Inmunología

Luisa María Coral Viveros

Tema 1: Las técnicas inmunológicas

Índice:
1. El sistema inmunitario
2. Inmunidad innata
3. Inmunidad adaptativa
4. Órganos del sistema inmune
5. Diagnóstico de enfermedades infecciosas
6. Seguimiento de enfermedades infecciosas
7. Estudios seroepidemiológicos
8. Técnicas inmunológicas

1. El sistema inmunitario

¿Que es el sistema inmunitario?

El sistema inmunitario es el conjunto de órganos, células, moléculas, y mecanismos que protegen al ser
humano de agentes infecciosos (bacterias, virus..) o de células propias o alteradas.

Sistema inmune

Inmunidad innata, Inmunidad adaptativa,

inespecifica o natural específica o adquirida

Actúa contra cualquier agente Actúa ante un agente concreto

(Da igual cuántas veces actúe el agente va (Las próximas infecciones actuará de forma
actuar con los mismos mecanismos) inmediata (porque tiene memoria))

No requiere de exposición previa (porque Es lenta (7 a 10 días) y requiere de exposición

naces con ella) previa al antígeno.

Sin memoria inmunológica (siempre va a

Con memoria inmunológica
actuar de la misma manera)

¿Que es un antígeno?
Cualquier agente que dentro
de un organismo provoca
una respuesta inmunitaria.

• Linfocitos B: producen
anticuerpos. proceso selectivo para
eliminar células que te atacan a ti
• Células dendríticas: actúan como
una fagocitosis.
• Sistema de complemento: se
desarrollan enzimas en cascada.
2. Inmunidad innata

La inmunidad innata se divide en los siguientes mecanismos de protección Antígeno

1. Barreras físicas y químicas

2. Respuesta innata celular
3. Respuesta innata humoral Anticuerpo

2.1 Mecanismos innatos de protección

a) Barreras físicas y químicas:

- Mucosas: Lisozimas, Mucosidad
- Piel: Queratina, pH ácido 5,5 , Elevada salinidad Membrana
- Vías respiratorias: Mucus, Células ciliadas
- Digestivo: Acidez, microbiota/bacterias simbióticas, tejido linfoide.

b) Inmunidad innata celular:

Está formada por células del organismo que son capaces de atacar de forma inespecífica.

1. Células fagociticas:
Presentan actividad fagocítica
Son células presentadoras de antígenos.
Su función principal es fagocitar y generalmente suelen ser macrofagos.

- Macrofagos: Provienen de los monocitos y los monocitos se encuentran en la sangre en la forma inactiva.
Al recibir una señal (quimiotaxis), el monocito sale de la sangre al tejido mediante la extravasación y se
transforma en macrófago.
Son células presentadoras de Ag.
Liberan Factor de Necrosis Tumoral (TNF), una citocina cuya función es la de señalizar. Participan en la
inflamación.
Realizan la diapédesis y al extravasarse se transforman de monocito a macrófago.

- Neutrófilos:
Tienen el núcleo lobulado (de 3 a 5 lóbulos) y poseen gránulos/granulosomas.
Los gránulos son producidos por el aparato de Golgi las cuales liberan una especie de toxina al medio.
Normalmente también fagocitan.
Son muy abundantes.
Realizan la diapédesis, pero no se transforman al extravasarse.

Diapédesis

1º Rodamiento 2º Captura 3º Adhesión 4º extensión 5º Extravasación 6º Fagocitosis del

agente patógeno

Se lleva a cabo en capilares, vénulas y arteriolas ya q solo tienen una capa de células y eso permite
realizar la extravasación.

Extravasación:
Proceso en el que se
atraviesa el capilar o vasos
sanguineos y pasa al tejido y
se lleva a cabo por señales
químicas
2. Presentadoras de Antígenos: Las células presentadoras de antígenos (CPA) enseñan fragmentos de
patógeno a los linfocitos.

Los macrófagos y las células dendríticas presentan los antígenos a través de unas moléculas que están en
sus membranas (MHC–II):

Dos tipos de complejo principal de histocompatibilidad (MHC): Es una molécula formada por proteínas

- Clase 1 (MHC-I): Aparece en casi todas las membranas de las células del ser humano. No aparecen en
las células precursoras de embriones ni en los eritrocitos. Poseen 1 proteína transmembrana con la cual
reconocen al antígeno.
- Clase 2: Aparece en la membrana de macrófagos, células dendríticas y linfocitos B. Poseen 2 proteínas
transmembrana con las cuales reconocen y presentan al antígeno.

3. Células NK: estás células no fagocitan al patógeno, lo que hacen es:

Ataca a células patógenas (células tumorales e infectadas)
Liberan una enzima (perforina) que agujerea la membrana creando un canal.
Tras esto liberan las granzimas, que atraviesan el canal y se unen a las caspasas dando lugar a la
apoptosis.

4. Mastocitos y basófilos:
Los dos tipos de células tienen gránulos de histamina y heparina, ambas producen aumento de la
respuesta inflamatoria. Y también se las conoce como células cebadas.
Intervienen en la inflamación y liberan aminas vasoactivas como la histamina.

5. Eosinófilos: Participa en respuestas a parásitos (helminto) y en alergias.

Contiene gránulos con sustancias tóxicas que liberan sobre el patógeno.

No fagocitan, sino que liberan sustancias tóxicas que atacan a gusanos (parásitos)
- Apoptosis: no sale nada al medio, sino q se empaqueta el citoplasma y tras esto desaparece la
membrana.
- Lisis o autolisis: La membrana se rompe y el contenido es liberado en la MEC, provocando una respuesta
inflamatoria.

c) Inmunidad innata humoral:

• Sistema de complemento: Complejo de enzimas y de proteínas que ayudan al sistema inmune innato.
Proteínas plasmáticas implicadas en cascadas bioquímicas.

Su función principal es provocar la lisis de la membrana de los patógenos.

Otras funciones que tiene son promover los procesos inflamatorios, contribuir a la fagocitosis y ayuda a la
activación de linfocitos B.

El sistema de complemento hace de puente entre la inmunidad innata y adaptativa (como las células
dendríticas).

Lisis: Ruptura de la membrana

Apoptosis: Muerte célular programada, se da una señal que indica
que la célula es vieja o que no puede seguir funcionando
correctamente y la célula inicia un proceso de muerte programada,
se contrae sobre sí misma sin que nada del interior salga fuera.
Autolisis de las células: La membrana se rompe y sale todo el
contenido que había dentro provocando una respuesta
inflamatoria.
Existen tres vías para la activación de C3: (solo es necesaria 1 para su activación)
1a vía: clásica (Inmunidad adaptativa)
2a vía: alternativa (Inmunidad innata)
3o vía: lectina (Inmunidad innata)

Vía clásica Vía alternativa Vía lectina

Activación de C3

Una vez se activa C3, se activan Vía lítica

en cascada C5, C6, C7, C8 y C9

Y esto provoca la Lisis celular

a). Vía clásica: (respuesta inmune adaptativa)

Se activa por la formación de complejos antígeno-anticuerpo.

Acoplada a la inmunidad específica por medio de los anticuerpos.
Hace un puente entre la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa.

Se inicia con la ruptura de C4 por parte de C1

C1-C4-C2-C3-C5-C6-C7-C8-C9

Convertasa de C5 Vía lítica

Cada Cx va rompiendo la siguiente Cx en 2 partes, uniéndose la parte más grande, la pequeña,

que es una anafilotoxina, se va.

C3: es una proteína que activa una cascada que conlleva la lisis celular.

b). Vía de las lectinas: (respuesta innata)

Es una variante de la vía clásica, pero se activa sin necesidad de anticuerpos.

La vía se inicia cuando las lectinas se unen a las manosas (azúcares q están en la superficie del patógeno)
creando un complejo parecido a C1.

El complejo lectina-manosa rompe C4.

Esta vía es realizada por lectinas y ficolinas. Estas últimas se unen a otros azúcares que también se
encuentran en la membrana del patógeno.

Lectina-C4-C2-C3-C5-C6-C7-C8-C9

Convertasa de C5 Vía lítica

c). Vía alternativa: (respuesta innata)

Se activa por la presencia de polisacáridos de la pared celular alternativa de las bacterias.

C3 se rompe al entrar en contacto con la superficie de algunos patógenos, quedándose la parte más
grande en la membrana.

