5.

MICROBIOLOGIA

A Microbiologia é classicamente definida como a área da ciência que se

dedica ao estudo de organismos que somente podem ser visualizados ao
microscópio. Com base neste conceito, a microbiologia aborda um vasto e diverso
grupo de organismos unicelulares de dimensões reduzidas, que podem ser
encontrados como células isoladas ou agrupados em diferentes arranjos. Assim, a
microbiologia envolve o estudo de organismos procarióticos (bactérias,
archaeas), eucarióticos(algas, protozoários, fungos) e também seres acelulares
(vírus).
Esta área do conhecimento teve seu início com os relatos de Robert Hooke e
Antony van Leeuwenhoek, que desenvolveram microscópios que possibilitaram as
primeiras observações de bactérias e outros microrganismos a partir da análise de
diversos espécimes biológicos. Embora van Leeuwenhoek seja considerado o "pai"
da microbiologia, os relatos de Hooke, descrevendo a estrutura de um bolor, foram
publicados anteriormente aos de Leeuwenhoek. Assim, embora Leeuwnhoek tenha
fornecido importantes informações sobre a morfologia bacteriana, estes dois
pesquisadores devem ser considerados como pioneiros nesta ciência. (SOCIEDADE
BRASILEIRA DE MICROBIOLOGIA, 2012).
 2

5.1. Preparo de meio de cultura

O estudo de bactérias exige o prévio isolamento e identificação, para tanto,

são utilizados diversos meios de cultura diferentes. Meio de cultura é uma mistura de
nutrientes que possibilitam o crescimento in vitro de microorganismos.
A maioria das bactérias cresce em meios de cultura. As exceções são as
ricketsias, clamídias, Mycobacterium leprae e Treponema, que são parasitos
intracelulares obrigatórios. Neste caso, estes microorganismos podem ser cultivados
em culturas de células e ovos embrionados.
Inoculação é a contaminação proposital de um meio de cultura, ou seja, é a
transferência de um determinado número de microorganismos para um meio de
cultura a fim de que estes se desenvolvam e permitam a sua identificação. A
inoculação das bactérias em diferentes meios envolve várias técnicas de
semeadura.
Toda a manipulação realizada em laboratório (com meios, cultura e material
utilizado) requer certos cuidados para evitar a contaminação. Esses procedimentos
são denominados técnicas assépticas. (SANT’ANNA; CERQUEIRA, 2007).

Os diversos meios de cultura existentes podem ser classificados de diversas

formas:
 3

(SANT’ANNA; CERQUEIRA, 2007).

 4

5.1.a. Mac conkey

O Ágar Mac Conkey é um meio seletivo e diferencial empregado no

isolamento de bactérias Gram negativas. A seletividade do Ágar Mac Conkey é
assegurada pela presença de sais biliares e cristal violeta , que impede o
crescimento de bactérias Gram positivas.
O caráter diferencial é feito através da leitura da fermentação da lactose. O
produto está disponível em placas ou em frascos com 100 mL. Amostra Vários tipos
de amostra podem ser inoculadas no Ágar Mac Conkey, devendo portanto o usuário
definir seus critérios de coleta, armazenamento e rejeição para cada tipo de amostra
usada.

5.1.b. Cled

O CLED Agar (Agar de cistina lactose deficiente em electrólitos) é um meio de

cultura para diferenciação para utilizar no isolamento e enumeração de bactérias da
urina. Este meio suporta o crescimento de agentes patogénicos e contaminantes
urinários, mas evita a proliferação indevida de espécies de Proteus devido a
ausência de electrólitos.
Os nutrientes noCL ED Agar são fornecidos pelas peptonas de caseínas e
gelatina e extracto de carne de vaca. A lactose foi incluída para fornecer uma fonte
de energia para os organismos com capacidade para utilizá-la através de um
mecanismo fermentativo. É utilizado o azul de bromotimol como um indicador de pH
para diferenciar os fermentadores da lactose dos não fermentadores da lactose. Os
organismos que fermentam a lactose irão reduzir o pH e alterar a cor do meio de
verde para amarelo. A cistina permite o crescimento de bactérias coliformes "de
colónias anãs". As fontes de eletrólitos são reduzidas para minimizar a proliferação
de espécies de Proteus. Deste modo, o meio permite a determinação quantitativa de
agentes patogénicos urinários incluindo o Proteus quando são utilizadas alças
calibradas para inoculação.
 5

