos observados en la

resistencia mediada por ARN. En A se muestra una planta de tabaco no
transgénica susceptible infectada con Potato virus Y (PVY). Se observa
un mosaico clorótico uniformemente distribuido sobre las hojas. La foto
B muestra una planta de tabaco transgénica que expresa ARNdc
derivado del genoma del virus PVY que muestra el fenotipo de
inmunidad. No se observan síntomas de ningún tipo. Las fotos C y D
muestran hojas de una planta transgénica que expresa ARNdc derivado
del genoma del virus PVY y que fueron desafiadas con el mismo virus.
La hoja que se muestra en D es una hoja más joven que la mostrada
en C. Se observa el fenotipo denominado de resistencia/recuperación,
consistente en una infección inicial y, a medida de que la planta crece,
se observa una desaparición progresiva de los síntomas en las hojas
más jóvenes. Finalmente, los síntomas desaparecen en las hojas
superiores.
Referencias:
Waterhouse, P.M., Wang, M.B. and Lough, T. Gene silencing as an
adaptive defence against viruses Nature, 411:834-842, 2001.
28
Fenotipo de recuperación en plantas de tabaco transformadas
con el gen de la proteína de cápside del Tobacco etch virus
Tomado de: Lindbo et al., Plant Cell, 1993.

A: CP de TEV; B: ARN de TEV;
1, 2, 3: hojas inferiores, medias y superiores de C: ARN de actina.
la planta CP+ (arriba) o CP- (abajo). 1: CP- infectada con TEV; 2: CP-
no infectada; 3, 5, 7: plantas CP+
no infectadas con TEV; 4, 6, 8:
plantas CP+ recuperadas luego
de la infección.
La transparencia muestra experimentos realizados con plantas de tabaco

que expresan la proteína de cápside del Tobacco etch virus (TEV) en los
que se observa el fenotipo de recuperación. En el panel izquierdo,
síntomas inducidos por TEV en plantas de tabaco transgénicas (foto
superior) y sin transformar (foto inferior). Las hojas 1, 2, 3 corresponden a
la parte inferior, media y superior de la planta respectivamente. Las
plantas CP+ muestran el fenotipo de recuperación: las hojas más jóvenes
tienen cada vez menos síntomas. El panel derecho muestra un análisis
de los niveles de la proteína de cápside de TEV (A) y del ARN
correspondiente (B), en extractos de hojas de plantas que presentaban el
fenotipo de recuperación (asintomáticas) o no transgénicas no infectadas
con el virus. Se observa que las hojas de las plantas CP+ recuperadas
(calles 4,6,8) no acumulan ARN derivado del transgén.
Referencias:
Lindbo, J.A., Silva-Rosales, L., Proebsting, W.M. and Dougherty, W.G.
Induction of a highly specific antiviral state in transgenic plants:
implications for regulation of gene expression and virus resistance. The
Plant Cell, 5(12):1749-1759, 1993.
29
Protección
mediada por • Silenciamiento génico transcripcional (TGS):
silenciamiento
Ausencia de expresión del gen de interés debido a
génico que ocurre metilación en la región promotora, lo que
impide su transcripción normal. Se desencadena por
interacción entre varias copias de un transgén que
tienen homología en sus regiones promotoras.
• Silenciamiento génico postranscripcional

(PTGS):
Ausencia de expresión del gen de interés debido a
una degradación inducible y específica del transcripto
de ARNm. Se desencadena por homología en la
región transcripcional entre los genes que interactúan,
Resistencia a virus los que algunas veces puede metilarse.
vegetales mediante
En la transparencia 6 se explicó que puede obtenerse resistencia mediada

por ARN mediante el desencadenamiento de silenciamiento génico o por la
expresión de ARN complementario al ARNm del gen cuya expresión se
desea anular (ARN antisentido). Según se desencadene antes o después
de la transcripción, el silenciamiento génico puede ser transcripcional
(TGS; transcriptional gene silencing) o postranscripcional (PTGS; post-
transcriptional gene silencing). La transparencia presenta las definiciones
actuales de TGS y de PTGS. En las restantes transparencias de este
bloque se profundizará la descripción del fenómeno de PTGS, y no se
discutirán el ARN antisentido o el TGS.
Referencias:
Matzke M., Matzke A., Pruss G. and Vance V. RNA-based silencing
strategies in plants. Current Opinion in Genetics and Development.
11:221–227, 2001.
Paszkowski J. and Whitham S. Gene silencing and DNA methylation
processes. Current Opinion in Plant Biology, 4:123–129, 2001.
30
Iniciación del PTGS de acuerdo con el modelo del umbral
Tomado de: Waterhouse et al.,Trends Plant Sci, 1999.
Se requiere un nivel umbral de ARN que contenga secuencias

virales para iniciar la respuesta de silenciamiento.
A pesar de que algunas plantas transgénicas resultaban resistentes, el

silenciamiento no era un fenómeno consistente, ya que no todas las
plantas que expresaban una determinada secuencia viral respondían al
mismo fenotipo. De hecho, la mayoría de las plantas transformadas con
una secuencia viral eran susceptibles al virus en cuestión, algunas
mostraban el fenotipo de recuperación y sólo unas pocas eran
resistentes desde el inicio (inmunidad). Los trabajos pioneros
demostraron que el nivel de resistencia guardaba una estrecha relación
con los niveles de transcriptos del transgén y que, normalmente, esta
relación dependía del número de copias del mismo integrado al
genoma de la planta. Uno de los primeros modelos que intentó explicar
estas observaciones fue el modelo del umbral. Este modelo postulaba
que se requiere un nivel umbral de ARN homólogo al del virus para
iniciar la respuesta de silenciamiento postranscripcional. En la
transparencia se muestra una representación esquemática de las
asunciones de este modelo. Se representan los niveles de ARN a ser
silenciado en tres situaciones distintas. Las plantas que contienen entre
3 y 8 transgenes (A) superan el umbral de transcripción requerido para
desencadenar el silenciamiento y muestran resistencia. Algunas plantas
con 1 ó 2 transgenes sólo exceden este nivel en presencia del ARN
viral (B) y la resistencia se desarrolla tiempo después de la infección.
Este caso permitiría explicar el fenotipo de recuperación. Otras plantas
31
con 1 ó 2 transgenes no expresan suficiente ARN para superar el umbral aún
en presencia del virus (C) y son por lo tanto susceptibles.
Referencias:
Waterhouse P.M., Smith N.A. and Wang M. Virus resistance and gene
silencing: killing the messenger. Trends in Plant Science, 4(11):452-457, 1999.
31
Iniciación
del PTGS
según el
modelo del ARN
aberrante
Resistencia a virus
vegetales mediante
Tomado de: Voinnet, Trends Genet., 2001.
La transparencia muestra un modelo de los mecanismos operantes en

el PTGS como respuesta a una infección viral en plantas. Durante la
replicación de virus a ADN o durante la transcripción de transgenes en
copia única se producen intermediarios de ARNsc aberrantes (por
ejemplo truncados) que son convertidos en ARNdc por un sistema de
vigilancia y amplificación mediado por una ARN polimerasa. Los
transgenes que contienen secuencias repetidas invertidas producen
ARNdc independientemente de éste sistema por apareamiento
intramolecular. Los virus con genoma de ARN producen ARNdc como
parte de su ciclo de replicación. Independientemente de cómo se activa
el sistema, se produce una acumulación de ARNdc, que a su vez es
procesado dando lugar a fragmentos de ARN pequeños de 21 a 23 nt
que se incorporan a un complejo que degrada el ARN de manera
específica de secuencia llamado RISC (por RNA Induced Silencing
Complex).
Referencias:
Voinnet O. Trends in Genetics, 17(8):449-459, 2001.
32
Clivaje de ARNsc dirigido por ARNdc en PTGS
Las proteínas análogas a

dicer se unen a los extremos
del ARNdc (A, B).
El complejo cliva al ARNdc

liberando fragmentos de
21 pb. El ciclo se repite
a partir de los extremos
libres (C) hasta degradar
completamente el ARN.
El complejo adquiere nuevos