El factor D rompe el factor B.

La parte más grande del factor B se une a C3.

El factor B es inestable al unirse a C3, y el factor P (properdina) lo vuelve estable.

C3-Factor B-Factor P-C3-C5-C6-C7-C8-C9

Concertada de C5 Vía lítica

d). Vía lítica:

La convertasa divide C5 en:

- C5a (parte pequeña) que es una anafilotoxina, proteína más potente que actúa en la quimiotaxis
atrayendo una mayor cantidad de células inmunes.
- C5b (parte grande) que se une a la membrana del patógeno.

C6 y C7 permiten la unión de C5 a la membrana volviéndola estable.

C8 se une a C7 atravesando la membrana.
C9 se une a C8 formando un poro o canal por el cual se lisa el patógeno.

C6-C5-C7 C6-C5-C7-C8 C6-C5-C7-C8-C9

MAC (complejo de ataque a membrana)
2.2 Respuesta infiamatoria

Respuesta inespecífica
Se produce ante una lesión o infección. Objetivo: Aislar la zona, destruir
Controlado por mediadores antiinflamatorios. al patógeno y reparar el tejido
Con cuadro clínico determinado y una duración breve

La inflamación permite dirigir las células de defensa al lugar de la lesión.

Neutrófilos (PMN polimorfonucleares) y macrófagos.
Vasodilatación que aumenta el flujo sanguíneo.
Los neutrófilos y los macrófagos atraviesan: la pared del vaso sanguíneo (diapédesis).
Las células van hacia el área afectada por quimiotaxis.
Se ponen en marcha los procesos de fagocitosis.

1. Fagocitosis:
Digestión celular endógena.
Los neutrófilos y los macrófagos ingieren los patógenos y los destruyen en su interior.
Hay material que no puede digerirse y es devuelto al medio extracelular.

2. Opsonización:
Se marca al patógeno con opsoninas (moléculas coadyuvantes de la apoptosis).
Esta proteína permite que los neutrófilos y los macrófagos lo reconozcan y lo ingieran.
Así, el patógeno es fagocitado.

3. Citolisis:
Lo llevan a cabo las células NK.
Destruyen células infectadas y
cancerosas.
Lo hacen a través de enzimas como: perforinas y granzimas.
Así, abren poros en el patógeno y lo destruyen.
3. Inmunidad adaptativa

Reconocimiento de lo propio y de los extraño.

- Se pone en marcha cuando el patógeno ha conseguido vencer las barreras de la inmunidad innata.
- Los linfocitos son los responsables de esta respuesta.
- Es específica para cada agente infeccioso.
- Es lenta y requiere de exposición previa al antígeno. Segunda exposición.

3.1. Inmunidad adaptativa celular:

En la respuesta inmune intervienen varios tipos de leucocitos. Los linfocitos B y T tienen una serie de
características:
- Especificidad.
- Diversidad.
- Reconocimiento de lo ajeno y lo extraño.
- Memoria inmunológica

a) Linfocitos T:
Los linfocitos T maduran en el timo y los linfocitos B en la médula ósea.
Los linfocitos T deben de reaccionar frente a lo extraño, pero no hacía lo propio, si reacciona ante lo
propio o no reacciona frente a lo extraño son eliminados.
CD3+ hace que TCR pueda pasar la señal del interior al exterior y dar estabilidad.

Son células que se originan en la médula ósea y maduran en el timo.

Tienen un receptor en su membrana (TCR) por el que se unen los antígenos.

Los linfocitos T virgen se diferencian y maduran en el timo. Selección de linfocitos.

Linfocitos T cooperadores (Th).

Dos tipos de linfocito T
Linfocitos T citotóxicos (Tc).
- Linfocitos T cooperadores (Th):
También conocidos como Linfocitos T helper.
Llevan en su membrana una glucoproteína conocida como CD4. Son CD4+
Las células presentadoras de Ag (macrófagos, neutrófilos y linfocitos B) presentan los antígenos a estos
linfocitos.
Intervienen en los mecanismos efectores que acaban con los patógenos.
Ayudan a la proliferación de las células efectoras.
Ayudan a aumentar la efectividad de los fagocitos y otras células efectoras.
Los Th a su vez se dividen en dos tipos:

Linfocitos citotóxicos

Molécula que ayuda en Moléculas que producen señales quimiotáxicas

la respuesta inflamatoria para iniciar la respuesta inflamatoria

- Linfocitos T citotóxicos
Llevan en su membrana una glucoproteína conocida como CD8. Son CD8+.
Se encargan de destruir células infectadas.
Utilizan enzimas como las perforinas y las granzimas para hacer un poro en la membrana de la célula.
A diferencia de las NK, los TCD8+ necesitan de activación.

Los LTc actúan en dos fases:

1. Activación y diferenciación del linfocito: de linfocito T precursor a linfocito T citotóxico efectivo.
Esto tiene lugar en el timo

2. Fase efectora:
a) Adhesión y formación del conjugado Tc-célula diana.
b) Golpe letal: el citoesqueleto del Tc se reorganiza y los granulosomas están en el polo de la célula
cerca de la membrana de la célula diana.
Los gránulos se fusionan con la membrana y son liberados al espacio extra celular. “Beso de la muerte”.
c) Disociación del Tc: este se separa de la célula diana antes de que esta se destruya.
d) Destrucción de la célula diana: Apoptosis.

Los macrófagos, neutrófilos,

células dendríticas (sistema
innato) y linfocitos B (sistema
inmune) presentan antígenos a
los linfocitos T helpers o T
colaboradores (LTh).
Los linfocitos T helpers y B se
retroalimentan en su activación.
b) Linfocitos B:
El linfocito B virgen se activa cuando su receptor BCR entra en contacto con un antígeno.
Se transforma en células plasmáticas que producen anticuerpos.
También pueden transformarse en linfocitos B de memoria.

Se crean en la médula ósea, donde maduran y se seleccionan.

Se activan en la sangre en el caso de que haga falta.
BCR: Receptor de células B.
Los linfocitos B y los linfocitos T cooperadores se convierten en células de memoria.

3.2. Inmunidad adaptativa humoral

a) Anticuerpos:

Proteínas del sistema inmunitario que son capaces de detectar y neutralizar elementos extraños.
Son muy muy específicos y reconocen solo un determinado antígeno. Se une al antígeno e impide que
pueda infectar a otras células.
También opsonizan células ya que las marcan para facilitar la fagocitosis.

Los anticuerpos están formados por cuatro cadenas:

• 2 pesadas (interiores)
• 2 ligeras (exteriores)

Además poseen dos regiones diferenciadas:

• Región constante
• Región variable

A la región específica del antígeno que reconoce el anticuerpo se le denomina EPÍTOPO.

A la región específica del anticuerpo que reconoce al antígeno se le denomina PARATOPO.

El anticuerpo reconoce una parte pequeña del antígeno (epítepo), el cual puede ser un azúcar, una
proteína…

•Idiotopo: parte que diferencia los anticuerpos de un mismo individuo dentro de este.
• Región bisagra: región no globular que se encuentra uniendo y dando flexibilidad a las cadenas
grandes de la Ig.
Variaciones de la Ig

Cada una de las variantes de inmunoglobulinas (IgG, IgA,IgM,IgD e IgE) igual

en individuos de la misma especie y diferente entre individuos de diferentes
• Isotopos:
especies

Ejemplo: la IgM humana tiene un Isotipo diferente a la IgM de ratón.

Diferentes polimorfísmoos presentes en individuos de la

misma especie. Cambios en la misma especie.
• Alotipos:
Ejemplo: la IgA1 en una persona NO es igual a la IgA1 de
otra persona

Variantes anti génicas características de cada inmunoglobulina en

un mismo individuo.
• Idiotipos
Cada variante reconoce un antígeno diferente

Tipos de anticuerpos
a) IgM:
Se encuentran pegados a los linfocitos B y disueltos en la sangre.
Se unen entre 5 IgM por la región Fc (final del brazo de abajo Y) formando un pentámero de IgM (no es
un inmunocomplejo ya que está formado por un Ag y un Ac
Son las primeras que se producen. No tienen regiones bisagra.
Aparecen como antenas en los linfocitos B.
Se unen en grupos de 5 por su región Fc y así tienen la capacidad de opsonización.

b) IgG:
Se generan después de las IgM.
Pueden atravesar la placenta y proteger al feto.
Las IgG suponen el 80% de todas las inmunoglobulinas del cuerpo.
Son las que permanecen una vez pasada la enfermedad.
Son los que permanecen más tiempo en el organismo

c) IgA:
Se generan después de las IgM.
Están presentes en la saliva, moco y leche materna.
También está en las mucosas.
Forma dímelos por la Fc.

d) IgD:
Sustituyen a las IgM y tienen mayor afinidad.
También aparecen formando parte de los linfocitos B

e) IgE:
Media en la mayoría de procesos alérgicos.
Su función es la de eliminar parásitos, sobre todo gusanos.
Alta afinidad.
b) citoquinas:
Las citoquinas son proteínas sintetizadas por los linfocitos T.
Tanto los Th1 como los Th2.