5.1.c. Agar sangue

A base deste meio é altamente nutritiva e promove um ótimo crescimento de

todos os microrganismos relevantes. O pH do meio deve ser de 7,3± 0,2 após
acrescer o suplemento de sangue desfibrinado. O sangue utilizado pode ser de
carneiro ou de cavalo, favorecendo a hemólise.
O agar sangue é utilizado em laboratórios de análises clínicas como cultivo
primário para o isolamento de Streptococcus spp e Staphylococcus spp.
Sangue humano pode ser usado quando se necessita isolar o bacilo da tuberculose
em esputo.
O sangue deve estar estéril, pois ele é adicionado ao agar após sua
autoclavação. Tal adição deve ocorrer quando a solução estive morna para evitar o
cozimento do sangue.

5.1.d. Milher Hinton

Ágar Mueller-Hinton é um meio de cultura microbiológico que é

freqüentemente usado para testes de susceptibilidade antimicrobiana. Também é
usado para isolar e cultivar Neisseria e Moraxella.
 6

5.2. Coloração de Gram

A coloração de Gram baseia-se na diferença das paredes celulares das

diversas bactérias e como estas serão coradas de forma distinta. As bactérias
denominadas Gram negativas possuem uma fina camada de glicoproteína recoberta
por uma espessa camada formada principalmente por lipoproteínas e substâncias
lipídicas. Já as consideradas Gram positivas possuem uma única e espessa camada
de glicoproteína.
Antes de iniciar a coloração, é necessário fazer um esfregaço, ou seja, pegar
uma colônia previamente isolada ou uma alçada de uma cultura pura e transferir
para uma lâmina limpa. Se for utilizada uma colônia, deve-se adicionar uma
gota/alçada de solução salina a 0,9%, homogeneizando-a. É importante que o
esfregaço seja bem preparado, para que, ao final da coloração, seja possível a
visualização das bactérias. Também é importante não esquecer de fixar o esfregaço
na chama do Bico de Bunsen, evitando que a massa de células a ser analisada se
perca durante as etapas da coloração.
Na primeira etapa da coloração, o corante violeta é adicionado sobre o
esfregaço. O corante, então, penetra na parede da bactéria, independente se esta é
Gram positiva ou Gram negativa. Ao adicionar o lugol, este se combina com o
corante Cristal Violeta, formando um grande complexo, o Cristal Violeta-Iodo (CV-I),
fixando o corante na parede a bactéria.
O álcool tem papel fundamental neste método. Ao ser adicionado sobre o
esfregaço corado com o Cristal violeta vai diferenciar as bactérias:
- à as Gram positivas, com sua parede rica em complexas cadeias de
peptidoglicano serão desidratadas, e os poros na parede serão reduzidos,
impedindo a saída do complexo CV-I e tornando a parede permanentemente corada
de roxo (a cor do complexo CV-I).
- à as bactérias Gram negativas possuem uma fina camada de
peptidoglicano, mas acima desta camada encontra-se uma outra, de caráter lipídico
(rica em LPS, lipoproteínas e outros componentes). Essa camada lipídica, em
contato com o álcool, dissolve-se, deixando a camada de peptidoglicano
desprotegida e permitindo a saída do complexo CV-I, tornando a célula descorada
neste momento.
 7