componentes (elipse verde),
desnaturaliza el ARNdc, y se
una a una de las hebras. El
fragmento unido sirve de
templado para hibridar con
el ARN blanco homólogo (d),
el que es clivado en la mitad
de la secuencia de 21 nt (D, E).
Tomado de: Waterhouse et al., Nature, 2001.
La transparencia ilustra el mecanismo propuesto para explicar la

degradación de ARN específica de secuencia y dirigida por ARNdc en
el fenómeno de silenciamiento génico postranscripcional (PTGS). Dicer
es una proteína de Drosophila que intervienen en el fenómeno de
interferencia mediada por ARN (que es análogo al PTGS en plantas) y
se representan como elipses rojas y azules. Su actividad produce el
clivaje del ARN blanco dando lugar a fragmentos de 21 pb llamados
“ARNs pequeños” (21 pb corresponden a dos giros de la doble hélice
del ARN) (c). En d), el complejo que contiene parte de la hebra de
polaridad negativa (anaranjado), es capaz de dirigir la degradación de
la hebra de polaridad positiva (amarilla). En e) el complejo que contiene
parte de la hebra de polaridad positiva es capaz de dirigir la
degradación de la hebra de polaridad negativa. De esta forma, ambas
hebras resultan específicamente degradadas. Se postula que los pasos
d) y e) ocurren en el citoplasma.
Referencias:
Waterhouse, P.M., Wang, M.B. and Lough, T. Gene silencing as an
adaptive defense against viruses. Nature, 411:834-842, 2001.
33
El silenciamiento se transmite sistémicamente
Tomado de: Voinnet, Trends Genet., 2001.
Al avanzar la investigación sobre el silenciamiento, se observó que, si

se injerta un tallo de una planta no silenciada sobre una base
silenciada, el tallo injertado se silencia progresivamente. Esto demostró
la existencia de una señal de silenciamiento que se propaga por la
planta de célula a célula vía plasmodesmos y a larga distancia por el
floema. La señal es también específica de secuencia, ya que el tallo
injertado sólo se silenciaba si expresaba un transgén homólogo al
transgén presente en la base silenciada. La transparencia muestra dos
ejemplos de transmisión sistémica del silenciamiento. En el panel de la
izquierda, se muestra una planta transgénica para el gen reportero
GFP (que codifica la proteína de fluorescencia verde, Green
Fluorescent Protein), la que se visualiza de color verde amarillento
cuando se la ilumina con luz ultravioleta. Cuando esta planta es
bombardeada con un plásmido de ADN que expresa el mismo gen bajo
un promotor fuerte, se desencadena el fenómeno de PTGS y se
silencia el transgén GFP. Las zonas silenciadas se ven rojas a la luz
ultravioleta. La foto muestra las hojas inferiores silenciadas y el
establecimiento paulatino del silenciamiento en las nervaduras de las
hojas superiores. Eventualmente, el silenciamiento del gen gfp se
establece en todos los tejidos de la planta.
34
Referencias:
Voinnet, O. RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends
in Genetics, 17:449-459, 2001.
34
El PTGS se puede inducir en plantas transgénicas
por expresión de ARNdc
Tomado de: Smith et al., Nature, 2000.
El mayor conocimiento sobre los mecanismos que regulan el

silenciamiento génico postranscripcional (PTGS) permitió utilizar este
fenómeno con fines biotecnológicos. Debido a que la formación del
ARNdc juega un papel principal en su desencadenamiento, varios
autores procuraron sintetizar moléculas de este tipo in planta para hacer
más eficiente este proceso. Existen varias formas de lograr este
objetivo. En la transparencia se comparan las eficiencias de distintas
construcciones genéticas para desencadenar el PTGS en una planta
transgénica. En general, cualquier construcción que de lugar a
transcriptos que contienen estructuras de doble cadena son inductores
eficientes de PTGS (comparar las dos primeras construcciones con las
demás). Las construcciones más eficientes fueron las que contienen la
secuencia a silenciar en orientación sentido y antisentido con un intrón
intercalado o una secuencia cualquiera entre ambas. Esta disposición de
secuencias da lugar a transcriptos que se pliegan sobre sí mismos en
forma de horquilla (ARNhp). En el caso de intercalarse un intrón, este se
procesa dentro del núcleo de la célula transformada dando lugar a
ARNdc de extremos protruyentes cortos. Se ha reportado la
construcción del vector denominado HANNIBAL, que permite clonar
cualquier secuencia en sentido y antisentido para obtener transcriptos de
este tipo. En el esquema inferior se muestra una construcción basada
en este vector diseñada para silenciar una secuencia del virus PVY, y
obtener de ésta forma resistencia al virus.
35
Referencias:
Smith, N.A., Singh, S.P., Wang, M.B., Stoutjesdijk, P.A., Green, A.G. and
Waterhouse, P.M. Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature,
407:319-320, 2000.
Wesley, S.V., Helliwell, C.A., Smith, N.A., Wang, M.B., Rouse, D.T., Liu, Q.,
Gooding, P.S., Singh, S.P., Abbott, D., Stoutjesdijk, P.A., Robinson, S.P.,
Gleave, A.P., Green, A.G. and Waterhouse, P.M. Construct design for efficient,
effective and high-throughput gene silencing in plants. The Plant Journal,
27:581-590, 2001.
35
El sinergismo
es un fenómeno
frecuente en las
infecciones
virales naturales
• Sinergismo
La interacción de dos virus en el mismo huésped

induce un aumento dramático en la intensidad de
los síntomas producidos y en la acumulación de
uno de los dos virus (ejemplo, sinergismo entre
Potato virus X y Potato virus Y).
Resistencia a virus
vegetales mediante
El sinergismo entre distintas especies de virus de plantas es un

fenómeno común que ha sido descripto en numerosos casos por los
fitopatólogos. El fenómeno es específico para determinadas especies
de virus y la base molecular del mismo era desconocida hasta hace no
mucho tiempo. Los estudios sobre los genes virales involucrados en la
virulencia han permitido echar nueva luz sobre estas interacciones.
Como se describe en las siguientes transparencias, la expresión del
sinergismo está relacionada con la supresión del silenciamiento génico.
36
Las plantas
transgénicas P1/HC-Pro es una proteína supresora del silenciamiento
que expresan A B
la proteína
P1/HC-Pro de
Tobacco etch
virus son más
susceptibles a
Cucumber mosaic
virus y Tobacco C D
mosaic virus
Tomado de: Pruss,et al., Plant Cell, 1997.

Resistencia a virus
vegetales mediante A y C: plantas transformadas con el vector vacío.
ingeniería genética B y D: plantas transformadas con el gen P1/Hc-Pro de TEV.
Las plantas fueron inoculadas con CMV (A y B) o TMV (C y D).
La expresión de proteínas virales en plantas transgénicas permitió

establecer las bases moleculares del fenómeno de sinergismo. Las
fotos que se muestran en la transparencia ilustran el incremento de
patogenicidad del Cucumber mosaic virus (CMV) y del Tobacco mosaic
virus (TMV) sobre plantas de tabaco que expresan la región P1/HC-Pro
del genoma del Potato virus Y (PVY). Era bien conocido que tanto CMV
como TMV (virus no relacionados entre sí) eran capaces de producir en
tabaco infecciones sinérgicas con PVY. Por otra parte, se demostró que
la región P1/HC-Pro de PVY codifica una proteína supresora del
silenciamiento génico postranscripcional (PTGS). Dado que el PTGS es
normalmente desencadenado por las infecciones virales, la presencia
de un supresor del silenciamiento (en este caso codificado por el
transgén) provoca un aumento en la severidad de los síntomas
provocados por CMV (panel B) y TMV (panel D). En estas plantas,
CMV y TMV se acumulan más allá de los límites normales en las
plantas no transgénicas. La presencia de proteínas virales supresoras
del PTGS correlacionadas con un aumento de los síntomas es un
argumento adicional sobre el significado biológico del PTGS. Parece
razonable que, si éste constituye un mecanismos de defensa antiviral,
los virus hayan desarrollado mecanismos para desbordarlo durante su
co-evolución con los hospedantes.
37
Referencias:
Pruss, G., Ge, X., Shi, X.M., Carrington, J.C. and Bowman Vance, V. Plant
viral synergism: the potyviral genome encodes a broad-range pathogenicity
enhancer that transactivates replication of heterologous viruses. The Plant
Cell, 9:859-868, 1997.
37
38
Trends in Plant Science May 2011, Vol. 16, No. 5
Figure 1. Current model of antiviral RNA silencing in plants and its

