UT 8

TÉCNICAS
DE
HIBRIDACIÓN
 01 02 03
DOT BLOT SOUTHERN BLOT NORTHERN BLOT

04 05 06
MICROARRAYS CAPTURA DE ADN RAMIFICADO
HIBRIDO
 07 08 09
ISH TIPOS DE ISH FLUORESCENTE ISH CROMOGÉNICA
MUESTRAS (CISH)

8.1 8.2
FISH METAFÁSICA FISH INTERFÁSICA
 TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN SEGÚN
EL MEDIO
Un criterio para
EN SOPORTE SÓLIDO
clasificar las La sonda o la diana se inmovilizan en
un soporte sólido (normalmente la
técnicas de secuencia diana)

hibridación puede EN MEDIO LÍQUIDO

El hibrido sonda-diana se forma en
ser el medio o solución y después se fija a la pared
del pocillo
soporte en el que
tienen lugar IN SITU (ISH: in Situ Hybridization)
Se localiza la secuencia sobre los
cromosomas/células/tejidos.
EN SOPORTE SOLIDO EN MEDIO LIQUIDO IN SITU

TÉCNICA DE CAPTURA FISH (FLUORESCENCIA. Se

DOT BLOT
DE HÍBRIDO marca con fluorocromos)

TÉCNICA DE ADN CISH (CROMOGÉNICA). Se

SOUTHERN BLOT
RAMIFICADO marca con haptenos

NORTHERN BLOT

MICROARRAYS
EN SOPORTE SÓLIDO
 01 DOT BLOT

En esta técnica Sobre la membrana

utilizan membranas se sitúa una gota de
de nylon o la muestra a
nitrocelulosa como analizar.
soporte sólido. Es la Se pueden utilizar
forma más simple de sondas radiactivas
hibridación. o sondas marcadas
con haptenos
 01 DOT BLOT

→ Primero se debe humedecer la membrana de

soporte en un tampón adecuado o bien en agua
destilada durante 5 o 10 minutos
→ Después se deja secar la membrana sobre dos
hojas de papel de filtro
→ A continuación se sitúa en el sistema de vacío
que permite la fijación de la muestra a la membrana
 01 DOT BLOT

→ En el caso de estar trabajando con ADN primero debe

desnaturalizarse .
→ Las muestras se someten a procesos de incubación y
neutralización, para seguidamente cargarse en las posiciones
de la plantilla y aplicar el vacío. De este modo el ADN queda
retenido en la membrana y los reactivos se filtran.
 01 DOT BLOT
Se detecta el híbrido: ya
sea mediante una placa
radiográfica (si era
Se añaden los radioactivo) o mediante
antígenos o Se realizan los un método de
proteínas que se lavados detección cromogénica
quieren detectar poshibridación (si eran haptenos)

Se añade una solución en la Se añade el Ac secundario

que se encuentra la sonda (o con el elemento
Ac 1º) y se incuba a una cromogénico (p ej una
temperatura adecuada enzima)
 01 DOT BLOT

Permite detectar la presencia y concentración de la secuencia de

bases o de la proteína (pero no discriminar entre diferentes
secuencias)
ELEMENTO
CROMOGÉNICO

AC SECUNDARIO

AC PRIMARIO

ELEMENTO
DIANA
MEMBRANA DE NITROCELULOSA (proteína,
secuencia..)
01 DOT BLOT
 01 DOT BLOT

VIDEO DOT BLOT

https://www.youtube.com/watch?v=EzEeWMOZr3c
 01 DOT BLOT
Sus aplicaciones más importante son:

Para detectar mutaciones,

Como técnica de (siempre que las
rastreo para variedades de los alelos
detectar secuencias sean reducidas como
de interés puede ser en la anemia
falciforme)

Detección de
presencia de
virus
bacterias o
parásitos
01 DOT BLOT
En este caso se recorta
una membrana del mismo
Un tipo especial de Dot tamaño que la placa Petri
blot se utiliza para en el que se encuentran
detectar bacterias que las colonias y se coloca
tienen una secuencia sobre las colonias para
génica concreta, que con realizar una impronta de
frecuencia es un plásmido estas.
De ese modo
posteriormente se puede
identificar la colonia de
interés
01 DOT BLOT
01 DOT BLOT
02 SOUTHERN BLOT
En este caso se pueden
identificar secuencias de
ADN que han sido
separados previamente en
una electroforesis en gel.
Después se transfiere a una
membrana de nitrocelulosa
o nylon
A diferencia del
dot blot, en este
caso se pueden
detectar varias
secuencias diana
de diferentes
tamaños en un
solo proceso de
hibridación
02 SOUTHERN BLOT