Se pueden dividir en cuatro grupos según sus funciones.

- Proinflamatorias
- Favorecen la respuesta celular o citotóxica
- Favorecen la producción de anticuerpos.
- Funciones homeostáticas no relacionadas con la inmunidad.

3.2.1 Fases de la respuesta de anticuerpos

Presenta cuatro etapas.

a) Fase de latencia: periodo entre la entrada del Ag y la detección de Ac específicos en suero.
b) Fase exponencial: la concentración de Ac en suero aumenta de forma exponencial.
c) Fase de meseta: se mantiene el nivel de Ac, mientras persiste la estimulación antigénica.
d) Fase de disminución: los anticuerpos van neutralizando al antígeno y los inmunocomplejos van siendo
retirados de la circulación.

3.3. Antígenos

Propiedades de los antígenos:

• Antigenicidad → capacidad de combinarse con anticuerpos.
Si una molécula es inmunogénica, también es antigénica.
• Inmunogenicidad → capacidad de inducir una respuesta inmune específica. Ag = Inmunógeno.
• Alergenicidad→capacidad de inducir algún tipo de respuesta alérgica.
Los alérgenos son inmunógenos.
• Tolerogenicidad→incapacidad de inducir una respuesta específica humoral o celular.

En los antígenos no toda la molécula interviene en la inducción de anticuerpos.

La parte del antígeno que se une con el receptor de los linfocitos y que desencadena la respuesta
inmunológica se llama epítopo o determinante antigénico.
4. Órganos del sistema inmune
4.1. Órganos linfoides primarios

a) Médula ósea roja

Hematopoyesis:
Se producen todas las células de la línea mieloide y linfoide a partir de los progenitores.
En la médula ósea madura los linfocitos B.
Los linfocitos T migran desde la médula hasta el timo. Adulto: tejido esponjoso de huesos planos.

b) Timo:
En el timo maduran los linfocitos T.
Mayor actividad en neonatos y en preadolescentes. En la adolescencia, el timo empieza a atrofiarse.
Actividad residual durante toda la etapa adulta.

4.2. Órganos linfoides secundarios

a) Ganglios linfáticos:
Los macrófagos fagocitan la mayor parte de los antígenos y estos son presentados a los linfocitos
(presentación de antígenos).
Los ganglios son más abundantes en determinadas zonas del cuerpo: axilas, ingles, zona cervical y
mesenterio.

b) Bazo:
Órgano más importante de respuesta inmunitaria a antígenos circulantes.
En el bazo se destruyen los eritrocitos envejecidos o en mal estado: Hemocateresis esplénica.

c) Amígdalas:
Papel decisivo con los patógenos que entran por la nariz y por la boca.
Existen tres tipos de amígdalas: palatinas, faríngeas o adenoides y las linguales.

d) MALT:
Tejido linfoide asociado a la mucosa (MALT) está presenta en el intestino (GALT) y en el árbol bronquial
(BALT) y también se encuentra en la mucosa urogenital.

5. Anticuerpos policlonales
5.1. Respuesta policlonal

El sistema inmune es capaz de generar muchísimas células B diferentes y, en consecuencia, muchísimas

moléculas diferentes de anticuerpos.

Nuestro cuerpo tiene células B con anticuerpos que son capaces de reconocer casi cualquier epítopo de
un antígeno presente en la naturaleza

Un patógeno genera proteínas y ciertas partes de esas

proteínas actúan como epítopos.
Así, alguno de los distintos anticuerpos generados por las
distintas células B presentes en el organismo reconocerán a
estos epítopos.
Una vez que el parátopo del anticuerpo se ha unido al epítopo
del antígeno, se produce un proceso de reacción y
proliferación de aquellas células B que han sido capaces de
identificar al antígeno.
Es lo que se conoce como reacción policlonal.
• Inmunógeno: cualquier sustancia que
desencadena la acción del sistema inmune.
• Huesos planos: costillas,caderas, esternón,
cráneo, vértebras.
• Gánglios linfáticos: es uno de los lugares
donde se da la presentación de Ag.
• Mesenterio: membrana que recubre los
órganos de la cavidad abdominal.
5.2. Obtención de anticuerpos policlonales

Para la obtención de anticuerpos policlonales se utilizan animales vivos.

Se inocula al animal con el antígeno con el que se quieren obtener anticuerpos.

El animal inoculado desarrollará una respuesta inmune y generará anticuerpos diferentes de distintas
células B.
Estos anticuerpos podrán ser extraídos mediante la obtención de suero del animal.

El animal habrá generado muchos clones de células B. Cada una de estas células sintetizará un
anticuerpo distinto con una especificidad diferente para cada uno de los epítopos presentes en el
antígeno.

Se crean indefinidos linfocitos B

diferentes, los cuales producen
anticuerpos diferentes que
pueden reconocer los diferentes
epítopos, y una vez un anticuerpo
se una al epítopo, se empieza a
crear clones del linfocito B que
produce ese anticuerpo.

6. Anticuerpos monoclonales
6.1. Obtención de anticuerpos monoclonales

1. Se inocula a un animal con el antígeno frente al cual se quiere obtener anticuerpos. Esto se hace de
forma repetida.
2. El animal desarrollará una respuesta inmune y se obtendrán las células B del bazo.
3. El animal genera numerosos clones de células B y cada una de esas células genera un anticuerpo con
una especificidad para un epítopo concreto del antígeno.
4. Una vez obtenidas las células B, se fusionan con células de mieloma múltiple gracias al uso de
polietienglicol.
5. Se ponen en un cultivo específico donde solo sobrevivirán aquellas células que hayan hibridado
(hibridomas).
6. Los hibridomas son células B con crecimiento ilimitado que son capaces de generar un anticuerpo
específico frente a un único antígeno.
6.2. Ventajas de los anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales suponen una ventaja frente a los policlonales.

Los anticuerpos monoclonales son homogéneos ya que todos derivan de un clon de célula B.
Además, son ilimitados porque existen cultivos permanentes.

• Ex vivo: vivo fuera del organismo

• In vivo: vivo dentro del organismo
• Vivo: natural
• Vitro: artificial
Tema 2: Tecnicas basadas en reacciones Ag-Ac Secundarias

1. Técnicas secundarias Ag-Ac

Existen 3 formas distintas en las que un antígeno puede unirse a un anticuerpo
1.1 técnicas de aglutinación
1.2 técnicas de precipitación
1.3 técnicas de fijación del complemento

1.1. Técnicas de aglutinación

Las reacciones de aglutinación suceden porque:
• Cada anticuerpo puede unirse a varios antígenos.
• Cada uno de los antígenos a varios anticuerpos.

En consecuencia se forma una red de antígenos y anticuerpos.

Aglutinación

Las técnicas de aglutinación se basan en la capacidad que tienen los antígenos multivalentes para unirse
a los anticuerpos complementarios dando lugar a inmunocomplejos o agregados visibles a simple vista

Ag Multivalente

Tienen varios epítopos o

Principio de las técnicas de aglutinación puntos de unión al Ac

En base a su capacidad de aglutinación, las Ig se pueden clasificar en:

• Aglutininas completas: siempre se aglutinan y son las IgM.
• Aglutininas incompletas: tienen menos poder aglutinante y en condiciones desfavorables no producen
la aglutinación. Son las IgG.

Las IgM forman estructuras

pentaméricas

Mayor poder de aglutinación

En base a su temperatura óptima de aglutinación, las Ig se pueden clasificar en:

• Aglutininas calientes: reacciones de aglutinación a una temperatura óptima de 37oC (IgM).