suppression by virus-encoded silencing suppressors. RNA silencing is initiated
by the recognition of viral dsRNAs or partially ds hairpin RNAs, which are
processed to vsiRNAs by dsRNA-specific RNases called DCLs (DCL2/3/4). In
the next step, HSP90-activated AGO1/7 [40] are loaded with vsiRNA, thereby
forming large RISCs, which probably also incorporate other unidentified
proteins (e.g. GW/WG motifs containing AGO interactor proteins).
Afterwards, the vsiRNA-loaded RISC targets viral RNAs by slicing or
translational arrest. Secondary vsiRNAs are produced in an amplification loop
through the actions of RDRs and their cofactors (SGS3 and SD5) [90]. Viral-
silencing suppressors can disrupt these pathways at multiple points, thereby
preventing the assembly of different effectors or inhibiting their actions. The
points at which certain VSRs (i.e. P14, P38, V2, 2b, P19, HC-Pro, P21, P0 and
P1) interact with the silencing pathways are depicted
39
P19 secuestra los vsiRNA e inhibe producción de AGO1
Trends in Plant Science May 2011, Vol. 16, No. 5
Figure 2. Model for the regulation of the level of AGO1 mediated by P19-
induced miR168. The virus infection triggers the enhanced expression of
AGO1 mRNA and, consequently, the AGO1 proteins as a part of the host
defence respond. The enhanced AGO1 level facilitates the formation of
vsiRNA-loaded RISCs. However, when the P19 VSR is expressed by the virus
it induces the overexpression of miR168, which presumably loads into AGO10
[95,109] and arrests the translation AGO1 mRNA. Thus, P19 VSR, in addition
to its siRNA sequestering ability, ensures that the loading of viral siRNAs onto
AGO1 is efficiently inhibited, thereby allowing successful systemic infection
40
La supresión del silenciamiento es una estrategia usada
por diversos virus de plantas a ARN y ADN
Grupo de virus Virus Supresión PTGS Proteína Otras funciones conocidas
Comovirus CpMV 5/6 ? -
Cucumovirus CMV 20/20 2b Movimiento de larga distancia específico

de huésped.
Geminivirus ACMV 6/6 AC2 Transactivador de la expresión génica.
Potexvirus NMV 8/9 ? -

NVX 7/9 ? -
VMV 7/9 ? -
Potyvirus PVY 10/10 HcPro Amplificación del genoma; sinergismo

viral; movimiento de larga distancia;
transmisión por áfidos; procesamiento
de la poliproteína.
TEV 10/10 HcPro Idem anterior.
Tobamovirus TMV 4/6 ? -
Tobravirus TRV 7/9 ? -
Tombusvirus TBSV 7/9 19K Determinante de síntomas y movimiento

específico de huésped.
Tomado de: Voinnet, et al., PNAS, 1999.
Los reportes sobre la presencia de proteínas supresoras en virus de

plantas se multiplicaron rápidamente. En general las proteínas a las
que se atribuyó actividad supresora habían sido previamente
caracterizadas como proteínas determinantes de síntomas y/o
responsables del movimiento viral. La transparencia enumera varias de
estas proteínas junto con las funciones ya conocidas. Más
recientemente, se describió la presencia de una proteína con actividad
supresora de silenciamiento en un virus animal.
Referencias:
Voinnet, O. Pinto, Y.M. and Baulcombe, D.C. Suppression of gene
silencing: a general strategy used by diverse DNA and RNA viruses of
plants. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A.,
96:14147-14152, 1999.
Li, H., Li, W.X. and Ding, S.W. Induction and suppression of RNA
silencing by an animal virus Science, 296:1219-1321, 2002.
41
Las proteínas • P1/HC-Pro de TEV ó PVY (potyvirus, ARNsc)
virales Previamente esta proteína había sido reportada como
determinante de patogenicidad, en el sinergismo
supresoras del y en el movimiento a larga distancia. Previene la degradación
silenciamiento del ARN pero no elimina la señal móvil que propaga el
silenciamiento.
actúan a
• 2b de CMV (cucumovirus, ARNsc)
distintos niveles Previamente esta proteína había sido reportada como
determinante de patogenicidad y como responsable
del movimiento viral a distancia. Solo previene el silenciamiento
en hojas jóvenes y cuando se localiza en el núcleo.
• p25 de PVX (potexvirus, ARNsc)
Es la proteína responsable del movimiento viral en las plantas
infectadas. Interfiere con la señal de propagación sistémica.
• p19 de TBSV (tombusvirus, ARNsc)
Previamente esta proteína había sido reportada como
determinante de síntomas y de especificidad de huésped.
Solo previene el silenciamiento en hojas jóvenes y sólo
en y alrededor de las venas.
Resistencia a virus
vegetales mediante • Ac2 de ACMV (geminivirus, ADNsc)
Previamente esta proteína había sido reportada como
determinante de síntomas. Suprime el mantenimiento del PTGS.
La transparencia describe las proteínas supresoras de silenciamiento

que han sido más estudiadas. Una conclusión interesante de estos
estudios es que la acción supresora se ejerce a niveles disímiles en la
ruta de que conduce al silenciamiento. Así, algunas proteínas
supresoras tienen actividad a nivel local (en la etapa de establecimiento
del silenciamiento) y otras a nivel de la señal sistémica (propagación
del silenciamiento). Los supresores virales son una poderosa
herramienta para: a) disecar los pasos de inicio, propagación y
establecimiento del silenciamiento; b) sobrexpresar genes de interés en
plantas transgénicas o en sistemas de expresión transitoria; c) estudios
de genómica funcional. En algunos casos, para entender el
funcionamiento de algunos genes, es más informativo sobrexpresarlos
(utilizando supresores de silenciamiento) que silenciarlos.
Referencias:
Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P. and Baulcombe, D. An enhanced
transient expression system in plants based on suppression of gene
silencing by the p19 protein of Tomato bushy stunt virus. The Plant
Journal, 33:949-956, 2003.
42
El PTGS es
un mecanismo
de defensa 1. La infección natural de virus desencadena
el silenciamiento.
frente a las
infecciones 2 La replicación viral puede ser suprimida
virales si se induce el silenciamiento experimentalmente.
3 Los virus de plantas codifican para una gran

variedad de supresores de silenciamiento.
4. Algunos componentes que participan del

silenciamiento son regulados positivamente
durante la infección por virus y viroides.
5 Las mutaciones en genes que codifican

componentes que participan del silenciamiento
inducen mayor susceptibilidad a las infecciones
Resistencia a virus
vegetales mediante virales.
La idea de que el PTGS evolucionó como un sistema de defensa

antiviral en plantas inicialmente surgió de la observación de que los
virus con genoma de ARN que replican en el citoplasma son tanto
inductores (VIGS; transparencia 35 y punto 1 de ésta transparencia)
como blanco del silenciamiento. A medida que se profundizó en el
estudio del mecanismo responsable del PTGS, se encontraron más
evidencias que apoyan esta hipótesis que se enumeran en ésta
diapositiva. Es importante destacar la habilidad de este sistema de
defensa para adaptarse a potencialmente cualquier virus, dado que su
especificidad no está determinada genéticamente, sino que, como se
explicó en la transparencia 30, es desencadenada por la secuencia de
un dado virus invasor.
43
Ejemplos de resistencia a virus de
plantas por ingeniería genética
Resistencia a virus
vegetales mediante
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44
Ensayos de
campo de
papaya
resistente
al Papaya
ringspot virus
Tomada del sitio http://www.apsnet.org/education/feature/papaya/Top.htm
Resistencia a virus
vegetales mediante
El virus Papaya ringspot virus (PRSV) causa una enfermedad en las