Permite reconocer la Además permite

presencia o ausencia de reconocer el
una secuencia concreta en tamaño de la
diferentes muestras secuencia ( a
diferencia del Dot
Blot)
 02 SOUTHERN BLOT
Para obtener una
Se separan los réplica exacta del
Actúan las fragmentos
enzimas de patrón de bandas
según su de ADN.
restricción tamaño. Incubación con la
Previamente hay sonda marcada y
Se realiza un que desnaturalizar lavado posterior
marcado para el ADN
reconocer
DIGESTIÓN rápidamente los
ENZIMÁTICA fragmentos que
migran HIBRIDACION
TRANSFERENCIA
DEL ADN A
MEMBRANA
ELECTROFORÉSIS
EN GEL

autorradiografía
REVELADO
02 SOUTHERN BLOT

AGENTE INTERCALANTE PARA MARCADO

 02 SOUTHERN BLOT
Aplicaciones
Detección
Elaboración de
de huellas secuencias
genéticas adquiridas

Estudio de
mutaciones
02 SOUTHERN BLOT
02 SOUTHERN BLOT

VIDEOS SOUTHERN BLOT

https://youtu.be/LNVdOdNQyCM
https://youtu.be/CSrUm-EgTK4
 03 NORTHERN BLOT
No es necesaria la
utilización de enzimas
Se basa en el de restricción, dado
que el ARN obtenido a
mismo proceso partir de un listado
Se deben utilizar
agentes
que la celular ya se encuentra desnaturalizantes
Southern blot ≠ dividido en varios
tamaños
porque el ARN en
solución tiene a
pero aplicado producir uniones
a ARN No es necesaria
la
desnaturalización
No es necesaria la previa
desnaturalización
previa
03 NORTHERN BLOT

VIDEO NORTHERN BLOT

https://youtu.be/11NHYntRV4Q
 03 NORTHERN BLOT
Aplicaciones
Estudios de
Análisis de corte y
expresión empalme
génica alternativos

Detección de
mutaciones
03 NORTHERN BLOT

Por si os lo preguntáis….si, hay una

técnica que se llama Western
Blot, que se utiliza para proteínas.
https://www.youtube.com/watch?v=qT_AqI-MKJc
 04 MICROARRAYS
Se utilizan pequeñas
porciones de ADN, que De las células que queremos
corresponden con estudiar, obtendremos su
diversos genes, de los ARNm y gracias a la
que se quiere comprobar transcriptasa inversa,
si se están expresando o obtendremos su ADN. (ADNc)
no. Cada punto es un que se marcará con una
gen. Estos se encuentran molécula fluorescente. Esto
en el chip. Esto son las será la SONDA
DIANAS.
 04 MICROARRAYS
Las sondas se
enfrentarán al chip del
microarray. Las sondas
que complementen con
las secuencias diana, se
hibridarán y quedarán
fijadas.
Se procede al lavado del
microarray para eliminar Se procede a leer el microarray mediante
un escáner que excita los puntos de la
las sondas no fijadas matriz. Un software interpreta los
resultados
04 MICROARRAYS
Resultado obtenido en un microarray en el que
se ha realizado un estudio comparativo de
expresión génica, marcando en rojo la muestra
problema y en verde la muestra de referencia.
Los puntos rojos indican expresión en la
muestra problema de genes normalmente
reprimidos; los puntos verdes indican genes
reprimidos en la muestra problema que se
expresan en situaciones normales; los puntos
amarillos indican genes que se expresan sin
alteraciones en la muestra problema; los
puntos anaranjados indican genes
sobreexpresados en la muestra problema; los
puntos amarillo-verdosos indican genes
infraexpresados en la muestra problema.
 04 MICROARRAYS
VIDEOS MICROARRAYS
https://www.youtube.com/watch?v=0ATUjAxNf6U
https://www.youtube.com/watch?v=hJMdso9SaIo
https://www.youtube.com/watch?v=wpiPK2OCtWM
https://www.youtube.com/watch?v=UgL1Pq2sk3M
04 MICROARRAYS

Con estos estudios se puede saber qué genes se

expresan y con qué intensidad relativa, ya que se
hibrida solo con un gen
Permite saber qué genes están activos en las muestras
 04 MICROARRAYS

https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/micro
array/
 04 MICROARRAYS
Aplicaciones
Hibridación
Estudios de genómica
expresión comparada
génica para estudiar los
efectos de
medicamentos y las
respuestas ante
agentes físicos,
Detecta la químicos o
Detecta infecciosos
mayor o
alteraciones con
menor
pérdida o
expresión de
ganancia de
los genes
material genético
EN MEDIO LÍQUIDO
05 CAPTURA DE HÍBRIDO
Se basa en la formación La captura del híbrido
de híbridos ADN-ARN, se produce utilizando
que van a interactuar anticuerpos
con anticuerpos específicos, que
específicos. La reconocen estos
secuencia diana puede híbridos. Los
ser ADN (la sonda será anticuerpos se
de ARN) o la secuencia encuentran en las
diana puede ser ARN (la paredes delos pocillos
sonda será ADN). de una placa microtiter.
05 CAPTURA DE HÍBRIDO
Lisis del virus y desnaturalización del ADN