• Aglutininas frías o crioaglutininas: llevan a cabo reacciones de aglutinación a una temperatura óptima
de 4oC (IgG).

La aglutinación solo ocurre si las concentraciones de Ag y Ac son iguales.

• Exceso de Ag: se bloquean los 2 parátopos del Ac.
• Exceso de Ac: se bloquean todos los epítopos

Para que la reacción de aglutinación se produzca correctamente es necesario diluir el suero. Para trabajar
en concentraciones de Ac y Ag adecuadas.

Dependiendo de la solubilidad del Ag, las técnicas de aglutinación pueden ser:

• Técnicas de aglutinación directa: si el Ag es insoluble.
• Técnicas de aglutinación indirecta: hay que insolubilizar el Ag mediante su fijación en un soporte
(partículas o células).
1.1.1. Técnicas de aglutinación directa:

Técnica que se basa en detectar la reacción de aglutinación que provoca la formación de inmunocomplejos.

Los antígenos insolubles están en suspensión, los epítopos que tienen van a intervenir en la formación de
inmunocomplejos.

La lectura es inmediata, dado que a simple vista se aprecia la formación de esos agregados insolubles.

La forma de visualizarlo depende del soporte:

• Soporte plano (portaobjetos): la reacción positiva implica la formación de “grumos”. Estos “grumos” son
los patógenos unidos entre sí por los Ac específicos.

• Placa de microtitulación: el positivo se evidencia por la formación de un velo en la superficie del

pocillo correspondiente.

a) Prueba rápida de aglutinación en placa:

Esta prueba se utiliza para determinar si un paciente tiene anticuerpos específicos frente a un agente
concreto.

Bacterias del género

Brucella teñidas de rosa Brucelosis
bengala hacen de
antígeno
b) Hemaglutinación directa:
Se aplica a la determinación de los grupos sanguíneos del sistema ABO y Rh.

Antígenos ABO:
Tipo A: eritrocitos con antígenos A.
Tipo B: eritrocitos con antígenos B.
Tipo AB: eritrocitos con antígenos A y B.
Tipo O: eritrocitos sin antígenos A ni B.

Antígenos Rh:
Dos fenotipos posibles:
Rh+ : los eritrocitos tienen un antígeno D. Personas con genotipo DD o Dd.
Rh- : los eritrocito no presentan ese antígeno D. Personas con genotipo dd.

¿Cómo se realiza esta prueba?:

La sangre ha de ponerse en contacto con antisuero que tiene Ac monoclonales contra los antígenos A o B o
el Rh.
La aglutinación supone la existencia de uno o varios de esos antígenos en sangre.
 1.1.2. Técnicas de aglutinación indirecta:
En la aglutinación directa se utilizan Ag que están solubles, pero que hay que insolubilizar.

La insolubilización se hace por fijación a un soporte:

• Sólido inerte: bolas de látex, partículas de bentonita, carbón activo o gelatina.
• Célula: eritrocitos.

Da lugar a un antígeno particulado: una partícula sensibilizada con Ag.

a) Aglutinación en látex en placa:

Se utiliza una placa con partículas de látex sobre las que se pueden unir Ag o Ac, se quedan así
inmovilizadas e insolubles.
Los positivos se observan por la aparición de un moteado.
Existen Kits comerciales con todo lo necesario y no requieren de equipo específico para su lectura.

El látex no tiene
especificidades
alguna, se une a lo
que sea.

Cuando esté el látex

se una a los Ag se
aglutina.

b) Hemaglutinación indirecta (HAI):

En vez de partículas inertes se utilizan células como soporte para los Ag.
No son Ags de los propios hematíes.
Se usa una placa de microtitulación con diluciones seriadas de los sueros.
Permite realizar una determinación semicuantitativa. Ej: Toxoplasmosis.

Resultado positivo: velo rosáceo (los eritrocitos se agregan por los Ac).
Resultado negativo: Botón rojo (los eritrocitos no se aglutinan y, pasado un tiempo, sedimentan).

Se necesita de un control negativo para asegurarse de que no hay hemaglutininas en el suero problema.

Los eritrocitos tienen

sus propios Ag y Ac.

No se usan los Se busca qu

Ags propios se aglutine
de los
eritrocitos
c) Inhibición de la hemaglutinación (IHA):
Esta técnica es una variante de la técnica de hemaglutinación indirecta.
Algunos virus son capaces de provocar la aglutinación en eritrocitos, debido a la hemaglutinina que hay
en sus membranas.
Si unos el suero de un paciente que creo que tiene un determinado virus y lo incubo con ese virus, se
formarán inmunocomplejos.

Así, el virus queda neutralizado y no puede unirse a los eritrocitos a través de las hemaglutininas.
Entonces, no se aglutinará la sangre y esta sedimentará.
Resultado negativo

Por el contrario, si el virus no es el mismo que el de los Ac del paciente, no se formarán

inmunocomplejos. Y el virus podrá unirse a los eritrocitos a través de las hemaglutininas.
Resultado positivo

d) Prueba de Coombs:
También se basan en las pruebas de hemaglutinación.

En la prueba de Coombs se utilizan anticuerpos que se unen a los antígenos (anticuerpos humanos) que
hay en la superficie de los eritrocitos.
Se utilizan anticuerpos de animales inmunizados contra IgG o IgM humana (Ac humanos)

Antisuero de Coombs
Directa:
Se detectan los antígenos ya unidos al eritrocito.

Si se une el anticuerpo de animal al anticuerpo de humano

Anemia Hemolítica Autoinmune

Se forma aglutinación

Reacción positiva

Si no se une el anticuerpo de animal al anticuerpo de humano

No se forma aglutinación

Reacción negativa

Indirecta:
Se detectan los anticuerpos libres y se le añade el antisuero de Coombs

Si se une el anticuerpo de animal al anticuerpo de humano

Eritroblastosis fetal
Se forma aglutinación

Reacción positiva

Si no se une el anticuerpo de animal al anticuerpo de humano

No se forma aglutinación

Reacción negativa
1.2. Técnicas de precipitación

Un antígeno soluble multivalente se une a un anticuerpo específico. Así, se forma un inmunocomplejo Ag-Ac.
Este inmunocomplejo, precipita.

1.2.1. Técnicas de precipitación en medio líquido

Se basan en medir la turbidez que se produce por la precipitación de los inmunocomplejos.

Se puede hacer mediante dos técnicas.
• Turbidimetría.
• Nefelometría.

a) Inmunoturbidimetría.
Se basan en medir la turbidez que se produce por la precipitación de los inmunocomplejos mediante una
luz directa que lo atraviesa.
Se utiliza un espectrofotómetro.
Puede ser cuantitativa si se utilizan anticuerpos contra las IgA, las IgM o las IgG.
Grandes concentraciones de inmunocomplejos.

b) Inmunonefelometría.
Se basan en medir la turbidez que se produce por la precipitación de los inmunocomplejos mediante una
luz que lo atraviesa y se refleja en la máquina en ángulo de 70º.
Se utiliza un Nefelómetro .

1.2.2. Técnicas de precipitación en gel

Actualmente es la forma más utilizada.

Se utiliza gel de agar o agarosa.
Se realizan unos pocillos en la agarosa y, después, se añaden los componentes de la reacción (antígenos
y anticuerpos).
Estos componentes se difunden a través del gel.
La velocidad de difusión de esos componentes (Ag o Ac) depende de varios factores:
• Concentración de los componentes.
• Temperatura.
• Tamaño de las moléculas.
• Viscosidad del medio.

Cuando un Ac se encuentra con su correspondiente Ag, se forma una banda en el gel de agarosa.
Entonces, se formarán tantas bandas como número de inmunocomplejos Ag-Ac se formen.

Hay técnicas de difusión espontánea y técnicas de difusión forzada.

a) Doble difusión de Ouchterlony.

Tanto el antígeno como el anticuerpo difunden libremente por la agarosa.
El gel de agarosa se deposita sobre una placa Petri o un portaobjetos.
Se realizan dos pocillos o más.
Se echan los antígenos en un pocillo y los anticuerpos en el otro.