plantas de papaya que constituye el principal factor limitante en la
producción de esta fruta. El virus pertenece al género Potyvirus y es
transmitido por áfidos. Fue descubierto en Hawai en la década del 40 y
llegó a casi eliminar la producción de papaya de esta región. Hacia
fines de los 80 el grupo dirigido por el Dr. Gonsalves, del Departamento
de Patología Vegetal de la Universidad de Cornell, EEUU, comenzó a
trabajar en el desarrollo de una estrategia de protección mediada por
secuencias derivadas del patógeno. Con la colaboración del Dr.
Sanford de la misma universidad, el grupo estableció un protocolo de
transformación de papaya por bombardeo de embriones de los
cultivares de papaya comerciales. En 1991 se identificaron las primeras
líneas transgénicas que expresaban el gen de cápside del PRSV y al
año siguiente se realizó una primera evaluación a campo cuyos
resultados se muestran en la transparencia. Las fotos muestran el
comienzo (panel superior) y el fin de un ensayo, varios meses después
(panel inferior) . Las plantas transgénicas y control están
entremezcladas en la misma parcela. Las plantas que sobreviven son
las correspondientes a la líneas transgénicas. En 1994, se realizó una
evaluación a gran escala que demostró que las plantas transgénicas no
se infectaban con PRSV y producían frutas de la misma calidad que las
plantas no infectadas. Finalmente, en 1998 se autorizó la
45
comercialización de éstas plantas transgénicas en EEUU.
Referencias:
Chiang, C.H., Wang, J.J., Jan, F.J., Yeh, S.D. and Gonsalves, D. Comparative
reactions of recombinant papaya ringspot viruses with chimeric coat protein
(CP) genes and wild-type viruses on CP-transgenic papaya. Journal of
General Virology, 82:2827-2836, 2001.
Gonsalves, D. Coat protein transgenic papaya: "acquired" immunity for
controlling papaya ringspot virus. Current Topics in Microbiology and
Immunology, 266:73-83, 2002.
45
Ensayos de
campo
zapallitos
resistentes
a ZYMV,
WMV
y CMV
cultivars of summer squash and papaya showing resistance to specific RNA

viruses have been marketed in the USA since the late
1990s, with local market shares of 20–50%
Squash expressing the CP gene of ZYMV, WMV, and CMV is highly resistant
to mechanical inoculation with a mixture of these three viruses
(upper right), whereas control plants inoculated with only one of these three
viruses are readily infected and exhibit severe symptoms (left and
lower right). (b) Comparative fruit yield of healthy virus-resistant transgenic
crookneck squash (back) and virus-infected nontransgenic
squash ( front). (c) Resistance of transgenic squash to aphid-mediated virus
transmission (center and right rows) from border virus source plants
(left row) under conditions where no insecticide was applied.
Plants of line ZW-20 express the CP gene of ZYMV (Zucchini yellow mosaic
virus) and WMV (Watermelon mosaic virus) and are resistant to these two
46
viruses (7, 15, 28, 56, 97). Plants of line CZW-3 express the CP genes of CMV
(Cucumber mosaic virus), ZYMV, and WMV, and are resistant to these three viruses
(31,
Transgenic squash CZW-3 expresses the neomycin phosphotransferase II (nptII) gene

and the coat protein (CP) genes of Cucumber mosaic virus (CMV), Zucchini yellow
mosaic virus (ZYMV), and Watermelon mosaic virus (WMV); thereby, it is resistant
to these three aphid-borne viruses.
46
Resistencia a Bombardeo de hojas de plantas no transgénicas (NT), o
Potato leaf roll transgénicas para la replicasa del PLRV (ORF 2b)
resistentes (R) o susceptibles (S) al mismo virus con las
virus en siguientes construcciones:
Solanum 35S-GUS 2x35S uid-A t-nos
A
tuberosum
mediada B 35S-GUS-rep 2x35S uid-A ORF2b t-nos
por el gen de
replicasa viral
A
Resistencia a virus Ken (NT) CE1 (R) CF1 (S)

vegetales mediante
ingeniería genética Las plantas resistentes (R) no expresan GUS: la protección se debe
a la presencia del silenciamiento génico postranscripcional
Tomado de: Vazquez et al., Arch. Virol., 2001.
El Potato leaf roll virus (PLRV) es el agente causal de una importante

enfermedad en papa. La transparencia muestra un ensayo realizado
para demostrar la presencia del silenciamiento génico postranscripcional
(PTGS) en tejidos de plantas transformadas con la replicasa de PLRV.
La construcción A contiene al gen uidA y da lugar a un transcripto que
codifica para la enzima beta glucuronidasa (GUS). Cuando se
transforman transitoriamente hojas de plantas no transgénicas (NT),
transgénicas resistentes (R) o susceptibles (S) a PLRV con la
construcción A por biobalística, se ve igual cantidad de puntos azules
debido a la expresión de GUS (la enzima produce un producto azul
cuando se incuba con el sustrato cromogénico). La construcción B da
lugar a un transcripto de fusión codificado por el gen uidA y el gen de la
replicasa de PLRV (ORF 2b). Cuando se utiliza ésta construcción para
bombardear hojas de plantas transgénicas que han desarrollado el
fenómeno de silenciamiento (CE1) no se ven puntos azules. Esto se
debe a la degradación del transcripto de fusión por el mecanismo de
PTGS, ya que éste contiene secuencias blanco de la degradación
específica (el ORF 2b presente en las plantas transgénicas). Se asume
que las plantas en que el silenciamiento sea más fuerte mostrarán
mayores niveles de resistencia a dicho virus. Las plantas no
transgénicas o transgénicas susceptibles muestran gran cantidad de
puntos azules. El trabajo fue realizado en el Instituto Nacional de
47
Tecnología Agropecuaria (INTA) de Argentina.
Referencias:
Vazquez, C., Asurmendi, S. and Hopp, H.E. Transgenic resistance in potato
plants expressing potato leaf roll virus (PLRV) replicase gene sequences is
RNA-mediated and suggests the involvement of post-transcriptional gene
silencing. Archives of Virology, 146:1337-1353, 2001.
47
Resistencia mediada por el gen de la nucleocápside
del Rice hoja blanca virus
A: Enfermedad causada
Líneas transgénicas
por el RHBV al Control Cica 8
no transgénico,
Cica 8 no transgénico
B: A la izquierda planta Cica 8
no transgénica inoculada
y enferma, centro y derecha
plantas transgénicas inoculadas y
A B no sintomáticas.
Línea transgénica (A3-49-60-12-3-3) Reacción después de 90 de inoculación C: Síntomas típicos

Línea trasngénica de la enfermedad del RHBV en
Resistente
(nivel 1) Cica 8 (abajo) y reacción
hipersensible en la línea
transgénica A3-49-60-12-3-3
(arriba).
D: Evaluación en campo del arroz

C Control Cica 8 no transgénica
Susceptible (nivel 9) D transgénico resistente al RHBV.
- Se observan fenotipos de resistencia y de recuperación en
plantas transgénicas de arroz.
- No se detecta ARN derivado del transgén por ensayo de Northern.
Se detecta transcripción por RT-PCR.
- Se sugieren un tipo de resistencia mediado por ARN (PTGS).
Tomado de: Lentini Z. et al., Theor Appl Genet., 2003 y
- Se evaluaron las características agronómicas por 4 generaciones. http://www.ciat.cgiar.org/biotechnology/crops_rice.htm
El Rice hoja blanca virus (RHBV) causa la enfermedad viral de mayor

importancia de arroz en América del Sur, Central y el Caribe. La
transparencia ilustra un trabajo desarrollado para obtener plantas de
arroz resistentes contra este virus. Las plantas transgénicas para el
gen de la nucleocápside viral presentaron una reducción significativa
del desarrollo de los síntomas característicos de la enfermedad. Las
plantas transgénicas presentaron lesiones típicas de la reacción
hipersensible (con necrosis alrededor de el sitio de inoculación) y/o el
fenotipo de recuperación (emergencia de hojas nuevas libres de
síntomas). Las plantas transgénicas expresaban el transcripto en muy
bajos niveles, y no se detectó la proteína de la nucleocápside viral. En
conjunto los resultados sugieren que se trata de una resistencia
mediada por el ARN viral del tipo de PTGS. El trabajo fue realizado en
el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) de Colombia.
Referencias:
Lentini, Z. Lozano, I., Tabares, E., Fory, L., Dominguez, J., Cuervo, M.
and Calvert, L. Expression and inheritance of hypersensitive resistance
to Rice hoja blanca virus mediated by the viral nucleocapsid protein
gene in transgenic rice. Theoretical and Applied Genetics, 106:1018-
1026, 2003.
48
Solanum Ensayos de resistencia a Potato virus X en plantas que
tuberosum expresan el gen de la proteína de cápside del mismo virus
resistente al
ELISA (Abs a 405 nm)

