- MICRO- - ORGANISMOS - DE LOS ALIMENTOS 2 ~ Métodos de muestreo - para analisis ~ microbiologicos: - Principios y - aplicaciones > especificas Dea yee yeu yee aa pea eee 2.2 edicién ICMSF OkMicroorganismos de los alimentos Volumen 2 Métodos de muestreo para andlisis microbiolégicos: Principios y aplicaciones especificas Segunda edicién Traducido por Dr. Juan Antonio Ordénez Pereda Catedrético de Tecnologia de los Alimentos Dr. Gonzalo Garcia de Fernando Minguilléa Prof. Titular de Tecnologia de los Alimentos Dpto. de Nutricién y Bromatologta II (Higiene y Tecnologia de los Alimentos) Facultad de Veterinaria, Madrid Editorial ACRIBIA, S.A. ZARAGOZA (Espafia) ) Dov rede akIndice de contenido — Tablas .. Figuras . : Prefacio a la segunda edicién Prefacio a la primera edicién Abreviaturas de sociedades y organismos ............06.0cecccceeee eee eeeseseeeeees XXI ‘ Parte I Principios ce 1 Criterios microbiolégicos significativos para alimentos . 3 ie A Principios para el establecimiento de los criterios microbiolégicos ..... 4 . B Definiciones ........ 5 : © Seleccién de los criterios microbiolégicos. Consideraciones esenciales . 6 a D _Desarrollos y aplicaciones a nivel internacional 9 2 Conceptos de probabilidad y muestreo ...................45 ees A Probabilidad 1B i: B _Poblacién y muestra de poblacién 14 C __Distribucién de recuentos . 14 : D___Eleccién de las unidades de muestra ... 15 E _ El programa de muestreo See ee F _Lacurva caracteristica de operacién 15 ae G___ Probabilidad de los riesgos de! Sacred y del consumidor . 17 H_ — Aceptacién y rechazo ... eee 7 fee 3 Principios para la obtencién de muestras .. 19 A {Qué es un lote?........ 19 : B {Qué es una muestra representativa? 20 s C Uso de la tabla de ntimeros aleatorios ... 20 oaYXyVRV, BY D Principios fundamentales .. 21 = E _ Consideraciones précticas . tec 4 Programas de muestreo apropiados ...........:000000e00eseseees 2 A Programas de atributos de dos clases . 29 B Programas de atributos de tres clases . . e 30 C — Comparacién entre los programas de dos y tres clases . vee D Influencia del tamaiio del lote ...... 34 ae E Muestreo de variables . 38 5 Elecci6n del programa de muestreo segtin el objetivo ............-5.5200 39 A Principios generales 39 B Factores que influyen en el riesgo 40 1 ie Indice de utilidad . . 47 D Anilisis de indicadores (riesgo bajo) 47 E _ Anilisis de patégenos (riesgo moderado y alto) 47 F _ Elecci6n de pruebas adecuadas . : 48 G Influencia de las condiciones de manipula ny uso en el riesgo cece 4B H Eleccién de la «categoria» ..... 50 I Eleccién entre programas de dos y tres ie 61 5 Determinacién de los valores my M .....-+ 61 K —_ Conocimiento especifico del lote ... 64 L___ gEn qué consiste una «probabilidad de aceptacin> satisfactoria? .. 65 M Eleccién denye ....-+ 66 N Muestreo investigativo ....... 67 © _Inspecciones mis rigurosas ..... nD 6 Programas de muestreo para situaciones con riesgo directo de presencia de patégenos ..... 75 A Concepto de tolerancia cero . cee sey ee eer 15 B Programas de muestreo para Salmonella ris C Problemas en la implantacion de programas de muestreo severos 79 D Relacién con las practicas comerciales habituales . 82 7 Control en el punto de origen. Aproximacién al sistema de andlisis de riesgos ¢ identificacién y control de puntos critics .......-......000++ 85 ‘A Opciones de control .....2..00seccceceetcerersseeesetseesennees 85 B El sistema de anilisis de riesgos ¢ @ identificaci y / control de puntos criticos (ARICPC) ..- 2.20 e eee eee tere on 87 c Aplicacién del sistema de ARICPC 93 8 Aplicacién de programas de variables 7 A Programas de variables . : 97 B Relacién con los programas de atributos . ae vrIdentificaci6n de una distribucién de frecuencias apropiada , Aplicacién de un programa de variables Seleccién de k, ....... Seleccién del valor limite V. oe ee Ejemplo de un programa de variables ........ ee Utilizaci6n de un programa de variables para Buenas Priicticas de Fabricacién . mommMoa 9 Recogida y manipulacién de muestras y unidades analiticas ............. A Unidad de muestra frente a unidad analitica ... B _ Directrices generales ..........2.000004 Parte II Propuestas especificas para el muestreo y programas de muestreo 10 Introduccién: Aplicacién y usos de criterios . A Formato de los capftulos de los productos B _ Seleccisn y aplicacién de los criterios C __Eleccién de los microorganismos . D__ Seleccién de los limites. 11 Programas de muestreo para carnes crudas . Razones del muestreo ... Programas de muestreo . Procedimientos de muestreo Recogida de muestras . Procedimientos analtticos moaw> 12 Programas de muestreo para carnes procesadas A Razones del muestreo . B Programas de muestreo 13 Programas de muestreo para carnes de aves y productos derivados ...... A Razones del muestreo . B Programas de muestreo ies Procedimientos de muestreo .. . D Procedimientos analfticos 14 Programas de muestreo para piensos de origen animal y alimentos para animales de compaiiia Aes Piensng ee ae See eee C __ Seleccién de criterios microbiolégicos . 97 98 98 100 100 103 103 104 13 3 113, 114 14 7 117 119 121 122 122 125 125 126 133 133 134 138 139 141 141 143 143 vw“15 Programas de muestreo para leche y productos lacteos ................ A B c Productos relativamente perecederos Productos relativamente estables . Procedimientos de muestreo . ~16 Programas de muestreo para huevos y ovoproductos ...............60000+ A B Programas de muestreo .... Procedimientos de muestreo . “17 Programas de muestreo para pescados y mariscos A B c D Aspectos sanitarios del pescado como alimento para el hombre........2++++ Bases para propuestas de muestreo especificas Programas de muestreo . Procedimientos de muestreo .. _~18 Programas de muestreo para hortalizas, frutas y frutos secos ......... : o> anmmoo Frutas y hortalizas crudas .......-... : Frutas y hortalizas congeladas . Frutas y hortalizas enlatadas .. Frutas y hortalizas deshidratadas . Levaduras y biomasa celular .... Frutos secos ......... Procedimientos de muestreo __ 19 Programas de muestreo para bebidas refrescantes, zumos, concentrados y consevas de frutas .................555 20 Programas de muestreo para cerales y sus productos ..............- A B 2 D Granos y harinas Pasta deshidratada y congelada Productos de panaderfa congelados rellenes o cubiertos ......-. Procedimientos y métodos de muestreo . _. 