Es una técnica cualitativa

b) Inmunodifusión Radial o técnica de Macini:
Uno de los componentes está libre y el otro está disuelto en el propio gel de agarosa.
La formación de los inmunocomplejos da lugar a un anillo de precipitación.
El diámetro de ese anillo es proporcional a la concentración del componente que difunde por el gel.
La difusión ocurre en todas las direcciones a partir del pocillo.
Normalmente, la agarosa lleva anticuerpos diluidos, por lo que en los pocillos se ponen diluciones seriadas
de un Ag.

c) Inmunoelectroforesis:
Combina la electroforesis con los anticuerpos.
Se prepara un gel de agarosa como si fuésemos a hacer una electroforesis.
Se pone una mezcla antigénica en el centro del gel. Y se empieza la electroforesis.
La electroforesis permite separar la mezcla de antígenos según su masa y su carga.
Una vez separados los antígenos, se ponen anticuerpos a lo largo del gel y se espera a que se de la
reacción de precipitación.

d) Inmunofijación:
Es una variante de la inmunoelectroforesis.
Se utiliza para evaluar las proteínas del mieloma múltiple.
El suero problema se pone en cinco carriles y se somete a electroforesis. Cada carril se cubre de Ac
específico.
Cuando el Ac se une al Ag se forma un precipitado.
e) Contrainmunoelectroforesis (CIEF).

Doble difusión, pero forzada mediante un campo eléctrico.

Ventaja: disminuir el tiempo de incubación y aumentar la sensibilidad.
Técnica cualitativa.
Se lleva a cabo en geles de agarosa.
El pH hace que los Ac tengan carga positiva o neutra y los Ag carga negativa.
Los Ac se mueven hacia los Ag y viceversa, hasta que se encuentran y precipitan.

f) Electroinmunodifusión (EID)

Inmunodifusión radial forzada por una corriente eléctrica.

Ventaja: incrementa la velocidad de incubación y aumenta la sensibilidad.
También se la conoce como electroforesis en cohete porque se forman precipitados que recuerdan a un
cohete.
El gel de agarosa lleva diluido el anticuerpo.
El pH del gel ha de tener el mismo punto isoeléctrico que los anticuerpos. Así estos no se desplazan por el
gel.
Solo migran los antígenos.
Tema 3: aplicación de técnicas basadas en reacciones Ag-Ac

Índice:
1. Introducción.
2. Enzimoinmunoensayos.
3. Fluoroinmunoensayos.
4. Radioinmunmoensayos.
5. Inmunoensayos quimioluminiscentes.
6. Inmunocromatograsfías.
7. Técnica de Western Blot.

1. Introducción:
En las reacciones antígeno-anticuerpo primarias no se genera ningún producto.
No se ve a simple vista ningún cambio.
Por eso, se utilizan indicadores o marcadores.

Todas las reacciones en las que utilizan marcadores tanto en antígenos como en anticuerpos se llama:
Imnunoensayos.

1.1. Marcadores:
Los marcadores se unen a los antígeno o a los anticuerpos.
Esta unión no impide la formación del complejo antígeno-anticuerpo.
Ni altera de su función.

A la unión del marcador con el antígeno o con el anticuerpo

Conjugado
Región constante

Las igM se unen

Parátopo
Los marcadores son moléculas de naturaleza variable:
- Fluorocromos.
- Enzimas.
- Isótopos radioactivos.
- Nanopartículas coloreadas de metales pesados.

a) Fluorocromos:
- Moléculas que tienen fluorescencia.
- Su color dependerá de en qué rango del espectro absorban la luz y en qué rango la emitan.
- Fluoroinmunoensayos.

b) Enzimas:
- La enzima se une al Ac o el Ag y se añade el sustrato de esa enzima.
- Si se ha producido la formación del inmunocomplejo, la enzima transforma al sustrato en un producto
coloreado.
- Enzimoinmunoensayos.

Enzima
c) Isótopos radioactivos:
- Los antígenos o anticuerpos son marcados con isótopos radioactivos.
- Técnica muy sensible.
- Actualmente en desuso por su peligrosidad.
- Radioinmunoensayos.

d) Nanopartículas coloreadas de metales pesados:

- Nanopartículas que se unen a los antígenos o los anticuerpos.
- En el revelado se ven líneas de precipitación coloreadas.
- Inmunocromatografías.

1.2. Clasificación de los inmunoensayos.

- Los inmunoensayos se pueden clasificar por el tipo de marcador.
- O por si hay competencia o no en la formación de inmunocomplejos.
- O por si en la valoración del resultado es necesario eliminar o no las moléculas que no han formado
inmunocomplejos. (Homogéneo o heterogéneo)

1.2.1. Competitivos y no competitivos.

a) Competitivos:
- Se establece una competencia entre antígenos marcados y antígenos sin marcar por un mismo Ac.

- Se establece una competencia entre antígenos marcados y antígenos sin marcar por un mismo Ac.
- Para determinar el antígeno de una muestra problema, se añade anticuerpo y antígeno marcado.
- El antígeno de la muestra y el antígeno marcado compiten entre ellos.
- Se mide la cantidad de Ag marcado no conjugado.
- Inversamente proporcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra.
- A mayor cantidad de Ag en la muestra, menos Ag marcado podrá formar inmunocomplejos.

b) No competitivos:
- Se utilizan para determinar un antígeno de la muestra problema y se añade anticuerpo marcado.
- Cuanto mayor sea la cantidad de Ag, más Ac marcados.

- La cantidad de Ac marcado que ha formado inmunocomplejos es directamente proporcional a la cantidad

de Ag.
 Inmunoensayos competitivos y no competitivos

Se pueden usar para determinar Ac en muestras

1.2.1. Heterogéneos y homogéneos.

a) Heterogéneos:
- Se retiran los Ac o Ag que no hayan formado inmunocomplejos. ➢ Los Ac o Ag problema suelen estar
en fase sólida.
- Los Ac o Ag que están sueltos se retiran con lavados sucesivos.
- Determinar sustancias de alto peso molecular.

b) Homogéneos:
- No se retiran las moléculas que no hayan formado inmunocomplejos.
- Procedimientos más sencillos.
- Determinar sustancias de bajo peso molecular.

1.3. Representación de datos y obtención de resultados.

Los resultados se pueden obtener por dos medios:

- El resultado es el valor medio mediante un formato normalizado.

- El resultado se obtiene por extrapolación en una curva patrón.
- El resultado se obtiene por extrapolación en una curva patrón.
2. Enzimoinmunoensayos:
- Los marcadores son enzimas.

Enzima
Enzima
Ag

Sustrato

Sustrato

Producto
Ag Producto coloreado
coloreado

2.1. Ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA).

2.1.1. Características generales.

- La técnica de ELISA tiene unas características básicas que se repiten en los distintos tipos de Elisa.
- El antígeno o anticuerpo lleva una enzima (marcador) y está insolubilizado.
- Se revela fácilmente porque se añade un sustrato que se transforma en un producto coloreado.
- Este producto coloreado puede verse a simple vista o con el uso de un espectrofotómetro.

a) Soporte:
El soporte debe ser inmunoadsorbente.
Microplacas de poliestireno.

b) Enzimas:
Las más usadas son:
- Fosfatasa alcalina
- Peroxidasa

Comercialmente conjugadas a antígeno y a anticuerpos.

Dos propiedades de las enzimas:

- Impedimento estérico: Tanto la enzima como los Ag y los Ac deben mantener su actividad.

Si la molécula es muy grande

o Impedimento estérico
Dos puntos de unión están muy juntos

- Relación de conjugación: A mayor cantidad de enzimas por Ac o Ag, mayor será la intensidad de la
señal.
c) Sustratos:
Se usan sustratos cromogénicos.
Estos sustratos son incoloros y se colorean al ser transformados en productos.
Se mide la variación de densidad óptica.

2.1.2. Pasos básicos de la técnica ELISA.

a). Tapizado.
Adsorción de los Ag o los Ac (conjugados o no) en el soporte.

b). Bloqueo o postapizado.

Se hace mediante la adición de una proteína irrelevante.
Así, se evitan fijaciones inespecíficas.

c) Conjugación:
Unión del Ag o el Ac con la enzima (marcador).

En el laboratorio Agente puente: glutaraldehído o m-peryodato sódico.

d) Incubaciones y lavados.
Se añaden Ac o Ag para que se formen inmunocomplejos.
Los Ac o Ag sobrantes se lavan con solución salina o PBS.

2.1.3. ELISAS no competitivos:

a) ELISA directo para detección de antígenos.