É importante lembrar de lavar a lâmina após a etapa de descoloração, pois se

restar algum resíduo de álcool, a próxima etapa não será realizada adequadamente,
e os resultados poderão ser alterados.
O esfregaço então é tratado com fucsina, que não terá efeito algum sobre as
células Gram positivas, que estão com os poros de sua parede reduzidos; mas
penetrará na parede das células Gram negativas, corando-as de vermelho.
Esta coloração é utilizada para a maioria das bactérias, mas há algumas que
não se coram por este método, como as micobactérias, as bactérias espiraladas e
as bactérias que não possuem parede celular. Para estes, há outros métodos de
coloração, como o método de Zihel-Neelsen, o de Fontana-Tribondeau e o método
de visualização em campo escuro.

Alguns fatores podem influenciar nos resultados obtidos na coloração:

- à Os corantes empregados na técnica, se não filtrados, podem deixar
resíduos (cristais) na lâmina.
- à Um descoramento excessivo ou insuficiente pode levar a uma incorreta
diferenciação da bactéria pelo álcool.
- à A idade da cultura bacteriana tem importância fundamental na coloração
de Gram. Em culturas envelhecidas, células Gram-positivas freqüentemente se
tornam Gram-negativas.
Enzimas líticas excretadas normalmente por culturas envelhecidas podem
causar danos à membrana e parede da célula, como por exemplo, alterando a
permeabilidade aos solventes. Conseqüentemente, o complexo iodo-cristal violeta
poderá ser retirado da célula. (SANT’ANNA; CERQUEIRA, 2007).
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5.3. Culturas realizadas

Foram realizadas _______ culturas, uma de secreção _____________ e outra

de secreção ___________. Ambas são descritas abaixo.
 9

5.4. Semeaduras

As técnicas de semeadura são o método pelo qual se transfere inóculos

bacterianos de um meio de cultura ou material a ser analisado (secreções,
alimentos) para um outro meio de cultura.
Para garantir que apenas o microorganismo desejado seja semeado, são
utilizadas as técnicas assépticas: procedimentos que devem ser adotados visando a
não contaminação de materiais, meios e culturas.
As técnicas de assepsia incluem:
- fazer a desinfecção da área de trabalho e anti-sepsia das mãos ANTES e
DEPOIS de qualquer trabalho. (1)
- trabalhar SEMPRE na área de segurança: uma área de aproximadamente
10 cm ao redor da chama do bico de Bunsen. (2)
- esterilizar adequadamente todo material (p.ex.: alças e agulhas
bacteriológicas) ANTES e DEPOIS de seu uso à sempre aquecer da base para a
ponta, evitando a formação de aerossóis. (3)
- flambar a boca dos frascos e tubos ANTES e DEPOIS das inoculações,
evitando a contaminação da cultura/material a ser analisado e garantindo que
somente o microorganismo desejado será inoculado. (4) (SANT’ANNA;
CERQUEIRA, 2007).
 10

5.4.a. Semeadura (por esgotamento)

(SANT’ANNA; CERQUEIRA, 2007).

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5.5. Identificação Bioquímica (Prova Bioquímica)

A classificação fisiológica (bioquímica) se dá porque os microrganismos

apresentam diferentes tipos de vias metabólicas para obtenção de energia, bem
como podem possuir enzimas específicas utilizadas no processo de metabolização
dos substratos ou mecanismos de virulência.
Os principais testes bioquímicos realizados são:

Teste da coagulase
Utilizado para distinguir a bactéria patogênica S. aureus e outras
Micrococcaceae que inclui outras espécies de Staphylococcus e o gênero
Micrococcus

Teste da utilização de citrato

Usado para diferenciação entre Enterobacteriaceae para determinar a
habilidade do organismo para usar citrato.
Azul de bromotimol é usado para indicar pH. Com o pH maior que 7,6 o meio
torna azul.

Teste da urease
Utilizado para diferenciar organismos que tem habilidade de hidrolisar uréia
com a enzima urease. Proteus um patógeno do trato urinário é diferenciado de
outras bactérias entéricas.
O vermelho fenol é o indicador que torna amarelo abaixo do pH 8,4 e
vermelho acima de 8,4 – a produção de amônia aumenta o pH.

