Wiczenia Z Iotechnologii Ywności: K B, Ż C T Ż

ĆWICZENIA
Z BIOTECHNOLOGII ŻYWNOŚCI
KATEDRA BIOTECHNOLOGII, ŻYWIENIA CZŁOWIEKA

I TOWAROZNAWSTWA ŻYWNOŚCI
AKADEMIA ROLNICZA W LUBLINIE

30 WRZEŚNIA 2021
SPIS TREŚCI
PRZEPISY BHP........................................................................................................................... 4
REGULAMIN OBOWIĄZUJĄCY NA ĆWICZENIACH Z BIOTECHNOLOGII
ŻYWNOŚCI ................................................................................................................................. 5
1. ZIMNE ZACIERANIE PSZENICY I OZNACZANIE WYDAJNOŚCI
FERMENTACYJNEJ ................................................................................................................. 7
3.1. WPROWADZENIE .................................................................................................................... 7
3.2. WYKONANIE ĆWICZENIA ..................................................................................................... 13
3.3. PRZEDSTAWIENIE WYNIKÓW ................................................................................................ 15
3.4. MATERIAŁY I SPRZĘT ........................................................................................................... 16
2. OTRZYMYWANIE ORAZ OCENA WYDAJNOŚCI I JAKOŚCI DROŻDŻY
PIEKARSKICH ......................................................................................................................... 33
2.1. WPROWADZENIE .................................................................................................................. 33
3. PRODUKCJA I CHARAKTERYSTYKA GLUKOAMYLAZY .......................................... 41
3.1. WPROWADZENIE .................................................................................................................. 41
4. PRAKTYCZNE WYKORZYSTANIE BAKTERII FERMENTACJI MLEKOWEJ ........ 50
4.1. WPROWADZENIE .................................................................................................................. 50
5. FERMENTACJA CYTRYNOWA ........................................................................................... 59
5.1. WPROWADZENIE .................................................................................................................. 59
6. BIOKONWERSJA ZWIĄZKÓW ORGANICZNYCH PRZEZ DROBNOUSTROJE ..... 80
6.1. WPROWADZENIE .................................................................................................................. 80
6.2. WYKONANIE OZNACZENIA ................................................................................................... 83
7. ZACIERANIE SŁODU BROWARNIANEGO I NASTAWIANIE FERMENTACJI
BRZECZKI PIWNEJ ................................................................................................................ 17
7.1. WPROWADZENIE .................................................................................................................. 17
2
8. BIOSYNTEZA KWASU OCTOWEGO
8.1. WPROWADZENIE
8.2. WYKONANIE ĆWICZENIA
8.3. PRZEDSTAWIENIE WYNIKÓW
8.4. MATERIAŁY I SPRZĘT
WZÓR SPRAWOZDANIA Z ĆWICZENIA………………………………………………....

WARTOŚCI WSPÓŁCZYNNIKÓW REFRAKCJI DLA REFRAKTOMETRU
ZANURZNIOWEGO……………………………………………………………………………
LITERATURA ………………………………………………………………………………….
SPIS AUTORÓW……………………………………………………………………………….
3
BŁĄD! NIE MOŻNA ODNALEŹĆ ŹRÓDŁA ODWOŁANIA.
PRZEPISY BHP
1. Do laboratorium przychodzimy bez płaszczy (kurtek), dużych plecaków, toreb itp., które
zostawiamy w szatni
2. Osoby przebywające na sali ćwiczeń mają obowiązek stałego używania bawełnianych
fartuchów ochronnych (zapiętych!) oraz obuwia o dobrej przyczepności do podłoża.
3. Nie spożywamy na sali ćwiczeniowej żadnych substancji, produktów i napojów.
4. Podczas ćwiczeń zachowujemy ostrożność. Chaotyczne wykonywanie poszczególnych
operacji oraz niedostateczna ich znajomość prowadzi najczęściej do nieszczęśliwych
wypadków.
5. Wszelkie urządzenia włączamy/wyłączamy jedynie za zgodą prowadzącego.
6. Powonieniem badamy tylko substancje wskazane przez prowadzącego. Nie nachylamy się
nigdy bezpośrednio nad naczyniem i nie wdychamy głęboko par substancji.
7. Przy ogrzewaniu i przelewaniu cieczy nie nachylamy się nad nimi, ponieważ mogą
wyprysnąć i trafić do oka lub poparzyć twarz.
8. Ogrzewanie cieczy w probówkach wykonujemy w następujący sposób: wylot probówki
kierujemy tak, aby przy ewentualnym wypryśnięciu, ciecz nie oblała nikogo znajdującego
się w pobliżu.
9. Przy przenoszeniu naczyń i przedmiotów gorących bierzemy je w rękę poprzez grubą
rękawicę lub za pomocą szczypiec.
10. Podczas przelewania cieczy żrących i przesypywania substancji żrących nakładamy
ochronne rękawice i okulary. Odczynników umieszczonych pod digestorium nie wolno
wynosić poza jego obręb bez wyraźnej zgody prowadzącego ćwiczenia.
11. Prace z substancjami o nieprzyjemnym zapachu oraz wydzielającymi szkodliwe dla zdrowia
pary wykonujemy zawsze pod włączonym wyciągiem (pod digestorium).
12. Gdy mimo zachowania ostrożności dojdzie do kontaktu z substancją niebezpieczną (kontakt
z oczami, skórą, przy spożyciu lub wdychaniu) neutralizujemy jej działanie.
O zaistniałym zdarzeniu zawsze w pierwszej kolejności informujemy prowadzącego
ćwiczenia.
13. Substancji niebezpiecznych (np. rozpuszczalników organicznych) nie wylewamy do
kanalizacji bez zgody prowadzącego.
14. W przypadku skaleczenia się szkłem lub innym ostrym narzędziem ranę przemywamy 3%
wodą utlenioną i owijamy sterylnym bandażem (apteczka w sali laboratoryjnej). Przy
poważniejszych skaleczeniach przystępujemy przede wszystkim do zatamowania krwotoku.
W tym celu wykonujemy ucisk powyżej skaleczenia przy krwotoku tętniczym, a poniżej
przy żylnym. Po założeniu ucisku należy udać się jak najszybciej do lekarza. O zaistniałym
zdarzeniu zawsze informujemy prowadzącego ćwiczenia.
15. W przypadku powstania pożaru w laboratorium gasimy ogień odpowiednim środkiem
gaśniczym.
16. W przypadku wystąpienia wątpliwości lub zauważonych nieprawidłowości (np. w działaniu
urządzeń) - należy się zgłosić do osoby prowadzącej ćwiczenia.
17. Po zakończeniu ćwiczeń student zobowiązany jest uporządkować stanowisko pracy i
doprowadzić je do stanu uniemożliwiającego wystąpienie zagrożeń
4
REGULAMIN OBOWIĄZUJĄCY NA ĆWICZENIACH Z

BIOTECHNOLOGII
Obowiązki studenta podlegające ocenie prowadzącego:
 Na ćwiczenia studenci przychodzą punktualnie.

 Wszystkich studentów obowiązuje fartuch bawełniany (zapięty!). W przypadku jego braku należy
zgłosić to osobie prowadzącej ćwiczenia.
 Po sali laboratoryjnej poruszamy się w obuwiu o płaskiej podeszwie i dobrej przyczepności do
podłoża.
 Student ma obowiązek być na wszystkich ćwiczeniach. Wyjątek stanowi choroba
potwierdzona zwolnieniem lekarskim. W przypadkach losowych proszę zgłaszać się do osób
prowadzących ćwiczenia, nie później niż dwa tygodnie po zdarzeniu. Prowadzący może (ale
nie musi) usprawiedliwić nieobecność w uzasadnionych przypadkach.
 Warunkiem dopuszczenia do wykonywania ćwiczeń jest teoretyczna znajomość materiału
ćwiczeniowego.
 Obowiązuje posiadanie własnej kopii wykonywanego ćwiczenia.
 Obowiązuje posiadanie zeszytu 16- karkowego w kratkę w którym każdy student notuje: datę,
temat ćwiczenia, numer ćwiczenia i wyniki uzyskane na danym dniu. Wyniki muszą być
przedstawione osobie prowadzącej ćwiczenie i zatwierdzone jej podpisem. Po zakończonych
ćwiczeniach zeszyt pozostaje własnością studenta.
 Ćwiczenia wykonywane są w stałych zespołach 2-3 osobowych
 Stłuczone kolbki, pipety, zlewki, cylindry, biurety i inny zepsuty, uszkodzony sprzęt zgłaszamy
prowadzącemu ćwiczenia.
 Po zakończeniu ćwiczenia student zobowiązany jest uporządkować stanowisko pracy i
doprowadzić je do stanu uniemożliwiającego wystąpienie zagrożeń
 Tydzień po każdym dwutygodniowym cyklu ćwiczeniowym należy oddać sprawozdanie z
przebiegu ćwiczenia (wzór sprawozdania zamieszczono na końcu skryptu)
 W przypadku nie przestrzegania swoich obowiązków ( np.: nie sprzątnięcia stołu laboratoryjnego, brak
fartucha), prowadzący ćwiczenia może dokonać adnotacji w dzienniku ćwiczeń
Zaliczenie ćwiczeń polega na:

 zaliczeniu wszystkich sprawozdań, oddanych w terminie
 zaliczeniu krótkich sprawdzianów z ćwiczeń, które są równoznaczne z odpowiedzią ustną
 przestrzeganiu obowiązków studenta
 obecności na wszystkich ćwiczeniach lub posiadaniu wszystkich nieobecności
usprawiedliwionych
Student, który nie uzyska zaliczenia w ostatnim dniu ćwiczeń nie może
przystąpić do egzaminu końcowego.
5
ZIMNE ZACIERANIE PSZENICY I OZNACZANIE WYDAJNOŚCI FERMENTACYJNEJ
1. ZIMNE ZACIERANIE PSZENICY I OZNACZANIE WYDAJNOŚCI

FERMENTACYJNEJ
1.1. WPROWADZENIE
W gorzelnictwie rolniczym surowce zbożowe jak np. pszenica mogą być stosowane jako
surowiec podstawowy. Pszenica przetwarzana jest na alkohol znacznie rzadziej niż żyto, a wódki z
niej sporządzone charakteryzuje pożądana przez smakoszy "miękkość i łagodność"
Główne składniki ziarna pszenicy występują najczęściej w następujących ilościach:
 skrobia i cukry fermentujące 56-66 %
 włókno 1,6 %
 białko 12,0 %
 tłuszcz 1,7 %
 substancje mineralne 1,7 %.
Duża zawartość skrobi w ziarnie pszenicy pozwala uzyskiwać z kwintala ziarna powyżej 38
dm3 spirytusu, co czyni ten surowiec jednym z najbardziej wydajnych spośród naturalnych
surowców przetwarzanych w gorzelnictwie rolniczym. Pszenica zasobna jest we wszystkie
substancje, potrzebne do prowadzenia procesu fermentacji alkoholowej bez potrzeby stosowania
dodatków pochodzenia chemicznego do zacierów.
Skrobia jest węglowodanem o sumarycznym wzorze (C6H10O5)n, stanowiącym zapasowy cukier
roślinny. Ciężar właściwy skrobi jest 1,65 razy większy niż ciężar właściwy wody. W tkankach
roślinnych występuje w postaci ziaren o zróżnicowanym kształcie i wymiarach. Skrobia w
odróżnieniu od cukrów prostych i dwucukrów nie wykazuje smaku słodkiego i jest
nierozpuszczalna w wodzie. Ogrzewana w środowisku wodnym ulega głębokim, nieodwracalnym
zmianom strukturalnym, czemu towarzyszy gwałtowny wzrost lepkości zawiesiny, czyli tzw.
kiełkowanie skrobi. Temperatura kleikowania skrobi różnego pochodzenia jest cechą gatunkową i
zawiera się w przedziale temperatur od ok 55°C do ok 85°C. Kleik skrobiowy dalej ogrzewany
ulega rozpuszczeniu. Po przekroczeniu temp. l20°C skrobia upłynnia się bardzo szybko. Zjawisko
to wykorzystywane jest w konwencjonalnej metodzie produkcji spirytusu z surowców skrobiowych
(parowanie pod zwiększonym ciśnieniem) jako zabieg ułatwiający przekształcenie skrobi w
fermentujące cukry.
6
Każda makrocząsteczka skrobi składa się z dwóch frakcji tj. amylozy i amylopektyny.
Rys. l Fragment cząsteczki amylozy.

Obydwie, chociaż zbudowane z tych samych elementów tj. cząstek glukozy, znacznie się różnią
budową wewnętrzną, a także cechami technologicznymi. Amyloza stanowi konglomerat 60-1000
cząsteczek glukozy, połączonych ze sobą w ten sposób, że czwarty atom węgla jednej cząsteczki
glukozy łączy się z pierwszym atomem węgla cząsteczki sąsiedniej. Wielokrotne powtórzenie tego
układu tworzy prosty, nierozgałęziony łańcuch cząsteczek glukozy połączonych ze sobą tylko
jednym wiązaniem (α-1,4), łatwo ulegający hydrolizie kwasowej i enzymatycznej.
Rys.2.Fragment cząsteczki amylopektyny.

Amylopektyna przedstawia sobą łańcuch rozgałęziony, złożony z 1200-3600 jednostek glukozy.
Proste odcinki łańcucha o długości 18-27 jednostek glukozy, nie różnią się budową od amylozy, ale
w miejscu połączenia z łańcuchem głównym występują inne wiązania sąsiadujących ze sobą
cząstek glukozy, a mianowicie wiązanie między pierwszym węglem i szóstym, tzw. wiązanie -1,6.
Jest ono bardziej oporne na rozłączanie i dlatego hydroliza amylopektyny wymaga stosowania, co
najmniej dwóch enzymów lub wyższego stężenia kwasu, jeżeli hydrolizę prowadzi się metodą
7
kwasową. Stosunek amylozy do amylopektyn w skrobi jest cechą gatunkową i waha się w
granicach 1:3 do 1:8.
Surowa skrobia surowców przerabianych w gorzelniach rolniczych jest węglowodanem nie
podlegającym fermentacji etanolowej. Na etanol mogą być przetworzone produkty hydrolizy
skrobi, czyli cukry. W praktyce nie można zhydrolizować skrobi nie uwalniając jej uprzednio z
tkanek roślinnych. Pierwszą czynnością jest więc zniszczenie struktury komórkowej surowca. Ten
cel można osiągnąć metodą termiczną lub mechaniczną.
Metoda termiczna zwana parowaniem, polega na ogrzewaniu surowca w środowisku wodnym
para o ciśnieniu 0,5 MPa do temperatury nie niższej niż 150°C. Poprawne parowanie surowców
skrobiowych powinno dać następujące efekty:
 zniszczenie struktury komórkowej i wypłynięcie skrobi na zewnątrz komórek
 przekształcenie skrobi w formę rozpuszczalną, która umożliwi jej kontakt z enzymami
amylolitycznymi
 sterylizację substratu.
Parowanie musi odbywać się w środowisku silnie uwodnionym. Rozpuszczanie skrobi

poprzedzone jest jej silnym pęcznieniem, spowodowanym dyfuzją wody do wnętrza ziarn
skrobiowych. Pęcznienie objawia się 60-100 krotnym zwiększeniem objętości poszczególnych
ziaren skrobi i wyraźnym wzrostem lepkości zawiesiny-proces ten nazywany jest kleikowaniem
skrobi. Kleikowanie skrobi różnego pochodzenia zaczyna się w różnych temperaturach, ale zawsze
po przekroczeniu temp. l20°C klajster przechodzi w stan płynny. Następuje upłynnienie skrobi. Tak
upłynniona skrobia ochłodzona do temp. 65°C staje się na powrót lepka, a po obniżeniu temp. do
55°C zastyga w pastowatą masę, bardzo trudno poddającą się procesowi scukrzania. Dlatego
schładzanie roztworu powinno być poprzedzone chemicznym lub enzymatycznym rozkładem
skrobi, co najmniej do dekstryn. Hydroliza skrobi do cukrów prostych dokonywana jest w
gorzelniach rolniczych za pomocą enzymów amylolitycznych pochodzenia roślinnego lub
mikrobiologicznego.
Metoda mechanicznego wydzielania skrobi z tkanek roślinnych jest tańsza od metody
termicznej i znalazła zastosowanie w tzw."zimnym zacieraniu". Eliminacja ogrzewania surowca w
parniku do temp. 150°C zmniejsza o ponad 50% zużycie energii cieplnej, niezbędnej w procesie
zacierania. Do rozdrobnienia surowców gorzelniczych mogą być stosowane specjalnie
przygotowane dla gorzelnictwa:
 młyny młotkowe
 młyny cierne
 młyny sztyftowe
8
 tarki krochmalnicze.
Rozdrabnianiu poddaje się surowiec suchy lub zawieszony w wodzie. Jego efektem zawsze
powinno być zniszczenie struktury komórkowej. W odróżnieniu od masy surowców parowanych,
rozdrobnione cechują się wyższym pH około 6. Jest to wynik eliminacji termicznego rozkładu
niektórych związków organicznych. Wyższe pH korzystne jest dla efektywnego działania enzymów
hydrolizujących skrobię. Już w trakcie rozdrabniania korzystne jest dodawanie płynnych roztworów
-amylazy w ilości 60-70% przewidzianej dawki. Zastosowanie preparatów enzymatycznych
pochodzenia mikrobiologicznego zdecydowało o możliwości prowadzenia oddzielnie upłynniania i
scukrzania skrobi. Przy tym upłynnianie odbywa się za pomocą enzymów termostabilnych w
temperaturze bliskiej temp. pasteryzacji.
Zacieranie parowanych surowców skrobiowych.
Zacieranie surowców skrobiowych poddanych wcześniej parowaniu polega na wspólnym

działaniu amylaz słodowych. Przy jednoczesnym działaniu - i - amylazy hydroliza skrobi
przebiega znacznie głębiej niż przy oddzielnym działaniu tych enzymów, przy czym otrzymuje się
75-80% maltozy. -amylaza rozpoczyna scukrzanie amylozy oraz łańcuchów bocznych
amylopektyny od końca łańcuchów, natomiast -amylaza atakuje cząsteczki substratu wewnątrz
łańcuchów. W obydwu przypadkach rozłączane są wiązania -1,4. Pod wpływem działania -
amylazy na amylozę i amylopektynę, oprócz maltozy powstają wyższe i niższe dekstryny. Wyższe
dekstryny tworzą się również pod wpływem działania -amylazy na amylopektynę. Dekstryny te są
typu erytrogranuloz, zaś -amylaza rozrywa je aż do wiązań -1,6, w związku z czym powstają
nowe substraty dla działania -amylazy. W ten sposób -amylaza zwiększa działanie -amylazy.
Poza tym -amylaza atakuje dekstryny typu sześciocukrów, powstające pod wpływem działania -
amylazy na amylozę. Dekstryny o prostym łańcuchu scukrzane są przez obie amylazy, przy czym w
wyniku działania -amylazy otrzymuje się maltozę i niewielkie ilości maltotriozy, zaś pod
wpływem -amylazy tworzą się maltoza, glukoza i maltotrioza, która następnie rozkładana jest do
maltozy i glukozy. Dekstryny o rozgałęzionych łańcuchach rozrywane są aż do miejsc rozgałęzień.
W ten sposób powstają dekstryny niższe ewentualnie kilkucukry, zwłaszcza trójcukry i izomaltoza.
Takich rozgałęzionych reszt na które nie działają już enzymy pozostaje 25-30% i nazywa sieje
dekstrynami granicznymi.
W przypadku tzw. zimnego zacierania, do mechanicznie uwolnionej skrobi zawieszonej w
środowisku wodnym dodaje się odpowiednią ilość termostabilnej -amylazy i glukoamylazy
pochodzenia mikrobiologicznego. Glukoamylaza hydrolizuje obydwie frakcje skrobi tj. amylozę i
amylopektynę do glukozy. Proces ten trwa jednak długo i dlatego w praktyce na skrobię działa się
9
kompleksowo -amylazą i glukoamylazą. W przypadku upłynniania skrobi i scukrzania jej

preparatami pochodzenia mikrobiologicznego, stwarzać należy kolejno optymalne warunki dla
działania poszczególnych enzymów. Warunki te musi określić producent preparatów np. proces
upłynniania skrobi przy użyciu preparatów enzymatycznych firmy NOVO takiego jak
TERMAMYL 120L odbywa się w temp. 85-95°C w czasie 30-60 min. w pH 5,5 do 6,0. Scukrzanie
skrobi przy użyciu preparatu SAN SUPER 240L tej samej firmy prowadzi się w temp.50°C w tym
samym pH. Chemizm procesu enzymatycznego upłynniania skrobi jest podobny jak w metodzie
klasycznej z użyciem -amylazy słodowej. -amylaza grzybowa zapewnia jednak uzyskanie
dekstryn o krótkich łańcuchach, dzięki czemu glukoamylaza efektywniej hydrolizuje je do glukozy
rozłączając wiązania -1,4 i -1,6. W wyniku zimnego zacierania otrzymujemy glukozę jako
produkt końcowy.
Gorzelnia rolnicza jest zakładem wytwarzającym etanol nie tylko z ziemniaków, lecz z wielu
innych surowców zawierających węglowodany pod postacią skrobi. Surowce te są produktami
odpadowymi, jak np. zmiotki mączne piekarnicze lub młyńskie, mąka skażona mikrobiologicznie
lub porażona owadami, wytrzepy mączne, przetwory zbożowe, pasze zawierające surowce
skrobiowe. Gorzelnie utylizując takie produkty przyczyniają się do znacznego zmniejszenia strat,
dając w zamian produkt taki jak alkohol etylowy i wywar. Zawartość węglowodanów w
wymienionych wyżej surowcach jest bardzo zróżnicowana i decyduje o nie tylko o wydajności
etanolu z jednostki masy, lecz również o ekonomiczności przedsięwzięcia.
Drożdże mogą rozwijać się zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych. Tlen
rozpuszczony w podłożu hodowlanym odgrywa rolę regulującą kierunek metabolizmu
komórkowego. W warunkach tlenowych ma miejsce intensywny przyrost masy komórkowej
drożdży, natomiast w warunkach beztlenowych dominuje fermentacja z wytworzeniem etanolu.
Zjawisko to, zwane efektem Pasteura, polega na tym, że w warunkach tlenowych w komórkach
drożdży uruchomiany jest cykl Krebsa oraz łańcuch oddechowy, przenoszący elektrony na tlen z
równoczesnym sprzężeniem z syntezą ATP. Kwas trifosfoadenozynowy jest głównym efektorem
hamującym aktywność fosfofruktokinazy szlaku EMP. Zwiększenie stężenia ATP hamuje glikolizę,
natomiast intensywne ubywanie ATP w reakcjach anabolicznych powoduje przyspieszenie procesu
glikolizy. W warunkach tlenowych ma zatem miejsce bardzo ekonomiczne wykorzystanie glukozy
w procesach syntezy. Natomiast w warunkach beztlenowych następuje indukcja fosfofruktokinazy,
aldolazy i kinazy pirogronianowej szlaku EMP, a więc przyspieszenie glikolizy. Powstający
pirogronian przy braku cyklu Krebsa i łańcucha oddechowego ulega enzymatycznej dekarboksylacji
do aldehydu octowego, który w tych warunkach (proces beztlenowy) jest akceptorem elektronów,
redukując się do etanolu. W warunkach beztlenowych wydajność syntezy materiału komórkowego
10
w stosunku do wykorzystanej glukozy jest mała, natomiast ma miejsce intensywne tworzenie

etanolu.
Pełny bilans fermentacji alkoholowej prowadzonej przez drożdże Saccharomyces cerevisiae
przedstawia się następująco:
C6H12O6 2CH3 CH2 OH + 2CO2
180 g 92 g 88 g
Maksymalna ilość etanolu jaką można otrzymać ze 100 kg skrobi (wyliczona na podstawie
równań stechiometrycznych) wynosi 71,54 1 w przeliczeniu na 100% etanol. W praktyce
wydajność etanolu nie przekracza 92-94% wydajności teoretycznej i spowodowane jest to tym, że:
- drobnoustroje prowadzące proces zużywają część węglowodanów na budowę nowych komórek,
- niewielkie ilości cukru nie ulegają fermentacji,
- część węglowodanów ulega przekształceniu na produkty uboczne fermentacji alkoholowej jak:
glicerol, alkohole wyższe, aldehydy, estry, kwasy.
Z tego powodu należy ustalić wydajność etanolu w przeliczeniu na 100 kg potencjalnie użytego
surowca.
W przypadku wyżej wymienionych surowców skrobiowych oznaczenie wydajności etanolu
przeprowadza się metodą biologiczną. Obejmuje ona następujące etapy:
1. oznaczenie zawartości skrobi w substracie
2. przygotowanie hydrolizatu surowca skrobiowego
3. fermentację etanolową hydrolizatu skrobiowego
4. wydzielenie etanolu z produktów metodą destylacji prostej
5. oznaczenie etanolu za pomocą refraktometru zanurzeniowego.
11
PIERWSZY TYDZIEŃ
1. Przygotowanie próby fermentacyjnej do zimnego zacierania pszenicy.

 odważyć 35g mąki pszennej do zlewki o pojemności 500ml, dodać 100ml wody i 0,5ml
preparatu enzymatycznego o głównej aktywności -amylazy,
 zlewkę należy umieścić w łaźni wodnej z termostatem, temperaturę doprowadzić do 80°C,
utrzymać ją przez okres 15 minut intensywnie mieszając zawartość zlewki,
 po obniżeniu temp. do 50-65°C należy ustalić pH na poziomie pH=5 (przy użyciu roztworu
HCl lub NaOH) i wprowadzić l ml preparatu enzymatycznego o głównej aktywności
glukoamylazy i próbkę przetrzymać w tej temperaturze przez ok. 15-20 min.
 ochłodzić zacier do temp. 20°C,
 dodać kilka kropli roztworu soli mineralnych,
 zawartość zlewki następnie należy przenieść ilościowo do wytarowanej kolby na 500 ml,
dodać 5% (v/v) mleczka drożdżowego i masę układu fermentacyjnego uzupełnić wodą do
250g netto,
 kolbę należy zamknąć czopem fermentacyjnym i wstawić do termostatu o temp. 28°C.
2. Oznaczenie zawartości skrobi w mące pszennej metodą Eversa w modyfikacji Grossfelda.