21 Programas de muestreo para especias, condimentos y gomas ......... (~ 22 Programas de muestreo para grasas y aceites ...... vin Comercio intemacional Obienci6n de muestras de especias y gomas Microbiologia de las especias, gomas y productos de herboristeria Programas de muestreo 179 179 179 181 181 183 185 185 188 189 190 191 191 192 192 19323 Programas de muestreo para azticar, cacao, chocolate y productos de pasteleria ... 1 Aaicary edulcorantes . A Razones del muestreo . B Programas de muestreo H Cacao y chocolate ...... A Razones del muestreo ... B Programas de muestreo HI Productos de pasteleria . A Razones del muestreo B Programas de muestreo IV Muestreo y andlisis para el cacao, licor de chocolate, recubrimientos a base de cacao, chocolate y otros productos de pasteleria 24 Programas de muestreo para alimentos formulados A Alimentos para bebés y niffos ......... B Programas de muestreo para alimentos para bebés y nifios y para algunos alimentos dietéticos . Procedimientos de muestreo 25 Programas de muestreo para aguas minerales naturales, otras aguas embotelladas, aguas de procesos y hielo . 26 Re A Definiciones e importancia econémica del agua en el comercio internacional ...... Razones del muestreo Programas de muestreo ........ Procedimientos de muestreo ... Procedimientos analiticos . . moaw Jimentos enlatados estables .... . A A B __Integridad de los envases . C Agua de enfriamiento D Pruebas de incubacién . E F Validacién de los procesos y registros .. Muestreo ... Apéndices jicas recomendadas para alimentos enlatados Objetivos y logros de la comisién internacional de especificaciones microbiolégicas para alimentos .. Miembros de la ICMSF y sus subcomisiones . Contribuidores a la financiacién de la ICMSF durante 1970 - 1984 Publicaciones de la ICMSF . 203 204 206 208 2u 213 214 217 217 221 221 222 222 222 223 2235. Laboratorios que han colaborado en los estudios de métodos de la ICMSF 6 Principios generales para el establecimiento y Y aplicacién de criterios microbiol6gicos de alimentos . See Glosasio ........- indice alfabético ...... 239 243 247Tablas ONE ra 10 a 12 13 14 Diez mil nimeros aleatorios Programas de dos clases (c=) ..- Programas de dos clases para determinados valores oc Programas de tres clases: probabilidades de aceptacién (P; )de Totes que contienen las proporeiones indicadas para varios ntimeros de unidades de nuestra analizadas y para diversos valores ¢ (P= rechazables [%}; P,, = aceptables provisionalmente [%])* . : Probabilidades de aceptacién (P,) para los programas de atributos a 5 clases cuando el lote analizado contiene 5%, 20% 6 50% de unidades de muestra >m* Severidad del programa (categoria) en relacién con el riesgo sanitario y con las condiciones de uso Pee eaeEaeL Principales microorganismos patégenos y toxinas .. : : Alimentos destinados a los grupos de consumidores mas susceptibles . Relaciones entre las «categorifas» (grado de importancia), tipo de alimento, pruebas microbiolégicas y condiciones de tratamiento del alimento .... Programas de muestreo recomendados para combinaciones de diferentes grados de riesgo para la salud y diversas condiciones de manipulacién (es decir, las 15 categorias) ne = Eleccién de programas de muestreo rutinarios 0 programas mis rigurosos en fancién de las circunstancias propias del alimento : Probabilidades de aceptacién (P,) para programas de dos clases con n entre 10 y 300 y c=Oyy entre 300 y 5000 yc=0.... Probabilidad de obtener una o mds muestras a en un muestreo ode n unidades de muestra en funcién de la proporcién, p, del lote que es rechazable .... Severidad de muestreos para Salmonella en alimentos con diferentes categorias de riesgo de causar enfermedad (todos son programas de 2 clases con ¢= 0) ......++++ Comparacién entre algunas caracteristicas de operacién de varios programas de muestreo importantes en la determinacién de microorganismos patégenos (datos recogidos de la Tablas 2 y 3) . eee Bae Bey BRE ce 37 40 68 70 a as 78 81 XI16. 17 18 19 20 21 eee 23 24 25 26 27 29 30 31 32 33 34 Valores de k, calcutados mediante la distribucién de t no central. Especiicacion de seguridad/calidad (rechazo si z+ k$ > V) .vsesesee . Ejemplo de recuento de aerobios en placa para una muestra de came de aves ( Valores de k, calculados usando una distribucién de ¢ no central. Limite de GMP (aceptacion si ¥ + k,s < v) a Programas de muestreo y limites microbiol6gicos recomendados para carne cruda . Programas de muestreo y limites microbiol6gicos recomendados para productos céirnicos procesados .... . Programas de muestreo para carmes curadas en semiconserva (a emplear cuando no se dispone de los datos del procesado o son insatisfactorios) . Programas de muestreo y Iimites microbiolégicos recomendados para carne de aves y productos derivados Programas de muestreo y limites microbiol6gicos recomendados para alimentos para animales de compaiifa . : Programas le muestreo y limites microbiol6gicos recomendados para leche en polvo yequeso........ . Programas de muestfeo y limites microbioldgicos recomendados para huevo liquide pasterizado, congelado y ovoproductos deshidratados .........0..00es00ee0+ “Asignacién de pescados, mariscos y sus productos a categoria ....... : Programas ce muestreo y limites microbiol6gicos recomendados para productos de lapesca ........ Programas de muestreo y limites microbiol6gicos recomendados para hortaizas, frutas, frutos secos y levaduras . os Programas de muestre y limites microbiol6gicos recomendados para cerales y productos dlerivados ......... ae Programas de muestfeo y limites microbiol6gicos recomendados para manteca de cacahuetes y de otros frutos secos Concentraciones de edulcorantes liquidos comerciales Programas de muestreo limites microbiol6gicos recomendados para cacao, chocolate y productos de pastelerfa ............+ Programas de muestreo y limites microbiol6gicos recomendados para alimentos infantiles y algunos tipos de alimentos dietéticos Programas de muestreo y mites microbioldgicos recomendados para aguas embotelladus .... 99 100 101 120 126 130 137 142 148 160 170 7 180. 187 196 199 200 207 eewane Curva caracteristica de operacién para n= 10, ¢ = 16 Curvas caracteristicas de operacién para te tamaiios 5 de muestra a(n vy diferentes criterios de aceptacién (c) en los programas de atributos de dos clases Eleccién del programa de muestreo para una aplicacién definida Consideraciones sobre la elecci6n dem y M 31 62 Relaciones entre el programa de muestreo y el grado de seguridad que confiere: curvas para tres programas de muestreo propuestos para Salmonella ....