SP. INF.
Potato virus X 1,60
1,40 CX34
por expresión 1,20
1,00 CX71
de la proteína 0,80
0,60
CX64
de cápside 0,40
0,20
SL94
CX28
0,00
SP. MO
Días posteriores a la inoculación (dpi)
Las plantas que expresan

el gen de cápside de PVX
resultaron protegidas contra
Resistencia a virus la infección.
vegetales mediante
Cortesía Dr. F. Bravo-Almonacid.
La transparencia muestra un ensayo de evaluación de resistencia en

plantas transgénicas de papa del cultivar Spunta que expresan en gen de
la cápside del Potato virus X (PVX). El ensayo se hizo en cámara de cría
bajo condiciones controladas. Las plantas fueron mecánicamente
inoculadas con PVX y se midió la acumulación del virus a distintos días
post-infección mediante ensayos de ELISA. Se observó que, mientras la
cinética de infección en las plantas controles era normal, en las
transgénicas se evidenciaban distintos niveles de resistencia. En algunos
casos, las plantas se comportaron como inmunes al virus. La resistencia
descripta responde al modelo de resistencia mediada por la proteína de la
cápside viral. El trabajo fue realizado en el Instituto de Investigaciones en
Ingeniería Genética y Biología Molecular (INGEBI-CONICET) de
Argentina.
SP.INF = planta de papa no transformada inoculada con PVX.

CX34/71/64/28 y SL94 = distintas líneas de plantas transgénicas inoculadas con PVX.
SP.MO = planta de papa sin inocular con PVX.
49
Solanum
tuberosum
(spunta)
resistente al
0 dpi
Potato virus Y
por expresión
de la proteína
de cápside
20 dpi
Resistencia a virus
vegetales mediante
35 dpi
Infección con PVY en cámara de crecimiento a diferentes días luego de haber

sido infectadas mecánicamente con el virus
De izquierda a derecha se muestran dos plantas transgénicas y una planta
control.
50
Solanum
tuberosum
(baronesa)
resistente al
Potato virus Y
por expresión
de la proteína
de cápside
Resistencia a virus
vegetales mediante
51
Ensayos de campo, estudios bioquímicos y moleculares en
plantas transgénicas de papa de la variedad Spunta, con el fin de
liberar al mercado un evento transgénico resistente al virus PVY
FBA et al Transgenic Research 2012
52
Potato virus Y (PVY) - Potyvirus
▪ Es uno de los virus más importantes y de mayor prevalencia que afectan al cultivo de la papa. Se han descrito
razas de PVY que pueden causar necrosis en hojas y en tubérculos
▪ Es transmitido por áfidos (Myzus persicae) de manera no persistente y también puede transmitirse
mecánicamente a través de la maquinaria, las herramientas, etc.
S. tuberosum cv. Spunta: > 60%
53
Estrategias para desarrollar resistencia a virus en plantas
Uso de genes de resistencia
Resistencia derivada del patógeno
Silenciamiento génico postranscripcional (PTGS)
54
Construcción utilizada y transformación
RB pNOS nptII tNOS p35S CP PVY tNOS LB
400
55
Búsqueda de resistencia a PVY
(infección mecánica en invernadero)
260 líneas
155 líneas
105 líneas
Alta presión de virus

ELISA para monitorear titulo de virus
40% de infección promedio en controles de Spunta
300 clones probados
4 a 8 plantas por clon
Sometidos a infección artificial: alta presión de virus
56
Búsqueda de resistencia a PVY: ensayos de campo
57
Screening for PVY: resistance field trials
Field trial location and year number of Plant Infection Number of

lines screened number/line Rate (%) infected
plants
General Belgrano. Spring 1998 10 5 14.5 3
General Belgrano. Fall 1999 51 4 14.5 14
Colonia Tirolesa. Spring 1999 67 13 24.1 54
Colonia Tirolesa. Fall 2000 72 5 31.8 38
Colonia Tirolesa. Spring 2000 30 5 5.6 6
Summary of the field trial screening procedure used to identify

PVY-resistant potato lines during 1998-2001
58
Screening for PVY resistance field trials: SY230, SY233
Field trial SY230 & SY233 Plant number/line Number of Infection

Infected Rate (%)
plants
SY230 154 0
SY233 441 1
SPUNTA 661 560 85
SY230 and SY233 were chosen for further characterization and

possible commercial release
Two of the PVY-resistant lines showing a consistant behaviour in all field trials
(SY230 and SY233) were multiplied and tested in a larger field assay. In this trial, 154
out of 154 SY230 plants were found to be virus-free, and only one out of 441 SY233
plants was found to contain detectable levels of virus. In the same trial, 560 out of 661
non-transformed Spunta plants used as controls were infected with PVY, implying an
infection rate as high as 85%. Based on this trial, SY230 and SY233 were chosen as
candidates for further characterization and possible commercial release.
59
Selection of kanamycin resistant lines
400 events
Screening
Micropropagation and greenhouse growth
for PVY
resistant 140 lines discarded due to poor growth
potato plants
Mechanical infection with PVY in greenhouse
155 lines discarded due to infection
Field trial testing for natural PVY infection
83 lines discarded due to virus infection
Field trial testing of selected lines
Selection of SY230 and SY233

for further characterization
60
Southern blot analysis: Transgene copy number
Probe nptII Probe CP PVY

Xba I Eco RV Xba I Eco RV
SP 230 233 SP 230 233 SP 230 233 SP 230 233
DNA size
Marker (bp)
9000
6000
5000
4000
3000
2000
1650
1000
850
EcoRV EcoRV EcoRV XbaI
RB pNOS nptII tNOS p35S CP PVY tNOS LB
61
Transcripts analysis Leaves Stem Root Plants infected
A Wt 230 233 Wt 230 233 Wt 230 233 with PVY
MW kb
9,5
7,5
4,4
2,4
1,4
0,2
CP-PVY
B
D Wt 230 233
YL OL S YL OL S YL OL S
MW kb
9,5
7,5
4,4
npt-II 2,4
1,4
0,2
62
Protein levels in lines SY230 and SY233
A
PVY / Spunta
-1 -1 -1 -1 -1 -1
SP 230 233 5000 MW 2500 1000 100 50 10
kDA
64
49
37
CP-PVY
26
19
15
Leaves Tubers
230 233 SP 230 233 SP Mw
B
37
npt-II
NptII 26
63
Comparative Field Trials
Alta presión de virus

30% de infección promedio en controles de Spunta
1 clon probado
1500 plantas por clon
Sometidos a infección natural presión de virus
normal
64
Comparative Field Trials
65
Comparative yield studies
Location Variety Total yield Number of Average tuber