5g mąki odważa się z dokładnością do 1 mg, przenosi ilościowo do kolby stożkowej na l00mL i
dodaje 25mL 1,124% roztworu HCl i dokładnie miesza. Drugą porcją 25 cm 3 roztworu kwasu
opłukuje się ścianki kolbki. Kolbkę wstawia się na 15 minut do wrzącej łaźni wodnej. W czasie
pierwszej minuty ogrzewania zawartość kolbki miesza się, a podczas dalszego ogrzewania miesza
się sporadycznie. Po zakończeniu ogrzewania próbkę chłodzi do temperatury 20°C i przenosi się do
kolby miarowej na 100mL, a kolbę stożkową opłukuje się małymi porcjami wody destylowanej (w
sumie 30-40 mL) tak aby próbkę przenieść do kolby miarowej w sposób ilościowy. Próbkę
następnie klaruje się roztworami Carreza I i II dodając po 1mL każdego z nich i uzupełnia wodą
destylowaną do kreski. Próbkę po 5 minutach sączy się przez sączek - przesącz po odrzuceniu kilku
pierwszych kropli wlewa się do rurki polarymetrycznej o dł. 2dm i odczytuje się skręcalność
roztworu na skali sacharymetru. Ilość gramów skrobii w 100mL badanego roztworu wylicza się ze
wzoru Biota:
100  a
C
l  d o20
gdzie: l - długość rurki polarymetrycznej w dm (jest napisana na rurce),
a- odczyt z sacharymetru, który należy pomnożyć przez 0,346 w celu wyrażenia go w stopniach
kątowych,
12
do20 - skręcalność właściwa skrobi w 1,124% roztworze HCL (dla skrobi ziemniaczanej wartość
ta wynosi 183,7°, a dla pszennej 183,6°).
3. Przygotowanie hydrolizatu z mąki pszennej do oznaczenia wydajności fermentacyjnej.

Naważkę mąki pszennej o masie 25g należy umieścić w kolbie płaskodennej o pojemności
1000ml, dodać 300ml wody destylowanej i 10ml 25% HCL. Kolbę należy zamknąć korkiem z
waty. Całość umieścić w autoklawie celem przeprowadzenia hydrolizy kwasowej mąki pszennej.
Hydrolizę prowadzić należy w temp. 120°C (l,4kg/cm2) w czasie 30 minut. Po tym czasie
hydrolizat należy ochłodzić do temp. otoczenia i za pomocą 30% NaOH doprowadzić odczyn
roztworu do pH=4,8 po czym dodać 0,15g ekstraktu drożdżowego. W warunkach sterylnych przy
płomieniu palnika do hydrolizatu należy wprowadzić 5ml czystej kultury drożdży gorzelniczych,
kolbę zamknąć korkiem z waty. Całość należy wstawić do termostatu o temp. 28-29°C na okres 7
dni.
DRUGI TYDZIEŃ ĆWICZENIA
4. Oznaczanie zawartości alkoholu etylowego w odfermentowanym zacierze (po zimnym

zacieraniu jak również w zacierze po hydrolizie kwasowej, patrz p. 1 i 3 wykonania
ćwiczenia - w sumie 2 próby).
Po ukończeniu fermentacji alkohol oddestylować w zestawie do destylacji prostej (rys. 1) do
cylinderka o poj. 100mL.
Rys. Schemat zestawu do destylacji prostej: l - kolba, 2 - chłodnica, 2a - termometr, 3 - odbieralnik

Destylat należy zobojętnić przy pomocy 2% roztworu NaOH do pH=7 (w jakim celu?) i powtórnie
oddestylować etanol do cylinderka na l00ml. Bardzo ważne jest zanotowanie końcowej objętości
13
uzyskanego destylatu. Zawartość otrzymanego alkoholu należy oznaczyć za pomocą refraktometru

zanurzeniowego.
5. Oznaczanie etanolu w destylacie za pomocą refraktometru zanurzeniowego.

Próbkę należy wlać do naczynia refraktometrycznego, naczynie wstawić do łaźni wodnej
o
refraktometru, a następnie należy odczytać wskazanie liczby refraktometrycznych na granicy
podziału pola jasnego i ciemnego w wizjerze refraktometru. Liczbę stopni refraktometrycznych
należy przeliczyć na % masowy i objętościowy alkoholu w badanym destylacie porównując jego
wskazania z tablicami przeliczeniowymi.
Obliczanie wyników:
We wstępie do ćwiczenia podano teoretyczną maksymalną wydajność alkoholu ze 100kg skrobi
oraz przeciętną teoretyczną wydajność. Mając do dyspozycji:
 wyliczoną zawartość skrobi w mące użytej do ćwiczenia
 wyliczoną %(m/v) zawartość alkoholu w obu destylatach uzyskanych z obu badanych
zacierów
 objętości obu uzyskanych destylatów
należy wyliczyć:
 maksymalną teoretyczną wydajność (w gramach) jaką można było uzyskać z użytej naważki
mąki
 praktyczną wydajność (w gramach) jaką uzyskano z użytej naważki mąki
 procentową praktyczną wydajność jaką uzyskano
Wskazówka: Teoretyczną maksymalną wydajność alkoholu ze skrobi wyliczoną z równania
stechiometrycznego należy przyjąć za 100%.
Przykładowy sposób obliczania wyników:

1. Zawartość skrobi w mące pszennej wg. metody Eversa z modyfikacją wynosi (np.:1,28 g/ 100ml
z 5 g badanej próbki mąki wg. wzoru Biota)
czyli w 5 g mąki - 1,28 g skrobi
25 g mąki - X1
X1 = 6,4 g skrobi (ogólna zawartość skrobi użytej w hodowli)
2. Zawartość etanolu wg. odczytu po destylacji wynosi np.: 35 stopni, natomiast odczytu z tabeli
wynosi 14,03 % (m/v)
3. Objętość końcowego destylatu wynosi np.: 60 ml
4. Objętość wyjściowa płynu hodowlanego np.:250 ml
14
Maksymalna teoretyczna wydajność z naważki w gramach, wg. punktu 1 będzie następująca:

100 kg skrobi - 71,54 l etanolu (100%)
100000 g - 71540 ml etanolu
1,28g - X2
X2= 0,92 ml etanolu z 5 g skrobi
ponieważ do hodowli użyliśmy 25 g skrobi jak w punkcie 1 należy pomnożyć wartość X2 przez 5,
uwzględniając dodatkowo gęstość etanolu , która wynosi 0,7893 g/ml
czyli
0,92 g etanolu(X2) - 5 g maki
X3 - 25g maki
X3= 4,6 g etanolu
X4= 4,6 g etanolu .
0.7893=3,63 g etanolu (maksymalna teoretyczna wydajność z 25 g maki / 100 ml destylatu)
Praktyczna wydajność:
14,03g etanolu - 250 ml płynu pohodowlanego
Y - 100ml
Y= 5,612 g etanolu /100ml
Ponieważ objętość destylatu wynosiła 60 ml ( patrz punkt 3) należy obliczyć faktyczne stężenie
etanolu w destylacie pomniejszone o gęstość etanolu. Czyli:
5,612 g (Y) - 100 ml
Y1 - 60 ml
Y1= 3,37g . 0,7893= 2,66g etanolu
Procentowa praktyczna wydajność (%) = Y1 (praktyczna wydajność) /X4 (wydajność
teoretyczna) x100 (%)
2,66/3,63 .100 =73,22%
Wyniki oznaczeń i analiz należy umieścić w sprawozdaniu w oddzielnych punktów wraz z

obliczeniami i przedłożyć osobie prowadzącej ćwiczenia w celu sprawdzenia. Należy także
zaznaczyć wszelkie odstępstwa od metod podanych w opracowaniu ćwiczeń. Na końcu
sprawozdania z ćwiczeń należy podać wnioski w formie zwięzłych punktów.
15
Odczynniki.
 mąka pszenna lub inny surowiec skrobiowy
 -amylaza bakteryjna /roztwór wodny/
 glukoamylaza grzybowa /roztwór wodny/
 roztwór soli mineralnych /25 ml H2O; 0,18g(NH4)2HPO4; 0,02g MgCl2/-10% i 30% roztwór
NaOH
 mleczko drożdżowe zawierające lg drożdży w 25 ml pożywki
 1,124% roztwór HCL
 płyny Carreza I i II
Aparatura.
 łaźnia wodna z termostatem
 mieszadło laboratoryjne
 zestaw do destylacji prostej z deflrgmatorem gruszkowym
 pehametr
 waga laboratoryjna
 refraktometr zanurzeniowy

Szkło laboratoryjne.
 zlewka szklana o pojemności 500 ml
 pipety na 10 ml
 kolby płaskodenne o pojemności 500 ml
 kolby miarowe o pojemności l00 ml
16
17
OTRZYMYWANIE ORAZ OCENA WYDAJNOŚCI I JAKOŚCI DROŻDŻY PIEKARSKICH
2. OTRZYMYWANIE ORAZ OCENA WYDAJNOŚCI I JAKOŚCI

DROŻDŻY PIEKARSKICH
2.1. WPROWADZENIE
Drożdże są zaliczane do tlenowców lub względnych beztlenowców, a przeprowadzana przez nie
fermentacja glukozy lub sacharozy jest procesem beztlenowym. W warunkach beztlenowych
drożdże szlachetne, tj. piekarskie, gorzelnicze, piwowarskie i winiarskie fermentują bardzo
intensywnie, natomiast rozwijają się bardzo słabo. W warunkach tlenowych drożdże przestawiają
się z fermentacji na oddychanie tlenowe. U niektórych gatunków drożdży, jak już wspomniano,
można prawie całkowicie stłumić fermentację przez silne napowietrzanie, jak to ma miejsce w
drożdżownictwie, gdzie chodzi tylko o możliwie największe nagromadzenie ich masy komórkowej.
Bywają również i takie przypadki, w których drożdże, np. w warunkach beztlenowych, prawie
wcale się nie rozwijają, gdyż nie maja zdolności fermentacyjnych lub wykazują je w minimalnym
stopniu, co w praktyce przemysłowej zostało wykorzystane do hodowli drożdży paszowych.
Typowe tlenowce, jakimi są różne gatunki należące rodzajów: Candida, Torulopsis, Mycoderma i
inne, są drożdżami dzikimi dla drożdżownictwa (jeśli chodzi o produkcję drożdży piekarskich),
natomiast dominującym gatunkiem szlachetnym jest Saccharomyces cerevisiae. Ta zdolność
drożdży szlachetnych do fermentacji lub oddychania w zależności od warunków ma
pierwszoplanowe znaczenie w fabrykach drożdży piekarskich, które przygotowują (hodują w
warunkach tlenowych) biomasę komórkową z przeznaczeniem jej do procesów fermentacyjnych
ciasta w przemyśle piekarskim. Dlatego też jedna z metod oceny jakości drożdży piekarskich jest
określenie ich biologicznej aktywności, czyli zdolności wytwarzania dwutlenku węgla
spulchniającego ciasto w drodze fermentacji.
Silnie fermentujące drożdże piekarskie (Saccharomyces cerevisiae) produkują znaczne ilości
CO2, który powoduje „rośnięcie ciasta”. Uzyskuje się je w kadziach z hodowli intensywnie
napowietrzonych. Jako produkt uboczny tworzy się zawsze etanol, głównie w początkowych
stadiach namnażania, tzw. generacjach. Regulując odpowiednio napowietrzanie podłoża
hodowlanego oraz ilości cukru w sposób ciągły dodawanego do kadzi, można uzyskać różną
wydajność masy komórkowej drożdży i alkoholu etylowego. Cukier najczęściej w postaci
rozcieńczonego roztworu melasy (przy gęstości 80o Blg w melasie znajduje się ok. 50% cukru –
sacharozy, czyli 50g w 100g melasy), dodawany do hodowli w sposób ciągły, ale małymi porcjami,
co ogranicza rozwój drożdży. W ten sposób zapobiega się tworzeniu produktów fermentacji, a cała
zawartość cukru zostaje wykorzystana do budowy komórek drożdżowych. Źródłem azotu dla
drożdży może być amoniak–sole amonowe, natomiast źródłem fosforu–rozpuszczalne fosforany
wapnia lub amonu (niekiedy stosuje się wodny wyciąg z superfosfatu lub kwas fosforowy).
18
Przygotowana brzeczka melasowa o określonej zawartości cukru i wzbogacona solami mineralnymi

(głównie azotowymi i fosforowymi) w ściśle zaprogramowanej ilości stanowi podstawowe podłoże
hodowlane dla drożdży.
Cechą wspólną wszystkich gatunków drożdży, niezależnie od przemysłu, w którym znalazły
praktyczne zastosowanie, jest ich stopniowe namnażanie, poczynając od skali laboratoryjnej w
stacji czystych kultur, a skończywszy na dużych tankach fermentacyjnych lub kadziach
hodowlanych. Proces namnażania drożdży rozpoczyna się w małych objętościach np. w
probówkach lub kolbach Erlenmayera, gdzie wyjałowione podłoże szczepi się wybraną rasą
drożdży. Drożdże mające zdolności fermentacyjne wstawia się tylko do termostatu o temp. ok. 28 o
C na 24 godziny, natomiast szczepom wykazującym charakter oddychania tlenowego należy
zapewnić napowietrzanie, oprócz zapewnienia identycznych warunków termostatowych oraz czasu
nagromadzania masy komórkowej. Rozwiniętą kulturę drożdżową przenosi się w warunkach
zachowania pełnej jałowości na świeże podłoże, którego ilość jest od 4 do 8–krotnie większa. W
wyniku kilkukrotnego przeszczepiania drożdży, tzw. „matki drożdżowej”, uzyskuje się właściwą
ilość biomasy komórkowej do zaszczepienia propagatora– pierwszego naczynia w skali
produkcyjnej.
W przemyśle drożdży piekarskich wyróżnia się przeciętnie dwa stopnie propagacji, tzw. mały i
duży propagator, w którym hodowle prowadzi się bez napowietrzania lub z niewielkim dopływem
powietrza w temp. 29o C i przy pH 4,8 w ciągu ok. 20 godzin. Dalszy proces hodowli drożdży
odbywa się według schematu technologicznego stosowanego w drożdżownictwie, stanowiącego
zamknięty cykl produkcyjny.
Omawiany cykl produkcyjny składa się z następujących stadiów namnażania drożdży zwanych
generacjami:
 Kolba Pasteura od 1 do dm3
 Kolba Karlsberga od 10 do 20 dm3 (w obu pierwszych etapach stosuje się brzeczkę słodową)
 Mały propagator od 50 do 150 dm3
 Duży propagator od 500 do 1000 dm3
 Generacja A od 5 do 10m3
 Generacja B od 40 do 60m3
 Generacja I i II od 40 do 60m3, napowietrzana 40-60m3/m3 brzeczki x godzina
 Generacja III od 100 do 150m3 , napowietrzana 80-100m3/m3 brzeczki x godzina
Tanki używane do hodowli drożdży zarodowych wyposażone są w barboterowy system

napowietrzania podłoża oraz chłodnice płaszczowe. Natomiast do namnażania drożdży w II i III
generacji stosuje się ostatnio najnowszy typ zamkniętej kadzi zaopatrzonej w śmigłowy system
napowietrzający, specjalną chłodnicę wbudowaną wewnątrz kadzi, cyklonowy system do
19
odpieniania brzeczki drożdżowej oraz automatyczną regulację dozowania brzeczki melasowej,

która jest sprzężona z analizatorem alkoholu w czasie hodowli drożdży.
Po zakończonym procesie hodowli drożdży w propagatorach, z generacji A i B nie wydziela się
drożdży, lecz w całości przepuszcza się do następnego tanku i uzupełnia świeżym podłożem.
Natomiast drożdże wyhodowane w I, II i III generacji oddziela się od brzeczki na wirówkach w
postaci skoncentrowanej (mleka drożdżowego) o gęstości ok. 14o Blg i przechowuje w zbiornikach.
Drożdże III generacji w postaci mleka zagęszcza się na filtrze próżniowym do zawartości 27–
30% s. m. W ten sposób przygotowana masa komórkowa drożdży poddawana jest formowaniu w
kostki i w tej postaci dostarczana na rynek.
Drożdże piekarskie otrzymuje się nie tylko w postaci świeżej, lecz także w stanie wysuszonym.
W tym celu świeże drożdże z filtra po uformowaniu w makaroniki o średnicy 2 mm i długości ok. 5
mm suszy się do zawartości ok. 93% s.m. przy stosunkowo intensywnym przewietrzaniu granulatu
drożdży w temperaturze nie przekraczającej 30oC.
Do hodowli drożdży metodą laboratoryjną można stosować fermentor. Prowadzi się ją wg
następujących zasad:
 minimalne stężenie cukru w podłożu, osiąga się przez dozowanie roztworu melasu
niewielkimi porcjami,
 napowietrzanie utrzymywane na stałym poziomie,
 pH utrzymywane na stałym załozonym poziomie przez dodatek niewielkich ilości roztworu
zasady w miarę obniżania się pH środowiska,
 utrzymanie temperatury na poziomie 29-30oC
W hodowli drożdży piekarskich poważną rolę odgrywają zakażenia bakteryjne oraz drożdże
dzikie, natomiast pleśnie w tym przypadku nie stanowią tak ważnego zagrożenia, gdyż czas
zdwajania ich biomasy komórkowej jest trzy do czterech razy dłuższy w stosunku do drożdży.
Głównymi czynnikami wpływającymi na czystość mikrobiologiczną hodowli drożdży są:

 jałowość pożywki węglowodanowej wraz z solami mineralnymi, które w sposób ciągły
dopływają do kadzi, gdzie odbywa się proces namnażania biomasy komórkowej,
 czystość powietrza, wody, naczyń (maszyn i urządzeń), stan sanitarny pomieszczeń i higiena
personelu.
Ponieważ proces hodowli drożdży odbywa się w warunkach tlenowych najgroźniejsze będą te
zakażenia, których rozwojowi sprzyjają tlenowe lub względnie beztlenowe warunki. Z drugiej
strony należy pamiętać, że optymalne pH dla rozwoju drożdży leży w przedziale od 4,5 do 5,0 oraz
fakt, ze są one mezofilami. W tych warunkach różne gatunki bakterii znajdują sprzyjające warunki
rozwoju. W drożdżownictwie spotykamy całą grupę bakterii mlekowych (Streptococcus,
20
Leuconostoc, Lactobacillus), gnilnych (Proteus vulgaris, Bacillus subtilis, B. megatherium) i

denitryfikujących (Pseudomonas fluorescens), które są szczególnie szkodliwe ze względu na
tworzenie azotynów inhibitujących rozwój drożdży piekarskich. Do ważnych zakażeń w
drożdżownictwie należą również bakterie, które mają zdolność do wytwarzania śluzów i oklejania
komórek drożdżowych powodując ich zlepianie się w duże aglomeraty i tzw. kłaczkowanie drożdży
w czasie hodowli. Do rodzin bakterii wykazujących zdolność wytwarzania śluzów można zaliczyć:
Lactobacillaceae, Enterobacteriaceae, Micrococcaceae i Pseudomonadeaceae.
Najbardziej uciążliwym zakażeniem w hodowli drożdży piekarniczych są drożdże dzikie
należące do rodzajów: Candida, Torulopsis, Mycoderma i in. Walka z dzikimi drożdżami w
przemyśle drożdży piekarskich jest wyjątkowo trudna do opanowania, ponieważ wymagania ich,
jeśli chodzi o skład podłoża, są mniejsze od wymagań drożdży szlachetnych, natomiast czas
generacji jest znacznie krótszy, a więc wygrywają one we współzawodnictwie o ten sam pokarm
węglowodanowy z drożdżami szlachetnymi i szybko opanowują środowisko. Dzikie drożdże mają
bardzo słabe uzdolnienia do fermentowania cukrów, a co za tym idzie do spulchniania ciasta w
piekarnictwie. Biomasa drożdży piekarskich z dużą ilością zakażeń drożdżami dzikimi będzie
wykazywała po dodaniu do ciasta bardzo słabą aktywność i małą przydatność technologiczną do
wypieku pieczywa. Jednym ze sposobów oznaczania zakażeń drożdżami dzikimi, oprócz badań
mikroskopowych na podstawie wyglądu morfologicznego układów i zespołów komórek
drożdżowych, jest tzw. test trehalazowy, polegający na oznaczeniu kąta skręcania płaszczyzny
światła spolaryzowanego alkoholowego roztworu ekstraktu cukrów uzyskanego z biomasy drożdży.
Badania te przeprowadza się w polarymetrze. Wykorzystano tutaj zasadę odkładania się substancji
zapasowych (węglowodanów) w komórkach drożdży szlachetnych w postaci wolnej trehalozy,
którą łatwo jest wyekstrahować z komórek za pomocą etanolu. Badania wykazały, że drożdże
dzikie nie mają zdolności biosyntezy tego cukru zapasowego i w związku z tym zawartość
trehalozy będzie wykazywała zawsze niższą wartość w porównaniu z drożdżami szlachetnymi,
które zawierają 16-18% trehalozy w przeliczeniu na suchą masę, a przy specjalnych rasach drożdży
nawet 25%.
21
ĆWICZENIE TRWA PRZEZ DWA KOLEKNE ZAJĘCIA
Przygotowanie podłoża do hodowli drożdży piekarskich:

Należy przygotować 300 cm3 podłoża o następującym składzie:
 sklarowany melas w ilości zapewniającej 10% stężenie sacharozy w podłożu
(STOPIEŃ ROZCIEŃCZENIA ZALEŻY OD KLASY MELASY - PATRZ TABELKA)
 0,85 % (m/v) (NH4)2SO4 w roztworze przygotowanego melasu
 0,12 % (m/v) (NH4)2HPO4 w roztworze przygotowanego melasu
pH podłoża należy ustalić na wartość 5,0 przy pomocy H2SO4, a następnie rozlać po 150cm3 do
dwóch kolb erlenmajera o objętości 500cm3 i wysterylizować (117o C, 15 min.).
Tabela 1. Wybrane cechy jakościowe melasy w I i II klasie jakości.