Hibridación con la sonda de ARN

Captura del híbrido→ Se traspasa a un pocillo de placa microtiter, que

tiene en la pared anticuerpos anti ADN-ARN. Los híbridos quedan así
fijados a la pared del pocillo
Detección del híbrido → mediante anticuerpos anti ADN-ARN
marcados con fosfatasa alcalina (se fijan al “otro lado” de la
molécula
Revelado; añadiendo una sustancia quimioluminiscente,
que mediante la fosfatasa alcalina produce luminiscencia
 05 CAPTURA DE HÍBRIDO
ANTICUERPOS ANTI
ADN-ARN
MARCADOS

n
d
a
HÍBRIDO ADN-ARN

N
R
A
Anticuerpo anti ADN-ARN

PLACA MICROTITER QUE INTERACTÚA

CON EL HÍBRIDO ADN-ARN AL
ANTICUERPOS ANTI ADN-ARN
05 CAPTURA DE HÍBRIDO

VIDEO
https://youtu.be/CGvOgRySZVo?t=64
https://youtu.be/SBWXsUo-w8M?t=61
 05 CAPTURA DE HÍBRIDO
Aplicaciones
Detección de
agentes
infecciosos Detección de
microorganismos
contaminantes
06 ADN RAMIFICADO

En este caso se une la secuencia diana a

un complejo de ADN, mediante sucesivas
hibridaciones.
De este modo se aumenta la sensibilidad
de la técnica
06 ADN RAMIFICADO

Lisis de las partículas víricas y desnaturalización (en virus

ADN)
Hibridación con 2 tipos de sondas
Sondas de captura: una parte se complementa con
el AN vírico y la otra parte se complementa a una cadena de
nucleótidos que está fijada a la pared del pocillo microtiter
Sondas de extensión: Una parte complementa con
el AN vírico y la otra a una cadena de nucleóticos
preamplificadora que se utilizará después.
06 ADN RAMIFICADO

Lisis de las partículas víricas y desnaturalización (en virus

ADN)
Hibridación con 2 tipos de sondas
SondasESde captura: unaUTILIZAR
FRECUENTE parte se complementa con
el AN vírico y la otra parteDE
EXTENSORES se CAPTURA,
complementa a una cadena de
QUE
nucleótidos que estáAMPLIFICAR
PERMITEN fijada a la pared
A LAdelSONDA
pocillo microtiter
DE CAPTURA
Sondas de extensión: Una parte complementa con
el AN vírico y la otra a una cadena de nucleóticos
preamplificadora que se utilizará después.
06 ADN RAMIFICADO
En la hibridación el ácido nucleico por
tanto queda unido a la sonda de
captura por un lado y a la sonda de
extensión por el otro.
La sonda de captura se unirá a los
oligonucleótidos que se encuentran en
la placa y que se complementan con
ella
06 ADN RAMIFICADO

Se realiza la hibridación en un tubo, de

modo que el ácido nucleico quedará unido
a ambos tipos de sondas por las regiones
complementarias, quedando las regiones
que no complementan sin hibridar.
 06 ADN RAMIFICADO

Captura del híbrido : la mezcla de hibridación

se pasa a un pocillo de una placa microtiter, en
la que hay una cadena de nucleótidos de
captura, que es complementaria a la región
del AN diana que ha quedado sin hibridar. De
este modo en el ácido nucleico queda anclado
a la placa .
06 ADN RAMIFICADO

Preamplificación : se añade una cadena de nucleótidos

preamplificador en cuyo extremo tiene una secuencia que
es complementaria a la región no hibridada de la sonda de
extensión ( o con el AN)
Amplificación : se añaden las cadenas de nucleótidos
amplificadores que hibridan con la cadena de nucleótidos
preamplificadores
06 ADN RAMIFICADO

Detección : se añaden oligonucleótidos marcados

con fosfatasa alcalina que se une a la cadena de
nucleótidos amplificadores
Revelado se añade un sustrato
químioluminiscente que por acción de la fosfatasa
alcalina emite luminosidad detectable .
06 ADN RAMIFICADO