Fijación al soporte del Ag.
Se añaden Ac marcados con enzimas.
Se deja incubar los Ac con los Ag y, después, se eliminan los conjugados que no se hayan unido.
Se añade un sustrato sobre el que actúe la enzima.
Incubación en oscuridad.
Se detiene la reacción y se leen los resultados.
b) ELISA indirecto para detección de anticuerpos.

Fijación al soporte de antígenos específicos para los Ac problema.

Se hace un lavado para eliminar los Ag que no se han fijado.
Se añaden los Ac problema.
Se incuban los Ac con los Ag y después se lavan. Solo quedarán los inmunocomplejos
Se añaden los conjugados: anti-anticuerpos marcados con enzima.
Se incuba para la formación de nuevos inmunocomplejos y se lava.
Se añade un sustrato sobre el que actúa la enzima.
Incubación en oscuridad hasta el desarrollo del color.
Se detiene la reacción y se ven los resultados.

c) Elisa sándwich DAS.

1. Fijación de los anticuerpos para el antígeno objeto de estudio.
2. Posterior lavado.
3. Adición de la muestra de estudio.
4. Incubación posterior para formación del inmunocomplejo.
5. Adición de los conjugados.
6. Conjugados = Ac con enzima contra el Ag
7. Incubación y lavado.
8. Adición del sustrato.
9. Incubación en oscuridad.
d) Elisa Sandwich HADAS.
1. Fijación de los anticuerpos para el antígeno objeto de estudio.
2. Posterior lavado
3. Adición de la muestra de estudio: Ag.
4. Incubación y lavado.
5. Adición de Ac específicos para el Ag.
6. Incubación y lavado.
7. Adición de conjugados: anti-anticuerpos para los Ac.
8. Incubación y lavado.
9. Adición del sustrato
10. Incubación en oscuridad y lectura.
2.1.4. ELISAS competitivos:

a) Elisa de competición para anticuerpos.

1. Fijación de Ag específico para el Ac de estudio.
2. Adición de muestra y conjugados.
3. Incubación y lavado.
4. Adición de sustrato e incubación en oscuridad.
5. Lectura resultados.

Los Ac fijados Los Ac fijados

son Ac son Ac sin
marcados marcar.
b) ELISA de competición para detección de Ag.
1. Fijación de Ac
2. Lavado y adición de BSA
3. Adición muestra y conjugados
4. Incubación y lavado
5. Adición de un sustrato
6. Frenado y lectura
3. Fluoroinmunoensayo.
Inmunoensayos cuyo marcador es un fluorocromo.

- Inmunofluorescencia
- Fluoroenzimoinmunoensayos

3.1. Inmunofiuorescencia.
Ag o Ac marcado con un fluorocromo.

a). Directa:
Se fija un Ag en un portaobjetos.
Se añade el Ac conjugado con un
fluorocromo. Se deja incubar
Se lava y se leen los resultados = Microscopio de fluorescencia
b) Indirecta
1. Se fija un Ag a un portaobjetos
2. Se añade un Ac problema y se incuba.
3. Se lava
4. Se añade un anti-Ac marcado con fluorescencia
5. Se incuba
6. Se lava y se leen los resultados: Microscopio de fluorescencia
3. Fluoroinmunoensayo.
3.2. Fluoroenzimoinmunoensayo.

Se utiliza la capacidad de las enzimas de generar productos.

4. Radioinmunoensayo

Se usan radioisótopos
Al antígeno o anticuerpo marcado con un radioisótopo se le conoce como trazador.

4.1. Tipos de radioinmunoensayos

a) RIA en fase líquida (inhibición por competición)

Se incuba Ag marcador (trazador)

Se incuba Ac Se incuba todo junto
Se incuba Ag sin marcar (concentración desconocida)

Se basa en inhibición por competición

Ag*
Compiten por
Un mismo Ac

Ag
Ag unido a Ac
Ag* libre

Ag* unido a Ac

Contador de centelleo líquido

Recuento Ag*

Contador gamma

b) RIA en fase sólida (no competitivo)

El proceso va por partes

1. Se fija a un soporte
2. Se añade BSA y se lava
3. Se añade Ac y se incuba NO competitivo
4. Se lava y se añade Ac marcado contra el Ac
5. Se incuba y se lava
6. Se leen los resultados
5. Inmunocromatografías

a). Cromatografía de flujo lateral

Prueba de un solo paso
Marcador: nanopartículas coloreadas

b). Nanopartículas de metales pesados

- Nanoparticulas oro: Bandas rosadas

- Nanopartículas selenio: Bandas azules

Tanto para Ag como Ac

c). Tira de nitrocelulosa

Presenta 5 zonas:
1. Siembra de la muestra
2. Zona conjugado
3. Zona de detección
4. Zona control
5. Región absorbente

d). Inmunocromatografía para detección de Ag

- Test Covid de Ag
- Test de embarazo

e). Inmunocromatografía para detección de Ac

6. Western Blot

Detección de proteínas sobre nitrocelulosa

Tema 4: Técnicas de identificación de poblaciones celulares

1. Introducción: técnicas de separación celular

Las distintas técnicas permiten la separación de poblaciones celulares.

- Identificación de células
- Activación y funcionalidad celular

2. Citometria de flujo:
Es una técnica de análisis de poblaciones celulares en suspensión. Se usa mucho para
La mayor aplicación actual es caracterizar subpoblaciones de linfocitos. leusemias, mielomas y
Tiene una alta especificidad. linfomas

Fundamento de la citometria de flujo

Se trata de forzar a una suspensión de células u otras partículas incluidas en un flujo de líquido isotónico
a pasar de una en una por delante de un haz de luz (láser) y varios detectores.
Permiten recoger y medir las diversas características físicas y/o químicas.

De esto se derivan dos grupos de parámetros:

1. Los parámetros derivados de la luz: Nos habla de características físicas. Es una luz que se dispersa al
incidir sobre la célula.
- Tamaño.
- Granularidad: si la superficie es lisa, rugosa o si tiene salientes la luz se dispersará de diferentes
maneras pudiendo conocer la complejidad de la célula.

2. Los parámetros derivados de Fluorocromos: Nos habla de características químicas

- Fluorocromos naturales (autofluorescencia)
- Fluorocromos unidos a Ac.

La finalidad de los fluorocromos es poder

interpretar los distintos tipos de células en
un dot-plot .

El aspecto mas importante del citometro de flujo es que puede hacer mediciones sobre cada célula o
partícula individual. Cada célula pasa una a una por un punto específico.
La información que es recogida por los detectores es enviada a un ordenador.
Mediante un programa, se podrán ver distintas gráficas.
La maquina cuenta todas las células y es
capaz de distinguir que célula tenia un
fluorocromo asociado
2.2. Preparación de suspensiones celulares

Hay una serie de requisitos:

1. Suspensión representativa del tejido.
2. Suspensión de alta calidad:
- Que este bien y tenga alta cantidad de células.
- Que no este contaminada.
- Que tenga pocos agregados y restos
- Que tenga bajos coeficientes de variación.
3. Preserve las características celulares.
4. Que contenga suficiente muestra celular.

Las muestras solidas:

- Disgregación mecánica: ejemplos: mortero, picadora
- Disgregación química: (enzimas) se deberá tener en cuenta que la enzima no destruya ni altere la
proteína de membrana que se vaya a estudiar.

Todos los métodos generan algún tipo de alteración celular o en los Ag de la membrana.

2.3. Funcionamiento:
La suspensión de células se conduce mecánicamente hasta una sección donde se convierte en una fina
corriente de fluido.
Se dispersa en unas microscópicas gotitas sobre las que incide el haz de luz.

En función de como dispersa la luz de la célula:

• Forward Scattering:
- Dispersión frontal a 0º
- Tamaño de la célula: por la sombra se ve si es más grande o mas pequeña

• Side Scattering:
- Dispersión lateral a 90º
- Complejidad superficial y granularidad de la célula: las células tienen proteínas de membrana en su
superficie y son detectadas por este láser. Hay células que tienen mayor cantidad de proteínas en la
membrana y por ellos son mas complejas y hay células que tienen menos cantidad de proteínas y son
menos complejas.
Las células pueden incubarse con Ac marcados con fluorocromos.
La luz láser excita a los fluorocromos y estos emiten luz.
Esta luz va a ser recogida por los tubos fotomultiplicadores.