Melasa I klasa II klasa
% sacharozy 47 44
o
Bx 75 75-73
pH 7,0-8,5 7,0-9,0
Hodowla drożdży piekarskich:

Przygotowane sterylne i ochłodzone do temperatury ok. 30oC podłoże zaszczepia się badaną
rasą drożdży (zawiesiną lub ezą ze skosu brzeczkowego). Hodowlę prowadzi się w temperaturze
28oC na wytrząsarce w celu zapewnienia tlenowych warunków hodowli przez ruch płynu w
kolbach.
Ocena szybkości podnoszenia ciasta metodą kulki wg Ostrowskiego

Odważa się 0,31g drożdży prasowanych z kostki, miesza w naczyniu z 4,8 ml wody
destylowanej i rozprowadza przy pomocy bagietki lub szpatułki, dodaje 5g maki i szybko wyrabia
ciasto nadając mu formę kulki (w przypadku innych próbek drożdży niż prasowane do naważki
dodaje się 5g mąki i wody tyle ile jest niezbędne). Kulkę wrzuca się do zlewki z wodą o temp. 32 oC
i umieszcza w termostacie o temperaturze 32-34o C. Mierzy się czas wypłynięcia kulki, który jest
równoznaczny z czasem podnoszenia ciasta. Otrzymane wg tej metody wyniki są następujące :
 dla drożdży piekarskich 18-20 min,
 dla drożdży Candida utilis 70-160 min,
22
Wyniki te można odnieść do metody standardowej przez pomnożenie ich przez 3,5. Przyjęta w
Polskiej Normie metoda oznaczania czasu podnoszenia ciasta składającego się z określonej ilości
drożdży piekarskich, soli kuchennej i mąki polega na włożeniu ciasta do foremki, określeniu czasu
w jakim wyrośnięte ciasto (w temp. 35oC) dotknie poprzeczki umieszczonej na formie. Uważa się,
że drożdże wykazują dobrą aktywność, jeżeli czas ten wynosi 60-65 min.
NA NASTĘPNYCH ZAJĘCIACH- PO TYGODNIU
Po zakończonym procesie hodowli płyn pohodowlany należy odwirować w dwóch gilzach do

wirowania (po 10 ml hodowli w każdej gilzie do wirowania) przy 3000 obr./min przez 10 min,
następnie należy zważyć ilość otrzymanej mokrej biomasy. Do obliczenia wydajności biomasy
przyjmuje się, że odwirowana w opisany sposób biomasa zawiera 17% suchej substancji.
Wydajność podaje się jako gD100/100g sacharozy, (D100 oznacza suchą substancję drożdży).
Ocena stanu fizjologicznego i czystości mikrobiologicznej drożdży

Z odwirowanej biomasy komórkowej drożdży wykonuje się bezpośrednio preparat
mikroskopowy i wykonuje rysunek komórek podając powiększenie. Oblicza się w procentach ilość
komórek pączkujących (w dojrzałych drożdżach ilość komórek pączkujących  5%).
Z tej samej odwirowanej próby drożdży wykonuje się
1. preparat przyżyciowy barwiony błękitem metylenowym rozcieńczonym 1: 10000 i
podaje w procentach zawartość komórek martwych (barwiących się na niebiesko)
2. stan odżywienia ocenia się wykonując preparat przyżyciowy barwiony płynem Lugola.
Zgromadzony w komórce materiał barwi się na brązowo.
Czystość mikrobiologiczną ocenia się metodą bezpośrednich obserwacji mikroskopowych. W
preparacie bezpośrednim liczy się procentowe zawartości komórek innych drożdży, bakterii i pleśni
w stosunku do kultury właściwej (wykonuje się co najmniej trzy preparaty).
23
Wyniki oznaczeń i analiz należy umieścić w sprawozdaniu w formie oddzielnych punktów wraz
z przeliczeniami i przedłożyć osobie prowadzącej ćwiczenia w celu sprawdzenia. Należy także
Sposób prezentacji wyników

Zawartość Ilość Wydajność Udział Udział Stan Czystość Czas
sacharozy mokrej (gD100 komórek komórek odżywienia mikrob. podnoszenia
w próbie biomasy ze 100g pączkujących martwych (+ lub -) (%) ciasta
hodowlanej (g/100 ml) sacharozy) (%) (%) (min)
(g/100 ml)
Próbka 1
Próbka 2
Itd...
24
 kolby na 250 lub 300 ml (x 2)

 melas
 drożdże piekarnicze
 10% kw. Siarkowy
 pehametr
 wirówka , gilzy wirownicze
 pipety miarowe na 5,10 i 25 ml, bagietka
 mąka
 termometr, termostat 34o C
 mikroskop
 pł. Lugola i bł. Metylenowy
 (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4
25
PRODUKCJA I CHARAKTERYSTYKA GLUKOAMYLAZY
3. PRODUKCJA I CHARAKTERYSTYKA GLUKOAMYLAZY

3.1. WPROWADZENIE
Enzymy są katalizatorami reakcji chemicznych zachodzących w układach biologicznych. Są to
białka o masie cząsteczkowej pojedynczego łańcucha polipeptydowego od 9000 (acylofosfataza) do
155 000 (podjednostka -polimerazy RNA), czyli zawierające od 60 do 1000 reszt aminokwasów.
Enzym może być pojedynczym łańcuchem polipeptydowym lub składać się z kilku łańcuchów
(każdy z nich nazywamy podjednostką) tworzących oligomeryczny kompleks. Masa cząsteczkowa
takiego kompleksu może sięgać 6 x 106. A więc rozmiar enzymu jest znacznie większy niż wymaga
tego prosta kataliza reakcji chemicznej, ale jest niezbędny do przebiegu reakcji. Pozwala on
bowiem na odpowiednie sfałdowanie łańcucha polipeptydowego i precyzyjne ułożenie
aminokwasów w miejscu, gdzie zachodzi reakcja chemiczna, tak aby osiągnąć optymalny efekt
katalityczny i zapewnić odpowiednie środowisko reakcji (enzym pełni funkcję chiralnego
rozpuszczalnika). Dodatkowo, duża powierzchnia cząsteczki enzymu umożliwia jego odpowiednie
zlokalizowanie w komórce, na przykład związane z błonami komórkowymi, czy też połączenie z
innymi enzymami w szlaki metaboliczne.
Wiele enzymów należy do białek złożonych, które składają się z części białkowej i związanej z
nią grupy prostetycznej (na przykład polisacharydu, lipidu, porfiryny, kationu metalu). W
niektórych grupa prostetyczna związana jest w sposób odwracalny i wówczas część białkowa nosi
nazwę apoenzymu, a ta grupa koenzymu.
Enzymy są niezwykle specyficzne i dotyczy to zarówno substratu (specyficzność substratowa),
jak i katalizowanej reakcji (spośród wielu reakcji, jakim może ulec substrat, katalizowana jest tylko
jedna określona reakcja). Specyficzność substratowa uwarunkowana jest budową określonego
rejonu powierzchni enzymu, zwanego centrum wiążącym, która chemiczną budową, wielkością i
kształtem jest komplementarne do cząsteczki substratu. W ten sposób jeden lub najwyżej kilka
strukturalnie zbliżonych związków chemicznych może związać się z enzymem i ulec przemianie w
centrum aktywnym enzymu. Centrum aktywne enzymu zawiera odpowiednio ułożone grupy
funkcyjne biorące bezpośredni udział w procesie katalizy.
Białkowa struktura enzymów determinuje szereg ich podstawowych właściwości oraz uzależnia
ich działanie od tych samych warunków, które wpływają na stan fizykochemiczny białek.
Wartość pH decyduje o stanie jonizacji polarnych grup białka enzymatycznego. Dla każdego
enzymu istnieje optymalna wartość (optimum pH) zapewniająca zarówno najodpowiedniejszy stan
jonizacji jego cząsteczki jak też optymalne warunki dla przekształceń chemicznych substratu. Dla
większości enzymów optimum pH przypada w pobliżu punktu neutralnego (pH 5-8). Znane są
jednak wyjątki o wartościach ekstremalnych pod tym względem np. pepsyna ma optimum pH 1,5, a
26
fosfataza alkaliczna pH ok.10. Im pH jest odleglejsze od punktu optymalnego, tym wolniejszy jest
przebieg reakcji enzymatycznej. Przy zbyt niskim lub zbyt wysokim pH może dochodzić do
denaturacji białka enzymatycznego, co doprowadza do całkowitego zaniku aktywności enzymu
czyli jego inaktywacji.
Podwyższenie temperatury sprzyja podniesieniu cząsteczek substratu na odpowiedni poziom
energii aktywacji, a zatem wywiera pozytywny wpływ także na szybkość reakcji enzymatycznych.
Podwyższenie temperatury o 10oC powoduje przeciętnie trzykrotne zwiększenie szybkości reakcji
enzymatycznej, jednak tylko do pewnej granicy temperatury, w której zaczyna się proces termicznej
denaturacji białka enzymatycznego. Większość enzymów wykazuje optimum działania w
temperaturze 35-45oC. Powyżej tej granicy zazwyczaj szybko następuje denaturacja. Chociaż znane
są enzymy wytwarzane przez organizmy zaadoptowane do wysokich lub niskich temperatur,
których optima temperatur wynoszą np. 70-100oC (-amylazy, proteazy, ksylanazy) lub 5-20oC
(pektynazy, celulazy).
Enzymy odznaczają się szczególną specyficznością i wysoką aktywnością w optymalnych
warunkach. Działają w organizmach żywych jak i poza nimi, dlatego ich aktywność katalityczną
można wykorzystać w produkcji przemysłowej.
Skrobia to podstawowe, odnawialne źródło węgla i energii występujące na Ziemi, powstające w
procesie fotosyntezy prowadzonym przez rośliny, które w ten sposób przekształcają energię
słoneczną w chemiczną. Skrobia jest zaliczana do homoglukanów, zbudowanych z dwóch frakcji:
amylozy (wiązania α-1,4-glikozydowe pomiędzy cząsteczkami α-D-glukopiranozy) i amylopektyny
(wiązania α-1,4 i α-1,6 glikozydowe pomiędzy cząsteczkami α-D-glukopiranozy). Enzymy
degradujące skrobię są szeroko rozpowszechnione w naturze, a w szczególności w królestwie
bakterii. Wiele z gatunków tych organizmów wytwarza je jako białka zewnątrz- i
wewnątrzkomórkowe. W praktyce enzymy zdolne do hydrolizy skrobi podzielono na:
endoamylazy, egzoamylazy, amylazy znoszące rozgałęzienia (ang. debranching enzymes) i
transferazy. Podział ten zgodny jest z postanowieniami Międzynarodowej Unii Biochemii i Biologii
Molekularnej (IUBMB), uwzględniającej mechanizmy hydrolizy enzymatycznej oraz specyficzność
substratową (Enzyme Nomenclature, 1992).
Niezależnie od oficjalnego podziału enzymów hydrolizujących skrobię w ostatniej dekadzie
opracowano klasyfikację opartą na strukturalnym podobieństwie oraz wspólnym mechanizmie
katalitycznym tych enzymów. W podziale tym za jednostkę nadrzędną uznano „rodzinę”. Enzymy
należące do „rodziny α-amylaz” znalazły się w rodzinie 13 i łączy je kilka cech wspólnych:
 zdolność do rozszczepiania wiązań α-glikozydowych,
 hydroliza wiązań z wytworzeniem mono- i oligosacharydów lub tworzenie wiązań
α-glikozydowych na drodze transglikozylacji,
27
 posiadanie w sekwencji aminokwasowej czterech silnie zakonserwowanych regionów (I-IV)

pełniących funkcję centrów aktywnych i miejsc wiązania substratu,
 obecność aminokwasów Asp i Glu w miejscach odpowiedzialnych za katalizę.
1. Endoamylazy
Do najbardziej znanych endoamylaz należą α-amylazy (E.C.3.2.1.1), które stanowią największą
i najlepiej poznaną grupę enzymów amylolitycznych. Są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie i
zarazem należą do najważniejszych wytwarzanych w skali przemysłowej enzymów. Prowadzą
reakcje endohydrolizy α-glukanów zawierających wiązania α-1,4-D-glikozydowe w miejscach
przypadkowych. Produktami hydrolizy skrobi, amylozy, amylopektyny i glikogenu są
maltooligosacharydy (maltoza do maltoheptaozy, zależnie od pochodzenia enzymu i czasu reakcji).
Mogą też hydrolizować β-graniczne dekstryny, izopanozę, pullulan (do panozy). α-amylazy
zależnie od pochodzenia wykazują bardzo szeroki zakres aktywności i stabilności. Ogólnie uważa
się, że są stabilne w pH 5,5-8,0, ale pochodzące z bakterii Bacillus mogą zachowywać stabilność w
znacznie szerszym zakresie pH 1-11. Stabilność termiczną utrzymują w przedziale 50-100oC, a
przed cieplną inaktywacją chronią je jony Ca +2, Na+, poliole oraz substraty skrobiowe. Jony Ca 2+
tworzą kompleks enzym- Ca2+, co znacznie obniża energię aktywacji. Kryterium podziału α-amylaz
jest wynikiem tworzonych produktów reakcji oraz pochodzenia poszczególnych enzymów, w
związku z tym wyróżnia się dwie duże grupy zawierające kilka podgrup:
A. α-amylazy tworzące dekstryny o zróżnicowanej masie cząsteczkowej:
 α-amylazy śliny
 α-amylazy trzustki
 α-amylazy roślinne (słodowe)
 grzybowe α-amylazy z Aspergillus oryzae
 upłynniające i scukrzające α-amylazy z bakterii rodzaju Bacillus
 termostabilne bakteryjne α-amylazy
 α-amylazy ze Streptococcus bovis
B. α-amylazy tworzące specyficzne oligosacharydy:
 α-amylazy tworzące maltotriozę (DP 3)
 α-amylazy tworzące maltotetraozę (DP 4)
 α-amylazy tworzące maltopentaozę (DP 5)
 α-amylazy tworzące maltoheksaozę (DP 6)
28
2. Egzoamylazy
Grupa ta obejmuje enzymy charakteryzujące się zdolnością do hydrolizy wiązań α-1,4-
glikozydowych jak β-amylazy (E.C. 3.2.1.2), a także α-1,4-glikozydowych i α-1,6-glikozydowych
jak glukoamylazy inaczej zwane amyloglukozydazami (E.C. 3.2.1.3) i α-glukozydazy (E.C.
3.2.1.20). Egzoamylazy odszczepiają pojedyncze jednostki glukozy od nieredukującego końca
skrobi i glikogenu (glukoamylaza i α-glukozydaza) tworząc tylko glukozę, a także maltozę i β-
graniczne dekstryny (β-amylaza). Glukoamylaza i β-amylaza hydrolizując wiązanie α-glikozydowe
konwertują położenie hydroksylu przy (C1) z α na β, oba enzymy produkowane są przez cały szereg
mikroorganizmów. Glukoamylazy rozkładają znacznie szybciej wiązania α-1,4 niż α-1,6-
glikozydowe w maltooligosacharydach. Podczas przedłużonej hydrolizy oligosacharydów, w
obecności glukoamylazy, możliwa jest rewersja glukozy do maltozy i izomaltozy. Jednak wiązania
fosforanowe, które występują w ziarnach skrobi ziemniaczanej, hamują aktywność tego enzymu.
Enzym ten posiada jedno centrum aktywne. Glukoamylaza występuje w minimalnych ilościach w
słodzie jęczmiennym, znaleziono ją także w tkanka zwierzęcych, ale głównym źródłem tego
enzymu są grzyby niższe z rodzaju Aspergillus, Rizophus, Endomyces, Endomycopsis. Pod
względem budowy glukoamylaza zaliczana jest do glikoproteidów. Zatem, w celu całkowitej
hydrolizy ziaren skrobi do glukozy, niezbędny jest udział trzech enzymów: α-amylazy,
glukoamylazy i fosfatazy. β-amylazy rozpowszechnione są również w nasionach, liściach, bulwach
i korzeniach roślin wyższych. Porównanie enzymów pochodzenia roślinnego i bakteryjnego
wykazało bardzo duże różnice zarówno w strukturze, budowie jak i mechanizmie katalizy. α-
glukozydazy podzielono na dwa typy ze względu na ich specyficzność substratową. Typ pierwszy
to typowe α-glukozydazy, które szybciej hydrolizują heterogenne substraty takie jak sacharoza, niż
substraty zawierające analogiczne podjednostki, jak np. maltoza. Typ drugi to enzymy zwane
maltazami, gdyż wykazują wysoką specyficzność względem homogennych substratów, jak np.
maltooligosacharydy i nie posiadają zdolności degradowania syntetycznych α-glukozydów i
heteroglikanów.
3. Amylazy znoszące rozgałęzienia (ang. debranching enzymes)

W klasycznym podziale Międzynarodowej Unii Biochemmii i Biologii Molekularnej (IUBMB)
uwzględniającej mechanizmy hydrolizy enzymatycznej, jak również specyficzność substratową
(Enzyme Nomenclature, 1992) do grupy tej zaliczono:
 pullulanazy lub α-dekstryno-6-glukanohydrolazy (E.C. 3.2.1.41) hydrolizujące wiązania α-
1,6-glikozydowe w pullulanie, głównym produktem hydrolizy jest maltotrioza;
 izopullulanazy (E.C. 3.2.1.57) hydrolizujące wiązania α-1,4-glikozydowe w pullulanie,
produktem końcowym jest izopanoza;
29
 neopullulanazy (E. C. 3.2.1.135) hydrolizujące wiązania α-1,4 i α-1,6-glikozydowe w

pullulanie prowadząc do powstania panozy jako głównego produktu degradacji
4. Transferazy
Koleiną grupę enzymów amylolitycznych tworzą białka należące do klasy transferaz. Katalizują
one rozszczepienie wiązania α-1,4-glikozydowego w α-glukanach, tj. amylozie i amylopektynie
(cząsteczki donora) i przenoszą część łańcucha (od nieredukującego końca) na inny fragment
łańcucha α-1,4-glikozydowego (cząsteczkę akceptora), z utworzeniem wiązania α-1,6-
glikozydowego. W ten sposób amyloza może być przekształcona w amylopektynę, a skrobia w
cząsteczkę glikogenopodobną. Tego rodzaju enzymami są glikozylotransferazy α-1,4-glukanu (E.C.
2.4.1.18). W grupie tej znajdują się również transferazy katalizujące reakcje konwersji skrobi do
cyklomaltodekstryn (CD) poprzez proces wewnątrzcząsteczkowej transglikozylacji tworząc
jednocześnie wiązanie α-1,4-glikozydowe, a noszące nazwę glikozylotransferaz
cyklodekstrynowych (E.C. 2.4.1.19) i transglukozydaz dekstrynowych (E.C. 2.4.1.25). Tego
rodzaju enzymy znaleziono w komórkach niektórych ssaków i mikroorganizmów.
izoamylaza
amylopullulanaza i
inne
glikozylotransferazy
glukoamylazy/alfa-
glukozydazy
glikozylotransferazy
cyklodekstrynowe
beta-amylazy/amylazy
maltogenne
alfa-amylazy
transglukozydazy dekstrynowe
Schemat działania enzymów amylolitycznych na skrobię. Ramka otwarta symbolizuje koniec

redukujący struktury poliglukanu.
30
ĆWICZENIE TRWA PRZEZ DWA KOLEJNE ZAJĘCIA
1. Przygotowanie podłoża do biosyntezy glukoamylazy:

Do kolby Erlenmajera o pojemności 250 ml należy naważyć następujące składniki:
Otręby pszenne 3g
Mąka pszenna 4g
Pepton 0,8 g
Ekstrakt drożdżowy 0,5g
MgCl2 0,1g
CaCl2 0,01g
Składniki wstępnie wymieszać ruchem obrotowym. Następnie do kolby dodać 20 ml buforu

fosforanowego o pH 5,0, wymieszać lekkim ruchem obrotowym i zamknąć korkiem z waty.
Przygotowaną pożywkę stała należy wysterylizować przez 15 min. w temp. 121 0C. Po sterylizacji i
ochłodzeniu pożywki do temperatury pokojowej, należy zaszczepić grzybnią w objętości 5 ml
/przygotowanie poniżej/..Hodowlę /bez wstrząsania/ prowadzić przez 7 dni w temperaturze. 30oC.
2. Zaszczepianie grzybnią
Należy pobrać sterylnie 5 ml przygotowanego inokulum grzybni i zaszczepić hodowlę . tak aby
zarodniki przedostały się wszędzie na powierzchnię wysterylizowanej pożywki
3. Przygotowanie krzywej wzorcowej:
Należy rozpuścić 100 mg glukozy w 100 ml wody uzyskując w ten sposób roztwór glukozy o
stężeniu 1mg/ml. Następnie uzyskany roztwór należy rozcieńczyć wodą do końcowych stężeń
glukozy: 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml i 0,1 mg/ml.
Przygotować pięć podpisanych probówek, następnie należy wprowadzić do pierwszej probówki
1 ml roztworu glukozy o stężeniu 1mg/ml, do drugiej probówki 1 ml roztworu glukozy o stężeniu
0,5mg/ml, do trzeciej probówki 1 ml roztworu glukozy o stężeniu 0,25 ml/ml, do czwartej probówki
1 ml roztworu glukozy o stężeniu 0,1 ml/ml a do piątej probówki 1 ml wody destylowanej (piąta
probówka to próba odczynnikowa). Następnie do wszystkich probówek należy dodać po 3 ml
odczynnika DNS, umieścić probówki na 5 minut we wrzącej łaźni wodnej i ochłodzić po czym do
każdej z nich dodać 11ml wody destylowanej. Następnie należy oznaczyć ekstynkcję otrzymanych
roztworów przy długości fali 550 nm wobec próby odczynnikowej. Należy wykreślić krzywą
wzorcową obrazującą zależność ekstynkcji (oś y) od stężenia glukozy w mg/ml (oś x).
31
PO TYGODNIU
3. Przygotowanie roztworów skrobi rozpuszczalnej:

W ćwiczeniu należy wykorzystać gotowy 1%(w/V) roztwór zawiesiny skrobi rozpuszczalnej w
buforze o pH 4,5 oraz analogiczny bufor bez substratu do rozcieńczania enzymu (proszę zapytać
prowadzącego ćwiczenia).
I. Do ćwiczenia należy przygotować kilka prób:

 Próba właściwa w dwóch powtórzeniach: 0,9 ml (roztwór skrobi o pH 4,5); wstępna
inkubacja przez 3min. w danej temperaturze utrzymywana przez cały czas badania;
dodać 0,1 ml rozcieńczonego enzymu i odliczyć czas reakcji; czas reakcji enzymu z
substratem to np.: 10 min.; po tym czasie dodać natychmiast 3 ml DNS.
 Próba kontrolna: 0,9 ml (roztwór skrobi o pH 4,5); wstępna inkubacja przez 3min. w
danej temperaturze utrzymywana przez cały czas badania; czas reakcji bez enzymu
patrz powyżej (próba właściwa) np.: 10 min.; natychmiast po tym czasie dodać 3 ml
DNS; dodać 0,1 ml rozcieńczonego enzymu.
 Próba zerowa (do zerowania spektrofometru): 1 ml wody destylowanej lub 1 ml
buforu bez substratu; dodać 3 ml DNS
Przygotowanie prób do reakcji enzymatycznych:

Rodzaj próby Roztwór Czas Płyn Czas DNS Płyn
skrobi wstępnej pohodowlany właściwej pohodowlany
inkubacji (rozcieńczony inkubacji (rozcieńczony
prób enzym) (enzym z enzym)
substratem)
Próba właściwa 0,9ml 3 min 0,1 ml np. 10 min 3,0 ml -
Próba kontrolna 2 0,9 ml 3 min. - np. 10 min 3,0 ml 0,1 ml
Próba zerowa 3 1 ml wody lub buforu bez substratu o odpowiednim pH ( 4,5 ) i 3 ml DNS
II. Etapy postępowania:

Należy przygotować 10 czystych probówek, 9 z nich ustawić w 3 szeregach (po 3 probówki w
każdym). Proszę zwrócić uwagę na to, że będą 3 rodzaje prób właściwych (6 probówek), 3 rodzaje
prób kontrolnych (3 probówki) w trzech różnych temperaturach oraz 1 próba zerowa. Każda próbka
właściwa musi być sporządzona w 2 powtórzeniach. Należy pobrać po 0,9 ml buforowanego
32
roztworu skrobiowego do oznaczonych markerem 9 probówek (3 dla każdej badanej temperatury

czyli 1 kontrolna i 2 próby właściwe), natomiast próba zerowa powinna zawierać 1,0 ml wody/lub
buforu. Pierwszy komplet trzech probówek należy pozostawić w temperaturze pokojowej, drugi
wstawić do termostatu ustawionego na 50oC, a ostatni do łaźni wodnej o temperaturze 80 oC i
zostawić przez 3 min. do osiągnięcia określonej temperatury inkubacji. Następnie dodać po 0,1 ml
rozcieńczonego preparatu enzymatycznego do prób właściwych (bez wyciągnięcia prób z
termostatu) w kolejności dla każdej badanej temperatury i odliczyć czas inkubacji. Wszystkie
próby należy inkubować w danej temperaturze opisanej powyżej i w określonym czasie np.: 10 lub
15 min. itd.). Po upływie określonego czasu inkubacji (ustalonego przez prowadzącego i
studenta) należy natychmiast dodać po 3 ml odczynnika DNS zawierającego kwas 3,5-
dinitrosalicylowy do każdej z prób właściwych według kolejności dodawanego rozcieńczonego
preparatu enzymatycznego. Potem, dodać ten sam odczynnik DNS po 3 ml do pozostałych
probówek a następnie dodać po 0,1 ml rozcieńczonego preparatu enzymatycznego do 3 prób
kontrolnych w zależności od temperatury inkubacji. Wszystkie probówki należy inkubować we
wrzącej łaźni wodnej przez 5 minut ( garnek z gotująca się wodą), a po wychłodzeniu do każdej z
prób należy dodać po 11 ml wody destylowanej i dokładnie wymieszać na worteksie. Z różnic
pomiędzy wartościami absorbancji próby właściwej a próby kontrolnej w danej temperaturze
inkubacji należy obliczyć wartość S (co stanowi faktyczne stężenie cukrów redukujących
wydzielonych przez enzym w warunkach reakcji) i podstawić do wzoru.
Badane próbki (płynów pohodowlanych) powinny być wykonane przy użyciu tego samego
odczynnika DNS którego używano do oznaczania redukcyjności w czasie wykonywania krzywej
wzorcowej.
Następnie należy oznaczyć ekstynkcję otrzymanych roztworów przy długości fali 550 nm wobec
próby odczynnikowej (zerowej). Jeśli absorbancja wynosi powyżej 1,5, należy wstępnie
rozcieńczyć badaną próbkę płynu pohodowlanego i jeszcze raz oznaczać redukcyjność z
odczynnikiem zawierającym kwas 3,5-DNS.
Obliczenie aktywności glukoamylazy:
SxR
A=
0,180 Sx xB R(min) x C ml
A= -------------------------------
0,180 x B x C
33
A - aktywność glukoamylazy w molach glukozy ml/ min-1

S - ilość glukozy odczytana z krzywej wzorcowej wyrażona w mg
R – krotność rozcieńczonego preparatu enzymatycznego
B- czas reakcji enzymu z substratem (min.)
C - objętość rozcieńczonego preparatu użytego do reakcji enzymatycznej (ml)
34
 mąka pszenna
 kwaśny fosforan potasowy (K2HPO4)
 siarczan magnezowy (MgSO4)
 chlorek wapniowy (CaCl2)
 inokulum A. niger
 termostat, łaźnia wodna
 glukoza
 kolba a, 500 ml, 3 kolbki 100ml
 zlewka
 pipety (10ml, 5ml, 1ml, 0,1ml)
 bagietki
 bufory 4,5; 3,0; 7,0
 probówki 10 sztuk
35
PRAKTYCZNE WYKORZYSTANIE BAKTERII FERMENTACJI MLEKOWEJ
4. PRAKTYCZNE WYKORZYSTANIE BAKTERII FERMENTACJI

MLEKOWEJ
4.1. WPROWADZENIE
Bakterie fermentacji mlekowej należą do rodziny Lactobacillaceae i są bardzo zróżnicowane
pod względem morfologicznym. Obok ziarniaków ułożonych w łańcuszki (Lactococcus,
Leuconostoc) lub w tetrady (Pediococcus) występują również krótkie lub długie pałeczki w formie
łańcuszków (Lactobacillus), obecnie do grupy bakterii mlekowych zaliczane są również
mikroorganizmy z rodzaju Bifidobacterium (ściśle beztlenowe). Są to bakterie Gram-dodatnie,
nieprzetrwalnikujące, nieruchliwe, względnie beztlenowe, w większości przypadków nie
posiadające katalazy oraz łańcucha oddechowego. Są bardzo wymagające pod względem
składników podłoża wzrostowego. Oprócz prostych źródeł węgla (cukry proste) wymagają dla
wzrostu wielu aminokwasów, a także witamin z grupy B. Nie przyswajają azotu z soli azotanowych
ani azotu amonowego. Dlatego naturalnym siedliskiem tych bakterii są: mleko, rośliny, szczątki
roślin oraz błony śluzowe ssaków, przy czym nie są one pasożytami. Nie występują w wodzie ani w
glebie. W tej grupie bakterii występują zarówno mezo- jak i termofile. Wspólną cechą bakterii z
rodziny Lactobacillaceae jest wytwarzanie znacznych ilości kwasu mlekowego (2-
hydroksypropionowego) z prostych związków węglowodanowych. Wytwarzany jest kwas mlekowy
lewoskrętny D(-) lub prawoskrętny L(+) albo mieszanina racemiczna tych kwasów.
W organizmie człowieka metabolizowana jest jedynie forma L(+) kwasu mlekowego, dlatego
nie jest obojętne, jaki enancjomer jest wytwarzany przez bakterie.
Zróżnicowany metabolizm węglowodanów u tych bakterii jest podstawą podziału na dwie
podgrupy: homofermentatywną i heterofermentatywną. Bakterie homofermentatywne, do których
m. in. należą Lactococcus lactis, Pediococcus acidilacci, Lactobacillus plantarum, L. bulgaricus,
prowadzą wysoce homogenną fermentację z wydajnością nie mniejszą niż 1,8 mola kwasu
mlekowego z l mola heksozy, co stanowi przeszło 90% wydajności teoretycznej.
U homofermentatywnych bakterii fermentacji mlekowej, przy braku łańcucha oddechowego, w
beztlenowych warunkach procesu, akceptorem elektronów jest pirogronian powstały na drodze
EMP. Enzymem odpowiedzialnym za tę reakcję jest dehydrogenaza kwasu mlekowego, której
koenzymem jest NAD. Proces ten można przedstawić następującym równaniem:
36
Utlenienie (odwodorowanie) NADH + H+ w tej reakcji umożliwia dalszy proces konwersji heksozy
do kwasu mlekowego, gdyż utleniona forma NAD może uczestniczyć w reakcji utlenienia aldehydu
3-fosfoglicerynowego do kwasu 3-fosfoglicerynowego w szlaku EMP i tym samym dostarczana jest
dalsza pula kwasu pirogronowego.
Inaczej przedstawia się metabolizm prostych węglowodanów u heterofermentatywnych bakterii
fermentacji mlekowej. Bakterie te nie posiadają aldolazy rozszczepiającej 1,6-difosfofruktozę na
dwie triozy, nie funkcjonuje zatem u nich szlak EMP. Posiadają one natomiast dehydrogenazę 6-
fosfoglukozową oraz dehydrogenazę 6-fosfoglukonianową, a także dalsze enzymy drogi
heksozornonofosforanowej (HMP), co umożliwia im przeprowadzanie metabolizmu cukrów na tej
drodze. W wyniku takiego metabolizmu produktami fermentacji heksozy u heterofermentatywnych
bakterii fermentacji mlekowej są: kwas mlekowy, etanol lub kwas octowy, dwutlenek węgla.
Schemat przemian heksozy u heterofermentatywnych bakterii fermentacji mlekowej z udziałem
szlaku HMP:
Najczęściej u heterofermentatywnych bakterii mlekowych obok kwasu mlekowego i CO 2

wytwarzany jest kwas octowy. Ale np. u Leuconostoc mesenteroides zamiast kwasu octowego
powstaje etanol. Znany jest jeszcze inny typ heterofermentacji mlekowej u Lactobacillus bifidus -
bezwzględnego beztlenowca występującego w mikroflorze jelitowej. Metabolizm heksozy u tego
drobnoustroju przebiega bez wydzielania CO2 wg następującej reakcji:
2C6H12O6 → 2CH3CH(OH)COOH + 3CH3COOH
37
Wykorzystanie bakterii fermentacji mlekowej jest bardzo szerokie i wiąże się przede wszystkim
z przemysłem spożywczym. W ulepszaniu i konserwacji materiału roślinnego wykorzystuje się
fermentację mlekową przy sporządzaniu kiszonek warzywnych (kapusta, ogórki, buraki), a także
kiszonek paszowych dla bydła. W procesie tym, często prowadzonym z wykorzystaniem mikroflory
autochtonicznej, ujawniają się bakterie mlekowe z rodzaju Lactococcus, Pediococcus, Leuconostoc,
a także pałeczki należące do Lactobacillus brevis, L. plantarum, L. fermenti.
Drugą dużą gałęzią przemysłu spożywczego, w której stosuje się bakterie fermentacji
mlekowej, jest przemysł mleczarski i serowarski. Przy wyrobie masła, serów twarogowych i serów
żółtych oraz napojów mlecznych typu jogurt, kefir, kumys itp. stosowane są czyste kultury bakterii
fermentacji mlekowej: Lactococcus lactis, L. diacetilactis, L. cremoris, L. thermophilus,
Leuconostoc citrovorum, L. mesenteroides, Lactobacillus bulgaricus, L. brevis, L. heheticus, L.
plantarum i inne.
Również w produkcji fermentowanych wyrobów wędliniarskich (np. salami) stosowana jest
mieszana mikroflora, w skład której wchodzą bakterie fermentacji mlekowej. Poza tym bakterie
fermentacji mlekowej znalazły zastosowanie w biosyntezie dekstranu (przy pomocy Leuconostoc
mesenteroides), nizyny - antybiotyku polipeptydowego stosowanego w przemyśle spożywczym
{Lactococcus lactis), a także w wytwarzaniu preparatów leczniczych {Lactobacillus acidophilus, L.
bifidus) podawanych doustnie dla poprawienia składu mikroflory jelitowej, zwłaszcza po przebytej
kuracji antybiotykowej.
Odrębną dziedziną biotechnologii jest produkcja kwasu mlekowego do celów spożywczych i
przemysłowych przy użyciu bakterii fermentacji mlekowej.
Wprawdzie obecnie chemiczna synteza kwasu mlekowego jest ekonomicznie porównywalna z
procesem mikrobiologicznym, to jednak do celów spożywczych preferuje się kwas mlekowy
otrzymywany na drodze biologicznej. W biotechnologii kwasu mlekowego stosuje się termofilne,
homofermentatywne bakterie z rodzaju Lactobacillus:
 dla surowców roślinnych L. delbruckii i L. plantarum
 dla surowców pochodzenia zwierzęcego (np. serwatka)- L. bulgaricus
W praktyce przemysłowej stosuje się najczęściej melasę, często sacharozę lub hydrolizaty
skrobiowe. Wytworzony kwas mlekowy jest neutralizowany za pomocą CaCO3, a po skończonej
fermentacji odzyskiwany z mleczanu wapnia za pomocą kwasu siarkowego. Roztwór kwasu
mlekowego po oddzieleniu gipsu poddawany jest oczyszczeniu, zagęszczeniu do 50% i w tej
postaci trafia na rynek. Proces ten można przedstawić następującymi reakcjami:
38
Wydajność praktyczna tego procesu kształtuje się w granicach 80-90% wydajności teoretycznej.
39
Celem ćwiczenia jest charakterystyka bakterii fermentacji mlekowej oraz mikrobiologiczna

produkcja kwasu mlekowego w skali laboratoryjnej.
1. Obserwacja i opis cech morfologicznych bakterii fermentacji mlekowej (hodowle

dostarczone w probówkach).
 Lactobacills plantarum- hodowany na MRS.
 Lactococcus lactis - hodowany na BHI.
W przypadku wszystkich dostarczonych hodowli bakterii należy sporządzić preparat

bezpośredni (pow. 600 razy) oraz preparaty utrwalone fioletem goryczkowym. W celu utrwalenia
preparatu należy pobrać kroplę płynnej hodowli na szkiełko podstawowe, wykonać rozmaz,
utrwalić w płomieniu, spłukać wodą, zabarwić fioletem goryczkowym, spłukać nadmiar barwnika i
mikroskopować pod imersją.
2. Wytwarzanie kwasu mlekowego w mleku przez przemysłowe szczepy bakterii Lactococcus

lactis, i Lactobacillus plantarum
Wyjałowić w autoklawie 2 probówki zawierające po 10 ml mleka. Po wyjałowieniu i
schłodzeniu mleka wysiać przy płomieniu palnika po 5 kropli czystej kultury wymienionych
bakterii i inkubować przez 7 dni (temp. 30°C )
3. Wytwarzanie kwasu mlekowego w podłożu ze skrobią przez przemysłowe szczepy bakterii

Lactococcus lactis i Lactobacillus plantarum
Należy przygotować 250mL podłoża o następującym składzie (odpowiednie naważki
składników należy wyliczyć z proporcji). Następnie należy odważyć i rozpuszczać składniki A, B,
C, D, F, i G w 100 ml wody. Wyliczoną i odważoną skrobię (składnik H) skleikować oddzielnie
w 50 ml wrzącej wody. Po ochłodzeniu skleikowanej skrobi należy dodać ją do wcześnie
rozpuszczonych składników i uzupełnić wodą destylowaną do objętości 225ml (Proszę
wykorzystać do tego celu cylinder ).
Podłoże ze skrobią do produkcji kw. mlekowego (g/litr)
40
NaNO3 (A) 0,3

MgSO4 x 7H2O (B) 0,05
KCl (C) 0,05
KH2PO4 (D) 0,1
CaCO3 (E) 5
CaCl2 x 2H2O (F) 0,01
ekstrakt drożdżowy (G) 0,1
Skrobia (wcześniej skleikowana) (H) 5
Wymieszać i do dwóch kolbek stożkowych o pojemności 250mL należy rozlać po 90mL

przygotowanego podłoża, zamknąć korkami z waty i autoklawować. Uwaga: Roztwór CaCO3
(składnik E) został wcześnie przygotowany i jest gotowy do użycia (2,5g w 50 ml wody lub
5%).
Po autoklawowaniu i wychłodzeniu podłoży do temperatury ok. 30oC należy zaszczepić je
w warunkach sterylnych przy płomieniu palnika objętością 0,5 mL czystej kultury
wymienionych bakterii i dodać po 10 ml gotowego i autoklawowanego roztwóru CaCO3
(składnik E) i inkubować przez 7 dni (w temp. 30°C).
PO 7 DNIACH
4. Hodowle w probówkach (2 probówki).

Całą zawartość każdej probówki należy przenieść do kolbki stożkowej na 100-200 mL,
probówkę dodatkowo opłukać kilkoma mL wody destylowanej które także należy dołączyć do
całości płynu pohodowlanego. Całość należy następnie miareczkować 0,1 M NaOH wobec
fenoloftaleiny. Należy zanotować liczbę mL roztworu NaOH zużytą do zmiareczkowania każdej
próby.
5. Hodowle w podłożu ze skrobią (2 kolbki).

Oznaczenie zawartości kwasu mlekowego oraz wydajności procesu w hodowlach bakterii LAB
w podłożu ze skrobią prowadzimy, wykorzystując płyn pofermentacyjny, który należy odwirowć.
Po odwirowaniu należy zlać znad osadu klarowny płyn pofermentacyjny i pobrać 10 ml do dalszej
analizy. Całość należy następnie miareczkować 0,1 M NaOH wobec fenoloftaleiny do różowego
41
zabarwienia w dwóch powtórzeniach dla każdego badanego szczepu. Należy zanotować liczbę mL
roztworu NaOH zużytą do miareczkowania każdej próby.
Sposób obliczania:
1 ml 0,1M NaOH zobojętnia 9,008 mg kwasu mlekowego.
Ogólna kwasowość kwasu mlekowego (mg/ml)= A x B x C/objętość próbki wykorzystanej do
zmiareczkowania
A= objętość NaOH zużyta do miareczkowania (ml)
B= molarność NaOH zużyta do miareczkowania (M)
C= równoważnik kwasu mlekowego(mg) = 90,08 mg
6. Przeliczanie kwasowości ogólnej na kwas mlekowy

W płynach pohodowlanych należy oznaczyć kwasowość ogólną i przeliczyć ją na kwas
mlekowy. Ten sposób określania kwasowości ogólnej (miareczkowej) próbek różnego pochodzenia
(w materiałach biotechnologicznych, próbkach żywności i innych) daje odpowiedź na temat ogólnej
zawartości związków ulegających zobojętnieniu w czasie miareczkowania roztworem odpowiedniej
zasady bez wyszczególnienia związków o charakterze kwaśnym, lecz metoda jest stosowana często
ze względu na swoją prostotę oraz wystarczającą dokładność umożliwiającą porównanie dużej
liczby różnych prób. Dalsza identyfikacja poszczególnych kwasów może być wykonana metodami
instrumentalnymi, np. HPLC, lecz metody instrumentalne na ogół wiążą się z potrzebą specjalnego
przygotowania prób, są drogie i niekiedy długotrwałe.
MASA MOLOWA kwasu mlekowego wynosi 90,08g/mol. 1 cząsteczka kwasu mlekowego zawiera
1 grupę karboksylową, więc reakcja zobojętniania roztworem NaOH przebiega jak przedstawiono
niżej:
1mol kwasu mlekowego + 1 mol NaOH = 1 mol mleczanu sodowego + 1 mol H2O
Tak więc:
 1 litr 1 molowego roztworu NaOH (czyli 1 mol NaOH) zobojętnia 1 mol kwasu mlekowego
(90,08 g)
 1 litr 0,1 molowego roztworu NaOH (0,1 mola NaOH) zobojętnia jedną tysięczną mola
kwasu mlekowego (jedną dziesiątą z 90,08g czyli 9,008 g kwasu)
 jedna tysięczna litra (1 mL) 0,1 molowego roztworu NaOH (0,0001 mola NaOH) zobojętnia
jeszcze tysiąc razy mniejszą naważkę kwasu mlekowego czyli 0,009008 g kwasu)
42
Tak więc mając objętość (w mL) zużytego roztworu NaOH o stężeniu ściśle 0,1 mol/L można z
proporcji obliczyć zawartość kwasów w próbce w przeliczeniu na kwas mlekowy (lub jakikolwiek
inny, jeśli znamy jego masę molową).
Wyniki należy podać jako kwasowość w % mieszanym tzn. % m/v czyli liczbę g kwasu mlekowego
w 100mL płynu pohodowlanego wyjściowego- należy więc uwzględnić wszystkie dokonane
rozcieńczenia.
43
 Drobnoustroje: Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis

 Podłoża: mleko odtłuszczone, podłoże do produkcji kwasu mlekowego.
 Odczynniki: 0,1 M NaOH, 0,5 M Na2CO3, 0,5 M H2SO4.
 Ekstrakt drożdżowy, skrobia , Ca CO3
 Sprzęt: mikroskop, szkiełka, biureta, kolbki na 300 (2) i 100 (3), lejek, sączki
 Pipety 1, 5, 10ml (sterylne), eza, waga, kuchenka elektryczna
44
FERMENTACJA CYTRYNOWA
5. FERMENTACJA CYTRYNOWA
5.1. WPROWADZENIE
Termin "fermentacja" w odniesieniu do biosyntezy kwasu cytrynowego ma znaczenie raczej
technologiczne, ponieważ nie jest to proces beztlenowy lecz przebiegający z udziałem tlenu. Jest to
proces utleniania niecałkowitego, podczas którego substancje organiczne zostają utlenione
częściowo i jako produkty przemiany materii są wydalane z komórki na zewnątrz. Do końcowych
produktów utleniania niecałkowitego zalicza się: kwas octowy, glukonowy, ketokwasy, kwas
bursztynowy, fumarowy, cytrynowy i inne.
Do przemysłowej biosyntezy kwasu cytrynowego wykorzystuje się wyselekcjonowane szczepy
grzyba Aspergillus niger, choć zdolność tę wykazuje także wiele innych gatunków grzybów
strzępkowych: A. awamori, A. flavus, Mucor piriformis, Trichoderma viride oraz w mniejszym
stopniu drożdże z rodzaju Candida, Pichia, Nocardia, Debaromyces. Dobre szczepy powinny
tworzyć duże ilości kwasu cytrynowego, mało produktów ubocznych w postaci kwasu
szczawiowego i glukonowego oraz odznaczać się stałością cech biochemicznych-nie ulegać
degeneracji.
Podstawowym surowcem przemysłowym w tej biosyntezie są węglowodany, w mniejszym zaś
stopniu stosuje się węglowodory nasycone (n-alkany). Wśród podłoży węglowodanowych można
stosować pożywki syntetyczne z dodatkiem sacharozy oraz melasę buraczaną-produkt odpadowy z
cukrowni, zawierający w swoim składzie ok. 50 % sacharozy. Do produkcji stosuje się roztwory
melasy (30-32%) tak, aby stężenie sacharozy wynosiło ok- 15-17%. Należy ją również pozbawić
jonów metali ciężkich za pomocą żelazocyjanku potasu, aby uniknąć nadmiernej produkcji biomasy
o niskiej aktywności (dotyczy to szczególnie jonów Mn 2+, Zn2+ i Fe2+, które wpływają na
aktywność enzymów glikolizy i cyklu Krebsa).
Pożywki syntetyczne zakwasza się do pH ok. 2-3, gdyż pleśnie są mikroorganizmami
kwasolubnymi. W przypadku fermentacji cytrynowej prowadzonej na melasie przy niskich
wartościach pH nie obserwuje się kiełkowania konidiów i rozwoju grzybni. Prawdopodobnie zbyt
kwaśny odczyn hamuje dysocjację kwasu octowego zawartego w melasie, który w postaci
niezdysocjowanej jest silnym inhibitorem kiełkowania konidiów Aspergillus niger. Dlatego
stosowane roztwory melasowe powinny posiadać odczyn zbliżony do obojętnego.
W praktyce przemysłowej stosuje się dwie metody fermentacji:
 proces klasyczny polegający na hodowli powierzchniowej grzyba Aspergillus niger na
tacach wypełnionych roztworem melasowym. Tace umieszczone są w specjalnych
komorach fermentacyjnych wyposażonych w systemy sterylizacyjne (m.in. nawiew
jałowego powietrza) oraz urządzenia do regulacji napowietrzania i temperatury. Wypełnione
odpowiednio przygotowanym podłożem tace szczepi się konidiami grzyba. Następuje
pęcznienie konidiów, zachodzi w nich aktywacja enzymów, uruchomienie materiałów
45
zapasowych i transportu wody. Konidia kiełkują dając początek grzybni. W ciągu 48 godz.
następuje rozwój grzybni na powierzchni roztworu (dojrzała wegetacyjna grzybnia tzw.
fermentacyjna), zaś proces hodowli prowadzi się ok. 9-11 dni (produkcja kwasu
cytrynowego przy niewielkich przyrostach biomasy). Optymalna temperatura fermentacji
wynosi ok. 30°C. Następnie odfermentowany roztwór melasowy odciąga się i poddaje
obróbce (usuwanie kwasu szczawiowego poprzez dodanie CaO, wytrącanie na gorąco
kwasu cytrynowego stosując Ca(OH)2, odzysk czystego kwasu cytrynowego za pomocą
H2SO4, zagęszczanie na wyparkach, krystalizacja), proces fermentacji wgłębnej z użyciem
kompleksowego podłoża melasowego lub syntetycznego z sacharozą.
 Stosuje się bioreaktory wyposażone min. w mieszadła lub inne systemy napowietrzania oraz
w systemy regulacyjne służące do kontroli procesu. W tym procesie rozwój grzybni w
postaci drobnych kuleczek (pellets) następuje w całej objętości podłoża. Do fermentacji
pożądane są kuleczki o średnicy nie mniejszej niż 1 mm i o strukturze dosyć luźnej, aby
zachodziła prawidłowa wymiana substratów i metabolitów, ale jednocześnie na tyle zwartej,
aby nie powodowały one nadmiernego przyrostu lepkości środowiska. Rozwój grzybni trwa
ok. 48h, a po nim następuje faza produkcji kwasu cytrynowego. Zwykle czas fermentacji
wgłębnej jest krótszy niż powierzchniowej - wynosi 5-7 dni, temperatura waha się od 28 do
30°C, a proces jest bardziej wydajny. Po zakończeniu fermentacji grzybnię oddziela się, a
płyn pohodowlany poddaje obróbce jw.
Bilans fermentacji można ująć wzorem sumarycznym:

C6H12O6 + 1,5 O2 → C 6H8O7 + 2H2O + 804 kJ
Ogólnie podczas fermentacji obserwuje się następujące zmiany:

 wzrost ciężaru nastawu (przyłączenie tlenu) częściowo maskowany parowaniem i spalaniem
całkowitym do CO2;
 nieznaczny spadek gęstości ( c. wł. sacharozy 1,58, a c. wł. kwasu cytrynowego 1,54);
 znaczny wzrost kwasowości spowodowany wytwarzaniem kwasu cytrynowego (80-90%
ogólnej kwasowości), kwasu szczawiowego (10-20% ogólnej kwasowości) i małych ilości
kwasu glukonowego.
Wydajność kwasu cytrynowego ze 100 kg węglowodanów wynosi od 50-70 kg przy fermentacji

powierzchniowej i do 90 kg przy procesie wgłębnym. Warunkiem wydajnej nadprodukcji kwasu w
hodowli Aspergillus nigsr jest wysokie stężenie cukru w podłożu, deficyt PO 43- i jonów metali
ciężkich oraz dobre natlenienie hodowli.
Biochemia syntezy kwasu cytrynowego

W procesie produkcji kwasu cytrynowego zachodzącym w komórkach A. niger biorą udział
dwa główne szlaki metaboliczne. W jednym z nich następuje glikolityczny rozkład heksoz do
pirogronianu i acetylo-CoA na drodze Embdena-Mayerhofa-Parnasa (EMP), a w drugim – w cyklu
kwasów trójkarboksylowych (TCA) powstaje kwas cytrynowy. Dodatkowo dużą rolę w łączeniu
tych dwóch szlaków odgrywa tworzenie szczawiooctanu z pirogronianu i dwutlenku węgla w
46
reakcjach anaplerotycznych oraz procesy transportu poprzez błony cytoplazmatyczne i

mitochondrialne.
W fazie intensywnego wzrostu komórek A. niger w trofofazie w rozkładzie heksoz, obok szlaku
glikolitycznego (EMP) dużą rolę odgrywa szlak pentozofosforanowy. Udział tych szlaków w
rozkładzie heksoz w tej fazie hodowli wynosi 2:1 na korzyść szlaku EMP. W fazie produkcji kwasu
cytrynowego w idiofazie stosunek ten zmienia się do 4:1 i szlak glikolityczny jest głównym
dostarczycielem prekursorów do biosyntezy cytrynianu w początkowych przemianach
zachodzących w cyklu Krebsa.
W normalnych warunkach fizjologicznych cytrynian, powstający w wyniku kondensacji
acetylo-CoA i szczawiooctanu, ulega częściowej przemianie do cis-akonitanu i izocytrynianu przy
udziale hydratazy akonitanowej i dalszemu utlenianiu w cyklu Krebsa. Hamowanie aktywności tego
enzymu deficytem jonów Fe2+ i Mn2+ w podłożu znacznie ogranicza przemianę cytrynianu i sprzyja
nagromadzaniu kwasu cytrynowego. Z kolei wysokie stężenie cytrynianu może hamować
aktywność fosfofruktokinazy, będącej głównym regulatorem szybkości glikolizy. Hamowanie to
jest znoszone przez wysoki poziom jonów NH4+ wewnątrz komórek A. niger występujący w
warunkach deficytu jonów Mn2+ w podłożu. Nadprodukcji kwasu cytrynowego sprzyja intensywne
natlenienie, ponieważ wysokie stężenie tlenu rozpuszczonego w podłożu powoduje wzrost
aktywności oddychania alternatywnego, które występuje obok klasycznego łańcucha oddechowego
z udziałem cytochromów. Alternatywna droga oddechowa jest jałowa energetycznie i nie blokuje
glikolizy. Jest ona prawdopodobnie indukowana deficytem jonów PO43- w podłożu.
47
Celem ćwiczenia jest: nastawienie fermentacji cytrynowej metodą powierzchniową na niżej

podanych podłożach, używając szczepów Aspergillus niger o różnych aktywnościach
kwasotwórczych, a po tygodniu oznaczenie kwasowości ogólnej płynów pohodowlanych i
przeliczenie jej na kwas cytrynowy.
Uwaga: jeśli opis metody podaje przygotowanie roztworu poprzez rozpuszczenie stałego
składnika w rozpuszczalniku lub w roztworze, to podany procent rozumiemy jako procent mieszany,
czyli m/v.
1. Przygotowanie podłoży fermentacyjnych:

Podłoże melasowe melasowe należy przygotować w dwóch wariantach:
 wariant 1: podłoże bez regulowania pH (pH ok. 7)
 wariant 2: podłoże zakwaszone do pH =3;
W tym celu należy przygotować 200 ml 30% roztworu melasy z dodatkiem żelazocyjanku potasu
K4 Fe(CN)6 w ilości 0,06%(m/v). W praktyce ten roztwór najlepiej przygotować w ten sposób, że
odważoną ilość melasy rozpuścić w wodzie wodociągowej i przed uzupełnieniem do 200 ml dodać
odpowiednią porcję żelazocjanku potasu rozpuszczonego w niewielkiej ilości wody destylowanej, a
następnie całość uzupełnić do 200 ml wodą wodociągową.
Otrzymany roztwór melasy należy podzielić na dwie porcje po 100 ml. W jednej części należy
obniżyć pH do wartości 3 za pomocą ok. 1M roztworu H2SO4 i przelać do kolby Erlenmeyera na
500 ml. Pozostałą część roztworu (100 ml) (bez korekty pH- przyjmujemy że pH w tym roztworze
wynosi 7,0) również przelać do kolby Erlenmeyera na 500 ml. Otrzymujemy w ten sposób 2 próby
fermentacyjne o objętości 100 mL każda (30% roztwory brzeczki melasowej): jedna z nich ma pH
3, a druga pH 7. Kolby należy zakorkować korkiem z waty i wyjałowić przy nadciśnieniu 3/4 atm.
w ciągu 20 min.
2. Inokulacja
Wszystkie podłoża po wyjałowieniu i ostudzeniu należy zaszczepić szczepami Aspergillus niger o
różnej aktywności kwasotwórczej w ilości 1ml gęstej zawiesiny konidiów na 100 ml podłoża
(sterylna pipeta szklana, NIE WOLNO! PIPETOWAĆ USTAMI LECZ ZA POMOCĄ POMPKI
48
DO PIPET). Próby należy odstawić do odpowiedniego kosza w celu prowadzenia hodowli

(inkubacja) w termostacie w temp. 28°C-30°C przez 7 dni).
PO TYGODNIU:
W hodowlach należy oznaczyć kwasowość ogólną i przeliczyć ją na kwas cytrynowy.

Kwasowość ogólna jest to suma wszystkich kwasów organicznych, jakie tworzą się podczas
fermentacji cytrynowej. W przypadku naszych hodowli, tworzony jest głównie kwas cytrynowy
(ok. 90%) oraz w mniejszych ilościach kwas szczawiowy i glukonowy.
Ten sposób określania kwasowości ogólnej (miareczkowej) próbek różnego pochodzenia (w
materiałach biotechnologicznych, próbkach żywności i innych) daje odpowiedź na temat ogólnej
instrumentalnymi, np. HPLC, lecz metody instrumentalne na ogół wiażą się z potrzebą specjalnego
4. Oznaczanie kwasowości ogólnej (miareczkowej, potencjalnej)

ZA POMOCĄ PIPETY Z NASADKĄ (POMPKĄ-W ŻADNYM WYPADKU NIE
WOLNO POBIERAĆ USTAMI!) I PRZY PALNIKU należy pobrać spod grzybni 2 ml płynu
pofermentacyjnego i przenieść do kolby stożkowej a 200 ml. Następnie należy dodać 10-20 ml
wody destylowanej i próbę zmiareczkować 0,1N NaOH wobec fenoloftaleiny do pierwszego
trwałego, różowego zabarwienia. Wyniki podać w ml 0,1 N NaOH/100 ml pożywki.
Miareczkowanie należy przeprowadzić dla każdej przeprowadzonej hodowli. Zanotować liczbę mL
roztworu NaOH zużytą na zmiareczkowanie każdej próby.
5. Przeliczanie kwasowości ogólnej na kwas cytrynowy

Przeliczenie zakłada wyrażenie kwasowości w przeliczeniu na kwas cytrynowy (występujący w
zdecydowanej przewadze w płynach pohodowlanych), jednak należy wiedzieć, że obecne są także
inne kwasy.
MASA MOLOWA kwasu cytrynowego wynosi 192 g/mol. 1 cząsteczka kwasu cytrynowego
zawiera 3 grupy karboksylowe, więc reakcja zobojętniania roztworem NaOH przebiega jak
przedstawiono niżej:
1mol kwasu cytrynowego + 3 mole NaOH = 1 mol cytrynianu sodowego + 3 mole H2O
Tak więc:
49
 3 litry 1 molowego roztworu NaOH (czyli 3 mole NaOH) zobojętniają 1 mol kwasu
cytrynowego (192 g)
 1 litr 1 molowego roztworu NaOH (1 mol NaOH) zobojętnia jedną trzecią mola kwasu
cytrynowego (jedna trzecia ze 192g = 64 g)
 1 litr 0,1 molowego roztworu NaOH (0,1 mola NaOH) zobojętnia jedną trzytysięczną mola
kwasu cytrynowego (jedna dziesiątą z 64g czyli 6,4 g kwasu)
i wreszcie: jedna tysięczna litra (1 mL) 0,1 molowego roztworu NaOH (0,0001 mola NaOH)
zobojętnia tysiąc razy mniejszą naważkę kwasu cytrynowego (jedna tysięczną z 6,4 g czyli 0,0064g
kwasu)
Tak, więc mając objętość (w mL) zużytego roztworu NaOH o stężeniu ściśle 0,1 mol/L można z
proporcji obliczyć zawartość kwasów w próbce w przeliczeniu na kwas cytrynowy (lub jakikolwiek
Wyniki należy podać jako kwasowość w % mieszanym tzn. %m/v .
50
 kolby Erlenmeyera a 500 ml (6), 300 ml (10) i 200 ml;

 waga techniczna;
 cylindry a 100 ml;
 pHmetr,
 pipety a 2 ml, 5 ml i 10 ml;
 biureta;
 melasa oraz r-r K 4Fe(CN)6,
 sacharoza, NH4NO3, KH2PO4, MgSO4;
 zawiesina konidiów A niger;
 do zakwaszania: H2SO4 i 1 N HC1; do oznaczania kwasowości: fenoloftaleina i 0,1 NaOH
51
52
BIOKONWERSJA ZWIĄZKÓW ORGANICZNYCH PRZEZ DROBNOUSTROJE
6. BIOKONWERSJA ZWIĄZKÓW ORGANICZNYCH PRZEZ

DROBNOUSTROJE
6.1. WPROWADZENIE
Drobnoustroje odznaczają się zdolnością przekształcania i wykorzystywania wielu egzogennych
związków organicznych. W procesach tych oprócz typowych reakcji katabolicznych
dostarczających energii i prekursorów do biosyntezy nowych związków można wyróżnić przemiany
zachodzące niejako na obrzeżu normalnego metabolizmu i nie mające istotnego wpływu na wzrost i
rozmnażanie mikroorganizmów. Są to najczęściej przemiany jednoetapowe, odznaczające się dużą
regio- oraz stereospecyficznością, noszące nazwę biotransformacji lub biokonwersji.
W praktyce wykorzystywanych jest wiele biotransformacji węglowodorów, węglowodanów,
aminokwasów, antybiotyków, terpenów, alkaloidów, prostaglandyn, steroidów. Otrzymane w
wyniku biokonwersji pochodne mają niejednokrotnie zmienione lub rozszerzone właściwości
biologiczne, dzięki czemu mogą być wykorzystane bezpośrednio, np. jako preparaty farmako-
logiczne, bądź służyć jako substrat do produkcji innych związków. Procesy biotransformacji mogą
być również wykorzystywane jako etapy pośrednie w syntezie związków czynnych optycznie lub w
wyodrębnianiu ich z mieszaniny racemicznej. Spośród bardzo dużej liczby biotransformacji
mających znaczenie w biotechnologii przedstawiona zostanie biokonwersja etanolu i sorbitolu, a ze
związków o bardziej złożonej budowie chemicznej - steroidów.
Biotransformacja etanolu i sorbitolu przez bakterie z rodzaju Acetobacter i Gluconobacter

Tak zwane bakterie octowe, należące do rodziny Acetobacteraceae, odgrywają ważną rolę w
przemyśle spożywczym oraz niektórych gałęziach przemysłu chemicznego i farmaceutycznego.
Wprawdzie dla celów chemicznych kwas octowy otrzymuje się na drodze suchej destylacji drewna
lub w syntezie chemicznej, to ocet konsumpcyjny w dalszym ciągu jest produkowany z
wykorzystaniem technologii mikrobiologicznej z surowców pochodzenia roślinnego. Fermentację
octową zalicza się do tzw. „fermentacji utleniających”. Kwas octowy wytwarzany jest w niej przez
bakterie z rodzaju Acetobacter w wyniku niecałkowitego utleniania etanolu i jako pośredni lub
końcowy produkt przemiany materii wydzielany do podłoża. Biokonwersji poddaje się etanol
zawarty w surówkach gorzelniczych lub rektyfikacie (ocet spirytusowy) oraz w lekkich winach
białych lub czerwonych (ocet winny). Tak otrzymany kwas octowy nie jest wydzielany z podłoża
„fermentacyjnego", lecz stanowi integralną część gotowego produktu pod nazwą ocet spożywczy.
Kwas octowy otrzymany na drodze chemicznej nie jest dopuszczony do produkcji octu
spożywczego.
53
Istnieje kilka metod otrzymywania octu. Są to: metoda orleańska, szybkiego octowania (zwana
też niemiecką lub Schützenbacha) oraz wgłębna (bezwiórowa). W metodzie orleańskiej surowcem
jest wino lub piwo z 2% dodatkiem kwasu octowego, który zapewnia warunki selektywne
bakteriom octowym. Proces tworzenia octu przebiega bardzo wolno, ponieważ bakterie octowe,
jako tlenowce, rozwijają się tylko na powierzchni płynu.
W metodzie szybkiego octowania na ocet przerabia się wodny roztwór alkoholu etylowego.
Proces fermentacji odbywa się w wysokich kadziach wypełnionych wiórami bukowymi. Są one
zalewane octem z zawiesiną bakterii octowych, które osadzają się na ich powierzchni. Następnie
przez wióry przepuszcza się bardzo wolno zalew zawierający roztwór alkoholu (10-12%) i kwasu
octowego (2%) oraz substancje odżywcze niezbędne do rozwoju bakterii octowych. Bakterie
utleniają zawarty w zalewie alkohol na kwas octowy.
Ostatnio w coraz większym stopniu do produkcji octu stosuje się metodę wgłębną
(bezwiórową), przy zastosowaniu acetatorów, która pozwala na skrócenie czasu produkcji i
osiągnięcie wydajności 90-95%.
Inną ważną dla gospodarki cechą bakterii octowych jest zdolność utleniania cukrów prostych
do odpowiednich kwasów jednokarboksylowych (-onowych), a niekiedy nawet dalej - do
ketopochodnych tych kwasów. Te uzdolnienia bakterii octowych również zostały wykorzystane w
praktyce. Kwas glukonowy produkowany przy użyciu bakterii z rodzaju Gluconobacter znalazł za-
stosowanie w przemyśle spożywczym, a także 5-lakton tego kwasu, który stosowany jest w
piekarnictwie. Glukonian wapnia stosowany jest w lecznictwie w przypadkach chorób alergicznych
lub przy ogólnym deficycie jonów Ca2+ w organizmie, podobnie glukonian żelazowy przy deficycie
tego pierwiastka. Glukonian sodu używany jest szeroko w produkcji płynów myjących oraz
proszków do prania, gdzie zastępuje niebezpieczne dla środowiska ekologicznego polifosforany.
Glukonian sodu stosowany jest także w budownictwie jako dodatek do zapraw betonowych przy
konstrukcji fundamentów o zwiększonej wytrzymałości. Bakterie z rodzaju Gluconobacter znalazły
również zastosowanie w biologiczno-chemicznej metodzie otrzymywania witaminy C. Przy udziale
tych bakterii prowadzi się biokonwersję sorbitołu do sorbozy- pośredniego związku w produkcji
witaminy C.
Bakterie octowe należą do bezwzględnych tlenowców, są to Gram-ujemne lub Gram-zmienne
pałeczki, urzęsione lub nieurzęsione, występujące pojedynczo, po dwie lub w krótkich łańcuszkach.
Charakterystyczne jest występowanie u tych bakterii form inwolucyjnych o pogrubionych lub
nadmiernie wydłużonych kształtach.
Do rodziny Acetobacteraceae przypisane są dwa rodzaje bakterii: Acetobacter i Gluconobacter.
Oba rodzaje mają zdolność utleniania etanolu do kwasu octowego, ale tylko bakterie z rodzaju
Acetobacter mogą dalej utleniać kwas octowy do CO2 i H2O, podobnie mogą one utleniać także
54
kwas mlekowy; dysponują kompletem enzymów cyklu Krebsa. W przeciwieństwie do Acetobacter,

bakterie z rodzaju Gluconobacter nie utleniają octanu i mleczanu do CO2, nie występuje u nich
bowiem cykl Krebsa, odznaczają się natomiast dużą aktywnością „ketogenną", utleniają glukozę do
kwasu glukonowego i dalej do keto-pochodnych: 2-keto-glukonowego, 5-keto-glukonowego, a
nawet niektóre gatunki bakterii do 2,5-diketoglukonowego. Bakterie z rodzaju Gluconobacter
posiadają również zdolność utleniania alkoholi wielowodorotlenowych, jak np. glicerolu do
dihydroksyacetonu czy sorbitolu do sorbozy. Bakterie należące do rodzaju Acetobacter wykazują
urzęsienie peritrichalne, natomiast z rodzaju Gluconobacter-biegunowe. Acetobacter spp. posiadają
zdolność wzrostu na podłożu zawierającym azot w formie soli amonowych, natomiast
Gluconobacter wymagają w podłożu organicznych form azotu. Omówione tu podstawowe
własności metaboliczne tych bakterii można przedstawić reakcjami- patrz rys. 1.
Licznie uczestniczące w tych procesach utleniających koenzymy dehydrogenaz odtwarzane są w
formie utlenionej w łańcuchu oddechowym, którym dysponują w pełnym lub nieco uproszczonym
składzie zarówno bakterie z rodzaju Acetobacter, jak i Gluconobacter
6.2. WYKONANIE OZNACZENIA

55
Cel ćwiczenia
Określenie zdolności przemysłowych szczepów bakterii z rodzaju Acetobacter i Gluconobacter
do utleniania alkoholi mono- i wielowodorotlenowych (etanolu i sorbitolu).
Materiały i podłoża
1. Drobnoustroje: Acetobacter schuzenbachii, Gluconobacter suboxydans, Gluconobacter sp.
2. Podłoża: skosy brzeczkowe 5°Blg z dodatkiem 3% etanolu lub 3% sorbitolu; podłoże dla
Gluconobacter do badania właściwości ketogennych: podłoże półsyntetyczne z glukozą,
podłoże półsyntetyczne z sorbitolem.
UWAGA- ĆWICZENIE DWUTYGODNIOWE.
1. Obserwacje makro- i mikroskopowe czystej kultury bakterii szybkooctujących -

Acetobacter schuzenbachii używanych w generatorowej metodzie produkcji octu.
W czasie obserwacji mikroskopowych korzystamy z hodowli Acetobacter schuzenbachii na skosie

brzeczkowym (5°Blg) z dodatkiem 3% etanolu (temp. inkubacji wynosiła 30°C). Utrwalony
preparat należy wybarwić fioletem goryczkowym i obserwując pod immersją należy zwrócić uwagę
na występowanie form inwolucyjnych.
2. Obserwacje makro- i mikroskopowe czystej kultury bakterii G. suboxydans używanej w

produkcji kwasu glukonowego.
a) Hodowla na skosie brzeczkowym (5°Blg) z dodatkiem 3% sorbitolu (temp. 28°C). Dalej
postępować jak w pkt l.
3. Badanie własności ketogennych bakterii.

Należy przeprowadzić 7-dobową wstrząsaną hodowlę G. suboxydans na podłożu z ekstraktu
drożdżowego z dodatkiem 5% glicerolu. W tym celu należy przygotować kolbkę stożkową o poj.
200mL. Następnie należy przygotować 50mL podłoża o następującym składzie:
 Ekstrakt drożdżowy 2,5g /50ml
 Glicerol 2,5g /50ml
 Woda dest. do 50ml pH 6,0-6,5
Podłoże należy przelać (50mL) do kolbki stożkowej, zamknąć korkiem z waty i sterylizować w
temp. 117oC przez 20 min. Po ochłodzeniu podłoża należy warunkach sterylnych- przy płomieniu
palnika wprowadzić do podłoża inokulum za pomocą ezy. Wytrząsanie hodowli trwa 7 dni w temp.
28°C. Po tygodniu - należy do 2 mL hodowli dodać kilka kropli 20% roztworu CuSO2 i podgrzać.
56
Pojawienie się pomarańczowego osadu Cu2O świadczy o zredukowaniu dwuwartościowej miedzi

przez powstały w podłożu dihydroksyaceton.
4. Badanie tworzenia kwasu glukonowego we wstrząsanych hodowlach G. suboxydans.