Lisis de las partículas víricas y desnaturalización si es necesario

Hibridación

Captura del híbrido

Preamplificación

Amplificacion

Detección

Revelado
06 ADN RAMIFICADO
AMPLIFICADOR
EXTENSOR

PREAMPLIFICADOR

AN DIANA

EXTENSOR DE CAPTURA

SONDA DE CAPTURA

PLACA con oligonucleótidos de captura

 06 ADN RAMIFICADO
Aplicaciones
Aumenta la
sensibilidad
de la captura Cuantifica
de híbrido la carga
viral de la
muestra
06 ADN RAMIFICADO
06 ADN RAMIFICADO
06 ADN RAMIFICADO
06 ADN RAMIFICADO
VIDEOS

https://youtu.be/k_t3rHTnEqg?t=88

https://www.thermofisher.com/es/es/home/life-science/gene-
expression-analysis-genotyping/quantigene-rna-assays.html
IN SITU (ISH)
07 ISH TIPOS DE MUESTRAS

La particularidad de esta técnica es que la

secuencia diana se encuentra en su lugar
fisiológico. Este pueden ser los cromosomas o el
núcleo en interfase (en el caso de que
busquemos ADN) o el citoplasma (en el caso de
que trabajemos con ARN).
07 ISH TIPOS DE MUESTRAS

Las muestras deben encontrarse en

monocapa sobre un portaobjetos donde se
realizará la hibridación
Permite investigar la expresión de un gen
mediante la detección del ARNm
También permite localizar el gen en el
cromosoma
 ISH (hibridación in situ)
08
0
FLUORESCENTE (FISH)

Se utilizan sondas marcadas con fluorocromos, que

se detectan en el microscopio de fluorescencia.
Se realizan sobre cromosomas metafásicos (FISH
metafásica) o en núcleos interfásicos desnudos
(FISH interfásica). También se puede realizar sobre
tejido congelado.
 ISH (hibridación in situ)
08 FLUORESCENTE (FISH)
La técnica básica consiste en aplicar una
solución en la que se encuentra la sonda
marcada sobre el área de hibridación (que
está en monocapa sobre un portaobjetos)
y colocar un cubreobjetos. A continuación,
se incuba la preparación para
desnaturalizar el ADN.
 ISH (hibridación in situ)
08 FLUORESCENTE (FISH)
Posteriormente se lava y se añade una
solución que se denomina de
contratinción, que contiene una sustancia
que al excitarse con luz ultravioleta los
núcleos muestran fluorescencia azul en el
microscopio de fluorescencia.
 ISH (hibridación in situ)
08 FLUORESCENTE (FISH)
 ISH (hibridación in situ)
08 FLUORESCENTE (FISH)
 ISH (hibridación in situ)
08 FLUORESCENTE (FISH)
 ISH (hibridación in situ)
08 FLUORESCENTE (FISH)
 8.1 FISH METAFÁSICA

Se detectan secuencias específicas de ADN

directamente en los cromosomas en extensiones
de metafases celulares. En este caso se utilizan
sondas que hibridan en el centrómero (en el caso de
que se quieran detectar anomalías numéricas) o
sondas específicas de un locus concreto (en el caso
de que se quieran detectar anomalías estructurales)
(en ocasiones también se utilizan sondas
teloméricas).
 8.2 FISH INTERFÁSICA
Se detectan secuencias específicas de ADN directamente en los
cromosomas, en extensiones de interfases celulares, también se
pueden utilizar sobre tejidos. Las sondas se crean para la
anomalía específica que se quiera detectar.
Es más rápida que la metafásica, al no necesitar cultivo
Detecta nº de copias de los cromosomas y algunas
reorganizaciones especificas de ciertos tipos de cáncer.
 09 ISH CROMOGÉNICA(CISH)

En este caso el híbrido se detecta gracias a una

reacción inmunohistoquímica, en la que se
produce un producto coloreado, que puede verse
en un microscopio convencional .
Se realiza sobre secciones de tejido FFPE (las
muestras fijadas en formol tienen cierta
fluorescencia en sí mismas por lo que se interpretan
con mucha dificultad en una FISH)
09 ISH CROMOGÉNICA(CISH)

Se utilizan para detectar secuencias génicas de

oncovirus (como el virus del papiloma humano) o
para detección de ARNm que permiten estudios de
la expresión génica (para detección de oncogenes
en determinadas lesiones )
09 ISH CROMOGÉNICA(CISH)

Primero se debe desparafinar e hidratar el tejido

Se digiere enzimáticamente para liberar los ácidos
nucleicos
Se realiza la hibridación
Para la visualización se utiliza un microscopio óptico
09 ISH CROMOGÉNICA(CISH)
FIN
 REPASO
https://es.educaplay.com/recursos-educativos/11830298-
repaso_ut_8_tecnicas_de_hibridacion_de_acidos_nucleicos.html