Ventajas Desventajas

Objetividad Costes instrumentación

Elevada sensibilidad Imposibilidad de visualizar las células analizadas
Velocidad de análisis
Mediciones simultáneas

Los citómetros de flujo más modernos separan poblaciones celulares, dos poblaciones se separan al
aplicar cargas + y -
2.4. Análisis de datos:

Los datos se analizan mediante un programa.

El programa analiza tanto el tamaño como la granularidad.
Y combina esos datos con el porcentaje de células que son fluorescentes y la intensidad de la misma.

Los datos se reflejan de las dos formas

1. Histogramas:
Número

Tamaño

El eje de las X refleja la intensidad de fluorescencia.

El eje de las Y refleja la densidad de las células.

2. Dot-plot

Es un conjunto de puntos y cada punto una célula.

Se escogen dos parámetros, suelen ser:

- Tamaño celular = Dispersión de la luz de frente: Forward Scattered (FSC).

- Complejidad celular = Luz dispersada por lateralmente: Side Scattered (SSC).
Complejidad

Tamaño

- Los linfocitos son células sin granularidad y de pequeño tamaño

- Monocitos son de mayor tamaño y poco complejos
- Neutrófilos son de mayor tamaño y muy complejos

Se utiliza para ver las poblaciones de células sanguíneas y alteraciones en células sanguíneas.
2.5.2. Cuantificación de moléculas:

Las principales moléculas que se pueden detectar son:

a). Proteínas:

Para ellos se utilizan microesferas

Estas microesferas se recubren con Ac específicos contra las proteínas.

• Se usan microesferas en vez de

un soporte para después poder
pasarlo por el citometro de flujo,
Se añade la proteína problema y se incuba.
donde estás simularán una célula.
• Se añade Fluorocromos para
conocer la cantidad de proteínas.

Se añade el Ac que lleva el fluorocromo

Lavado y análisis en citómetro de flujo

b). Anticuerpos:

Permite el diagnóstico serológico de enfermedades infecciosas.

También se emplean microesferas

Microesferas recubiertas de los Ag específicos

Añadir los Ac muestra e incubar

Se añaden Fluorocromos
para conocer la cantidad
de Ig.

Lavar y añadir los Ac con fluorocromo

Lavar y analizar con el citómetro de flujo

Tema 5: Valoración de la funcionalidad de la inmunidad celular

1. Estudio de linfocitos
Son responsables de la inmunidad adaptativa
Su estudio permite hacer una valoración del sistema inmune
Los estudios son tanto de funcionalidad como de cuantificación

1.1. Técnicas de separación de linfocitos

Para realizar cualquier prueba hay que separar los linfocitos de resto de células sanguíneas.

a). Separación de linfocitos: Ficoll

Es la técnica más habitual para obtener linfocitos de sangre periférica.
Consiste en obtener sangre sin fibrina y diluirla en medio de cultivo.
Esta dilución se vierte sobre un tubo que contiene Ficoll
Se centrifuga y se obtiene la sangre separada.

El medio de separación esta formado por dos compuestos:

1. Ficoll 400:
- Tiene una densidad mayor que los linfocitos.
- Tiene una densidad menor que los eritrocitos y los granulocitos.
- Provoca aglutinación de los eritrocitos.

2. Diatrizoato de sodio:
- Densidad óptima para la separación de células
- Osmolalidad necesaria para mantener la viabilidad de las mismas (evita que las células estallen).

Fundamento de la separación:
- Granulocitos: más densos.
- Fondo del tubo Eritrocitos: se aglutinan. Fondo del tubo.
- Células mononucleares: interfase.

Tras la centrifugación:
- Banda superior: corresponde al plasma
- Banda intermedia: células mononucleares
- Banda inferior: sedimento de eritrocitos y granulocitos

Pasos para la separación:

1. Diluir la sangre con el medio de cultivo.
2. Echar el ficoll al tubo Falcon.
3. Verter la sangre diluida sobre el Ficoll.
4. Centrifugar a 400 G durante 30 minutos.
5. El tubo tiene tres fases. Se recoge la fase
intermedia y se pasa a un tubo limpio.
6. Se añade medio otra vez y se resuspende.
7. Se lavan las células y se centrifuga. Se repite el
paso y se añade medio nuevo
8. Se añade azul Tripán para ver la viabilidad de
las células. (Ya que solo tiñe los muertos).
Los linfocitos vivos se podrán usar para hacer un
cultivo y tras esto un cariotipado de ellos.
1.1.1. Separación de poblaciones

a). Separación celular inmunomagnética:

Partículas magnéticas recubiertas de Ac
Se usan unos Ac u otros: según que linfocitos se quieran separar.

b) Técnicas de inmunotoxicidad:
Se separa una población Lisandro el resto de poblaciones subcelulares.
Se utilizan Ac y el sistema de complemento.

c). Panning para linfocitos:

Se usan placas que tienen Ac contra los linfocitos
Tanto linfocitos B como T

d). Citometría de flujo:

Separar distintas poblaciones y subpoblaciones celulares.

1.2. Estudio funcionalidad linfocitos B

La Funcionalidad de Linfocito B se determina por:

- La capacidad de dividirse.
- Producción de anticuerpos = diagnóstico de inmunodeficiencias

Se cuantifican los niveles

IgG
IgM Inmunodifusión radial
IgA

1.3. Estudio funcionalidad linfocitos T:

Se puede hacer mediante:

a). Estudios de proliferación en respuesta a mitógenos

Mitógeno: Sustancia que interviene en el ciclo celular, estimulando la división celular.

La proliferación de los linfoblastos = aumento de ADN

Si añado tímida tritiada al medio de cultivo = los linfoblastos incorporan esa timina

Se pone en contacto linfocitos maduros con un mitógeno y produce que vuelva a estadios de maduración
anterior (linfoblasto), lo que permite que se divida.

Se añade timidina tritiada (H3) para que al incorporarse el ADN de los linfocitos se les pueda identificar al
ser tritio radioactivo.

Se hará la tasa de proliferación comparando linfoblastos de control y linfoblastos con mitógeno.

Los linfoblastos con mitógeno deberán proliferar con mayor rapidez que los linfoblastos control.

b). Valoración de citoquinas

Se miden las cantidades de citoquinas que hay en los sobrenadantes de los cultivos estimulados con
mitógenos.
Se miden mediante un Elisa HADAS
c). Prueba de hipersensibilidad cutánea retardada:
Es una prueba típica cuando se sospecha que tiene tuberculosis: Test de Mantoux
Se hace con una inoculación intracuténea de una cantidad de antígeno, suele ser un derivado proteico
purificado (PPD).

Pasadas las 48 - 72 horas se observa el sitio de la inyección.

Si se observa si hay una aparición de pápula superior a 2mm de diámetro (positivo). Que quiere decir que
hay anticuerpos contra ese antígeno.

Si no aparece ninguna pápula = Test negativo (se sospecha de algún tipo de inmunodeficiencia)

2. Estudio de las Células fagocíticas

Los fagocitos (macrofagos y neutrófilos) son Células de la inmunidad innata.

Hay diferentes métodos de estudio:

1. Nitro blue tetrazolium:

Se usa Nitro blue tetrazolium:

- Es un compuesto soluble de color amarillo.
- Es fagocitado y se transforma en un compuesto azul. (La reacción de cambio de color se da por las
oxidasas). (Si funcionan bien y son capaces de producir peróxido de hidrógeno (H2O2) transformarán el
compuesto cambiando de color).
- Si no se transforma en Formazán, quiere decir que no funcionan las oxidadas del NADPH.

Enfermedad granulomatosa crónica

Oxidadas del NADPH afectado

Fagocitos Fagocitos
funcionando bien funcionando mal

2. Evaluación de la actividad microbicida:

Sirve para ver la capacidad de los fagocitos no solo de fagocitar si no también de destruir microorganismos

Se hace un cultivo con bacterias al crecer se las cuentas y se añaden fagocitos, después de un tiempo se
vuelven a contar y se ven cuántas colonias han desaparecido.

3. Ensayos de quimiotaxis:
Observar la locomoción de los neutrofilos en una dirección concreta y ver si se ven atraídos por diferentes
estímulos.

Se ponen dos cámaras aisladas separadas por un filtro (un filtro que permite el paso de los neutrofilos). En
una de las cámaras se ponen las células y en la otra cámara se pone un agente quimiotáctico.
3. Estudio del complemento:

Función principal: producir la lisis de las membranas de las células de los patógenos.