(g/plot) tubers/stem weight (g)
SY 230 3426 ± 899 5 46
Balcarce SY 233 4225 ± 376 5,4 59
Spunta 4265 ± 1497 6,5 45
SY 230 4025 ± 1281 2,9 33
Córdoba SY 233 4010 ± 1536 2,6 35
Spunta 3040 ± 1627 2,6 30
SY 230 2450 ± 490 2,6 44
Malargüe SY 233 2100 ± 540 2,7 43
Spunta 2900 ± 1000 2,6 43
SY 230 8271 ± 2985 2,7 43
San Juan SY 233 8780 ± 3088 2,9 44
Spunta 8275 ± 2323 2,6 43
Table 2. Comparative yield studies. Yield comparison assays between lines SY230,
Sy233 and non-transformed Spunta were performed at 4 potato-producing areas of
Argentina during the growth season 2005/6. Each assay comprised 4 independent
plots of one row of 25 plants (5 m long) [explicar cuanto media y que comprendia
cada plot]. The Balcarce and Cordoba sites are located in in the central production
region of Argentina. The Malargue and San Juan sites are located close to the Andes in
a virus-free, seed-tuber production area. Total yield values for each locations are
presented as the mean-values resulting from the 4 independent plots and their
respective standard deviations.
66
Tuber characteristics and biochemical analysis
Location Variety Specific Starch Dry matter Chips Glycoalkaloids

gravity % % colour mg/100g fresh weight
Solanine Chaconine Total
Balcarce SY230 1,066 11,0 18,0 4,5 2,40 ± 0,18 6,47 ± 0,37 8,87
SY233 1,068 11,3 18,6 7,5 3,18 ± 0,48 8,94 ± 1,03 12,12
Spunta 1,069 11,6 18,8 6 1,98 ± 0,27 6,05 ± 0,50 8,03
Córdoba SY230 1,083 14,6 20,7 8 3,10 ± 0,43 7,10 ± 0,70 10,20
SY233 1,081 14,0 20,5 8 3,26 ± 0,67 7,63 ± 1,37 10,89
Spunta 1,086 15,1 21,5 6,5 3,43 ± 0,09 9,17 ± 1,34 12,60
Malargüe SY230 1,057 9,1 16,5 3,5 1,63 ± 0,44 4,68 ± 1,68 6,31
SY233 1,064 10,6 17,5 3 1,71 ± 0,21 5,51 ± 0,77 7,22
Spunta 1,063 10,3 17,4 3 2,79 ± 1,79 5,93 ± 2,70 8,72
San Juan SY230 1,080 10,7 22,8 6 1,32 ± 0,03 5,07 ± 0,19 6,39
SY233 1,081 11,1 22,2 6 2,73 ± 0,57 8,27 ± 3,26 11.00
Spunta - - - - 2,60 ± 0,25 8,44 ± 3,16 11,04
Table 3. Tuber analysis. Biochemical and industrial parameters of potato tubers were
measured in SY230, SY233 and non-transformed Spunta samples obtained from the
comparative assays referred in Table 2. Values for each location are presented as the
mean-values resulting from the 4 independent plots and their respective standard
deviations
67
Tuber biochemical analysis, cont
Location Total protein % Soluble Fat Crude Fiber Ashes (g/100g Carbohydrates
/ Variety (g/100g DW) proteins (g/100g DW) (g/100g DW) DW) (g/100g DW)
San Juan
SY230 2.25  0.17 68.5  6.8 0.45  0.06 0.60  0.00 1.22  0.07 19.6  0.13
SY233 1.85  0.06 70.4  5.1 0.45  0.13 0.55  0.06 1.12  0.08 21.1  1.09
Spunta 2.42  0.61 68.3  7.6 0.48  0.10 0.45  0.06 1.23  0.23 20.8  2.37
Balcarce
SY230 2.32  0.10 64.3  6.9 0.42  0.10 0.65  0.17 1.09  0.10 16.6  2.23
SY233 2.18  0.05 61.5  11.3 0.35  0.06 0.62  0.10 1.15  0.05 16.8  2.38
Spunta 2.25  0.19 62.1  20.1 0.45  0.06 0.62  0.05 1.11  0.17 16.6  3.75
Malargüe
SY230 2.25  0.37 65.8  3.9 0.40  0.00 0.58  0.05 1.11  0.08 13.8  1.05
SY233 2.45  0.06 70.0  7.4 0.48  0.05 0.65  0.17 1.05  0.13 17.4  1.18
Spunta 2.50  0.14 78.1  10.0 0.42  0.10 0.48  0.05 1.08  0.03 15.6  0.63
Table 4. Tuber analysis. Biochemical parameters of potato tubers were measured in

SY230, SY233 and non-transformed Spunta samples obtained from the comparative
assays referred to in Table 2. Values for each location are presented as mean-values
resulting from 4 samples taken from 2 independent field trials at consecutive growth
seasons.
68
Ensayo a campo: flujo génico
Fig. 5 Field trial design to assess pollen-mediated gene transfer from S.

tuberosum (cv Spunta) to S. chacoense. Each dot
corresponds to an individual plant. Black dots: S chacoense plants. Grey dots:
S. tuberosum plants. Distance between plants
rows are indicated in meters
69
Secuenciación del evento SY233: búsqueda de secuencias del vector
70
Secuenciación del evento: cómo se integró al genoma de papa ?
Secuenciación del evento: donde se integró ?
71
Que hay dónde se integró ?
72
SPUNTA TICAR
RNA del VIRUS
Replicación
Traducción y
ensamblado de los
nuevos virus
VIRUS
Diseminación a nuevas células

e infección sistémica
Infección
73
Proceso de aprobación de un OVGM en Argentina
CONABIA SENASA DIRECCION

DE
Evaluación de Evaluación MERCADOS
Bioseguridad de inocuidad
Impacto en los
ambiental alimentaria
mercados
SECRETARIA DE AGROINDUSTRIA
74
75
Plantas transgénicas con resistencia a virus en etapa de experimentación
o de pruebas experimentales a campo en países en vías de desarrollo
Cultivo Virus País

Ají CMV y TMV China
Ají pimiento PVY Indonesia
Algodón ClCV Pakistán
Vigna mungo virus India
Tungro virus Malasia
Arroz RRSV Tailandia
RDV China
Banana BTV Filipinas
Batata SPFMV India y Kenia
Caña de azúcar SCMV y Yellow virus Brasil
SCMV Egipto
Cítricos Tristeza virus Cuba
CPsV Argentina
Maíz MSV Sudáfrica
MRCV Argentina
Maní PStV Indonesia
Tomado de: FAO.Bio.Dec www.fao.org/biotech/inventory_admin/dep/default.asp
Existen numerosos reportes de plantas resistentes a virus en la

literatura. En la tabla se muestran ejemplos del uso de técnicas de
ingeniería genética para obtener resistencia contra distintos grupos
virales que afectan una gran variedad de cultivos. Se han seleccionado
ejemplos de trabajos realizados en países subdesarrollados. Para una
revisión más global sobre la evolución de este campo, se recomienda
consultar a la base de datos Bio.DeC (Biotechnologies in Developing
Countries) de la FAO
Referencias:
www.fao.org/biotech/inventory_admin/dep/default.asp.
76
Cultivo Virus País

Pimienta picante CMV y TMV Corea
Pimienta dulce CMV China
Poroto BGMV Brasil
Repollo TuMV China
Tabaco TSWV y PVY Brasil
PVY Corea
TMV Indonesia y China
México y Corea
Trigo BYDV China
Tomate Geminivirus y Tospovirus Brasil
Geminivirus Cuba
CMV México y China
TYLCV Tailandia, China y Egipto
Zapallo PMV, PAMV y SMV2 México
Zuchini PMV, PAMV, SMV2 y ZAMV México
Referencias:
77
Cultivo Virus País