Teste da β-galactosidase (ONPG)

O teste ONPG é utilizado para identificar bactéria que fermenta lactose em
glicose + galactose pela enzima β-galactosidase.
ONPG reage com β-galactosidase para produzir a cor amarela.
 12

Liquefação de gelatina (gelatinase)

Utilizado para distinguir a patogênica S. aureus (+) da não patogênica S.
epidermidis (-).Outras tipicamente gelatinase (+) são: Proteus, Enterobacteriacease,
Serratia, Bacillus anthracis, B. cereus, Clostridium tetani e C. perfringens.

Produção de gás sulfídrico (H2S)

Identifica bactérias capazes de reduzir enxofre.
Resultado positivo são membros de Enterobacteriaceae, especialmente os
gêneros de Salmonella e Proteus. Resultados negativos podem ser Pseudomonas
fluorescens, Morganella morganii.
Sulfato de ferro serve como indicador que reage com H2S produzindo um
precipitado preto no meio.

Teste do indol
Usado para diferenciar Enterobacteriaceae que é capaz de produzir indol,
amonia e ácido pirúvico usando a enzima triptofanase a partir do triptofano. Em
organismos indol positivos, os reagentes HCl e dimetilaminobenzaldeido se reagem
com o indol para produzir um corante que torna a superfície do meio vermelho.
(UNIVAP, 2012).

5.5.a. Resultado obtido em sala

* Bactéria identificada em aula

Lactose + Uréase + Endol -
Gás - Tripitofano - Lisina
H2S - Motilidade + Citrato

BACTÉRIA ____ : ___________________________________

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5.6. Antibiograma

O sucesso na terapêutica antimicrobiana de uma infecção bacteriana

depende da sensibilidade do agente à droga utilizada. Algumas bactérias
apresentam um perfil de sensibilidade previsível e constante, no entanto muitas
outras são altamente suscetíveis ao desenvolvimento ou aquisição de resistência a
diversos antimicrobianos. Atualmente, o uso adequado e criterioso de
antimicrobianos é muito importante para prevenção da seleção de amostras
bacterianas multirresistentes. O teste de sensibilidade a antimicrobianos ou
antibiograma permite o esclarecimento objetivo do perfil de sensibilidade do
patógeno e a utilização de drogas eficazes no tratamento.
O antibiograma ou TSA é indicado para qualquer microrganismo relacionado
ao processo infeccioso, mas principalmente àqueles cuja sensibilidade a drogas
normalmente empregadas na terapia não seja previsível como por exemplos: S.
aureus, bacilos gram-negativos não fermentadores (Pseudomonas), bacilos Gram
negativos fermentadores (enterobactérias) etc.
A seleção dos antimicrobianos para a realização dos antibiogramas de rotina
deve seguir alguns princípios. Uma das estratégias adotadas é o reconhecimento
que alguns agentes antimicrobianos podem ser agrupados em classes, baseando-se
no seu espectro de atividade. Assim, um só representante de classe necessita ser
testado, a não ser quando dentro de uma mesma classe de antimicrobianos não
exista a possibilidade de equivalência.
Uma bactéria é considerada sensível a um antimicrobiano quando o seu
crescimento é inibido, in vitro, por uma concentração três, ou mais vezes, inferior
àquela que o antimicrobiano atinge no sangue, caso contrário ela é considerada
resistente. O meio termo (bactérias moderadamente resistentes) é dado por aquela
cujo crescimento é inibido por concentrações intermediárias. Na interpretação dos
resultados, consideramos as bactérias intermediariamente resistentes como
resistentes.
A concentração inibitória do antimicrobiano pode ser determinada direta ou
indiretamente. A determinação direta é feita pelos chamados métodos da diluição, e,
a indireta, pelo método de difusão em placa com discos impregnados com as
drogas.
 14