Las alteraciones del complemento:

- Pruebas funcionales
- Pruebas inmunoquímicas

3.1. Cuantificación de fracciones C1, C3 y C4

la ausencia o presencia de C1, C3 y C4 provoca las inmunodeficiencias o enfermedades autoinmunes.

La evaluación del Complemento (C) en el laboratorio sirve para:

- Estudio de inmunodeficiencias: Es la ausencia o no funcionalidad de algunos de los factores de la

cascada por causa genética.
- Enfermedades autoinmunes: Orientar el diagnóstico y ayudar a evaluar el curso de la enfermedad.
Ejemplo de enfermedad autoinmune: lupus eritematoso.

Se puede ver si hay una septicemia por bacterias Gram - y en shock anafiláctico.

Nivel bajo de C3
Todas ellas se determinan y cuantifican mediante inmunodifusión radial o nefelometría.

3.2 Actividad hemolítica del complemento

Ver la capacidad tiene el sistema para lisar eritrocitos

Sirve solo para analizar la Vía Clásica y se hace mediante:

- Técnica CH50
- Técnica de hemolisis en gel de agarosa.

a) Técnica CH50:
Se mezcla el suero con el sistema de complemento + Eritrocitos sensibilizados (marcados) con Ac = Vía
Clásica se activa.
Se produce la hemolisis de eritrocitos
Se van añadiendo volúmenes crecientes de suero con sistema de complemento
Se calcula el volumen de suero que lisa el 50% de los eritrocitos.
Se le conoce como unidad hemolítica 50 o como unidad CH50.

b). Técnica de hemolisis en gel de agarosa: (es una modificación del anterior)
Se prepara un gel de agarosa al cual se incorporan eritrocitos sensibilizados con Ac
Se excavan pocillos en la agarosa
Se añade suero que contiene complemento
Está en distintas concentraciones
Muestra problema y muestras control
El complemento difunde por el gel, entra en contacto con los Ac de los eritrocitos y se genera un halo
circular de lisis.
El diámetro será proporcional a la concentración y funcionalidad de la muestra.
• Enfermedad celiaca: intolerancia al gluten
- Malabsorción, atrofia de las vellosidades intestinales e intolerancia al gluten.
- El gluten es quién ataca a las células.
- Ocasionado por una predisposición genética.

• Colitis ulcerosa: enfermedad que afecta a la mucosa que recubre el colón por que los Ac la atacan
- Dolor abdominal.
- Pérdida de peso
- Segmentó afectado: colón
- Anticuerpos que atacan la capa mucosa
- Diarrea sanguinolenta

• Enfermedad de Chron: (colón irritable)

- Dolor abdominal
- Fiebre
- Pérdida de peso
- Puede afectar a todo el tracto gastrointestinal

• Vitíligo:
- Despigmentación de la piel
- Los Ac destruyen los melanocitos.
- Manchas blancas en la piel

b). Enfermedades sistémicas o no organoespecificas: El sistema inmune ataca a varios órganos o zonas de tu
cuerpo.

La respuesta inmune va contra distintos tejidos del organismo

• Lupus eritematoso:
- Crónica (de por vida)
- tenemos linfocitos T y B autorreactivos (que te van a atacar)
- Ausencia de linfocitos T reguladores (como no hay, nadie te defiende de los linfocitos que te atacan)
- Producción de anticuerpos antinucleares (atacan al núcleo de las células)
- Afecta sobretodo a mujeres
- Fiebre alta
- Exantemas - Lo más frecuente en una persona con lupus es tener la
- Artritis piel mal y antes de eso afecta tus órganos
- Problemas cardiacos y pulmonares - Se suelen poner corticoides para bajar la inflamacón,
aparte de inmundosupresores.
- Las enfermedades autoinmunes están muy ligadas al
• Artritis reumatoide: estrés.
- Enfermedad crónica (de por vida)
- Inflamatoria
- Afecta a las articulaciones
- Se caracteriza por: destrucción del cartílago, erosiones óseas y deformaciones articulares.
- Afecta más a las mujeres
- Sobre todo se da entre los 35 y los 50 años
- Predisposición genética
- Factores ambientales fundamentales: haber pasado la rubéola, citomegalovirus, herpes y mononucleosis,
bacterias intestinales.
- Se produce factor reumatoide (la función exacta se desconoce, sirve como marcador molecular)
- Su función exacta en la enfermedad se desconoce
- Marcador de actividad inflamatoria y autoinmune.
• Anemia hemolítica autoinmune:
- Enfermedad primaria (no hay una causa detrás)
- o secundaria debido a que se desarrolla por cánceres u otras enfermedades autoinmunes.
- Los eritrocitos sufren hemolisis debido a que hay autoanticuerpos que los atacan.
Es muy difícil crear un tratamiento efectivo 100% porque habrá que matar también lo bueno

2. Tipos de autoanticuerpos

La naturaleza y especificidad de los anticuerpos es muy variada.

Para detectar estos autoanticuerpos, se utilizan todas las técnicas inmunológicas vistas en los temas
anteriores.
(Inmunofluorescensia directa y Elisa)

Los autoanticuerpos pueden ser:

2.1. Autoanticuerpos organoespecíficos

Reconocen tejidos o células de un tejido concreto. (Van por algo en concreto, ya sea una proteína,
polisacarido o lo que sea de ese tejido)
Los antígenos que se utilizan para detectar estos autoanticuerpos son sacados de los tejidos o células
concretas.
Es fácil de detectar porque va a un órgano en concreto.

2.2. Autoanticuerpos no organoespecíficos

Se dividen en dos grupos

a) Autoanticuerpos Antinucleares (ANA):

- Atacan el contenido del núcleo celular (atacan los núcleos)
- Se detectan mediante una inmunofluorescencia indirecta
- Se utiliza una línea celular específica HEp-2
Sirven para detectar si tengo una enfermedad autoinmune pero no para saber cual, se sabe despues con
el cuadro clínico y con pruebas más específicas.

IFI sobre células Hep - 2

b) Anticitoplasma de neutrófilo (ANCA):

- Anticuerpos (propios) que actúan sobre neutrófilos.
- Indican la existencia de varias enfermedades autoinmunes
- Se detectan mediante inmunofluorescencia indirecta (lo que más se usa)
- Hay dos tipos de patrones P-ANCA y C-ANCA
- Se usan neutrófilos
- Sirven para detectar si tengo una enfermedad autoinmune pero no siempre saber cual, se sabe despues
con el cuadro clínico y con pruebas más específicas.
3. Determinación de autoanticuerpos

- La inmunofluorescencia indirecta es la más utilizada

- Los antígenos utilizados son variados (depende de la enfermedad si es órgano especifica o no)
- Permiten detectar distintas enfermedades autoinmunes

3.1. Determinación de autoanticuerpos organoespecíficos mediante IFI.

- Se puede usar para detectar distintas enfermedades autoinmunes

- Ejemplo: Diabetes mellitus II, tiroiditis de hashimoto.
- Normalmente el diagnóstico es bioquímico pero también se puede hacer un diagnostico inmune.
- Hay excepciones en pruebas inmunológicas
- Se usan cortes de páncreas humano
- Suero problema (sospecha de autoanticuerpos contra los islotes de Lagerhans)
- Inmunofluorescencia indirecta

3.2. Detección de autoanticuerpos no organoespecíficos mediante IFI.

Autoanticuerpos que más se utilizan son los ANA y los ANCA

a) Detección de ANA:
Prueba de tamizaje
Sospecha de una enfermedad autoinmune Se realiza un IFI (Inmunofluorescencia indirecta)
Si es positivo, se realiza un ELISA
Se utilizan células que tienen gran cantidad de material nuclear
Línea celular Hep-2
Carcino escamoso esofágico: presentan un núcleo de mayor tamaño

Procedimiento:
1. Se pone en contacto el suero problema con las células
2. Se deja incubar, se lava y se añade un segundo anticuerpo con un fluorocromo
3. Se deja incubar, se lava y se interpretan los resultados

Resultado positivo:
- Aparecerá fluorescencia
- El suero contiene ANA

Resultado negativo:
- No aparecerá fluorescencia Pregunta de examen
- El suero no contiene ANA Que pruebas se realizan: inmunofluorescencia
indirecta (IFI)
Como se interpreta el resultado

1. Patrón de fluorescencia

2. Cantidad de anticuerpos en suero