- 16 Curvas caracteristicas de operacién para los programas de muestreo con un niimero pequefio de unidades de muestra (tos recogidos a partir de las Tablas 2 y 3) Distribucién logaritmica normal . 80 8Abreviaturas AMI AOAC APHA CEC DHSS EEC FAO FPL HPB HWC IAMS ICMSF IDF TEC 10cC Iso. TUBS de sociedades y organismos American Meat Institute (Instituto Americano de la Carne) ion of Offical Analytical Chemists (Asociacién de Quimicos Analiticos Oficiales) ‘American Public Health Association (Asociacién Americana de Salud Pablica) Commission on the European Communities (Comisién en la Comunidad Europea) Department of Health and Social Security, UK (Departamento de Salud y Seguridad Social, R.U.) European Economic Community, now European Unién (Comunidad Econémica Europea, ahora Comunidad Europea) Food and Agriculture Organization of the United Nations (Organizaci6n de las Naciones Unidas para la Agricultura y Alimentaci6n) United States Food and Drug Administration (Administracién de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos) Food Processors Institute (Instituto de Fabricantes de Alimentos) Health and Protection Branch, Health and Welfare Canada (Seccién de Salud y Proteccién, Salud y Bienestar de Canada) Health and Welfare Canada (Salud y Bienestar de Canada) International Association of Microbiological Societies (Asociacién Internacional de Sociedades de Microbiologia) International Commission on Microbiological Specifications for Foods (Comisién Internacional sobre Especificaciones Microbiolégicas de los Alimentos) International Dairy Federation (Federacién Internacional de Lecheria) International Egg Commission (Comisién Internacional de Huevos) International Office of Cocoa and Chocolate (Oficina Internacional del Cacao y Chocolate) International Standards Organization (Organizaci6n Intemacional de Normas) International Union of Biological Societies (Unién Internacional de Sociedades de Biologia) XXIIUMS NAS NCA NCDC NCI NFPA NRC NSDA OSU USDHEW USPHS WHO XXII International Union of Microbiological Societies (Unién Internacional de Sociedades de Microbiologia) National Academy of Sciences of United Sates (Academia Nacional de Ciencias de Estados Unidos) National Canners Association (Asociacién Nacional de Conserveros) United States National Communicable Disease Center (Centro Nacional de Enfermedades Transmisibles de Estados Unidos) National Cheese Institute (Instituto Nacional del Queso) National Food Processors Association (Asociacién Nacional de Fabricantes de Alimentos) National Research Council of the United States (Consejo Nacional de Investigacién de Estados Unidos) National Soft Drink Association (Asociacién Nacional de Bebidas Refrescantes) Oregon State University (Universidad del Estado de Oregén) United States Department of Health, Education and Welfare (Ministerio de Salud, Educacién y Bienestar de Estados Unidos) United States Public Health Service (Servicio de Salud Pablica de Estados Unidos) World Health Organization of the United Nations (Organizacién Mundial de la Salud de las Naciones Unidas)Parte I Principios i) saae]seee) cee) seaa) aa)1 Criterios microbiolégicos significativos para alimentos ‘Tradicionalmente, las agencias internacionales y las organizaciones comerciales han utiliza- do tres estrategias principales para el control de los riesgos microbianos de los alimentos. Estas son: a) educacién y entrenamiento, b) inspeccidn de las operaciones y del utillaje y c) andlisis nicrobiolégicos. Como en la edicién precedente de este libro (ICMSF, 1978b), nuestro princi- pal objetivo es hacer énfasis en el uso de las pruebas microbiolégicas mediante la aplicacién de riterios microbiolégicos para alimentos; es decir, normas, especificaciones y recomendaciones para minimizar los riesgos microbianos de los alimentos. Sin embargo, reconocemos que para utilizar cada una de las tres estrategias tradicionales es necesario disponer de un sistema de control 6ptimo de los riesgos microbianos. El Capitulo 7 trata, con todo detalle, de un sistema que incluye todas estas estrategias, el sistema de Andlisis de Riesgos ¢ Identifieacion y Control de Puntos Criticos (ARICPC). Desde la publicacién de la primera edicién de este libro, ha aumentado répidamente el inte~ és en los criterios microbiolégicos debido, principalmente, a la creencia general de que dichos criterios son titiles para asegurar la salubridad y calidad de los alimentos y, por tanto, de su acep- tabilidad por el consumnidor, Igualmente, este aumento del interés en los criterios microbiolGgi- os se ha debido también a la atencién que los fabricantes han prestado y a las consecuencias derivadas de la aplicacion de los mismos. El fundamento para la aplicacién de los criterios'microbiolégicos se basa en que los micro- organisms estn intimamente relacionados con la salubridad y calidad de los alimentos. El fac- tor predominante es, sin embargo, la salubridad, Este término se refiere a Ia presencia 0 ausen- cia de microorganismos patégenos 0 sus toxinas, al niimero de patégenos presentes y 2 la facilidad con que estos agentes pueden controlarse 0 destruirse. La calidad microbiolégica se refiere, por otra parte, a 1a presencia 0 ausencia de microorganismos que pueden causar Ia alte- racién o que indican algin fallo en el seguimiento de Buenas Précticas Comerciales (BPC), y a laeficacia de las medidas para controlar o destruir dichos microorganismos. La aplicacién de criterios microbiolégicos deberfa distinguir entre un producto aceptable ¢ inaceptable o entre précticas de fabricacién y manipulacién aceptables e inaceptables. El uso de Jos criterios microbiolégicos para estos fines ha sido tratado previamente por la ICMSF y diver- sos cientificos ¢ instituciones. Entre ellos se incluyen diversos grupos de estudio de la Organizacién Mundial de la Salud (WHO) y de la Organizacién para la Agricultura y Alimen- VNVOY i c= mn a = os 4 Microorganismos de los alimentos tacién (FAO) de las Naciones Unidas (ICMSF, 1978b, 1980; FAO/WHO, 1974,1975,197, 1979; WHO, 1974,1976; Codex, 198ta,b; NAS-NRC, 1964; Corlett, 1974; Foster, 1969; Kronick, 1973; Olson, 1975, 1978; Peterson, 1970; Thatcher, 1955). Aquf se han intentado incluir los