Należy przeprowadzić 7-dobową wstrząsaną hodowlę G. suboxydans na podłożu z ekstraktu
drożdżowego z dodatkiem 8% glukozy. W tym celu należy przygotować kolbkę stożkową o poj.
200mL. Następnie należy przygotować 50mL podłoża o następującym składzie:
 Ekstrakt drożdżowy 0,05g /50ml
 Glukoza 5g/50ml
 (NH4)2HPO4 0,05g/50ml
 KH2PO4 x 7H2O 0,05g/50ml
 Woda dest. uzupełnić do 50ml
 pH 4,8-5,0
Podłoże należy przelać (50mL) do kolbki stożkowej, zamknąć korkami z waty i sterylizować w
temp. 117oC przez 20 min. Po ochłodzeniu podłoży należy warunkach sterylnych- przy płomieniu
palnika wprowadzić do podłoża inokulum za pomocą ezy. Wytrząsanie hodowli trwa 7 dni w temp.
28°C. Po tygodniu należy zbadać zawartość powstałego kwasu glukonowego na drodze
miareczkowania 5ml próby za pomocą 0,1 molowego roztworu NaOH wobec fenoloftaleiny.
Należy zanotować liczbę mL roztworu NaOH zużytą na zmiareczkowanie próby.
Przeliczanie kwasowości ogólnej na kwas glukonowy
W płynie pohodowlanym należy oznaczyć kwasowość ogólną i przeliczyć ją na kwas
glukonowy. Ten sposób określania kwasowości ogólnej (miareczkowej) próbek różnego
pochodzenia (w materiałach biotechnologicznych, próbkach żywności i innych) daje odpowiedź na
temat ogólnej zawartości związków ulegających zobojętnieniu w czasie miareczkowania roztworem
odpowiedniej zasady bez wyszczególnienia związków o charakterze kwaśnym. Zaletą tej metody
jest jednak prostota oraz wystarczająca dokładność umożliwiającą porównanie dużej liczby różnych
prób, stąd jest ona często stosowana. Dalsza identyfikacja poszczególnych kwasów może być
wykonana metodami instrumentalnymi, np. HPLC, lecz metody instrumentalne na ogół wiążą się z
potrzebą specjalnego przygotowania prób, są drogie i niekiedy długotrwałe.
MASA MOLOWA kwasu glukonowego wynosi 196g/mol. 1 cząsteczka kwasu glukonowego

zawiera 1 grupę karboksylową, więc reakcja zobojętniania roztworem NaOH przebiega jak
przedstawiono niżej:
57
1mol kwasu glukonowego + 1 mol NaOH = 1 mol glukonianu sodowego + 1 mol H2O
Tak więc:
 1 litr 1 molowego roztworu NaOH (czyli 1 mol NaOH) zobojętnia 1 mol kwasu
glukonowego (196 g kwasu glukonowego)
kwasu glukonowego (jedną dziesiątą ze 196g czyli 19,6 g kwasu)
 jedna tysięczna litra (1 mL) 0,1 molowego roztworu NaOH (0,0001 mola NaOH) zobojętnia
jeszcze tysiąc razy mniejszą naważkę kwasu glukonowego czyli 0,0196 g kwasu)
proporcji obliczyć zawartość kwasów w próbce w przeliczeniu na kwas glukonowy (lub inny, jeśli
znamy jego masę molową).
Wyniki należy podać jako kwasowość w % mieszanym tzn. % m/v czyli liczbę g kwasu mlekowego
w 100mL płynu pohodowlanego.
58
 Mikroskop, eza, szkiełka (barwnik fiolet goryczkowy)

 Biureta, pipety (1, 5, 10 ml)
 Sorbitol, glicerol
 20% roztwor CuSO2
 0,25 M NaOH, fenoloftaleina
 2 kolbki na 250-300 ml, zlewki
 48 godzinne inokulum Gluconobacter na podłożu z sorbitolem (w probówce 20 ml)
59
ZACIERANIE SŁODU BROWARNIANEGO I NASTAWIANIE FERMENTACJI BRZECZKI PIWNEJ
7. ZACIERANIE SŁODU BROWARNIANEGO I NASTAWIANIE

FERMENTACJI BRZECZKI PIWNEJ
7.1. WPROWADZENIE
Skrobia jest węglowodanem o sumarycznym wzorze (C6H10O5)n, stanowiącym zapasowy cukier

roślinny. Ciężar właściwy skrobi jest 1,65 razy większy niż ciężar właściwy wody. W tkankach
roślinnych występuje w postaci ziaren o zróżnicowanym kształcie i wymiarach. Skrobia w
odróżnieniu od cukrów prostych i dwucukrów nie wykazuje smaku słodkiego i jest
nierozpuszczalna w wodzie. Ogrzewana w środowisku wodnym ulega głębokim, nieodwracalnym
zmianom strukturalnym, czemu towarzyszy gwałtowny wzrost lepkości zawiesiny, czyli tzw.
kleikowanie skrobi. Temperatura kleikowania skrobi różnego pochodzenia jest cechą gatunkową i
zawiera się w przedziale temperatur od ok. 55°C do ok. 85°C. Kleik skrobiowy dalej ogrzewany
ulega rozpuszczeniu. Po przekroczeniu temp. l20°C skrobia upłynnia się bardzo szybko. Dla
browarnictwa szczególnie ważne znaczenie ma fakt, że przy udziale enzymów amylolitycznych
optymalna temperatura kleikowania skrobi zawartej w słodzie jest znacznie obniżona. Proces
kleikowania rozpoczyna się już od temp 20 °C.
Każda makrocząsteczka skrobi składa się z dwóch frakcji tj. amylozy i amylopektyny.
60
Rys. Fragment cząsteczki amylozy.

Obydwie, chociaż zbudowane z tych samych elementów tj. cząstek glukozy, znacznie się różnią
budową wewnętrzną, a także cechami technologicznymi. Amyloza stanowi konglomerat 60-1000
cząsteczek glukozy, połączonych ze sobą w ten sposób, że czwarty atom węgla jednej cząsteczki
glukozy łączy się z pierwszym atomem węgła cząsteczki sąsiedniej. Wielokrotne powtórzenie tego
układu tworzy prosty, nierozgałęziony łańcuch cząsteczek glukozy połączonych ze sobą tylko
jednym wiązaniem (-1,4), łatwo ulegający hydrolizie kwasowej i enzymatycznej.
61
Rys. Fragment cząsteczki amylopektyny.
62
Zdjęcie komórki bielma wypełnione ziarnami skrobi (1,2,3) oraz komórki warstwy aleuronowej (4)
Zdjęcie ziarna skrobi słodu jęczmiennego które uległy częściowej degradacji pod wpływem
enzymów amylolitycznych wytwarzanych przez ziarno jęczmienia w czasie słodowania
Amylopektyna przedstawia sobą łańcuch rozgałęziony, złożony z 1200-3600 jednostek glukozy.
Proste odcinki łańcucha o długości 18-27 jednostek glukozy, nie różnią się budową od amylozy, ale
w miejscu połączenia z łańcuchem głównym występują inne wiązania sąsiadujących ze sobą
cząstek glukozy, a mianowicie wiązanie między pierwszym węglem i szóstym, tzw. wiązanie -1,6.
Jest ono bardziej oporne na rozłączanie i dlatego hydroliza amylopektyny wymaga stosowania co
najmniej dwóch enzymów lub wyższego stężenia kwasu, jeżeli hydrolizę prowadzi się metodą
kwasową. Stosunek amylozy do amylopektyn w skrobi jest cechą gatunkową i waha się w
granicach 1:3 do 1:8.
Surowa skrobia zawarta w słodzie jest węglowodanem nie podlegającym fermentacji
etanolowej. Na etanol mogą być przetworzone produkty hydrolizy skrobi, czyli cukry. W praktyce
nie można zhydrolizować skrobi nie uwalniając jej uprzednio z tkanek roślinnych. Pierwszą
czynnością jest więc zniszczenie struktury komórkowej surowca. Ten cel można osiągnąć metodą
termiczną lub mechaniczną. Uwolnienie skrobi ze struktury tkankowej musi odbywać się w
63
środowisku silnie uwodnionym. Rozpuszczanie skrobi poprzedzone jest jej silnym pęcznieniem,
spowodowanym dyfuzją wody do wnętrza ziaren skrobiowych. Pęcznienie objawia się 60-100
krotnym zwiększeniem objętości poszczególnych ziaren skrobi i wyraźnym wzrostem lepkości
zawiesiny-proces ten nazywany jest kleikowaniem skrobi.
Hydroliza skrobi zawartej w słodzie do cukrów prostych i dekstryn odbywa się przy udziale
występujących w nim enzymów. Zacieranie słodu jęczmiennego polega na wspólnym działaniu
amylaz słodowych. Przy jednoczesnym działaniu obydwu amylaz hydroliza skrobi przebiega
znacznie głębiej niż przy oddzielnym działaniu tych enzymów, przy czym otrzymuje się 75-80%
maltozy, -amylaza rozpoczyna scukrzanie amylozy oraz łańcuchów bocznych amylopektyny od
końca łańcuchów, natomiast -amylaza atakuje cząsteczki substratu wewnątrz łańcuchów. W
obydwu przypadkach rozłączane są wiązania -1,4. Pod wpływem działania -amylazy na amylozę
i amylopektynę, oprócz maltozy powstają wyższe i niższe dekstryny. Wyższe dekstryny tworzą się
również pod wpływem działania -amylazy na amylopektynę. Dekstryny te są typu erytrogranuloz,
zaś -amylaza rozrywa je aż do wiązań -1,6, w związku z czym powstają nowe substraty dla
działania -amylazy. W ten sposób -amylaza zwiększa działanie -amylazy. Poza tym -amylaza
atakuje dekstryny typu sześciocuków, powstające pod wpływem działania -amylazy na amylozę.
Dekstryny o prostym łańcuchu scukrzane są przez obie amylazy, przy czym w wyniku działania -
amylazy otrzymuje się maltozę i niewielkie ilości maltotriozy, zaś pod wpływem -amylazy tworzą
się maltoza, glukoza i maltotrioza, która następnie rozkładana jest do maltozy i glukozy. Dekstryny
o rozgałęzionych łańcuchach rozrywane są aż do miejsc rozgałęzień. W ten sposób powstają
dekstryny niższe ewentualnie kilkukucukry, zwłaszcza trójcukry i izomaltoza. Takich
rozgałęzionych reszt na które nie działają już enzymy pozostaje 25-30% i nazywa się je
dekstrynami granicznymi.
Proces zacierania polega na zmieszaniu śrutu słodowego z wodą i utrzymaniu tej mieszaniny w
temperaturach dostosowanych do optymalnych warunków przemian zachodzących w procesie
zacierania. W pierwszej fazie zacierania przechodzą do roztworu pierwotne substancje
rozpuszczalne słodu powstałe na skutek enzymatycznych przemian składników bielma w czasie
kiełkowania ziarna. Równocześnie w pierwszej fazie zacierania przechodzą do roztworu enzymy
słodu.
W następnych zaś fazach biegną przemiany substancji koloidowych i reakcje enzymatycznego
rozkładu nierozłożonych składników ziarna (tzw. składników ekstraktowych), a w tym przede
64
wszystkim reakcje rozkładu skrobi i białka. Zajmiemy się głównie procesami rozkładu skrobi i
białek, albowiem należą one do najważniejszych przemian w czasie zacierania.
Wiemy, że skrobia ulega enzymatycznej hydrolizie szybko, jeśli wchodzi w reakcję w postaci
skleikowanej lub rozpuszczalnej. Enzymatyczny rozkład skrobi surowej lub częściowo surowej,
jaka znajduje się w ziarnach słodu, przebiega niezmiernie powoli i niecałkowicie.
Dla skleikowania skrobi słodowej podnosi się temperaturę zacieru od początku procesu
zacierania. Czynność tę wykonuje się w metodzie dekokcyjnej przez odbieranie pierwszych warów
bardzo gęstych, tj. zawierających największą ilość gęstwy słodowej (a więc skrobi), a później przez
stopniowe ich ogrzewanie (w kotle zaciernym) do temp. wrzenia. Po wprowadzeniu takich warów
do kadzi zaciernej, główny zacier uzyskuje przez to w końcowej fazie zacierania temperaturę 75° C.
Temperatura 75° C jest konieczna nie tylko z uwagi na całkowite skleikowanie wszystkich ziarenek
skrobiowych słodu (zwłaszcza słodu źle rozluźnionego), ale również z uwagi na specyficzną
właściwość enzymów amylolitycznych, które w wyższej temperaturze dają w rozkładzieskrobi
więcej dekstryn niż w temperaturze niższej.
Stopień scukrzania skrobi w browarnictwie różni się zasadniczo od stopnia jej scukrzania w
gorzelnictwie. W procesie gorzelniczym staramy się skrobię scukrzyć możliwie w najwyższym
stopniu. W najlepszych warunkach zacierania osiągamy w tym przemyśle 80% skrobi zamienionej
w maltozę. Pozostała zaś reszta w postaci dekstryn ulega rozłożeniu dopiero w trzeciej fazie
fermentacji alkoholowej, w obecności czynnych enzymów amylolitycznych. W browarnictwie w
procesie zacierania ilość tworzącej się maltozy nie przekracza nigdy 75%, a w specjalnych
warunkach może nawet obniżyć się do 65%. Pozostałe stąd dekstryny nie ulegające bezpośrednio
fermentacji (z powodu nieobecności amylazy) biorą udział w tworzeniu się cennego ekstraktu
piwa.
Ilość ekstraktu w ogóle, a specjalnie ekstraktu dekstrynowego, zależy od typu piwa, a to łączy
się ściśle z jakością otrzymywanej brzeczki w procesie zacierania. Stosunek bowiem dekstryn do
maltozy wynosi:
- w brzeczkach ze słodu ciemnego: 1 : 2

- w brzeczkach ze słodu jasnego: 1 : 3,2
Czynnikami regulującymi stosunek maltozy do dekstryn w brzeczce są, poza temperaturą, czas
zacierania, siła amylolityczna słodu oraz pH.
Optymalna temperatura działania -amylazy (cukrującej) na skrobię jest niższa (50-55°C) od
temperatury działania -amylazy (dekstrynującej) 60-65° C. Wprawdzie optimum działania amylaz
65
w obecności skrobi a zwłaszcza w obecności ich produktów hydrolizy (maltoza i dekstryny) układa
się nieco w wyższych temperaturach (amylazy w tych warunkach są więcej wytrzymałe na wpływy
termiczne), to jednak w zakresie temp. 60°C (przerwa scukrzenia) -amylaza będzie więcej
osłabiona niż -amylaza. W konsekwencji tego będzie się tworzyć w zacierze więcej dekstryn a
mniej maltozy.
66
Wpływ temperatury zacierania na ilość tworzących się cukrów przedstawia tabelka:
Temperatura Cukry Niecukry Stosunek

62,5 oC
zacierania 78,64
Cukry 21,35
w% 1 : 0,27do
cukrów
65,0 70,28
(maltoza 29,72 1 : 0.42
niecukrów
70,9 62,72w %
surowa) 31,28 1 : 0,45
75,0 59,93 40,07 1 : 0,67
W procesie rozkładu skrobi odgrywa również ważną rolę czynnik czasu. Dłuższe lub krótsze
przetrzymywanie zacieru lub jego części (warów) w obrębie lub powyżej temperatur optymalnych
prowadzi do powstawania większej ilości maltozy. I głównie tym czynnikiem (tj. czasem zacierania
w danej temperaturze) wpływamy na stosunek maltozy do dekstryn w brzeczce.
Poza tym należy przypomnieć, że w słodzie browarniczym endogenna amylaza jest więcej lub
mniej osłabiona w zależności od temperatury i czasu suszenia słodu, a więc w zależności od typu
słodu, jaki pragniemy wyprodukować. Słód jasny według literatury ma siłę amylolityczną w
zakresie 160—350 jednostek. Jednak aktywność amylazy (kształtujące siłę amylolityczną, czyli -
amylaza i -amylaza) w czasie zacierania stale ulegają inaktywacji. Jeśli przyjmiemy siłę
amylolityczną zacieru w temp. 35°C za 100%, to:
- siła amyloityczna zacieru w temp. 52° C (po pierwszym warze) wynosi 61,1%
- siła amylolityczna zacieru w temp. 62° C {po drugim warze) wynosi 26,8%
- siła amylolityczna zacieru w temp. 75° C (po trzecim warze) wynosi 7,3%
Degradacja białek w czasie zacierania słodu

Drugą ważną reakcją zachodzącą w procesie zacierania jest rozkład ciał białkowych. Optymalna
temperatura działania enzymów proteolitycznych waha się w granicach 48—55° C. Dlatego zacier
lub też jego część przetrzymujemy w temp. 50°C. Zacier przechodzi tzw. przerwę białkową.
Tworzą się wówczas z białek nie tylko produkty hydrolizy, jak peptony i aminokwasy; ale prócz
tego białka przechodzą w stan rozpuszczalny i pozostają w roztworze jako wysokocząsteczkowe,
nierozłożone substancje. Stopień rozkładu ciał białkowych, podobnie jak stopień rozkładu skrobi,
powinien być również regulowany. Czynnikami regulującymi są również temperatura i czas
zacierania.
67
Daleko posunięty rozkład białek nie jest pożądany, gdyż zmniejsza się pienistość piwa i staje się
ono w smaku „pustawe". Natomiast niedostateczny rozkład białek utrudnia filtrowanie piwa i
"powoduje jego mętnienie w czasie magazynowania.
Nie bez wpływu na procesy enzymatyczne zachodzące w czasie zacierania, jak również na
procesy koagulacyjne, a zatem na klarowanie brzeczki, jest stężenie jonów wodorowych zacieru. W
pierwszej fazie zacierania pH zacieru wynosi około 6, a przy użyciu wody fabrycznej o dużej
twardości nawet 6,3. W czasie zacierania stężenie jonów wodorowych powiększa się do wartości
pH 5,4 – 5,9. Przyczyną tego jest przede wszystkim uwalnianie się kwasu fosforowego z
organicznych połączeń fosforowych (głównie fityny) i tworzenie się aminokwasów podczas
hydrolizy substancji białkowych. Niska kwasowość zacieru wpływa źle na wydajność ekstraktu.
Enzymatyczne procesy rozkładu składników słodu nie zachodzą sprawnie. Dopiero w miarę
zbliżania się pH do wartości optymalnych polepszają się warunki zacierania i prócz zwiększenia
ilości ekstraktu otrzymuje się piwo o lepszym połysku, smaku, pienistości itd.
Dlatego zacier zakwasza się czasem kwasem mlekowym (zwłaszcza przy użyciu twardej wody
fabrycznej). Zachodzi wówczas reakcja pomiędzy kwasem mlekowym a kwaśnymi węglanami i
alkalicznymi fosforanami, jak następuje:
Mg(HCO3)2 + 2CH3-CHOH -COOH = (CH3-CHOH-COO)Mg + 2H2O + 2CO2
Ca(HCO3)2 + 2CH3-CHOH -COOH = (CH3-CHOH-COO)2Ca + 2H2O + 2CO2
Ca(HPO4)4 + 2CH3-CHOH-COOK = CaHPO4 + K2HPO4 + 2CH3 · CHOH • COOH
K2HPO4 + CH3-CHOH-COOH = KH2PO4 + CH3-CHOK-COOK
Nie należy jednak kwasowości zwiększać poniżej pH 5.
Zacier można zakwaszać na drodze biologicznej przez wysianie bakterii kwasu mlekowego
(Lactobacillus delbriickii) na filtrowanej brzeczce. Kwaśną brzeczkę dodaje się do zacieru w
ilościach potrzebnych do uzyskania żądanej kwasowości.
Aparatura warzelni.
W praktyce browarniczej spotyka się warzelnie pojedyncze i podwójne.
W warzelni podwójnej (rys.) znajdują się następujące urządzenia:
a) kadź zacierna (I),
b) kocioł zacierny {II),
c) kocioł warzelny (brzeczkowy) (III),
d) kadź filtracyjna (IV) lub prasa filtracyjna,
68
e) cedzak chmielowy (obecnie stosowany rzadko, gdyż do brzeczki dodaje się nie szyszki
chmielowe lecz granulaty lub koncentraty które nie wymagają osobnego usuwania z
brzeczki),
f) pompy: zacierowa i brzeczkowa.
W warzelni pojedynczej kadź zacierna służy jednocześnie jako kadź filtracyjna, a kocioł
warzelny jako kocioł zacierny. Do tego (poza pompami) dochodzą jeszcze różne naczynia
pomocnicze związane z pojedynczym układem warzelni.
Opiszemy urządzenia warzelni podwójnej. Kadź zacierna, kocioł zacierny i kocioł warzelny są
zbudowane z blachy stalowej austenitycznej (z miedzianej bardzo rzadko, zwykle w minibrowarach
restauracyjnych i w celach reklamy) w kształcie naczynia cylindrycznego. W wypukłym dnie tych
naczyń mieści się mieszadło (w kształcie śmigła), zaś górna część, również wypukła, zakończona
jest szerokim przewodem wyprowadzającym opary na zewnątrz. Tylko kotły zacierny i warzelny są
ogrzewane, dawniej bezpośrednio ogniem, obecnie wężownicą lub płaszczem parowym.
Nieogrzewana zaś kadź zacierna w celu uniknięcia strat ciepła jest izolowana. W pokrywie kotłów i
kadzi mieszczą się włazy z przesuwanymi drzwiczkami.
Stosunek głębokości kadzi do powierzchni powinien wynosić według Thausinga 1:4,0 do 1:4,5.
W kadzi znajdują się dwa dna: górne sitowe (filtrujące) i dolne całe, do którego spływa klarowna
brzeczka. Górne dno filtracyjne składa się z 8-12 płyt mających prostokątne otwory o szerokości od
0,6-1mm. Płyty w postaci wycinków koła umieszczone ściśle obok siebie stoją na nóżkach (o
wysokości 1-2 cm) na dolnym dnie. Przestrzeń pomiędzy płytami a dnem kadzi podzielona jest za
pomocą listew na sektory (jakby komory), z których klarowna brzeczka spływa oddzielnie prze-
wodami spustowymi (poprzez kurki) do wspólnej wanny. Dzięki takiemu ułożeniu sektorów i
oddzielnemu odprowadzaniu brzeczki można kontrolować przebieg filtrowania każdej płyty sitowej
z osobna.
Schemat klasycznej warzelni przedstawaia rysunek:

Czteronaczyniowa warzelnia (klasycznego rodzaju budowy)
(1) kadziokocioł zacierny I
(2) kadziokocioł zacierny II
(3) kadź filtracyjna
(4) kocioł warzelny,
(5+6) zbiornik do śrutysłodowej (jezdny)
(7) odchmielacz
(8) napęd mieszadła
(9) pompa do zacieru
69
(10) pompa do wybicia
Uproszczony schemat warzelni