Melón CMV México y China
ZYMV Egipto
Nuez moscada Stripped virus China
Papa PVY Argentina y China
PLRV Argentina y Cuba
PVY y PLRV Brasil Egipto China y Colombia
PVX y PVY Perú Sudáfrica Indonesia México
Papaya PMV Bangladesh e Indonesia
PRSV Malasia China Brasil y México
RV Filipinas
RSV Cuba
PRV Tailandia
Pepino ZYMV Egipto
Pimienta CMV Malasia
CVBMV Tailandia
Referencias:
78
Resistencia derivada de la expresión
de genes no virales
Resistencia a virus
vegetales mediante
79
Resistencia Expresión de anticuerpos de cadena única
a virus (scFv antibodies) o “plantibodies” en plantas
por expresión
de anticuerpos
o “plantibodies”
Resistencia a virus
vegetales mediante
Cada molécula de anticuerpo está constituida por cuatro cadenas polipeptídicas:

dos pesadas (H) y dos livianas (L). En las cadenas livianas se distinguen dos
regiones: la región variable (VL), que incluye los primeros 107 aminoácidos, y la
región constante de la cadena liviana (CL), que incluye la segunda mitad de la
cadena. Las cadenas pesadas poseen también una región variable (VH), que
involucra a los primeros 115 aminoácidos de la cadena. El resto de la cadena
pesada (CH) se subdivide en 3 dominios de aproximadamente 110 aminoácidos
cada uno (CH1, CH2 y CH3). Los enlaces disulfuro que unen entre si a las
cadenas pesadas (cuyo número varia en las distintas clases y subclases de
inmunoglobulinas) están localizados entre los dominio CH1 y CH2; esta porción
de la molécula recibe el nombre de región bisagra. El sitio de combinación del
anticuerpo con el antígeno está determinado en forma conjunta por la estructura
de las regiones VL y VH. Por lo tanto, una molécula de anticuerpo como la
mostrada en la transparencia posee dos sitios de unión, es decir, es bivalente.
La digestión enzimática de un anticuerpo genera dos fragmentos llamados Fab
(cada uno con un sitio de combinación) y un fragmento llamado Fc, que incluye
los dominios CH2 y CH3. La porción Fc es la que define las propiedades
efectoras de los diferentes anticuerpos. Debido a que las regiones constantes no
son requeridas para el reconocimiento antigénico, es posible expresar en
plantas moléculas derivadas más pequeñas que retienen la especificidad de
unión al antígeno. Estos derivados incluyen a los Fab y a los scFv (por single
chain Fv). Estos últimos poseen las regiones variables de las cadenas pesadas
80
y livianas unidas por una cadena peptídica flexible y son los más utilizados
para su expresión en plantas debido a que penetran los tejidos blancos más
eficientemente, son menos inmunogénicos y tienen un mayor recambio dentro
de los tejidos. Una estrategia que ha sido ensayada con éxito para desarrollar
resistencia antiviral consiste en expresar en forma constitutiva en las plantas
anticuerpos de tipo scFv dirigidos contra distintos componentes virales.
80
Expresión de anticuerpos de cadena única contra la proteína
de cápside del Artichoke mosaic virus en plantas de tabaco
Tomado de: Tavladoraki et al., Nature, 1993.
Porcentaje de infección de plantas Título de virus en hojas inoculadas

control y de dos líneas transgénicas y hojas superiores de plantas
inoculadas con ACMV. inoculadas con ACMV a los 14 días
post-infección.
La transparencia muestra algunos de los resultados obtenidos en un trabajo

en que se expresó un anticuerpo scFv (single chain Fv) dirigido contra un
sitio conservado de la proteína de cápside del Artichoke mosaic virus
(AMCV) en plantas de tabaco. La expresión de scFvs en plantas es
particularmente sencilla debido a su pequeño tamaño y a que no se
requiere de un ensamblaje posterior para que sean activos. Es importante
señalar que antes de realizar la construcción genética que permitirá
expresar el scFv en las plantas, es imprescindible hacer un relevamiento
exhaustivo de anticuerpos monoclonales contra la proteína de interés por
ELISA para seleccionar anticuerpos capaces de reconocer la proteína viral
con una alta afinidad. A partir del hibridoma seleccionado, se obtiene ADN y
se amplifican la región codificante de las cadenas pesadas y livianas por la
técnica de PCR usando iniciadores adecuados. El panel izquierdo muestra
el porcentaje de plantas pertenecientes a dos líneas transgénicas (círculos
vacíos) o no transgénicas (círculos llenos) que resultan infectadas por el
AMCV a distintos días post-inoculación. Ambas líneas evaluadas resultaron
protegidas frente a la infección cuando se las compara con las plantas
control. En el panel derecho se midió la acumulación de virus (en μg) por
mg de proteínas de la hoja inoculada y en la hoja inmediatamente superior.
Si bien en las plantas transgénicas no se observan diferencias en la
acumulación viral en las hojas inoculadas, en las hojas superiores al sitio de
inoculación se acumula significativamente menos virus, lo que revela la
existencia de resistencia. Esta resistencia es específica para AMCV, ya que
no se expresa al inocular las plantas con virus no relacionados.
81
Tavladoraki, P., Benvenuto, E., Trinca, S., De Martinis, D., Cattaneo, A. and
Galeffi, P. Transgenic plants expressing a functional single-chain Fv antibody
are specifically protected from virus attack. Nature, 366:469-472, 1993.
81
Cuellos
de botella • Se requieren muy altos niveles de expresión.
en el uso • Se debe lograr que el anticuerpo se exprese
de “plantibodies” en los compartimentos celulares donde
ocurren los pasos de multiplicación viral a ser
inhibidos.
• Los anticuerpos a expresar deben ser
seleccionados previamente por su habilidad
de bloquear un paso crucial en el ciclo
de multiplicación o transmisión viral.
Por lo tanto se requiere de un ensayo
de interferencia viral bien diseñado.
Los anticuerpos más promisorios son

Aquellos dirigidos hacia proteínas con
Resistencia a virus
vegetales mediante
actividad catalítica y no los dirigidos hacia
ingeniería genética proteínas estructurales.
Para lograr una alta expresión, se utilizan promotores fuertes y

constitutivos para maximizar la transcripción. En general se utiliza el
promotor del transcripto de 35 S del Caulifolwer mosaic virus (CaMV)
para expresión en dicotiledóneas y el promotor del gen de la ubiquitina
de maíz para expresión en monocotiledóneas. Asimismo, los vectores
utilizados frecuentemente incluyen un intrón ya que su presencia permite
generalmente incrementar los niveles de transcripción. Durante el diseño
de la construcción a utilizar, es fundamental considerar el destino final
de la proteína que se desea expresar. En el caso de la expresión de
anticuerpos en plantas, se ha demostrado que los anticuerpos
recombinantes son más estables en algunos compartimientos
intracelulares que en otros, y esto contribuye al rendimiento total. Los
anticuerpos recombinantes se acumulan hasta 10.000 veces más en el
retículo que aquellos expresados en citosol. Asimismo, las
inmunoglobulinas de longitud completa deben ser dirigidas a la vía de
secreción para ser glicosiladas. El entorno del retículo endoplásmico
favorece el correcto plegamiento y ensamblaje de las cadenas, mientras
que la glicosilación ocurre en el retículo endoplásmico y en el aparato de
Golgi.
Referencias:
Fischer, R., Twyman, R.M. and Schillberg, S. Production of antibodies in
82
plants and their use for global health. Vaccine, 21:820-825, 2003.
82
Resistencia
a virus
por expresión
de genes R Genes R de resistencia a virus clonados
de resistencia Especie Gen R Estructura Patógeno
Arabidopsis HRT LZ-NBS-LRR Turnip crinkle virus
natural
Arabidopsis RCY1 CC-NBS-LRR Cucumber mosaic virus
Papa Rx1 NBS-LRR Potato virus X
Papa Ry TIR-NBS-LRR Potato virus Y
Soja KR1 TIR-NBS-LRR Soybean mosaic virus
Tabaco N TIR-NBS-LRR Tobacco mosaic virus
Tomate Tm-2(2) CC-NBS-LRR Tomato mosaic virus
Tomate Sw-5 NBS-LRR Tospovirus
CC: Dominio coiled coil.

LRR: Repetición rica en leucinas o leucine rich repeat.
LZ: Dominio de zipper de leucina o leucine zipper.
NBS: Dominio de unión a nucleótidos o nucleotide binding domain.
TIR: Receptor con homología a Toll y receptor de interleukina 1 o Toll-interleukin-1 receptor.
Resistencia a virus
vegetales mediante
Los genes R de resistencia en plantas codifican receptores que interactúan

directa o indirectamente con ligandos que están codificados por genes de
avirulencia (o genes avr) presentes en el patógeno. Este reconocimiento
inicial desencadena respuestas defensivas en el huésped. La ausencia de un
determinado gen R en la planta o del gen avr correspondiente del patógeno,
trae como consecuencia una colonización exitosa por parte del patógeno y el
progreso de la infección. Esta respuesta defensiva mediada por genes R y
avr recibe el nombre de “resistencia gen a gen”. Hasta el momento se han
clonado más de 20 genes de resistencia específica de raza a infecciones de
plantas causadas por virus, bacterias, hongos, nematodes e insectos. La
familia más numerosa de genes de resistencia codifica proteínas que
contienen un dominio de unión a nucleótidos (llamado NBS por su nombre en
inglés, nucleotide binding site) y un dominio repetitivo rico en leucinas
(llamado LRR, por su nombre en inglés, leucine-rich repeat). Los dominios
NBS son sitios de unión a ATP y GTP. Los dominios LRR se encuentran en
proteínas muy diversas y funcionan como sitios de interacción proteína-
proteína, carbohidrato-proteína y/o de unión péptido-ligando y están
directamente involucrados en la especificidad de la interacción gen a gen.
Una estrategia de resistencia todavía relativamente poco explorada (debido
sobre todo a la dificultad para aislar los genes en cuestión), es transformar
plantas con genes R. Una ventaja de este enfoque es que algunos genes R
ha demostrado una perdurabilidad notable a campo, lo cual es indicio de que
83
el mecanismo involucrado afecta funciones imprescindibles para el patógeno.
Su limitación principal es que, en general, la protección ofrecida por los genes
R es de rango estrecho. Muchos de ellos son fácilmente desbordados por los
virus (en particular por aquellos de genoma a ARN) debido a la alta tasa de
variabilidad que éstos son capaces de desplegar en la naturaleza.
Posiblemente, la principal aplicación de esta estrategia sea transformar
muchos cultivares susceptibles de una misma especie, lo que introduce
ventajas de tiempo respecto al cruzamiento por métodos clásicos. Otra
variante posible de este enfoque es introducir varios genes R distintos en un
mismo cultivo (apilamiento de genes) para obtener resistencia más amplias. El
trabajo de Lanfermijer y colaboradores describe un ejemplo interesante de
esta estrategia.
Referencias:
Dinesh-Kumar, S.P., Whitham, S., Choi, D., Hehl, R., Corr, C. and Baker, B.
Transposon tagging of tobacco mosaic virus resistance gene N: its possible
role in the TMV-N-mediated signal transduction pathway. Proceedings of the
National Academy of Science U.S.A., 92:4175-4180, 1995.
Dinesh-Kumar, S.P., Tham, W.H. and Baker, B.J. Structure-function analysis of
the tobacco mosaic virus resistance gene N. Proceedings of the National
Academy of Science U.S.A., 97:14789-14794, 2000.
Dangl, J. and Jones, J. Plant pathogens and integrated defence responses to
infection. Nature, 411:826-833, 2001.
Lanfermeijer, F.C., Dijkhuis, J., Sturre, M.J., de Haan, P. and Hille, J. Cloning
and characterization of the durable tomato mosaic virus resistance gene Tm-
2(2) from Lycopersicon esculentum. Plant Molecular Biology, 52:1037-49,
2003.
83
Referencias 1. Sanford, J.C. and Johnston, S.A. The concept of parasite-
derived resistance: deriving resistance genes from the
parasite's own genome. Journal of Theoretical Biology,
113:395-405, 1985.
2. Beachy, R.N. Coat-protein-mediated resistance to tobacco
mosaic virus: discovery mechanisms and exploitation.
Philosophical Transactions Royal Society and London. Series
B Biological Sciences, 354:659-664, 1999.
3. Voinnet, O. RNA silencing as a plant immune system against
viruses. Trends in Genetics, 17:449-59, 2001.
4. Waterhouse, P.M., Wang, M.B. and Lough, T. Gene silencing
as an adaptive defence against viruses. Nature, 411:834-42,
2001.
5. Carrington, J.C., Kasschau, K.D. and Johansen, L.K.
Activation and suppression of RNA silencing by plant viruses.
Virology, 281:1-5, 2001.
6. Schillberg, S., Zimmermann, S., Zhang, M.Y. and Fischer, R.
Antibody-based resistance to plant pathogens. Transgenic
Research, 10:1-12, 2001.
Resistencia a virus
vegetales mediante
84

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BIOTECNOLOGIA VEGETAL

Resistencia a virus de plantas

Departamento de Ciencia y Tecnologia

Resistencia derivada del patógeno mediada

Resistencia derivada del patógeno mediada

Ejemplos de resistencia a virus de plantas por

Resistencia derivada de la expresión de genes

Local and systemic resistance mediated by resistance (R) genes. a |

The receptor−ligand hypothesis versus the guard hypothesis. a | The

Uso de plantas libres de virus (cultivo de tejidos, cultivo de

• La inoculación de una planta con una cepa viral

TMV: Tomato mosaic virus.

• Una misma cepa puede ser protectiva

• La cepa protectiva puede causar pérdidas

Todos estos inconvenientes se solucionarían

En la transparencia se mencionan algunas de las desventajas que

Sandford and Johnston, 1985.

En 1985 Sanford y Johnston enunciaron por primera vez el concepto de resistencia

3. Genes R de resistencia naturales

La transparencia resume las estrategias de resistencia a virus que es posible

La transparencia muestra un ciclo de vida generalizado de un virus a ARN. Se

Tomado de: Powel Abel P. et al., Science, 1986.

A: La expresión de proteína de la cápside (CP) causó un retraso en la

La transparencia muestra ensayos tomados del trabajo en que se describió

Resistencia a virus Tomado de: Register and Beachy, Virology, 1988.

La transparencia muestra resultados de un trabajo realizado para intentar

Tomado de: Register and Beachy, Virology, 1988.

• La decapsidación de la partícula viral comienza junto con la traducción:

• A pH 8, las partículas se desestabilizan y exponen los primeros 200 nt del

En otros trabajos realizados para explorar el mecanismo actuante en la

Tomado de: Beachy et al., Annu. Rev. Phytopatol., 1990.

Una característica importante de la protección mediada por la cápside

Tomado de: Bendahmane et al., J. Virol., 1997.

La transparencia muestra el resultado de experimentos realizados con

La transparencia esquematiza el mecanismo más comúnmente

Tobamovirus CP TMV; ToMV; AIMV tabaco; tomate

Existen numerosos reportes de protección mediada por la cápside en

3. Existe correlación entre resistencia y nivel de expresión

4. La protección es superada por altas dosis de inóculo (viriones).

5. La protección es más efectiva para el virus homólogo.

6. En algunos casos, la efectividad y/o el espectro de protección

7. Actúa a nivel celular afectando una etapa temprana del ciclo

La transparencia resume las principales características del mecanismo de

Tomado de: Aaziz et al., Trends Plant Sci., 2001.

La transparencia muestra una representación esquemática de un

La MP nativa permite el movimiento del dextrano F de 10 kDa.

Las fotografías que se muestran en la transparencia corresponden a un

Días después de la inoculación Días después de la inoculación

Resistencia a virus Tomado de: Lapidot et al., Plant J., 1993.

La transparencia muestra una serie de ensayos realizados con plantas

La transparencia muestra el comportamiento de plantas transgénicas

2. Se requiere la presencia de la proteína de movimiento,

3. Existe correlación entre nivel de resistencia y nivel

4. Es una protección de rango amplio. Protege frente

Es importante remarcar que en los casos reportados de protección

por replicasas 2. En muchos casos, no se requiere presencia de la proteína.

3. Tolera altas dosis de inóculo.

4. Es una protección de rango estrecho. Opera frente al virus

5. Se asume que, en la mayoría de los casos, la resistencia

En 1990 y 1992 se publicaron dos trabajos pioneros que demostraron

Tomado de: Lindbo et al., Mol. Plant Microbe Interact., 1992.

B49: Planta no transgénica.

En una serie de trabajos que involucraban la transformación de plantas