- Método de Diluição (MIC): No método de diluição, concentrações variadas

do antibiótico, obtidas pela diluição em Caldo ou Agar, são inoculadas com o
microrganismo. A concentração mais baixa do antibiótico que evita o crescimento
após a incubação de 12 a 24 horas é a concentração inibitória mínima, é a medida
da sensibilidade.
- Método da Difusão do Disco: Nos testes pelo método de difusão, discos de
papel impregnados com o antibiótico são colocados uniformemente na superfície do
Agar semeado com o microrganismo. Forma-se, então, um gradiente de
concentração pela difusão do antibiótico a partir do disco para o Agar com
conseqüente inibição do crescimento do microorganismo sensível ao determinado
(os) antibiótico (os).
Devido à sua simplicidade e por poderem ser realizados rapidamente, os
métodos de difusão com disco (de Bawer e Kirby) têm preferência sobre os de
diluição para os testes de rotina, mas é indispensável que sejam, rigorosamente
padronizados, pois a presença de algumas substâncias nos meios podem influenciar
o tamanho do halo de inibição. Para minimizar os riscos de resultados errôneos,
utilizamos o Agar Mueller-Hinton como meio de crescimento, pois este é um meio
padronizado e sem componentes que possam interferir nos resultados. Deve-se
ressaltar que o teste de sensibilidade deve ser realizado com uma cultura pura,
devendo-se fazer uma coloração de Gram antes de qualquer TSA para a
confirmação da pureza da cultura.
A base para o julgamento de sensibilidade é o tamanho real do halo de
inibição (zona sem crescimento em volta dos discos de antibiótico). O tamanho do
halo sozinho não é uma medida quantitativa da atividade do antibiótico, assim, é
errôneo pensar que quanto maior o halo, mais potente seja o antibiótico. Por essa
razão, comparações diretas dos diâmetros dos halos produzidos por antibióticos não
relacionados são falsos e não devem ser realizados. Deve-se interpretar a
sensibilidade de acordo com os dados obtidos (diâmetro do halo) em comparação
aos dados da tabela de interpretação do antibiograma, com antibacterianos de uso
corrente na terapêutica clínica.
Na escolha do antimicrobiano a ser utilizado, devem ser avaliados os
seguintes critérios: toxicidade seletiva, bactericida, amplo espectro, não deve ser
alergênico, não deve provocar efeitos colaterais e não devem ter microorganismos
resistentes. (SANT’ANNA; CERQUEIRA, 2007).
 15

TÉCNICA
- embeber o swab na suspensão bacteriana padronizada e inocular na placa
de Mueller-Hinton de modo a obter um crescimento confluente (estriar em pelo
menos 3 direções)
- aguardar um tempo para que o Agar absorva o inóculo (mais ou menos 10
minutos) e, com o auxílio de uma pinça estéril, colocar os discos de antibióticos
sobre o Agar, pressionando levemente cada disco para que este fique aderido ao
meio. Deixar entre eles e deles à borda da placa um espaço não inferior a 15 mm.
- Incubar 18-24 horas a 35o C.
- Medir com régua o diâmetro do halo de
inibição, comparar com os dados da tabela e
expressar seus resultados.
(SANT’ANNA; CERQUEIRA, 2007).

Meio utilizado na prática:

 16

5.6.a. Resultado obtido em sala

Em aula, o antibiograma foi realizado com ________ amostra (s) isolada (s).
Foram impregnados na placa na qual foi semeada a bactéria em questão
________ antibióticos: ________, __________, _________ e________ .

Após a incubação, apresentou-se _______ halo (s) ao redor do disco de -

__________. Esse halo apresentou um diâmetro de _________ mm, o que (indicou
ou não indicou) a sensibilidade ao antibiótico.

* Referência do halo: < 13 (resistente) 14-17 (Intermediário) >18 (Sensível)