(1) zbiornik słodu,
(2) śrutownik,
(3) naczynia zacierne,
(4) kadź filtracyjna,
(5) kocioł warzelny,
(6) whirlpool,
(7)płytowy wymiennik ciepła
Nad dnem filtracyjnym znajduje

się mieszadło grabkowe służące do
spulchniania i mieszania osadzonych
70
wysłodzin w czasie ich przemywania. W końcu w górnej części kadzi mieści się aparat do
zraszania i wymywania wysłodzin, tzw. kropidło. Aparat ten pracujący na zasadzie młynka Segnera
składa się z poziomej rury dziurkowanej umieszczonej na ruchomej osi pionowej. Kadź filtracyjną
buduje się z blachy austenitycznej i w celu ograniczenia strat ciepła okłada się ją różnymi
materiałami izolującymi.
Brzeczka z kadzi filtracyjnej spływa grawitacyjnie do kotła warzelnego. W wypadku
ustawienia kotła warzelnego i kadzi filtracyjnej na jednym poziomie, brzeczkę przetłacza specjalna
pompa, zwana pompą brzeczkową.
Technika zacierania.
Znamy wiele sposobów zacierania. W zasadzie wszystkie sposoby można podzielić na dwie
następujące grupy: metodę dekokcyjną czyli warową i metodę infuzyjną. W obu metodach
temperaturę zacieru doprowadza się stopniowo do 70-75° C. Różnica polega tylko na sposobach
stopniowego ogrzewania zacieru do tej temperatury. W metodzie dekokcyjnej osiąga się to przez
ogrzewanie do wrzenia części zacieru, tzw. waru, i wprowadzenie go z powrotem do głównego
zacieru, natomiast w metodzie infuzyjnej -przez stopniowe ogrzewanie całego zacieru.
Śrut słodowy wprowadza się do kadzi zaciernej (bezpośrednio lub pośrednio poprzez tzw.
przedzaciernik. Stosunek ilości śrutu (zasyp) i ilości wody (zalew) jest różny i zależny od sposobu
zacierania, od rodzaju słodu i od charakteru piwa, jaki chcemy wyproukować.
W zależności od ilości odbieranych warów rozróżniamy w metodzie dekokcyjnej trzy sposoby:
trój-, dwu- i jednopanwiowe (warowe).
W trójpanwiowym sposobie zacierania postępujemy w następujący sposób: słód miesza się w
kadzi zaciernej z gorącą wodą tak, żeby temperatura mieszaniny wynosiła około 35°C. Następnie
odbiera się część gęstej masy zacieru (pierwszy war) i przepompowuje przewodem do kotła
zaciernego, gdzie tę część zacieru stopniowo doprowadza się do temperatury wrzenia i we wrzeniu
utrzymuje około 20 minut. W czasie ogrzewania do temperatury wrzenia stosuje się dwukrotne
przetrzymywanie waru (czyli przerwę): pierwsze 10-minutowe w temp. 50°C (przerwa białkowa) i
drugie 15-20-minutowe w temp. 62-63° C (przerwa na scukrzanie). Uzyskany w ten sposób
pierwszy war przepompowuje się przewodem z powrotem do kadzi zaciernej. Tutaj na skutek
zmieszania temperatura całego zacieru podnosi się z 35°C do około 50°C. Teraz odbiera się z kadzi
zaciernej znowu około 30% gęstego zacieru (drugi war) i przepompowuje podobnie jak poprzednio
do kotła zaciernego. Tę drugą część zacieru stopniowo doprowadza się również do temp. wrzenia i
71
utrzymuje we wrzeniu około 20 minut, stosując tylko jedno przetrzymywanie (przerwę cukrową) w
temp. około 65oC przez czas około 20 minut. Podczas ogrzewania drugiego waru zacier główny w
kadzi zaciernej przechodzi przerwę białkową. Wprowadzony następnie do kadzi zaciernej drugi war
podnosi temperaturę całego zacieru do 62-65°C (przerwa cukrowa całego zacieru). W końcu
odbiera się znowu 3 część zacieru (trzeci war) tym razem rzadkiego i bez żadnej „przerwy"
ogrzewa się go w kotle zaciernym do temp. wrzenia (zniszczenie enzymów). W tym czasie reszta
zacieru przechodzi w kadzi przerwę cukrową. Po około 20-minutowym wrzeniu trzeciego waru
przerzuca się go do kotła zaciernego, gdzie cały zacier uzyskuje po wymieszaniu temperaturę około
75°C. Na tym proces zacierania jest skończony. Zacieranie tym sposobem trwa 5-6 godzin.
Zacieranie trójpanwiowe stosuje się obecnie bardzo rzadko- głównie przy produkcji ciemnego
piwa lub też przy przerabianiu słabo rozluźnionego słodu. Natomiast w produkcji piwa jasnego
stosuje się przeważnie skrócony sposób zacierania: dwupanwiowy lub jednopanwiowy.
W sposobie dwupanwiowym początkowa temperatura mieszaniny śrutu z wodą wynosi 50-52°C
(przerwa białkowa). Odebraną część zacieru (pierwszy war) ogrzewa się i po 20-minutowym
przetrzymywaniu w temperaturze 63°C (przerwa cukrowa) doprowadza do temp. wrzenia,
utrzymując zacier w tej temperaturze przez czas około 15 minut. Następnie ten pierwszy war
wprowadza się do kadzi zaciernej, dzięki czemu cały zacier ogrzewa się do temperatury 63-65°C
(przerwa cukrowa). Postępowanie z drugim warem może być dwojakie: albo doprowadza się go
wprost do temp. wrzenia i gotuje przez 10 do 15 minut, albo najpierw robi się 10-30-minutową
przerwę w temperaturze 70-75° C i dopiero później gotuje. Przepompowany do kadzi drugi war
doprowadza cały zacier do temperatury 75 oC.
W sposobie jednopanwiowym ustala się początkową temperaturę masy zacierowej na 63° C i w
tej temperaturze utrzymuje przez 30 minut (przerwa białkowa i cukrowa). Następnie odebraną gęstą
część zacieru gotuje się w kotle zaciernym przez 30 do 60 minut (zależnie od stopnia rozluźnienia
słodu). Po czym zagotowany zacier spuszcza się dwiema porcjami do kadzi, uzyskując przez to
temperaturę 75°C całego zacieru.
Metoda infuzyjna (stosowana najczęściej) polega na stopniowym ogrzewaniu całego zacieru bez
odbierania warów. Podczas ogrzewania robi się przerwy przewidziane dla rozpadu białek i
scukrzenia skrobi. Zacier w końcowej fazie uzyskuje temperaturę 70-75°C.
Czynnikiem kontrolnym w procesie zacierania jest reakcja jodowa. Klarowna brzeczka
ostudzona do temperatury pokojowej nie powinna się barwić z roztworem jodu, jednak pomimo
najlepszej pracy w warzelni wysłodziny zawierają zawsze pewną ilość skrobi. Jeśli wysłodziny
72
wygotujemy z wodą, to otrzymany stąd filtrat zabarwi się z roztworem jodu na kolor niebieski.
Skrobia ta pochodzi głównie z końców ziarn słodowych, w których rozluźnienie zaszło najsłabiej.
W celu więc scukrzenia tej skrobi oraz rozpuszczenia niektórych składników błon
komórkowych (hemicelulozy) w niektórych browarach wyługowane wysłodziny poddaje się
specjalnemu zacieraniu pod ciśnieniem 3 atm (przez 30 minut). Uzyskana stąd brzeczka służy do
przygotowania następnego zacieru. Metody ciśnieniowej używa się również przy zacieraniu
surowców niesłodowych (np. mąki jęczmiennej), służących jako dodatek do surowców słodowych.
Pierwszy tydzień
Przygotowanie brzeczki laboratoryjnej.

W zlewce szklanej o poj. 500cm3 należy odmierzyć 200cm3 wody destylowanej, dodać
naważkę 50g śruty słodowej, preparatu enzymatycznego glukoamylazy i -amylazy po 1 cm3,
włączyć mieszadło elektryczne na minimalne obroty, całość dobrze wymieszać i podgrzewać przez
30-40 min. w temp. 60°C. Następnie temperaturę wody w łaźni wodnej należy podnieść do 73°C i
w tej temperaturze zacier przetrzymywać aż do zaniku reakcji na skrobię.
W tym czasie należy przygotować dwie kolby stożkowe o poj. 500 cm 3 (kolby należy zważyć),
duży szklany lejek z umieszczonym w nim stożkowym rękawem filtracyjnym oraz kolbkę z 300
cm3 przegotowanej i wystudzonej wody destylowanej.
Od chwili osiągnięcia temp. 73°C przez zacier należy kontrolować i zanotować czas scukrzenia
skrobi. Oznaczenie scukrzenia skrobi wykonuje się na płytce porcelanowej - do zagłębienia płytki
nanosi się kilka kropli zacieru i dodaje kroplę 0,02 M roztworu jodu. Pojawienie się barwy żółtej
świadczy o scukrzeniu. Jeżeli barwa jest brunatna, fioletowa lub niebieska badanie należy
ponawiać, co 5 minut, gdyż nie osiągnięto wymaganego stopnia scukrzenia skrobi. Po osiągnięciu
scukrzenia skrobi wyłącza się mieszadło, całość zacieru należy energicznie wymieszać i całość
(części stałe ze słodu czyli wysłodziny spełniają rolę warstwy filtracyjnej) natychmiast na
gorąco przelać do przygotowanego wcześniej lejka wypełnionego rękawem filtracyjnym i
wstawionego do wcześniej zważonej kolby stożkowej o pojemności 500cm3. Pierwsze kilkadziesiąt
cm3 filtratu należy zawrócić, gdyż ta część jest zwykle mętna. Należy zwracać uwagę, aby
73
w czasie dolewania filtrowanej brzeczki nie zruszyć warstwy filtracyjnej ułożonej z wysłodzin.
Po przefiltrowaniu brzeczki należy zważyć kolbę wraz z przefiltrowaną brzeczką i dolać
wody destylowanej do osiągnięcia masy netto 450g. Połowę czyli 225g przygotowanej brzeczki
należy przenieś do drugiej kolby stożkowej na 500cm 3. Brzeczkę należy schłodzić do temperatury
około 20oC i natychmiast zaszczepić drożdżami Saccharomyces carlsbergensis (w ilości 10%(v/v)
gęstwy drożdżowej). Kolby należy zamknąć korkami z waty celulozowej i wstawić do chłodni o
temp. 8-9°C na okres 7 dni. Po tym czasie należy oznaczyć zawartość etanolu metodą destylacji
prostej.
74
PO DWÓCH TYGODNIACH OD NASTAWIENIA FERMENTACJI:
Po ukończeniu fermentacji alkohol z młodego piwa (połączona zawartość obydwu kolb o

objętości 500cm3) należy oddestylować w zestawie do destylacji prostej (rys. 1) do cylindra o
pojemności 100mL.
Rys. Schemat zestawu do destylacji prostej: l - kolba, 2 - chłodnica, 2a - termometr, 3 – odbieralnik
Destylat należy zobojętnić przy pomocy 2% roztworu NaOH do pH=7 (w jakim celu?) i powtórnie
oddestylować etanol do cylinderka na l00ml. Bardzo ważne jest zanotowanie końcowej objętości
uzyskanego destylatu. Zawartość otrzymanego alkoholu należy oznaczyć za pomocą refraktometru
zanurzeniowego.
Oznaczanie zawartości etanolu w destylacie za pomocą refraktometru zanurzeniowego.

Uzyskaną próbkę destylatu należy wlać do naczynia refraktometrycznego, naczynie wstawić do
łaźni wodnej refraktometru, a następnie należy odczytać wskazanie liczby o refraktometrycznych na
granicy podziału pola jasnego i ciemnego w wizjerze refraktometru. Liczbę stopni
refraktometrycznych należy przeliczyć na % masowy i objętościowy alkoholu w badanym
destylacie porównując jego wskazania z tablicami przeliczeniowymi.
Biorąc pod uwagę objętość uzyskanego młodego piwa, objętość uzyskanego destylatu oraz
odczytaną zawartość alkoholu w destylacie należy obliczyć procentową zawartośc alkoholu w
młodym piwie po tygodniu fermentacji.
75

1. Materiały:
 słód jęczmienny
 enzymy komercyjne wykorzystywane przy procesie słodowania
2. Odczynniki:
 0,02 M roztwór jodu 100 cm3
3. Aparatura:
 łaźnia wodna z regulacją temperatury 1 szt.
 mieszadło elektryczne z autotransformatorem
 zlewka 500 cm3 2 szt.
 bagietka szklana
 płytka porcelanowa do próby jodowej
 statyw laboratoryjny
 kolba stożkowa o poj. 750 cm3
 kolba stożkowa o poj. 500 cm3
 odważniki
 waga techniczna uchylna
 stożkowy rękaw filtracyjny
 lejek szklany duży
76
8. BIOSYNTEZA KWASU OCTOWEGO

8.1. WPROWADZENIE
Biosynteza kwasu octowego odbywa się głównie z udziałem bakterii kwasu octowego z rodzaju
Acetobacter lub Gluconobacter. Komórki tych mikroorganizmów mają kształt pałeczek i wymiar
0,6-0,8 X 1,0-4,0 μm (Acetobacter) i 0,6-0,8 X 1,0-2,0 μm (Gluconobacter), mogą występować
pojedynczo, parami lub w łańcuszkach, są gramujemne. Bakterie octowe są tlenowcami i nie są
zdolne do metabolizmu beztlenowego, mogą być ruchliwe lub nie, komórki ruchliwe są urzęsione
peritrichalnie (Acetobacter) lub polarnie (Gluconobacter), nie tworzą przetrwalników oraz są
chemoorganizmami to znaczy, że wykorzystują energię tylko ze związków organicznych.
Optymalne warunki wzrostu bakterii Acetobacter mieszczą się w przedziale 25-30 °C. Optymalny
odczyn podłoża na początku fermentacji wynosi 5,5-6,0. Komórki rosną i tworzą kwas octowy w
podłożu o pH 4,5-3,0 .
Przemysłowa produkcja octu odbywa się na podłożach biotechnologicznych zawierających etanol
(np.: wino, denaturat) i polega na przemianie alkoholu etylowego, poprzez aldehyd octowy do
kwasu octowego:
CH3CH2OH + NAD →dehydrogenaza etanolu →CH3CHO + NADH2

alkohol etylowy aldehyd octowy
CH3CHO + NAD+ H2O →dehydrogenaza aldehydu octowego →CH3COOH + NADH2
aldehyd octowy kwas octowy
Fermentacja octowa jest zaliczana do tzw.” fermentacji utleniających”, gdzie w środowisku

kwaśnym etanol jest niecałkowicie utleniany przez bakterie Acetobacter do kwasu octowego w
warunkach wysokiego natlenienia ( dostępu tlenu). Acetobacter mogą prowadzić dalszy proces
77
utleniania kwasu octowego do dwutlenku węgla i wody ( nadoksydacja) co w octownictwie jest

procesem niekorzystnym.
Istnieje kilka metod otrzymywania octu: orleańska ( w beczkach, surowiec wino lub piwo),
niemiecka- Schützenbacha w stojakach ( szybka metoda, surowiec: wodny roztwór etanolu) oraz
wgłębna ( w fermentorach- acetatorach).
Średnio w wyniku produkcji otrzymuje się od 9 do 13% kwasu octowego, który jest następnie do
celów spożywczych rozcieńczany od 6 do 10%, filtrowany i pasteryzowany.
Cel ćwiczenia jest nastawienie fermentacji octowej metodą wgłębną na niżej podanym podłożu, z
użyciem szczepu Acetobacter acetii, a po tygodniu oznaczenie kwasowości ogólnej płynu
pohodowlanego i przeliczenie jej na kwas octowy.
Wykonać barwienie proste komórek bakterii Acetobacter aceti

W tym celu odtłuścić szkiełko podstawowe, nanieść ezą płynną hodowlę, wykonać rozmaz,
wysuszyć preparat nad płomieniem palnika, utrwalić preparat przeciągając trzy razy przez płomień
palnika, barwienie preparatu fioletu krystalicznego 1 min., spłukanie barwnika wodą destylowaną,
suszenie preparatu, oglądanie preparatu pod mikroskopem)
Oznaczyć zawartość alkoholu etylowego w winie jabłkowym przy użyciu refraktometru

zanurzeniowego.
Wino o objętości 100 cm3 należy przelać do kolby o objętości 500 ml i zobojętnić przy pomocy
1M roztworu NaOH do pH=7. Dodać potłuczoną ceramikę na dno kolby i destylować w zestawie
do destylacji prostej (rys. 1) do zlewki miarowej o pojemności 200 mL.
78
Rys. Schemat zestawu do destylacji prostej: l - kolba, 2 - chłodnica, 2a - termometr, 3 – odbieralnik
Po destylacji otrzymaną próbkę etanolu uzupełnić do 100 ml wodą destylowaną .

Po destylacji otrzymaną próbkę etanolu uzupełnić do 100 ml wodą destylowaną . Około 20 ml
destylatu wlać do naczynia refraktometrycznego i wstawić do refraktometru zanurzeniowego, a
następnie należy odczytać wskazanie liczby o refraktometrycznych na granicy podziału pola jasnego
i ciemnego w wizjerze refraktometru. Liczbę stopni refraktometrycznych należy przeliczyć na %
masowy i objętościowy alkoholu w badanym destylacie porównując jego wskazania z tablicami
przeliczeniowymi ( na końcu skryptu). Podać % zawartość etanolu w 100 ml destylatu.
Biorąc pod uwagę objętość uzyskanego destylatu oraz odczytaną zawartość alkoholu w
destylacie należy obliczyć procentową zawartość alkoholu w winie.
Przygotować podłoże hodowlane do fermentacji octowej

Uwzględniając stężenie etanolu w winie, przygotować 200 mL podłoża hodowlanego w
kolbach o objętości 500 mL, rozcieńczając wino, sterylną wodą wodociągową do zawartości
etanolu od 4%, 6% lub 8% (podłoże wykonać w dwóch powtórzeniach). Nie należy go sterylizować
w autoklawie. Następnie podłoże zaszczepić 5% ( 5ml/100 ml podłoża) płynnym innoculum
bakterii Acetobacter aceti. Hodowlę prowadzić w wytrząsarce Infrost Minitron – 150 rpm, w
temperaturze 25-30°C przez 5 dób.
PO TYGODNIU:
79
Oznaczyć zawartość alkoholu etylowego w płynie pohodowlanym przy użyciu

refraktometru zanurzeniowego.
Płyn pohodowlany o objętości 100 cm3 przelać do kolby o objętości 500 ml i zobojętnić przy
pomocy 25% roztworu NaOH do pH=7. Wykonać destylację prostą i oznaczyć zawartość alkoholu
w destylacie przy użyciu refraktometru zanurzeniowego jak opisano powyżej.
Oznaczanie kwasowości ogólnej ( miareczkowej)

Przenieść 5 ml płynu pohodowlanego do kolbki stożkowej i uzupełnić do 50 ml wodą
destylowaną. Całość należy następnie miareczkować 0,1 M NaOH wobec kilku kropli
fenoloftaleiny do różowego zabarwienia. Należy zanotować liczbę mL roztworu NaOH zużytą do
zmiareczkowania próby. Miareczkowanie wykonać w dwóch powtórzeniach i przeliczyć na 100 ml
płynu pohodowlanego.
Sposób obliczania:
1 ml 0,1M NaOH zobojętnia 6,052 mg kwasu octowego.
Ogólna kwasowość kwasu octowego (mg/ml)= A x B x C/objętość próbki wykorzystanej do

zmiareczkowania
A= objętość NaOH zużyta do miareczkowania (ml)
B= molarność NaOH zużyta do miareczkowania (M)
C= równoważnik kwasu octowego (mg) = 60,52 mg
6. Przeliczanie kwasowości ogólnej na kwas octowy

W płynach pohodowlanych należy oznaczyć kwasowość ogólną i przeliczyć ją na kwas octowy.
Ten sposób określania kwasowości ogólnej (miareczkowej) próbek różnego pochodzenia (w
materiałach biotechnologicznych, próbkach żywności i innych) daje odpowiedź na temat ogólnej
80
instrumentalnymi, np. HPLC, lecz metody instrumentalne na ogół wiążą się z potrzebą specjalnego
MASA MOLOWA kwasu octowego wynosi 60,052 g/mol. 1 cząsteczka kwasu octowego zawiera
1 grupę karboksylową, więc reakcja zobojętniania roztworem NaOH przebiega jak przedstawiono
niżej:
1mol kwasu octowego + 1 mol NaOH = 1 mol octanu sodowego + 1 mol H2O
Tak więc:
 1 litr 1 molowego roztworu NaOH (czyli 1 mol NaOH) zobojętnia 1 mol kwasu octowego
(60, 052 g)
kwasu octowego (jedną dziesiątą z 60,052g czyli 6,0052 g kwasu)
proporcji obliczyć zawartość kwasów w próbce w przeliczeniu na kwas octowy (lub jakikolwiek
Wyniki należy podać jako kwasowość w % mieszanym tzn. %m/v czyli liczbę g kwasu octowego w
100mL płynu pohodowlanego wyjściowego- należy więc uwzględnić wszystkie dokonane
rozcieńczenia.
 Drobnoustroje: Acetobacter acetii

 Podłoża: wino , woda destylowana
 Odczynniki: 0,1 M NaOH
81
 Sprzęt: mikroskop, szkiełka, biureta, kolbki na 500 ml (1) i 150 ml (2), lejek, sączki
 Pipety 1, 5, 10ml (sterylne), eza, waga, kuchenka elektryczna
ZAŁĄCZNIKI
8.5. WZÓR SPRAWOZDANIA Z ĆWICZEŃ
Nazwisko i Imię: Symbol podgrupy: 1A

Malinowska Agnieszka Data(-y) wykonywania ćwiczenia: 17.10.2007
Kowalik Piotr
Osoba prowadząca ćwiczenia: stopień naukowy, imię i nazwisko
Temat i numer ćwiczenia:

Wpływ pH i temperatury na aktywność glukoamylazy (ćwiczenie nr 6)
82
1. Cel ćwiczenia (nie więcej niż 1-3 zdania)

Nie należy zamieszczać teoretycznego opisu dotyczącego ćwiczenia!
2. Zadania do realizacji (w formie podpunktów)

np.:
a) przygotowanie próbek piw do analiz
b) oznaczenie gęstości piwa
c) oznaczenie zawartości ekstraktu w piwie
d) oznaczenie zawartości etanolu w piwie
e) oznaczenie barwy piwa itd.
3. Wprowadzone zmiany w metodykach

Należy w wyraźnie wydzielonych podpunktach wyszczególnić wprowadzone
zmiany w metodykach w stosunku do metod dostarczonych w tekście ćwiczenia.
4. Spostrzeżenia i obliczenia
Spostrzeżenia takie jak np. zmiana barwy, wygląd hodowli jak również pełne
przeliczenia wyników, rysunki, wykresy, tabele należy przedstawić w wyraźnie
wydzielonych podpunktach, adekwatnie do punktu 2 „Zadania do realizacji”.
Uwaga: Należy zamieszczać pełne obliczenia rachunkowe bez stosowania
skrótów myślowych.
5. Wnioski
Wnioski należy przedstawić w formie zwięzłych punktów.
W przypadku braku możliwości poprawnego wnioskowania np. na skutek
uzyskania błędnych lub niepewnych wyników eksperymentu należy przedstawić
na podstawie dogłębnej analizy przebiegu eksperymentu prawdopodobne
przyczyny uzyskania nieprawidłowego wyniku. Analizę błędów popełnionych w
czasie eksperymentu należy wyraźnie oddzielić od wniosków.
8.6. TABLICE DO REFRAKTOMETRU ZANURZENIOWEGO

Gew Vol. g/100 Gew Vol. g/100 Gew Vol. g/100
Sk. T. Sk. T. Sk. T.
% % cm3 % % cm3 % % cm3
15,0 0,00 0,00 0,00 20,0 3,13 3,92 3,11 25,0 6,02 7,50 5,96
1 06 08 06 1 19 4,00 17 1 08 57 6,00
2 13 16 13 2 25 07 23 2 13 64 06
3 19 24 19 3 31 15 29 3 19 71 12
4 25 32 26 4 37 22 35 4 24 78 17
5 32 40 32 5 43 30 41 5 30 84 23
6 38 48 39 6 49 37 47 6 35 91
83
7 45 56 45 7 55 45 53 7 41 98 33
8 51 64 51 8 61 52 59 8 46 8,05 39
9 57 73 58 9 67 60 65 9 52 11 44
16,0 0,64 0,81 0,64 21,0 3,73 4,67 3,71 26,0 6,57 8,13 6,49
1 70 89 70 1 79 75 77 1 62 25 55
2 77 97 77 2 85 82 83 2 68 32 60
3 83 1,05 83 3 91 89 88 3 73 38 65
4 89 12 89 4 97 97 94 4 79 45 71
5 96 20 96 5 4,03 5,04 4,00 5 84 52 76
6 1,02 28 1,02 6 09 11 06 6 89 58 81
7 08 36 08 7 15 19 12 7 95 65 87
8 15 44 15 8 20 26 17 8 7,00 72 92
9 21 52 21 9 26 33 23 9 06 78 97
17,0 1,27 1,60 1,27 22,0 4,32 5,40 4,29 27,0 7,11 8,85 7,02
1 34 68 34 1 38 48 35 1 16 92 08
2 40 76 40 2 44 55 40 2 22 98 13
3 46 84 46 3 49 62 46 3 27 9,05 18
4 53 92 52 4 55 69 52 4 33 12 24
5 59 2,00 59 5 61 76 57 5 38 18 29
6 65 07 65 6 67 83 63 6 43 25 34
7 71 15 71 7 72 90 69 7 49 32 39
8 78 23 77 8 78 98 74 8 54 38 45
9 84 31 83 9 84 6,05 80 9 60 45 50
18,0 1,90 2,39 1,90 23,0 4,90 6,12 4,86 28,0 7,65 9,51 7,55
1 96 47 96 1 95 19 91 1 70 58 60
2 2,02 54 2,02 2 5,01 26 97 2 76 64 66
3 08 62 08 3 07 33 5,02 3 81 71 71
4 15 70 14 4 12 40 03 4 86 78 76
5 21 78 20 5 18 47 13 5 92 84 81
6 27 85 27 6 24 54 19 6 97 91 86
7 33 93 33 7 29 61 25 7 8,02 97 92
8 40 3,01 39 8 35 68 30 8 08 10,04 97
9 46 08 45 9 41 75 36 9 13 10 8,02
19,0 2,52 3,16 2,51 24,0 5,46 6,82 5,41 29 8,18 10,17 8,07
1 58 24 57 1 52 89 47 1 23 24 12
2 64 31 63 2 58 95 52 2 29 30 18
3 70 39 69 3 63 7,02 58 3 34 37 23
4 77 47 75 4 69 09 63 4 39 43 28
5 83 54 81 5 74 16 68 5 45 50 33
6 89 62 87 6 80 23 74 6 50 56 38
7 95 70 93 7 86 30 79 7 55 63 43
8 3,01 77 99 8 91 37 85 8 61 69 49
9 07 85 3,05 9 97 43 90 9 66 76 54
20,0 3,13 3,92 3,11 25,0 6,02 7,50 5,96 30,0 8,71 10,82 8,59