progresos conseguidos en este Area de la microbiologfa de los alimentos y, asimismo, ayudar a tener una perspectiva del contenido de los siguientes capitulos. A PRINCIPIOS PARA EL ESTABLECIMIENTO DE LOS CRITERIOS MICROBIOLOGICOS Entre las contribuciones mas recientes en relacién con el desarrollo de los criterios micro- biolégicos significativos de los alimentos, quizas haya sido la més relevante la prepara- cién del Codex Alimentarius «Principios Generales para el Establecimiento y Aplicacién de Criterios Microbiolégicos para Alimentos» (Codex, 1981a). La preparacién de este docu- mento fue impulsada en primer lugar por una resolucién' del Comité Técnico 34, Subcomité 9, de la Organizacién Internacional de Normas (ISO) en la que se expresaba la preocupacién sobre la proliferacién creciente de criterios innecesarios 0 que no reflejaban Ia realidad. Un Comité de Expertos de la FAO/WHO formado a peticién del Comité del Codex de Higiene de los Alimentos elabord un borrador. El documento fue adoptado después, sin apenas moditicaciones, por la Comisién del Codex Alimentarius. Se reproduce en su totalidad en el Apéndice 6. Brevemente, en él se establece: (a) las partes que comprende un criterio microbiolégico; (b) las definiciones para cada uno de los tres tipos de criterios microbiolégicos (norma, especificacién, recomendacién); (c) los objetivos de los criterios microbiolégicos: (d) los factores que deben considerarse para satisfacer los objetivos de los criterios microbiolégicos; (e) las bases para la seleccién de cada parte de un criterio microbiolégico y (f) acciones a tomar basadas en los resultados de ta aplicacién de los crite- rios. Aunque los «Principios Generales» se desarrollaron para que existieran unas pautas para satisfacer los objetivos del Codex, Ia industria y las agencias reguladoras locales, regionales y nacionales pueden adaptarlas ficilmente a sus necesidades particulares. Asi lo ha hecho la ICMSF a Ia hora de desarrollar las recomendaciones que se ofrecen para los grupos de ali- mentos recogidos en la Parte II de este libro. Es necesario insistir, sin embargo, en que los eri- terios que se recomiendan se elaboraron de acuerdo con tres premisas fundamentales: (a) el ali- mento debe comercializarse a nivel internacional; (b) el criterio es necesario desde el punto de vista de la salubridad y de las buenas précticas comerciales y (c) el criterio debe servir para un fin dtil, 1 Recomendacisn de ISO, Comité Técnico 34, Subcomité 9, tercera sesi6n anual, Budapest, Mayo 1976: «Las especi- ficaciones microbioldgicas de los alimentos se estin estableciendo en todo el mundo por agencias reguladoras. Preocupa a los expertos que, en muchos casos, las especificaciones microbiolégicas no se basen en principios sbi dos: por ejemplo. se han establecido especificaciones para ciertos alimentos cuya necesidad real no puede justficar- se razonablemenie y, en otfas ocasiones, existen especificaciones que no reflejan adecuadamente los riesgos det consumidor o los asumiidos por el fabricante 0 los de ambos. El Subcomité 9 de la ISOTC34 recomienda que ta FAOMWHO promucva la organizacién de un Comité de Expertos de la FAONWHO para que elabore una lineas ‘maestras para el establecimiento y aplicacién de especificaciones microbioligicas para alimentos»Criterios microbiolégicos significativos para alimentos 3 B DEFINICIONES Los criterios microbiolégicos se definieron en Ia edicién precedente de este libro pero ahora se necesitan definiciones més claras. La ICMSF, aunque respalda las definiciones recogidas en Jos «Principios Generales» para los fines del Codex, cree que se necesitan algunas modifica- ciones para cubrir los objetivos de la ICMSF. Las definiciones que a continuacién se ofrecen intentan reflejar este punto de vista. .- Un criterio microbioldgico para un alimento, definido de acuerdo con los objetivos de la ICMSF y con el sentido usado en este libro, consiste en: 1 establecer el alimento al que se aplicaré el criterio 2. establecer el(los) contaminate(s) que preocupa(n) (es decir, la especies o grupos de micro- organismos y/o sus toxinas) 3 el(los) método(s) analitico(s) que va(n) a utilizarse para su deteccién y/o recuento 4 la muestra que va a tomarse del lote de! alimento o del punto de interés, por ejemplo, un determinado punto en la Iinea de fabricacién 5 el(los) limite(s) microbiolégico(s) apropiado(s) para el producto; esto es, los valores de 1, ¢, m_y M (véase Capitulo 5) El término programa de muestreo, en el sentido que se usa en este libro, incluye todo lo mencionado anteriormente Los términos para describir los criterios microbioldgicos, de acuerdo con los objetivos de la ICMSF y con el sentido usado en este libro, se definen como sigue: 1 Una norma microbiolégica es un criterio microbiolégico, definido como anteriormente se ha indicado, que forma parte de una ley o regulacién. Es un criterio obligatorio que el orga- nismo regulador ha de hacer cumplir donde tiene jurisdicci6n. 2. Una especificacién microbiolégica es un criterio microbiol6gico, definido como anterior~ mente se ha indicado, que se aplica a un alimento o ingrediente para su aceptaci6n por parte de un fabricante o un organismo ptiblico 0 privado. Es un criterio obligatorio en el sentido que los alimentos o ingredientes que no cumplan la(s) especificacién(es) estin expuestos a que sean rechazados por el comprador. En la edicién precedente este punto se recogia bajo la denominacién de especificacién de compra. 3. Una recomendacién microbiolégica es un criterio microbiol6gico, definide como anterior- mente se ha indicado, que puede usar un fabricante 0 un organismo regulador para monito- rizar un sistema o proceso de un alimento. Las recomendaciones ayudan a determinar si las condiciones microbioldgicas en los puntos criticos de control 0 en el producto final son aceptables 0 no. Las recomendaciones no suelen ser obligatorias, slo consultivas, pero pue~ den serlo dependiendo del origen de la muestra (por ej., de los puntos criticos de control), microorganismos que preocupan y naturaleza del alimento que se est elaborando. Puede que sea de utilidad ofrecer alguna explicacién de ciertas diferencias entre estas defi- niciones y las recogidas en el documento «Principios Generales» (Codex, 1981a, reproducidas parcialmente en el Apéndice 6, pg. 243). Los criterios microbiol6gicos del Codex se ajustan totalmente a las reglas de pricticas higiénicas del Codex. El término «especificacién» se aplica exclusivamente a productos finales y su propésito es aumentar la garantia que proporciona el significado higiénico que ha sido cubierto por el respectivo cédigo. Sin embargo, los fabrican- tes de alimentos, las instituciones piblicas y privadas, y los diversos organismos gubernamen- tales, incluidos las militares, requieren, con frecuencia, que los vendedores 0 suministradores6 Microorganismos de los alimentos proporcionen alimentos e ingredientes que no excedan de ciertos limites microbianos de acuer- do con lo que consta en las especificaciones de compra. En el documento «Principios Generales» del Codex no se hace mencién alguna en relacidn a este objetivo. Las recomenda- ciones microbiolégicas tienen por finalidad monitorizar los puntos criticos de control en un establecimiento © producto final. Para el Codex, estos objetivos sélo intentan orientar al fabricante y tanto las especificaciones como las recomendaciones no son obiigatorias, s6lo consultivas. Las normas microbiolégicas se propusieron para ser Normas del Codex Alimentarius (a diferencia de las estipulaciones referentes a las pricticas higiénicas det Codex) y son obligatorias. Estas normas no se introducirdn de nuevo sino que derivarén de las especificaciones microbiolégicas de los productos finales que han acompaftado a las reglas practicas de los procedimientos del Codex y se han aplicado extensamente a los alimentos. Presumiblemente, Ia experiencia que se obtenga podria justificar el esta- blecimiento de una norma o bien la continuidad del criterio como especificacién del producto final, C SELECCION DE LOS CRITERIOS MICROBIOLOGICOS. CONSIDERACIONES ESENCIALES La eleccién de una norma, especificacién o recomendacién para una determinada aplicacién es un proceso complicado, Este hecho se hace evidente tan pronto como se tenga en cuenta la gran diversidad de alimentos que se esta elaborando, sus microbiotas y las operaciones que se aplican durante su procesado y preparacién, Por ejemplo, si un alimento se somete, cerca del final de su procesado, a un tratamiento microbicida severo, quedaria sin significado la relacién entre el recuento microbiano del produto final y las condiciones higiénicas que imperaron durante todo el proceso Para cumplir con los objetivos de un criterio microbiolégico deben considerarse los facto- res siguientes, tal como se establece en los «Principios Generales»: 1 laevidencia de riesgo(s) para la salud. 2. 1a microbiologfa de la materia prima. 3. el efecto del tratamiento en la microbiologfa del alimento. 4 la probabilidad y consecuencias de ia contaminacién microbiana y/o el crecimiento de 1os microorganismos durante las posteriores manipulaciones y almacenamiento subsiguiente. 5 el tipo de! consumidor sometido al riesgo 6 la relacién coste/beneficio asociada con la aplicacién del criteri Finalmente, para que los criterios microbiol6gicos tengan un significado entre los criterios utilizados para determinar la salubridad del alimento y su calidad, se requiere lo siguiente: (a) conocer los agentes etioldgicos especificos de la enfermedad alimentaria y su significado y conocer los otros microorganismos indicadores de fallos en las picticas de fabricacién; (b) dis- poner de métodos analiticos adecuados y seguir investigando para desarrollar nuevos y mejores métodos y (c) disponer de procedimientos de muestreo apropiados y de bases racionales para el muestreo y para el establecimiento de los limites microbiolégicos que deben tolerarse. El lec- tor observard que los requisitos anteriores estin relacionados directamente con las premisas que componen un criterio microbiolégico. A continuacién se hace un breve resumen de la informa- ci6n disponible relativa a dichos requisitos.Criterios microbiolégicos significativos para alimentos 7 a Agentes etiolégicos 0 contaminantes Los informes periédicos, resimenes anuales, textos y revisiones que tratan de las enferme- dades transmisibles por los alimentos (Anon, 1980, 1981; CDC, 1983; Health and Welfare, Canada, 1984; FAOVHO, 1974, 1975; Okabe, 1973; Riemann and Bryan, 1979; WHO, 1974, 1976) justifican la eleccién de los patégenos asoviados a los brotes de enfermedades alimenta- rias que se discuten en ef Capitulo 5. Los patdgenos se agrupan en tres categorias de acuerdo con la gravedad del riesgo. La decision de incluir 0 no un determinado patégeno en estos gru- pos depende de su relevancia en la seguridad microbioldgica del alimento. Salmonella, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens y Vibrio parahaemolyticus continéan siendo los agentes causales mas frecuentes de enfermedades alimentarias. La inci- dencia de brotes causados por cada uno de ellos varia segtin el pais 0 la localizacién geogréfi- ca. Por ejemplo, alrededor de! 40-50% de los brotes de enfermedades alimentarias descritos en Japén fueron causados por V. parahaemolyticus debido al consumo de pescado crudo mientras en los paises occidentales se producen brotes ocasionales por consumo de pescado procesado, pero no crudo. En muchos paises occidentales, el 70-80% de los brotes descritos anualmente se deben a la combinacién de Salmonella, Staph. aureus y C. perfringens. Los brotes de botulismo, aunque relativamente infrecuentes, causan una gran constemacién debido a que ponen la vida en grave peligro. Los alimentos procesados adquiridos en el comercio no suelen ser los implicados en esta enfermedad pero los preparados 0 enlatados en el hogar constituyen los vehiculos comunes de transmisién. : Otros patégenos, como Escherichia coli enteropatégeno, Shigella, Bacillus cereus, Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Streptococcus pyogenes, Mycobacterium tuberculosis, Brucella abortus, Corynebacter diphteriae, Campylobacter fetus subsp. jejuni y los virus, son agentes causantes de enfermedades alimentarias, pero no suelen estar implicados en los brotes o la extensién e importancia de su papel no ha sido evaluada adecuadamente. Con bastante frecuencia, ei patégeno responsable de la enfermedad no se identifica; asf ocu- 1ti6 con el 30-60% de los brotes descritos por el Center for Disease Control (USA) durante el periodo 1977-81 (CDC, 1983), lo que puede deberse a una incompleta investigacién en el labo ratorio, a que el microorganismo responsable no se hubiera reconocido entonces como agente causante de enfermedad alimentaria o porque no se pudiera identificar con las técnicas analiti- cas disponibles. En la mayorfa de los pafses, la notificacién de los casos y Ia investigacién de los brotes de enfermedades alimentarias son bastante deficientes. Por ejemplo, en Canada y en Estados Unidos se estima que el niimero de brotes que realmente ocurre es mucho mayor que el denun- ciado (Hauschild y Bryan, 1980). Esta situacién es desafortunada porque, ademas de impedir una evaluacién continua de la tendencia de los agentes etiolégicos y de los alimentos vehicu- Jantes, una denuncia e investigacién tempranas de los brotes permite (a) la identificacién y decomiso de los productos contaminados, (b) Ja correccidn de fallos en la preparacién de ali- mentos en Ios establecimientos de servicio, en las industrias y en los hogares, (c) la identifica- cién y el tratamiento adecuado de los portadores humanos de patégenos de alimentos y (d) la posible deteccidn de nuevos agentes causantes de enfermedades alimentarias. La deteccién de algunas especies y grupos microbianos en los alimentos indica la posibili- dad de que esos productos contengan patdgenos y hasta qué punto se han seguido las Buenas Pricticas de Fabricacién (GMP) durante la fabricacién o el procesado. La relacin entre la pre- sencia de microorganismos «indicadores» y cada una de aquellas situaciones es, por supuesto,8 Microorganismos de los alimentos indirecta y las posibilidades de correlaciones positivas varfan entre ninguna y muy alas. Ya se ha ofrecido un ejemplo al respecto, el que se refiere a un recuento microbiano de un producto final que ha recibido un tratamiento para la destrucci6n de los microorganismos en la fase final del proceso. En cambio, las posibilidades son muy elevadas cuando los andlisis revelan Ia pre- sencia de microorganismos indicadores capaces de crecer en las superficies de los equipos y en los puntos criticos de control cuando se producen fallos en la limpieza 0 cualquier otra negli- gencia. Es esencial, por tanto, saber qué especies o grupos indicadores hay que analizar e incluir entre las premisas de un criterio microbioldgico (ICMSF, 1978a, 1978b, 1980). Una gran parte de la investigacién publicada sobre microbiologia de los alimentos esté relacionada con este asunto, b Metodologia El libro Microorganisms in Food, 1 (KCMSF 1978a) describe los métodes para la deteccién y recuento de los principales patégenos causantes de enfermedades alimentarias y de los gru- pos 0 especies cuya presencia en Jos alimentos (entre limites numéricos) indica la exposicién a condiciones que podrian conllevar contaminaciones con microorganismos peligrosos y/o per- mitir su multiplicacién. Durante muchos afios, la Federacién Internacional de Lecheria ha normalizado diversos métodos; unos han sido publicados y otros estan en distintas fases de desarrollo (IDF, 1981-82). De forma similar, la Organizaci6n Internacional de Normas (ISO), a través de varios sub- comités del Comité Técnico 34 (Productos Agricolas), ha publicado diversos «métodos inter- nacionales» (ISO, 1983); otros estén en desarrollo. En las normas de prdcticas higiénicas del Codex se especifica dénde son aplicables los métodos de la ISO. La American Association of Official Analytical Chemists (AOAC) fue uno de los primeros organismos en iniciar estudios sistematicos para normalizar los métodos de andlisis para ali- mentos. Cuando se aplican, los métodos de la AOAC se consideran oficiales por los organismos nacionales, estatales 0 locales de Estados Unidos que tienen responsabilides reguladoras sobre alimentos (AOAC, 1980). Los métodos de mas amplia aplicacién (es decir, los que no se limi- tan a la deteccién y enumeracién de microorganismos patégenos ¢ indicadores) estén recogidos en un Compendium of Methods, publicado por la American Public Health Association (APHA; Speck, 1984). Esta publicacién es probablemente la recopilacién mas detallada de métodos titi- les en este campo. Tambicn, los Standards Methods for the Examination of Dairy Products, publicados por vez primera en 1910 y actualmente se encuentra en su decimocuarta edicién, son muy conocidos y utilizados en todo el mundo. En 1975, se formé un grupo de trabajo conjunto de la IDF/ISO/AOAC con el fin de armo- nizar los métodos de las tres organizaciones. El trabajo de la ICMSF esti coordinado con el de estos grupos a través de miembros comunes y se han hecho importantes esfuerzos para minimi- zar las diferencias en aspectos bisicos de métodos de interés mutuo. Los métodos incluidos en tas publicaciones de la APHA e ICMSF que antes se citaban difieren de los correspondientes de la ISO, IDF y AOAC principalmente en su formato. En resumen, durante casi un siglo de investigacién en distintos laboratorios de todo el mundo se ha estado progresando en el desarrollo de métodos para el andilisis microbioldgico de los alimentos. Debido a ello, algunos de nuestros métodos actuales son precisos pudiéndose aplicar rutinariamente por analistas bien entrenados que dispongan de recursos adecuados. Sin embargo, muchos otros son complejos y de gran duracién, lo que limita su aplicacién. Algunos métodos no son adecuados para ciertos objetivos u originan resultados equivocos (por ej., elCriterios microbiolégicos significativos para alimentos 9 so de algunas toxinas de los patégenos entéricos o la determinacién de patogenicidad de cepas de la misma especie, como las de E. coli, ¥. enterocolitica y Campylobacter fetus subsp. jejuni). Es necesario, por tanto, fomentar la investigacién destinada a la solucién de estas difi cultades y continuar con la coordinacién entre las organizaciones implicadas en fa normaliza- cién de métodos. Tales esfuerzos harin disminuir las barreras (Ia falta de métados adecuados y normatizados) para que los criterios microbiolégicos se apliquen de una forma més amplia. Si no existe un método adecuado y practico para la deteccidn o enumeracién del microorganismo contaminante de interés, falta la base para el establecimiento del criterio microbiolégico. *c Muestreo y programas de muestreo Una vez que se ha decidido anatizar la presencia de uno o varios contaminantes en un ali- mento, se puede examinar el lote completo o una muestra del mismo. La primera opcién des truiré el loie y es, por tanto, impracticable. Entonces, surgen dos preguntas ;qué tamaiio debe tener la muestra? y gqué conclusiones pueden extraerse de los resultados analiticos? La contes- tacién a estas preguntas implica conceptos estadisticos de probabilidad y muestreo de la pobla- ciGn. Estas y otras consideraciones se tratan en la Parte I del presente libro. Brevemente, un programa de muestreo es un procedimiento para la recogida de una mues- ira, el andlisis de las unidades de muestra adecuadas y Ia toma de decisiones apropiadas bas en un criterio establecido. El criterio puede ser la ausencia de un determinado contaminan- te en una proporcién definida o en todas las unidades de la muestra examinadas (por ¢j., Salmonella) 0 el néimero de unidades de muestra que no deben exceder a una tasa especificada de bacterias totales o a la de una especie o grupo de indicadores. Un programa de muestreo especificado en un criterio microbiolégico debe ser consecuente con ef riesgo que probablemente esté asociado con el alimento: cuanto mayor sea el riesgo, mayor serd la severidad del programa de muestreo. El Comité de Salmonella (NAS-NRC, 1969) utilizé este principio al desarrollar un sistema para la clasificacidn de los alimentos en cinco categorias de acuerdo con Ia probabilidad de Ia presencia de Salmonella en los alimentos. La clasificaci6n se basé en tres caracteristicas de los productos: (a) el producto contiene un ingre- diente identificado como factor potencial en el desarrollo de salmonelosis, (b) el proceso de fabricacién no incluye un tratamiento que destruya las salmonelas, y (c) existe la posibilidad de que Salmonella se multiplique si el producto se manipula mal 0 se somete a algtin abuso duran- te su distribucin. Mas tarde, la ICMSF propuso un sistema similar, aunque no idéntico, en el que se contemplan 15 grados de riesgos, llamados categorfas (en inglés cases) (véase Capitulo 5, tabla 6). Se sugieren programas de muestreo pensados para cada grado de riesgo (categorfa) (véase Tabla 10), Finalmente, la eleccién de un programa de muestreo dependerd, para un determinado 3 mento o producto relacionado, de la profundidad con que se conozca la microbiologia de dicho producto. La Comisién obtuvo esta informacién de datos procedentes de diversas fuentes, de los recogidos en los «Principios Generales» y, en cierta medida, de las opiniones de expertos. Todo esto dio lugar a las bases de los criterios microbiolégicos sugeridos en la Parte II de este libro. D DESARROLLOS Y APLICACIONES A NIVEL INTERNACIONAL A nivel internacional, los criterios microbiolégicos para alimentos encuentran su expresién dentro del marco del programa conjunto de ka FAQ y la OMS, ejecutado por la Comisi6n del10 Microorganismos de los alimentos Codex Alimentarius y descrito por Kermode y McNally (1973) y en el Procedural Manual de la Comisién del Codex Alimentarius (Codex, 1975). Este programa fue el resultado directo de los crecientes conflictos entre los requisitos de la legislacién alimentaria y las necesidades gene- rales de los principales mercados mundiales de alimentos. Los problemas eran patentes por los setios obstéculos comerciales (no arancelarios) que tenian su origen en las distintas legislacio- nes vigentes en los diferentes pafses. La ComisiGn se ha impuesto como objetivo el desarrollo de normas internacionales para alimentos para ser aplicadas a nivel mundial o regional: igual- mente, propone una serie de medidas como los cédigos de pricticas y las recomendaciones. Es de esperar que su adopcién general sirva para eliminar las barreras no arancelarias para el comercio de los alimentos y para evitarlas en el futuro. Las normas del Codex y los eddigos de pricticas cubren diversos aspectos del control de ali- mentos, como la composicién, el etiquetado, los aditivos y la higiene. Los organismos subsi diatios de la Comisién, tos comités del Codex, elaboran las normas y los cddigos. Aunque el periodo de tiempo desde que se elabora el borrador hasta su adopcién es largo (normalmente entre cuatro y cinco afios), se ha trabajado con eficacia, como lo demuestra el establecimiento de 130 normas y eédigos de précticas internacionales para alimentos; otros estin en diferentes etapas de su desarrollo. E! Comite del Codex sobre Higiene de Alimentos tiene la mayor res- ponsabilidad sobre todo en lo que se refiere a la higiene de los alimentos en los documentos del Codex, incluyendo los criterios microbioldgicos. Se ha hecho especial hincapié en los cédigos de practicas higiénicas (practicas de buena fabricacién). El Comité ha necesitado del asesora- miento de expertos a 1a hora de tratar materias microbiolégicas altamente especializadas y, de forma especial, en e! desarrollo de los criterios microbiolégicos. La ICMSF ha proporcio- nado dicha asistencia mediante, sobre todo, sus tres publicaciones; ademas, ef Comité ha adop- tado los programas de 2 y 3 clases de la ICMSF. También diversos grupos de consulta de la FAO/WHO han proporcionado un valioso asesoramiento (FAO/WHO, 1975, 1977, 1979, 1980) El primer grupo (FAO/WHO, 1975) revisé todo el trabajo existente sobre criterios micro- biolégicos y recomends la inclusién de las especificaciones del producto final en el «Cédigo de Practicas Higiénicas para los Ovoproductos» que entonces estaba elaborando el Comité. Este fue el primer criterio microbiolégico (especificacién) en un cédigo de practicas higiénicas. El segundo grupo de consulta (FAO/WHO, 1977) considers los criterios microbiolégicos para otros productos para los que se estaban elaborando cédigos de précticas higignicas. Adicionalmente, el grupo preparé el documento de «Principios Generales», al que repetidas veces se ha hecho referencia. Este mismo grupo hizo otras recomendaciones, entre las que se incluyen las especificaciones microbiolégicas para gambas y langostinos precocidos y las de alimentos para bebés y nifios, Estos criterios se incorporaron en los respectivos cédigos de prac ticas higiénicas de estos alimentos. Ademis, el grupo sugirié que se consideraran criterios pat otros muchos alimentos y recomendé que, de forma inmediata, se prestara atencién a le leche en polvo, carne cruda refrigerada y congelada, carne de cangrejo precocida y congelada, coco desecado y langosta precocinada y cangelada. El tercer grupo de consulta (FAO/WHO, 1979) dedicé su atencién fundamentalmente a los criterios microbiolégicos para la carne cruda refrigerada y congelada, considerindolos desa- consejables (véanse Capitulos 11 y 13). En las consideraciones mas recientes de criterios microbioldgicos (FAO/WHO, 1980), se recomendaron especificaciones para productos finales semideshidratados. Estos estén conteni- dos en un borrador del «Cédigo de Pricticas Higiénicas para la Leche en Polvo» (Codex, 1981c) y se discutiran en el Capitulo 15.Criterios microbiolégicos significativos para alimentos u Ala vista de lo anteriormente expuesto y del continuo interés de la ICMSF en los criterios microbiolégicos como uno de los medios mas ttiles para asegurar la salubridad y la calidad de Jos alimentos, se preparé la presente revision del segundo libro. Para describir los principios del muestreo y proponer los programas de muestreo, se ha hecho un especial esfuerzo para ade- cuarse a los conocimientos actuales. Es inevitable fa inclusién de nuevos conocimientos sobre un tema tan dindmico como Ia salubridad y calidad de los alimentos. La cuidadosa evaluacién y aplicacién de los criterios microbiolégicos indicaré hasta qué punto dichos criterios conti- nuardn siendo de utilidad. REFERENCIAS ‘Anon 1980. 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Si en el alimento analizado existe un nimero relativamente elevado de los microorganismos cuya presencia se pretende detectar, es de esperar que un ntimero relativamente elevado de los andlisis ofrezcan un resultado positivo. Pero si el mimero de microorganismos es escaso cabe esperar que 1a cantidad de andlisis con resultado positivo sea pequeiia. En estos dos casos, 1a probabilidad de obtencién de un resultado positivo serfa, respectivamente, alta y baja. A PROBABILIDAD En realidad, la probabilidad de obtener un resultado positivo es el ntimero de veces que el resultado es positivo dividido entre el nimero de veces que se analiza el alimento. Asi, si hay un resultado positivo 112 veces en 1,000 andlisis, se estima que la probabilidad es de 112/1,000 = 0,112 mientras que si lo hubiera 914 veces en los 1.000 anilisis, la probabilidad seria 914/1.000 = 0.914. Se utiliza el término «estimacién» porque, si se repitiesen de nuevo las 1.000 pruebas sobre el mismo material empléando la misma técnica no se podria tener la certeza de observat, res- pectivamente, 112 y 914 resultados positivos. Pero los resultados se aproximarian a dichos valo- res, porque 1.000 és un niimero muy elevado de pruebas. Por lo tanto, la probabilidad estimada para un resultado positivo (0 cualquier resultado en cualquier tipo de prueba) es 1a proporcién de veces que se dio el resultado positivo en relacién al niimero total de pruebas o andlisis reali- zados. La probabilidad fluctia entre 0 y 1. Sera cero cuando el alimento no contiene microor- ganismos (suponiendo que ef método empleado detectase cualquier microorganismo presente), y 1 si todos los anilisis realizados proporcionaran un resultado positivo. {Qué significa una estimacién observada de pruebas positivas de 0,112? Supéngase que ta totalidad del lote se subdivide en pequefias unidades de muestra, por ejemplo diez millones de 1314 Microorganismos de los alimentos unidades de muestra de I gramo cada una. Supéngase que analizamos todas elas y que 1.051.200 han dado resultado positivo. Entonces la relacién 1.051.200/10.000.000 (proporcién real de positivos) = 0,10512 es el valor de la probabilidad. Pero, ,qué clase de probabilidad? Ya no es una «estimacién» de la probabilidad de obtener un resultado positivo sino que es lu «pro- babilidad real» o «probabilidad de la poblacién». Es evidente que ésto no es prictico, dado el tiempo necesario para la realizacién de los andlisis y que ino quedaria alimento para consumir!, pero es conveniente,fener presente este concepto. La «probabilidad de poblacién» determina la probabilidad de una muestra 0 probabilidad estimada que puede esperarse al analizar un néime- ro determinado de unidades de muestra, Si este ntimero es bajo, es posible que la probabilidad estimada no sea precisa. En general, nunca sé conoce la probabilidad real o de poblacién, sino que s6lo se tienen estimaciones de ella. No obstante, se sabe que cuanto mayor sea el ntimero de unidades incluidas en la muestra de la poblacién, la probabilidad estimada se acercaré més a la probabilidad de la poblacién. B POBLACION Y MUESTRA DE POBLACION En la seccién precedente se introdujeron dos conceptos bisicos: (i) poblacién como totali- dad y (ii) muestra de la poblacién, Estos conceptos son respectivamente (en relacién con los resultados de un andlisis) los resultados de las pruebas realizadas sobre todas las unidades del lote del alimento y os resultados obtenidos exclusivamente con Jas unidades de muestra anali- zadas. En términos de recuento total en placa, por ejemplo, estos conceptos estarian represen- tados por (i) todos los recuentos que pudieran hacerse analizando todas y cada una de las uni- dades del lote, y (ii) los recuentos obtenidos en las unidades de muestra analizadas, Los estadisticos emplean el término «muestra» para el grupo de unidades de la poblacién que se considera para estimar una caracteristica de la misma, mientras que un analista 0 un bacteri6- logo Hamaria, a cada una de estas unidades, una «muestra», Para evitar esta confusién, se dis- guiré entre la «muestra de la poblacién» y las «unidades de muestra». El conjunto de todas las unidades de muestra forma la muestra de la poblacién. C DISTRIBUCION DE RECUENTOS Cualquier serie de mediciones 0 recuentos pueden analizarse por encuadramiento, es decir, tomando cada ntimero, por orden. y encuadrandolo en el intervalo nutnérico que le correspon- da. Por ejemplo, se podrian tener clases para recuentos totales distribuidas como sigue: de 8,000 9.999, de 10.000 a 11.999, de 12.000 a 13.999, ete. Una vez obienidos los resultados de los recuentos, se encuadran en el intervalo al que correspondan, Esta distribucién de 16s datos observados, en clases, se llama «distribucién de frecuencias». Si se quiere calcular la probabi- lidad estimada de un recuento entre, por ejemplo, 10.000 y 14.000, se suman las frecuencias de las clases que caen entre dichos limites, concretamente 10.000 - 11.900 y 12,000 - 13.999, y después la suma de estas dos frecuencias se divide por la frecuencia total de todas las clases. Por ejemplo, si fuese 15 dividido por 300, la probabilidad serfa 0,050. En general, cuanto mayor sea el ntimero de recuentos, mayores seran las frecuencias de las clases y, si se representan gri- ficamente, se tiende a perfeccionar la curva resultante.