% % cm3 % % cm3 % % cm3
30,0 8,71 10,82 8,59 35,0 11,34 14,03 11,14 40,0 13,89 17,14 13,60
1 76 89 64 1 39 10 19 1 94 20 65
2 82 95 69 2 44 16 24 2 99 26 70
3 87 11,02 74 3 49 22 29 3 14,04 32 75
84
4 92 08 79 4 55 29 34 4 09 38 79
5 98 14 85 5 60 35 39 5 14 44 84
6 9,03 21 90 6 65 41 44 6 19 50 89
7 08 28 95 7 70 48 49 7 24 56 94
8 14 34 9,00 8 75 54 54 8 29 62 98
9 19 41 05 9 81 60 59 9 34 68 14,03
31,0 9,24 11,47 9,10 36,0 11,86 14,67 11,64 41,0 14,39 17,74 14,08
1 29 53 15 1 91 73 69 1 44 80 13
2 35 60 20 2 96 79 74 2 49 86 17
3 40 66 26 3 12,01 86 79 3 54 92 22
4 45 73 31 4 06 92 84 4 59 98 27
5 51 79 36 5 11 98 89 5 63 18,04 31
6 56 86 41 6 16 15,04 94 6 68 10 36
7 61 92 46 7 22 11 99 7 73 16 41
8 66 99 51 8 27 17 12,04 8 78 22 46
9 72 12,05 56 9 32 23 09 9 83 28 51
32,0 9,77 12,12 9,61 37,0 12,37 15,29 12,14 42,0 14,88 18,34 14,55
1 82 18 67 1 42 36 19 1 93 40 60
2 87 24 72 2 47 42 24 2 98 46 65
3 93 31 77 3 52 48 29 3 15,03 52 70
4 98 37 82 4 58 54 33 4 08 58 74
5 10,03 44 87 5 63 61 38 5 13 64 79
6 08 50 92 6 68 67 43 6 18 69 84
7 14 57 97 7 73 73 48 7 23 75 88
8 19 63 10,02 8 78 79 53 8 28 81 93
9 24 69 07 9 83 85 58 9 33 87 98
33,0 10,29 12,76 10,12 38,0 12,88 15,92 12,63 43,0 15,38 18,93 15,02
1 35 82 17 1 94 98 68 1 43 99 07
2 40 89 23 2 99 16,04 73 2 47 19,05 11
3 45 95 28 3 13,04 10 78 3 52 10 16
4 50 13,01 33 4 09 16 83 4 57 16 21
5 56 08 38 5 14 22 88 5 62 22 25
6 61 14 43 6 19 29 92 6 67 28 30
7 66 21 48 7 24 35 97 7 72 34 35
8 71 27 53 8 29 41 13,02 8 77 40 39
9 76 33 58 9 34 47 07 9 82 46 44
34,0 10,82 13,40 10,63 39,0 13,39 16,53 13,12 44,0 15,87 19,52 15,49
1 87 46 68 1 44 59 17 1 92 58 53
2 92 52 73 2 49 65 22 2 96 64 58
3 97 59 78 3 55 72 26 3 16,01 70 63
4 11,03 65 83 4 59 78 31 4 06 76 67
5 08 72 88 5 64 84 36 5 11 81 72
6 13 78 93 6 69 90 41 6 16 87 77
7 18 84 98 7 74 96 46 7 21 93 82
8 23 91 11,04 8 79 17,02 51 8 26 99 86
9 29 97 09 9 84 08 55 9 31 20,05 91
35,0 11,34 14,03 11,14 40,0 13,89 17,14 13,60 45,0 16,36 20,11 15,96
85

% % cm3 % % cm3 % % cm3
45,0 16,36 20,11 15,96 50,0 18,88 23,13 18,35 55,0 21,46 26,21 20,80
1 41 17 16,01 1 93 19 40 1 52 27 85
2 46 23 05 2 98 25 45 2 57 33 90
3 51 29 10 3 19,04 31 50 3 62 39 95
4 56 35 15 4 09 37 55 4 67 45 21,00
5 61 41 19 5 14 44 60 5 72 52 04
6 66 47 24 6 19 50 65 6 78 58 09
7 71 53 29 7 24 56 70 7 83 64 14
8 76 59 34 8 29 62 74 8 88 70 19
9 81 65 38 9 34 68 79 9 93 76 24
46,0 16,86 20,71 16,43 51,0 19,40 23,74 18,84 56,0 21,98 26,83 21,29
1 91 77 48 1 45 80 89 1 22,04 89 34
2 96 83 53 2 50 87 94 2 09 95 39
3 17,01 89 58 3 55 93 99 3 14 27,01 44
4 06 95 62 4 60 99 19,04 4 19 08 48
5 11 21,01 67 5 65 24,05 09 5 24 14 53
6 16 07 72 6 71 11 13 6 29 20 58
7 21 13 77 7 76 17 18 7 34 26 63
8 26 19 81 8 81 24 23 8 39 32 68
9 31 25 86 9 86 30 28 9 44 39 73
47,0 17,36 21,31 16,91 52,0 19,91 24,36 19,33 57,0 22,50 27,44 21,78
1 41 38 96 1 96 42 38 1 55 51 83
2 46 43 17,00 2 20,02 48 43 2 60 57 88
3 51 49 05 3 07 54 48 3 65 63 93
4 56 55 10 4 12 61 53 4 71 69 98
5 61 61 15 5 17 67 58 5 76 75 22,02
6 66 67 20 6 22 73 62 6 81 82 07
7 71 78 24 7 27 79 67 7 86 88 12
8 76 79 29 8 33 85 72 8 92 94 17
9 81 85 34 9 38 92 77 9 97 28,00 22
48,0 17,86 21,91 17,39 53,0 20,43 24,98 19,82 58,0 23,02 28,06 22,27
1 91 97 43 1 48 25,04 87 1 08 13 32
2 96 22,03 48 2 53 10 92 2 13 19 37
3 18,01 09 53 3 58 16 97 3 18 25 42
4 06 15 58 4 64 22 20,02 4 23 31 47
5 12 21 63 5 69 29 07 5 29 37 52
6 17 27 68 6 74 35 11 6 34 44 57
7 22 34 72 7 79 41 16 7 39 50 61
8 27 40 77 8 84 47 21 8 45 56 66
9 32 46 82 9 89 53 26 9 50 62 71
49,0 18,37 22,52 17,87 54,0 20,95 25,59 20,31 59,0 23,55 28,68 22,76
1 42 58 92 1 21,00 65 36 1 60 75 81
2 47 64 97 2 05 72 41 2 66 81 86
3 52 70 18,01 3 10 78 46 3 71 87 91
4 57 76 06 4 15 84 51 4 76 93 96
5 63 82 11 5 20 90 56 5 81 29,00 23,01
6 68 88 16 6 26 96 60 6 86 06 06
7 73 94 21 7 31 26,02 65 7 91 12 11
86
8 78 23,01 26 8 36 09 70 8 97 18 16
9 83 07 31 9 41 15 75 9 24,02 24 21
50,0 18,88 23,13 18,35 55,0 21,46 26,21 20,80 60,0 24,07 29,31 23,26
87

% % cm3 % % cm3 % % cm3
60,0 24,07 29,31 23,26 65,0 26,82 32,54 25,82 70,0 29,86 36,04 28,60
1 12 37 31 1 88 60 87 1 92 12 66
2 18 43 36 2 94 67 93 2 98 19 72
3 23 49 41 3 27,00 74 98 3 30,05 26 78
4 28 56 46 4 06 81 26,03 4 11 33 83
5 34 62 51 5 12 87 09 5 18 41 89
6 39 68 56 6 17 94 14 6 24 47 95
7 44 75 61 7 23 33,01 20 7 31 56 29,01
8 50 81 65 8 29 08 25 8 37 63 07
9 55 87 70 9 34 15 30 9 44 71 13
61,0 24,60 29,93 23,75 66,0 27,41 33,22 26,36 71,0 30,50 36,78 29,19
1 66 30,00 80 1 47 28 41 1 57 86 25
2 71 06 85 2 53 35 47 2 63 93 31
3 77 12 90 3 59 42 52 3 70 37,00 36
4 82 19 96 4 65 49 58 4 76 08 42
5 88 25 24,01 5 71 56 63 5 83 15 48
6 93 31 06 6 77 63 69 6 90 23 54
7 99 38 11 7 83 70 74 7 97 31 60
8 25,04 44 16 8 89 77 80 8 31,03 38 66
9 10 51 21 9 95 84 85 9 10 46 72
62,0 25,15 30,57 24,26 67,0 28,01 33,91 26,91 72,0 31,17 37,53 29,78
1 20 63 31 1 07 98 96 1 24 61 84
2 26 70 36 2 13 34,05 27,02 2 30 68 91
3 31 76 41 3 19 12 07 3 37 76 97
4 37 83 46 4 25 19 13 4 44 84 30,03
5 42 89 51 5 30 26 18 5 50 91 09
6 47 96 57 6 37 33 24 6 57 99 15
7 52 31,02 62 7 43 40 30 7 64 38,07 21
8 58 09 67 8 49 47 35 8 70 15 27
9 63 15 72 9 55 54 41 9 77 22 33
63,0 25,69 31,21 24,77 68,0 28,61 34,61 27,46 73,0 31,84 38,30 30,39
1 75 28 82 1 68 68 52 1 91 38 46
2 80 34 87 2 74 75 57 2 98 46 52
3 86 41 93 3 80 82 63 3 32,04 54 58
4 92 48 98 4 86 89 69 4 11 61 64
5 97 54 25,03 5 92 96 74 5 18 69 70
6 26,03 61 08 6 99 35,03 80 6 26 77 77
7 09 67 13 7 29,05 10 86 7 33 85 83
8 14 74 19 8 11 17 91 8 40 93 89
9 20 80 24 9 17 25 97 9 47 39,01 95
64,0 26,26 31,87 25,29 69,0 29,23 35,32 28,08 74,0 32,54 39,08 31,02
1 31 94 34 1 29 39 08 1 61 16 08
2 37 32,00 40 2 35 46 14 2 68 24 14
3 43 07 45 3 41 53 20 3 75 32 20
4 49 13 50 4 48 61 26 4 82 40 27
5 54 20 55 5 54 68 31 5 89 48 33
6 59 27 61 6 60 75 37 6 96 56 39
7 65 34 66 7 67 82 43 7 33,03 64 46
88
8 71 40 71 8 73 90 49 8 10 72 52
9 77 47 77 9 79 97 54 9 17 80 58
65,0 26,82 32,54 25,82 70,0 29,86 36,04 28,60 75,0 33,24 39,88 31,65
89

% % cm3 % % cm3 % % cm3
75,0 33,24 39,88 31,65 80,0 37,13 44,19 35,06 85,0 41,63 49,09 38,96
1 31 96 71 1 22 28 14 1 73 20 39,04
2 38 40,04 78 2 30 37 21 2 83 30 13
3 46 12 84 3 38 46 28 3 93 41 21
4 53 20 90 4 46 55 36 4 42,03 52 29
5 60 28 97 5 55 65 43 5 13 62 38
6 68 36 32,03 6 63 74 50 6 23 73 46
7 75 45 10 7 71 83 58 7 33 84 55
8 83 53 16 8 80 93 65 8 43 94 63
9 90 61 23 9 88 45,02 73 9 53 50,05 72
76,0 33,97 40,69 32,30 81,0 37,97 45,11 35,80 86,0 42,63 50,16 39,80
1 34,05 78 36 1 06 21 88 1 73 27 89
2 13 86 43 2 14 30 95 2 84 38 98
3 20 94 49 3 23 40 36,03 3 94 49 40,06
4 28 41,03 56 4 32 49 10 4 43,04 60 15
5 35 11 63 5 41 59 18 5 14 71 24
6 43 20 69 6 50 69 25 6 25 82 33
7 50 28 76 7 59 78 33 7 35 93 41
8 58 37 83 8 68 88 41 8 45 51,04 50
9 66 45 89 9 76 97 48 9 56 15 59
77,0 34,73 41,53 32,96 82,0 38,85 46,07 36,56 87,0 43,66 51,26 40,68
1 80 62 33,03 1 94 17 64 1 77 37 77
2 88 71 10 2 39,03 27 71 2 87 48 86
3 96 79 16 3 11 36 79 3 98 60 95
4 35,03 88 23 4 20 46 87 4 44,08 71 41,03
5 11 96 30 5 29 56 95 5 19 82 12
6 19 42,05 37 6 38 66 37,03 6 30 93 21
7 27 13 44 7 48 76 10 7 41 52,05 30
8 35 22 51 8 57 86 18 8 52 16 40
9 42 31 57 9 66 96 26 9 63 28 49
78,0 35,50 42,40 33,64 83,0 39,75 47,05 37,34 88,0 44,74 52,39 41,58
1 58 48 71 1 85 15 42 1 85 51 67
2 67 57 78 2 94 25 50 2 96 62 76
3 75 66 85 3 40,03 35 58 3 45,07 74 85
4 83 74 92 4 12 45 66 4 18 86 94
5 91 83 98 5 22 56 74 5 29 97 42,04
6 98 92 34,06 6 31 66 82 6 41 53,09 13
7 36,06 43,01 13 7 40 76 90 7 52 21 22
8 14 10 20 8 50 86 98 8 63 33 32
9 22 19 27 9 59 96 38,06 9 75 45 41
79,0 36,30 43,28 34,34 84,0 40,68 48,06 38,14 89,0 45,86 53,56 42,50
1 38 37 42 1 78 16 22 1 97 68 60
2 46 46 49 2 87 26 30 2 46,09 80 69
3 54 55 56 3 96 37 38 3 20 92 79
4 63 64 63 4 41,06 47 46 4 32 54,04 89
5 71 73 70 5 15 57 55 5 43 16 98
6 79 82 77 6 25 68 63 6 55 28 43,08
7 87 91 85 7 34 78 71 7 66 41 18
90
8 96 44,00 92 8 44 88 79 8 78 53 27
9 37,05 09 99 9 53 99 88 9 90 65 37
80,0 37,13 44,19 35,06 85,0 41,63 49,09 38,96 90,0 47,02 54,77 43,47
91

% % cm3 % % cm3 % % cm3
90,0 47,02 54,77 43,47 95,0 53,81 61,66 48,93 100,0 63,41 70,91 56,27
1 14 90 56 1 96 82 49,05 1 65 71,14 45
2 26 55,02 66 2 54,12 98 17 2 90 37 63
3 38 15 76 3 28 62,13 30 3 64,15 61 81
4 50 27 86 4 44 29 42 4 41 84 57,00
5 62 40 96 5 60 45 54 5 67 72,08 19
6 75 52 44,06 6 76 61 67 6 93 32 38
7 87 65 16 7 92 76 79 7 65,20 57 58
8 99 78 26 8 55,08 92 92 8 48 82 78
9 48,12 91 36 9 24 63,08 50,05 9 76 73,07 99
91,0 48,24 56,03 44,47 96,0 55,41 63,24 50,18 101,0 66,04 73,33 58,19
1 37 16 57 1 58 40 31 1 34 60 40
2 49 29 67 2 74 56 44 2 63 87 61
3 62 42 78 3 91 72 58 3 94 74,15 83
4 75 55 88 4 56,08 88 71 4 67,25 44 59,05
5 87 68 98 5 25 64,05 74 5 57 73 28
6 49,00 82 45,09 6 42 22 97 6 90 75,03 52
7 13 95 19 7 60 39 51,11 7 68,24 33 76
8 26 57,08 30 8 77 57 24 8 58 64 60,01
9 39 21 40 9 94 74 37 9 94 96 27
92,0 49,52 57,35 45,51 97,0 57,13 64,91 51,51 102,0 69,30 76,28 60,54
1 65 48 62 1 31 65,08 64 1 68 61 82
2 78 62 72 2 49 26 78 2 70,08 96 61,10
3 92 75 83 3 67 44 92 3 49 77,33 39
4 50,05 89 94 4 85 62 52,06 4 91 72 69
5 19 58,03 46,05 5 58,04 80 21 5 71,37 78,12 62,00
6 32 17 16 6 23 99 35 6 86 54 33
7 46 30 27 7 42 66,17 50 7 72,36 99 67
8 60 44 38 8 61 36 65 8 90 79,46 63,04
9 74 58 49 9 80 55 80 9 73,48 95 44
93,0 50,88 58,72 46,60 98,0 59,00 66,74 52,96 103,0 74,07 80,47 63,86
1 51,02 86 71 1 20 93 53,11 1 74,68 81,02 64,30
2 10 59,00 82 2 40 67,12 27 2 75,34 61 77
3 30 15 94 3 61 32 42 3 76,20 82,29 65,30
93,35 37 22 99 4 81 51 58 4 77,60 83,47 66,24
4 44 29 47,05 5 60,02 71 74 103,46 80,00 85,33 67,72
5 58 43 16 6 23 91 90
6 72 58 28 7 45 68,11 54,06
7 87 72 39 8 66 32 22
8 52,01 87 51 9 89 53 39
9 15 60,01 62 99,0 61,10 68,74 54,55
94,0 52,80 60,16 47,74 1 33 94 71
1 45 31 86 2 55 69,15 88
2 59 45 97 3 77 36 55,04
3 74 60 48,09 4 62,00 57 21
4 89 75 21 5 23 79 38
5 53,04 90 33 6 46 70,01 56
6 19 61,05 45 7 69 23 73
92
7 34 20 57 8 93 46 91
8 50 36 69 9 63,17 68 56,09
9 65 51 81 100,0 63,41 70,91 56,27
93
SPIS AUTORÓW
Dr inż. Jacek Pielecki

Dr Piotr Janas
Dr inż. Dominik Szwagier
Mgr inż. Tomasz Czernecki
Dr Monika Kordowska-Wiater
Dr Adam Waśko
Dr inż. Monika Pytka
94
95
96

Wiczenia Z Iotechnologii Ywności: K B, Ż C T Ż

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Wiczenia Z Iotechnologii Ywności: K B, Ż C T Ż

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

ĆWICZENIA

KATEDRA BIOTECHNOLOGII, ŻYWIENIA CZŁOWIEKA

AKADEMIA ROLNICZA W LUBLINIE

WZÓR SPRAWOZDANIA Z ĆWICZENIA………………………………………………....

REGULAMIN OBOWIĄZUJĄCY NA ĆWICZENIACH Z

Obowiązki studenta podlegające ocenie prowadzącego:

 Na ćwiczenia studenci przychodzą punktualnie.

Zaliczenie ćwiczeń polega na:

1. ZIMNE ZACIERANIE PSZENICY I OZNACZANIE WYDAJNOŚCI

Rys. l Fragment cząsteczki amylozy.

Rys.2.Fragment cząsteczki amylopektyny.

Parowanie musi odbywać się w środowisku silnie uwodnionym. Rozpuszczanie skrobi

Zacieranie parowanych surowców skrobiowych.

Zacieranie surowców skrobiowych poddanych wcześniej parowaniu polega na wspólnym

kompleksowo -amylazą i glukoamylazą. W przypadku upłynniania skrobi i scukrzania jej

w stosunku do wykorzystanej glukozy jest mała, natomiast ma miejsce intensywne tworzenie

1.2. WYKONANIE ĆWICZENIA

1. Przygotowanie próby fermentacyjnej do zimnego zacierania pszenicy.

2. Oznaczenie zawartości skrobi w mące pszennej metodą Eversa w modyfikacji Grossfelda.

3. Przygotowanie hydrolizatu z mąki pszennej do oznaczenia wydajności fermentacyjnej.

DRUGI TYDZIEŃ ĆWICZENIA

4. Oznaczanie zawartości alkoholu etylowego w odfermentowanym zacierze (po zimnym

Rys. Schemat zestawu do destylacji prostej: l - kolba, 2 - chłodnica, 2a - termometr, 3 - odbieralnik

uzyskanego destylatu. Zawartość otrzymanego alkoholu należy oznaczyć za pomocą refraktometru

5. Oznaczanie etanolu w destylacie za pomocą refraktometru zanurzeniowego.

Przykładowy sposób obliczania wyników:

Maksymalna teoretyczna wydajność z naważki w gramach, wg. punktu 1 będzie następująca:

Wyniki oznaczeń i analiz należy umieścić w sprawozdaniu w oddzielnych punktów wraz z

1.3. MATERIAŁY I SPRZĘT

2. OTRZYMYWANIE ORAZ OCENA WYDAJNOŚCI I JAKOŚCI

Przygotowana brzeczka melasowa o określonej zawartości cukru i wzbogacona solami mineralnymi

Tanki używane do hodowli drożdży zarodowych wyposażone są w barboterowy system

odpieniania brzeczki drożdżowej oraz automatyczną regulację dozowania brzeczki melasowej,

Głównymi czynnikami wpływającymi na czystość mikrobiologiczną hodowli drożdży są:

Leuconostoc, Lactobacillus), gnilnych (Proteus vulgaris, Bacillus subtilis, B. megatherium) i

2.2. WYKONANIE ĆWICZENIA

ĆWICZENIE TRWA PRZEZ DWA KOLEKNE ZAJĘCIA

Przygotowanie podłoża do hodowli drożdży piekarskich:

Tabela 1. Wybrane cechy jakościowe melasy w I i II klasie jakości.

Hodowla drożdży piekarskich:

Ocena szybkości podnoszenia ciasta metodą kulki wg Ostrowskiego

NA NASTĘPNYCH ZAJĘCIACH- PO TYGODNIU

Po zakończonym procesie hodowli płyn pohodowlany należy odwirować w dwóch gilzach do

Ocena stanu fizjologicznego i czystości mikrobiologicznej drożdży

2.3. PRZEDSTAWIENIE WYNIKÓW

Sposób prezentacji wyników

2.4. MATERIAŁY I SPRZĘT

 kolby na 250 lub 300 ml (x 2)

3. PRODUKCJA I CHARAKTERYSTYKA GLUKOAMYLAZY

 posiadanie w sekwencji aminokwasowej czterech silnie zakonserwowanych regionów (I-IV)

3. Amylazy znoszące rozgałęzienia (ang. debranching enzymes)

 neopullulanazy (E. C. 3.2.1.135) hydrolizujące wiązania α-1,4 i α-1,6-glikozydowe w

Schemat działania enzymów amylolitycznych na skrobię. Ramka otwarta symbolizuje koniec

3.2. WYKONANIE ĆWICZENIA

ĆWICZENIE TRWA PRZEZ DWA KOLEJNE ZAJĘCIA

1. Przygotowanie podłoża do biosyntezy glukoamylazy:

Składniki wstępnie wymieszać ruchem obrotowym. Następnie do kolby dodać 20 ml buforu

3. Przygotowanie roztworów skrobi rozpuszczalnej:

I. Do ćwiczenia należy przygotować kilka prób:

Przygotowanie prób do reakcji enzymatycznych:

II. Etapy postępowania:

roztworu skrobiowego do oznaczonych markerem 9 probówek (3 dla każdej badanej temperatury

Obliczenie aktywności glukoamylazy: