Miolo Toxinologia

ORGANIZADORES:
Silvana Marcussi
Marcus Vinicius Cardoso Trento
Pedro Henrique Sousa César
Anderson Assaid Simão
Toxinologia:
Fundamentos e Métodos
Análises toxicológicas na avaliação de Produtos

Naturais, Químicos e Sintéticos
Alfenas • MG
2018
Todos os direitos reservados. Nenhuma parte desta edição pode ser utilizada ou
reproduzida por qualquer meio ou forma, seja mecânico ou eletrônico, — nem
apropriada ou estocada em sistema de banco de dados, sem a expressa autorização dos
organizadores.
1ª edição: maio de 2018
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Pinho, Alice
Toxinologia: fundamentos e métodos. Análises toxicológicas na

avaliação de produtos naturais, químicos e sintéticos / Silvana
Marcussi, Marcus Vinicius Cardoso Trento, Pedro Henrique
Sousa César e Anderson Assaid Simão (organizadores). –– 1. ed.
São Paulo : PoloBooks, 2018.
121 p.; 16x23cm.
ISBN: 978-85-5522-280-1
1. Biologia, ciências da vida. 2. Toxinologia. I. Título
CDD 570
Índice para catálogo sistemático:

1 Biologia, ciências da vida : 2 Toxinologia
2018
Editora PoloPrinter
11 . 3791.2965 11 . 98393.7000
www.poloprinter.com.br
atendimento@poloprinter.com.br
polo.books
2 Toxinologia: Fundamentos e Métodos

Organização:
Silvana Marcussi
Autores:
Silvana Marcussi
Carlos Henrique de Moura Oliveira
Mariana Aparecida Braga
Mateus William de Faria Eleutério
Tatiane Silva de Abreu
Larissa Fonseca Andrade-Vieira
Tássia Flávia Dias Castro
Toxinologia: Fundamentos e Métodos 3

ÍNDICE
CAPÍTULO I...................................................................................................9
1. Introdução a Toxinologia...........................................................................10
CAPÍTULO II...............................................................................................16
2. Toxinas de peçonhas de serpentes.............................................................17
2.1 Metaloproteases................................................................................22
2.2 Desintegrinas...............................................................................26
2.2.1 Desintegrinas-RGD..................................................................27
2.2.2 Desintegrinas-MLD.................................................................27
2.2.3 Desintegrinas R/KTS...............................................................28
2.3 Serinoproteases.................................................................................29
2.4 Fosfolipases.......................................................................................30
2.4.1 Fosfolipases A2.........................................................................31
2.5 L-aminoácido oxidases ....................................................................36
2.6 Lectinas do tipo-C.............................................................................37
2.7 Hialuronidases...................................................................................38
CAPÍTULO III..............................................................................................40
3. Metodologias em Toxinologia: Extração de peçonhas e
venenos; Caracterização Bioquímica.........................................................41
3.1 Extração de peçonhas e venenos.......................................................41
3.1.2 Escorpiões e aranhas; vespas e abelhas....................................43
3.1.3 Lagartas (taturanas)..................................................................45
3.1.4 Anêmonas ................................................................................46
3.1.5 Sapos, rãs e pererecas...............................................................46
3.2 Caracterização bioquímica................................................................46
3.2.1 Determinação quantitativa de proteínas...................................46
3.2.2 Cromatografia de troca iônica em CM-Sepharose...................50
3.2.3 Cromatografia por exclusão molecular ...................................52
3.2.4 Eletroforese em gel de poliacrilamida com agentes
desnaturantes e determinação do peso molecular
estimado..................................................................................55
CAPÍTULO IV..............................................................................................61
4. Metodologias em Toxinologia: Atividades in vitro....................................61
4.1 Atividade fosfolipásica.....................................................................62

4.2 Atividade proteolítica adaptada em meio sólido ..............................65
4.3 Atividade hemolítica direta ..............................................................68
4.4 Atividade Trombolítica ....................................................................70
4.5 Atividade Hemaglutinante................................................................71
4.6 Atividade coagulante e anticoagulante ............................................71
4.7 Teste de degradação do fibrinogênio.................................................73
4.8 Atividade de L-aminoácido oxidase.................................................74
4.9 Atividade sobre o BAPNA (atividade enzimática de
serinoproteases).................................................................................75
4.11 Inibição da Succinato Desidrogenase avaliada em
extrato de fígado de frango ..............................................................77
CAPÍTULO V................................................................................................80
5. Metodologias em toxinologia: Ensaios de citotoxicidade,
genotoxicidade e mutagênese....................................................................81
5.1 Teste de citotoxicidade......................................................................81
5.1.1 Teste de viabilidade celular......................................................82
5.1.2 Teste do micronúcleo em células humanas in vitro..................82
5.1.3 Teste do cometa em leucócitos humanos.................................87
5.1.4 Teste do Cometa em células vegetais.......................................90
5.1.5 Avaliação de efeitos de compostos naturais (peçonhas)
sobre o ciclo celular de células meristemáticas de
Lactuca sativa ou Allium cepa................................................91
5.1.6 Avaliação de fragmentação de DNA usando
eletroforese em gel de agarose (células
meristemáticas de Lactuca sativa ou Allium cepa).................94
5.1.7 Extração de DNA de leucócitos humanos................................97
5.1.8 Ensaio de Fragmentação de moléculas de DNA
obtidas de leucócitos humanos..............................................100
CAPÍTULO VI............................................................................................102
6. Metodologias em Toxinologia: Atividades in vivo..................................103
6.1 Indução de edema ...........................................................................103
6.2 Atividade hemorrágica ...................................................................104
6.3 Atividade miotóxica........................................................................105
6.4 Ensaios de inibição..........................................................................106
6.5 Teste do cometa em brânquias de peixes........................................107
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................108

PREFÁCIO
A construção desta obra teve como propósito apresentar uma

visão geral sobre as principais metodologias empregadas na
subárea toxinologia que está contida na grande área toxicologia. Embo-
ra a maioria das metodologias apresentadas tenha sido desenvolvida vi-
sando à obtenção e caracterização de toxinas de animais, pesquisadores
de diversas áreas têm feito uso destas técnicas para estudar diferentes
compostos, sejam eles de origem natural (animal, vegetal ou microorga-
nismo), química (resíduos industriais, agrotóxicos, fertilizantes, reagen-
tes laboratoriais, entre outros) ou sintética.
Os testes descritos possibilitam avaliar o efeito de diferentes com-
postos sobre moléculas e células in vitro e in vitro, enfatizando princi-
palmente a ação sobre a hemostasia (lise de eritrócitos, alterações na co-
agulação do plasma, lise de trombos sanguíneos e quebra de moléculas
de fibrinogênio ou outras proteínas de forma específica ou promíscua),
inibições enzimáticas (inibição de fosfolipases A2, envolvidas principal-
mente nos processos de coagulação sanguínea e resposta inflamatória;
inibição de proteases, relacionadas a processos de coagulação sanguí-
nea, fibrinólise, trombólise, entre outros) e atividades genotóxica/anti-
genotóxica (sobre material genético humano, animal e vegetal).
Em adição ao uso de metodologias, amplamente empregadas na
área de toxinologia, para avaliação de compostos de diversas naturezas,
também se destaca a ampla empregabilidade de peçonhas e toxinas de
animais como ferramentas laboratoriais, de indução de efeitos farmaco-
lógicos e tóxicos, empregáveis na caracterização de diferentes compos-
tos. Neste contexto, peçonhas e toxinas são indutoras de efeitos que se
pretende inibir com substâncias naturais, químicas ou sintéticas, assim

como são fontes enzimáticas para a avaliação de inibidores de enzimas,
destacando a relevância de seu uso pelo fato de que muitas classes de
moléculas presentes nas peçonhas já terem conhecidas suas estruturas e
mecanismos de ação.
As metodologias descritas neste livro têm sido desenvolvidas,
adaptadas e disseminadas entre discentes e docentes de diversos grupos
de pesquisa, deveras distribuídas em monografias, dissertações, teses,
trabalhos em eventos científicos e artigos, agora podem ser acessadas
em detalhes no presente trabalho.

BIO G RAFI A DOS ORG ANI ZADO RES
___________________
Silvana Marcussi: Bióloga, graduada em Licenciatura Plena pelo
Centro Universitário Barão de Mauá de Ribeirão Preto – SP; Mestre
em Biotecnologia pela Universidade de Ribeirão Preto – UNAERP,
SP; Doutora em Bioquímica pela Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto – USP e Pós-Doutora em Farmacologia, pela Faculdade de Ciên-
cias Farmacêuticas de Ribeirão Preto – USP. Atualmente é Professora
Adjunta IV/Pesquisadora da Universidade Federal de Lavras – UFLA,
Coordenadora Adjunta do Programa de Pós-Graduação em Agroquí-
mica, lotada no Departamento de Química e responsável pelo Labora-
tório de Bioquímica/Toxicologia (marcussi@dqi.ufla.br).
___________________
Marcus Vinicius Cardoso Trento: Biólogo, graduado em bacharelado
pela Universidade Federal de Lavras – UFLA – MG. Participou do pro-
grama Ciência Sem Fronteiras na University of The Fraser Valley em
Abbostsford, BC, Canadá. Mestre em Química e Bioquímica de Produ-
tos Naturais e Sintéticos pelo Programa de Pós-Graduação em Agroquí-
mica – PPGAQ, UFLA. Atualmente é Doutorando do mesmo Programa
(marcusvinicius.ct@gmail.com).
___________________
Pedro Henrique Sousa César: Biólogo, graduado pela Universidade
Federal de Lavras – UFLA – MG; Mestre em Química e Bioquímica
de Produtos Naturais e Sintéticos pelo Programa de Pós-Graduação em
Agroquímica – PPGAQ, UFLA. Atualmente é Doutorando do mesmo
Programa (pedrocesar.biologia@gmail.com).
___________________
Anderson Assaid Simão: Químico, graduado pela Universidade Fe-
deral de Lavras – UFLA (2007), Mestrado (2010), Doutorado (2013)
e Pós-doutorado (2014) em Agroquímica pela UFLA, com ênfase em
Bioquímica. Atualmente é professor Substituto de Bioquímica no De-
partamento de Química da UFLA (andersonbsbufla@yahoo.com.br).

C A P ÍTU L O I
I n tro d u ç ã o a Toxin ologia
Silvana Marcussi

1. Introdução a Toxinologia
E stima-se que ocorram cinco milhões de casos de acidentes ofí-

dicos em todo mundo, ocasionando 100 mil mortes por ano,
sendo o ofidismo, caracteristicamente acidental (AMBADE; BORKAR;
MESHRAM, 2012). No Brasil, em 2007, foram registrados aproxima-
damente 21 mil envenenamentos por animais peçonhentos, dos quais os
escorpiões contribuíram com valor próximo a seis mil casos seguidos
por outros animais como serpentes e aranhas. Conforme relatado no site
do SINITOX, o número de acidentes notificados com escorpiões dimi-
nuiu considerando os dados de 2006 (BRASIL, 2010). Entretanto, não
podemos afirmar que o número de acidentes diminuiu uma vez que, por
algum motivo não avaliado, as vítimas de envenenamentos por escorpi-
ões podem não estar procurando atendimento médico.
Embora os escorpiões sejam responsáveis por grande número de
acidentes notificados no Brasil, às serpentes se destacam pela gravidade
dos envenenamentos que ocasionam considerando casos de amputação
e óbito. Assim, acidentes causados por serpentes caracterizam signifi-
cativo problema de Saúde Pública, especialmente em países tropicais
como o Brasil, pela frequência com que ocorrem e pela mortalidade
que ocasionam (PINHO; PEREIRA, 2001). No ano de 2011 os casos
de acidentes notificados em todo o Brasil, foram de 30.686. Sendo que
as regiões com maior ocorrência foram Norte, Nordeste e Sudeste (esta
última com 7.493 casos notificados) (BRASIL, 2012a).
No Brasil, de 2000 a 2011, a ocorrência de acidentes ofídicos va-
riou de 11.757 a 30.836 casos, sendo a taxa de mortalidade 0,47% no
ano mais recente (BRASIL, 2012b). Contudo, estes dados epidemioló-
gicos representam apenas os acidentes notificados, ou seja, cujas vítimas
procuraram atendimento médico. Algumas regiões do país são de difícil
acesso retardando ou impossibilitando a chegada das vítimas aos postos
médicos. Nestas circunstâncias, muitas pessoas que sofrem acidentes
com animais peçonhentos procuram alternativas de tratamento na pró-
pria natureza, como a utilização de extratos, infusões e compressas utili-

zando diferentes plantas, além de fazerem uso da técnica de torniquete,
não havendo, dessa maneira, conhecimento exato sobre a frequência dos
casos de envenenamentos por parte das autoridades responsáveis.
De acordo com Barravieira (1991) existem mais de trezentas es-
pécies de serpentes peçonhentas catalogadas no mundo, classificadas
em cinco famílias principais: Boidae, Colubridae, Viperidae, Elapidae
e Hidrophidae. No Brasil, as serpentes peçonhentas pertencem a duas
famílias, Elapidae e Viperidae, representadas por quatro gêneros e seus
respectivos nomes populares: Bothrops (jararaca, jararacuçu, urutu, cai-
çaca e combóia), Crotalus (cascavel), Lachesis (surucucu) e Micrurus
(coral-verdadeira). A distribuição geográfica nos estados do Brasil de
serpentes da família Viperidae e Elapidae é mostrada nas Tabelas 1 e 2,
respectivamente.
Tabela 1. Distribuição geográfica de serpentes da família

Viperidae nos estados do Brasil
DISTRIBUIÇÃO
ESPÉCIE BIOMA(S)
GEOGRÁFICA
AM, PA, AC, RO, TO, AP, MA,
Bothrops atrox Amazônia
RR, MT
B. brazil PA, AM, RO, MT Amazônia
B. jararacussu MG, ES, RJ, RS, SP, SC, BA, MS Mata Atlântica
B. leucurus ES, BA, SE, AL, PE, PB, CE, RN Mata Atlântica
B. marajoensis PA, AM, RO,MT Mata Atlântica
TO, GO, DF, PA, PI, PR, SP, MA, Cerrado e
B. moojeni
BA, MT, MS Caatinga
B. muriciensis AL Mata Atlântica
B. pirajai BA Mata Atlântica
B. bilineatus AM, AC, RO, PA Amazônia
B. erythromelas BA, PE, CE Caatinga
Mata Atlântica e
B. fonsecai MG, ES, RJ, RS, SP, SC, BA, MS
Pampa

B. insularis SP Mata Atlântica
Mata Atlântica e
B. itapetiningae MG, SP, SC, MS, PR, SC
Pampa
Caatinga, Mata
RS, SC, PR, MS, GO, MT, MG,
B. neuwiedi Atlântica e
BA, TO, MA, PI, CE, AL
Amazônica
B. pauloensis MG, SP,GO, MS, MT Mata Atlântica
B. otavioi SP, ES Mata Atlântica
Mata Atlântica e
B. cotiara SP, PR, SC
Pampa
Mata Atlântica e
B. diporus MS, SP, PR, SC, RS
Pampa
Mata Atlântica e
B. lutzi MG, PI, BA, PE, GO
Caatinga
MT, MS, RO, AM, AP, PA, RR, Cerrado,
*Crotalus
SP, MG, DF, GO, TO, BA, MA, PI, Caatinga e áreas
durissus
CE, PE, PB, RN, AL, PR, SC, RS antropizadas
Adaptada de: Bernarde e Gomes (2012); The Reptile Database (2013).

*No Brasil a espécie Crotalus durissus abrange diferentes subespécies: Crotalus
durissus terrificus, Crotalus durissus ruruima, Crotalus durissus collilineatus e Cro-
talus durissus marajoensis.
Tabela 2. Distribuição geográfica de serpentes da família

Elapidae nos estados do Brasil
DISTRIBUIÇÃO
ESPÉCIE BIOMA(S)
GEOGRÁFICA
Micrurus
MT, RO, AM Amazônia
albicinctus
Mata Atlântica e
M. altirostris PR, RS, SC
Pampa
M. averyi PA, AM, RR Amazônica

M. brasiliensis GO, MG, BA Cerrado
Mata Atlântica e
M. corallinus BA, ES, RJ, SP, MS, PR, SC, RS
Pampa
Mata Atlântica e
M. decoratus SP, MG, RJ, PR
Pampa
M. filiformis PA, AM, MA, RO Amazônia
TO, MT, MS, GO, DF, BA, MG,
M. frontalis Cerrado e Pampa
SP, PR, SC, RS
M. hemprichi PA, RO, AM, MA, Amazônia
M. ibiboboca BA, SE, MA, PE, PI, AL, CE, PB Caatinga
M. langsdorffii AM Amazônia
GO, AM, AP, MA, RO, RR, MT, Cerrado,
M. lemniscatus
MS, TO, MG Amazônia
M. nattereri AM Amazônia
M. mipartitus AM, RR Amazônia
M. pacaraimae RR Amazônica
M. paraensis MT, PA Amazônica
M. psyches RR Amazônica
M. putumayensis AC Amazônica
M. pyrrhocryptus MT, MS Pantanal
M. silviae RS Pampa
M. spixii AM, PA, TO, MT, MA, RO, AC Amazônica
MT, TO, RO, AC, AM, RR, MA,
M. surinamensis Amazônica
PA, AP
M. tricolor MT, MS Pantanal
RJ, MG, BA, AC, AM, PA, RR, Amazônia e Mata
*Lachesis muta
RO, MT, CE, ES, PE, AL, AP, MA Atlântica
Adaptada de: Bernarde e Gomes (2012); The Reptile Database (2013).
*No Brasil, a espécie Lachesis muta abrange as subespécies Lachesis muta muta e
Lachesis muta rhombeata.

As serpentes mais importantes do ponto de vista da saúde pública,
no Brasil, são as Bothrops recentemente reclassificadas em cinco gêne-
ros - Bothrops, Bothropoides, Bothriopsis, Botrocophias e Rhinocero-
phis; Crotalus; Lachesise Micrurus (BRASIL, 2012c).
Entre os casos notificados em que o gênero da serpente foi identi-
ficado, no ano de 2011, espécies do gênero Bothrops foram responsáveis
por 85,3% dos casos, Crotalus por 10%, Lachesis por 3,87% e Micrurus
por 0,83%, sendo a maior taxa de letalidade pertencente aos envenena-
mentos crotálicos (1,87%) (BRASIL, 2012c).
As peçonhas de serpentes são as mais complexas de todas as pe-
çonhas animais até então estudadas, contendo 20 ou mais componentes
diferentes, sendo que mais de 90% do peso seco destas peçonhas cons-
tituem-se de proteínas, muitas das quais possuem atividade enzimática,
e a parte não proteica é composta por carboidratos, lipídeos, íons metá-
licos (que em sua maioria tem papel fundamental na atividade das en-
zimas atuando como cofatores), aminoácidos livres, nucleotídeos, entre
outros (VARANDA; GIANINNI, 1999).
O segundo lugar de destaque, dentre os animais peçonhentos mais
temidos pelo homem, é atribuído aos escorpiões, que em alguns estados
como Minas Gerais e Rio de Janeiro, são responsáveis não apenas por
um número significativo de acidentes, mas também por alguns casos de
letalidade, principalmente entre vítimas como crianças e adultos com
prévios problemas de saúde (ex: problemas cardiovasculares). A espécie
Tityus serrulatus é a maior responsável pelos acidentes ocorridos no
Brasil, uma vez que se trata de uma espécie totalmente adaptada a am-
bientes urbanos e de ampla distribuição geográfica no país devido a sua
rápida e fácil proliferação por partenogênese. As peçonhas destes ani-
mais são compostas principalmente por peptídeos de ação neurotóxica
destacada por seus efeitos sobre canais iônicos.
Embora pouco notificados, os acidentes com abelhas ocorrem em
número elevado em todo o mundo, superando os acidentes com os de-
mais animais peçonhentos e venenosos, podendo levar as vítimas a mor-
te caso o indivíduo seja hipersensível aos constituintes da peçonha ou
acometido por várias ferroadas simultâneas.

Menor importância se dá aos acidentes com anfíbios (sapos, rãs,
entre outros) cnidários (águas vivas, anêmonas, entre outros) outros
aracnídeos que não os escorpiões (aranhas), diversos insetos (vespas,
lagartas, formigas, entre outras), embora muitos destes requeiram assis-
tência médica com tratamento específico (soros) ou sintomático (anti-
bióticos, anestésicos, analgésicos, anti-inflamatórios, anti-alergênicos,
entre outros), visando não apenas minimizar os efeitos imediatos, mas
também as possíveis sequelas permanentes ou desenvolvimento de pro-
blemas de saúde tardios.

C A P ÍT U L O II
To x i n a s d e p e ç on h as d e
se r p e n t es
Silvana Marcussi

2. Toxinas de peçonhas de serpentes
A s proteínas de peçonhas podem apresentar atividades en-

zimáticas que determinam a toxicidade das peçonhas ou,
serem inativas enzimaticamente, porém indutoras de efeitos tóxicos e
farmacológicos relevantes. Os principais efeitos são: miotoxicidade,
hemorragia, coagulação sanguínea, indução ou inibição de agregação
plaquetária, neurotoxicidade, edema e citotoxicidade.
Toxinas animais de menor massa molecular, como peptídeos,
exercem efeitos diretos sobre a modulação de canais iônicos e recepto-
res. A despolarização e hiperpolarização de canais resultam em sintomas
que podem estar associados com mudanças hemodinâmicas (SITPRIJA,
2008).
Toxinas com atividade enzimática, especialmente proteases
(SVMP, Snake Venom MetalloProtease e SVSP, Snake Venom Serine
Protease) e fosfolipases A2 (PLA2) iniciam processos inflamatórios que
envolvem a geração de citocinas pró-inflamatórias e mediadores vasoa-
tivos, levando a alterações hemodinâmicas, renais e sistêmicas.
Algumas toxinas podem agir diretamente sobre eritrócitos, mió-
citos, fatores da cascata de coagulação sanguínea além de células epi-
teliais e do endotélio vascular. Essa desorganização fisiológica, causa-
da por toxinas de peçonhas, pode resultar em coagulação ou hemólise
intravascular, predisposição para contrair doenças e/ou destruição de
tecido muscular. As toxinas podem agir induzindo injúrias em quais-
quer estruturas renais através da diminuição do fluxo sanguíneo, coa-
gulação intravascular disseminada e toxicidade vascular (SITPRIJA,
2008).
As L-aminoácido oxidases (LAAOs) são flavoenzimas que catali-
sam a deaminação oxidativa de L-aminoácidos, produzindo um interme-
diário iminoácido, por meio da redução do cofator flavina. Este iminoá-
cido sofre hidrólise produzindo α-cetoácidos e amônia. A reoxidação do
cofator é promovida por oxigênio molecular, produzindo água oxigena-
da. Estas enzimas são classificadas como oxido-redutases, agem no gru-

po doador de elétrons (CH-NH2) e apresentam o oxigênio como aceptor
de elétrons. A geração de radicais resultante de sua atividade enzimática
têm sido correlacionada à algumas atividades biológicas desempenha-
das por estas enzimas, como por exemplo citotoxicidade, apoptose, ge-
notoxicidade e efeitos sobre a agregação de plaquetas (SOUZA et al.,
1999; DU; CLEMETSON, 2002; ZHANG et al., 2004; MARCUSSI et
al., 2011; 2013).
As Hialuronidases são enzimas que participam da degradação de
glicosaminoglicanas, componentes fundamentais da derme (KREIL,
1995) como o hialuronan (ácido hialurônico) e o sulfato de condroitina.
Estas enzimas são produzidas por bactérias, fungos, nematoides, san-
guessugas, bacteriófagos e outros vírus, tumores malignos, crustáceos,
lisossomas, esperma de mamíferos, venenos e peçonhas de diversas es-
pécies de animais (STERN; CSÓKA, 2000).
Vários órgãos humanos (testículo, olho, pele, baço, fígado, rins e
útero) e fluidos corporais (placenta, lágrima, sangue, esperma e urina)
(STERN; JEDRZEJAS, 2006) também são produtores de Hialuronida-
ses. Estas enzimas estão envolvidas em diversos processos biológicos,
como fagocitose, mitose, desenvolvimento e implantação de embriões,
adesão, migração, proliferação e diferenciação celular (TOOLE et al.,
1984; HAKANSSON; VENGE, 1985; KNUDSON; TOOLE, 1987).
Sua atuação em processos relativos à manutenção e integridade da ma-
triz extracelular, permite sua ampla aplicação médica (MENZEL; FARR,
1998), como por exemplo, para acelerar a difusão e absorção de fluidos
(PIRRELLO; CHEN; THOMAS, 2007), reduzir edemas (JOHNSSON
et al., 1999) e aumentar a eficiência de anestésicos (MARNTIDALE,
1982). Nas peçonhas de serpentes apresentam um papel fundamental na
dispersão de outras classes de toxinas no organismo da vítima.
O estudo das peçonhas ofídicas é de grande importância sobre
vários aspectos. A elucidação da fisiopatologia dos envenenamentos é
fundamental para o avanço na terapia dos acidentes ofídicos. Adicional-
mente, o estudo dessas peçonhas vem contribuindo para o conhecimento
de diversos processos fisiológicos e fisiopatológicos, destacando-se a
estrutura e a função dos receptores nicotínicos, a cascata de coagula-

ção sanguínea, a fibrinólise, o processo inflamatório e a vasoconstricção
(FRANÇA; MÁLAQUE, 2003).
Segundo França e Málaque (2003), alterações na homeostasia são
frequentemente observadas em acidentes ofídicos e resultam principal-
mente da ação de três tipos de enzimas, que estão presentes também, na
peçonha botrópica, são elas: enzimas coagulantes ou anticoagulantes,
fatores hemorrágicos e PLA2s.
Pesquisas em busca de novos fármacos cresceram substancial-
mente nos últimos anos, principalmente com substâncias bioativas ex-
traídas de plantas e animais. Estima-se que 60% das drogas antitumorais
e antibióticas que se encontram no mercado, ou estão em estudo na fase
clínica, são de origem natural (SANT’ANA, 2005). As toxinas animais
ganharam seu espaço no mercado farmacêutico, assim como as molécu-
las vegetais (SOARES et al., 2004).
A utilização de proteínas isoladas de peçonhas animais, assim
como proteínas recombinantes ou peptídeos sintéticos, está se tornando
cada vez mais frequente entre os grupos de pesquisas e as indústrias
de biotecnologia. Os compostos biologicamente ativos da peçonha de
serpentes, cujos efeitos tóxicos são relevantes no âmbito de saúde públi-
ca, têm sido amplamente estudados em busca de estruturas moleculares
com função de receptores neuromusculares, contribuindo para a com-
preensão do sistema imunológico (STOCKER, 1990).
Proteínas de peçonhas são ferramentas para investigar os meca-
nismos de coagulação do sangue, além de seu uso como modelos mole-
culares para o desenvolvimento de agentes terapêuticos de grande valia
no tratamento do envenenamento e de algumas patologias (TRENTO et
al., 2001). Doenças neurodegenerativas são passíveis de serem controla-
das com o uso de terapias adequadas, entretanto pesquisadores buscam
novas terapias mais efetivas no controle de patologias como Artrites,
Alzheimer, Parkinson, Epilepsias e Reumatismo ou até mesmo para a
cura total dessas. Nesse contexto, moléculas de origem naturais são fun-
damentais em estudos que levem a melhor compreensão do desenvolvi-
mento de algumas doenças assim como à elaboração de medicamentos
mais efetivos.

Toxinas de artrópodes e serpentes são fortes candidatas a indu-
zirem efeitos genotóxicos e/ou mutagênicos uma vez que diversos sin-
tomas imediatos, observados durante os envenenamentos, e sequelas
tardias são resultantes da ação sobre diversos tipos celulares, podendo
interferir na migração, crescimento, multiplicação e comunicação ce-
lulares. Inúmeros trabalhos descrevem atividades como citotoxicidade,
indução de apoptose e outros eventos que podem ser parcialmente ex-
plicados pela ligação de toxinas a receptores presentes na superfície de
vários tipos celulares.
Adicionalmente, o aparecimento de artrites, problemas renais e
hepáticos ou doenças neurodegenerativas, desenvolvidas precocemen-
te, em vítimas de envenenamento por animais peçonhentos, podem ser
evidências de um acúmulo de danos no organismo ou em órgãos especí-
ficos causados pelas toxinas.
Os danos no DNA celular podem ser permanentes, sendo trans-
mitidos às gerações celulares seguintes e caracterizando, dessa forma,
mutações. Podemos ainda sugerir que estas mutações, após inúmeras
gerações, resultariam em mau funcionamento de órgãos ou até mesmo
a morte. Entretanto, o potencial genotóxico e/ou mutagênico de toxinas
animais também podem ser explorados em benefício do homem, visto
que diversas destas moléculas apresentam potencial anticâncer, mos-
trando-se promissoras para o desenvolvimento de novas drogas antitu-
morais.
Considerando os inúmeros trabalhos que descrevem o potencial te-
rapêutico de toxinas de peçonhas animais sobre diferentes doenças (PAL
et al., 2002; McLANE; JOERGER; MAHMOUD, 2008; SANT’ANA
et al., 2005) é possível afirmar a existência de toxicidade das mesmas
sobre processos celulares relacionados às doenças, uma vez que com-
postos ativos podem ser letais ou levar a cura dependendo da forma de
administração e da dose utilizada.
Estudos químicos, bioquímicos, farmacológicos, fisiológicos e to-
xicológicos de determinados compostos como, proteínas e peptídeos,
estão sendo realizados de forma cada vez mais minuciosa, com o obje-
tivo de encontrar nas peçonhas animais, moléculas com ação benéfica

ao homem para a utilização clínico/científica (SANT’ANA, 2005). Um
exemplo de medicamento que hoje já é comercializado, que surgiu a
partir de uma toxina modelo (Bothrops jararaca), é o captopril (RO-
CHA et al., 1949), utilizado no tratamento da hipertensão arterial, insu-
ficiência cardíaca congestiva e doença arterial coronária (FERREIRA,
2000). Outros exemplos são mostrados na Tabela 3.
Tabela 3. Exemplos de medicamentos sintetizados a partir

de toxinas animais
FONTE
FÁRMACO USO TERAPÊUTICO
(ANIMAL)
Anticoagulante/ antiplaquetário da Sistrurus
Eptifibatide
classe dos inibidores da glicoproteína miliarius
(Integrilin)
IIb/IIIa (eventos trombóticos) barbouri
Echistatin Anticoagulante (eventos trombóticos) Echis carinatus
Ranatensin Antihipertensivo Rana
Antihipertensivo (inibidor da ECA- Bothrops
Captopril
enzima conversora de angiotensina) jararaca
Heloderma
Exenatida Diabetes Melitus
suspectus
Ancrod (Arwin® Anticoagulante para AVC isquêmico Calloselasma
ou Viprinex®) agudo (eventos trombóticos) rhodostoma
Ziconotida Analgésico (tratamento de dor
Conus magnus
(Prianlt®) crônica)
Anticoagulante (tratamento de infarto
Batroxobin Bothrops
cerebral agudo, angina pectoris e
(Defibrase®) moojeni
surdez repentina)
Anticoagulante (aplicação em Agkistrodon
Fibrolase síndrome coronariana e oclusão contortrix
periferal aguda) contortrix
Adaptada de: Mello (2011).

2.1 Metaloproteases
As enzimas proteolíticas presentes nas peçonhas de serpentes

podem atuar numa grande variedade de substratos naturais, tais como:
hemoglobina, colágeno, fibronectina, fibrina, elastina, fibrinogênio, in-
sulina e glucagon (MAZZI et al., 2004).
Enzimas coagulantes são proteínas que ativam, de modo isola-
do ou simultâneo, o fator X da cascata de coagulação e a protrombina.
Essas proteínas possuem ação semelhante à trombina, convertendo o fi-
brinogênio em fibrina. Essas ações produzem distúrbios da coagulação,
que se caracterizam pelo consumo de seus fatores, geração de produtos
de degradação de fibrina e fibrinogênio, o que pode causar incoagulabi-
lidade sanguínea (GANS, 1978).
Fatores hemorrágicos, também chamados de hemorraginas, são
enzimas encontradas nas peçonhas de serpentes que provocam lesões na
membrana basal dos capilares, associadas à plaquetopenia (diminuição
das plaquetas) e alterações na coagulação sanguínea (GANS, 1978).
As metaloproteases (MPs) de peçonhas de serpents (SVMP –
Snake Venom MetalloProtease) compreendem enzimas dependentes de
zinco com massa molecular variável. São altamente tóxicas na sua maio-
ria, apresentam atividade fibrinogenolítica e são as principais responsá-
veis pelo efeito hemorrágico observado após o envenenamento, induzi-
do pelas serpentes Viperidae (KAMIGUTI; ZUZEL; THEAKSTON,
1998), embora algumas SVMPs tenham se mostrado não hemorrágicas.
Adicionalmente estas moléculas geralmente induzem mionecrose, da-
nos na pele e reação inflamatória (GUTIÉRREZ; RUCAVADO, 2000;
TEIXEIRA et al., 2005).
As MPs de peçonhas de serpentes podem ser classificadas a partir
de critérios como massa molecular, domínio estrutural e intensidade he-
morrágica (CINTRA et al., 2012). Podendo ser separadas em 4 grupos:
P-I que apresenta apenas um domínio metaloprotease, P-II que apresen-
ta domínio metaloprotease e desintegrina, P-III possui domínio metalo-
protease, desintegrina e outro rico em cisteína (Figura 1).

Figura 1. Classes de metaloproteases e os produtos provenientes do
processamento proteico. Os pontos de interrogação na figura indicam
que o produto processado não foi identificado na peçonha.
Fonte: elaborada por Pedro H. S. Cesar, adaptada de Fox (2009).
SVMP do tipo P-I já foram descritas com diversas atividades,

dentre elas, hemorrágica, fibrinolítica, inflamatória, mionecrótica, pro-
teolítica e apoptótica. As do tipo PII já tiveram algumas propriedades
estudadas como: atividades hemorrágica, proteolítica e de inibição da
agregação plaquetária. Algumas P-III já foram descritas como hemor-
rágicas, apoptóticas, inibidoras de agregação plaquetária, ativadoras de
fagocitose por macrófagos, da protrombina e do fator X da coagulação.
As P-IIId apresentaram característica de ativar o fator X atuante na coa-
gulação sanguínea (FOX; SERRANO, 2005).

Essas toxinas podem interagir com diferentes fatores da cascata
de coagulação (MATSUI; FUJIMURA; TITANI, 2000). O efeito sobre
os componentes da coagulação, tais como o fibrinogênio, fator de Von
Willebrand, fibrina e/ou plaquetas, tem sido um dos mais prováveis me-
canismos de ação propostos para as MPs (BRAUD; BOM; WISNER,
2000; MATSUI; FUJIMURA; TITANI, 2000; MATSUI; HAMAKO,
2005; SWENSON; MARKLAND, 2005). As MPs com atividade fibri-
nogenolítica são aplicáveis no tratamento de tromboses, pois diminuem
o nível plasmático do fibrinogênio ou solubilizam os coágulos de fibrina,
processo conhecido como trombólise (MATSUI et al., 2000; MATSUI;
HAMAKO, 2005). Diversas enzimas têm sido isoladas de peçonhas bo-
trópicas e crotálicas e caracterizadas com o objetivo de desenvolver futu-
ros fármacos, algumas destas moléculas estão apresentadas na Tabela 4.
Tabela 4. Enzimas relacionadas às alterações hemostáticas, isoladas de

espécies dos gêneros Bothrops e Crotalus
FRAÇÃO
ESPÉCIE EFEITO
REPRESENTATIVA
Bothrops Ativação dos fatores I, II, V, VII e X Batroxobina b,
jararaca a
; trombomodulina dependenteb Botrojararacina a
Ativação dos fatores V, VIII e XIII a; Trombocitina a,
B. atrox trombomodulina dependenteb, Batroxobina b,
ativação do fator Von Willebrand d Botrocetina b,d
Crotalus Enzima com atividade
Crotalase
adamanteus trombina-likea
Protease II e III e
C. atrox Digestão da cadeia beta e gamac
Atrolysin c
C. durissus
Proteólised Crotalocitina d
terrificus
C. horridus Ativação de fosfolipases A2
Convulxina d
horridus endógenasd
(a) ação pró-coagulante, (b) ação anticoagulante, (c) ação fibrinogenolítica, (d) estí-
mulo de agregação plaquetária.
Fonte: Castro (2006).

O quadro fisiopatológico observado após envenenamento por
serpentes das subfamílias Crotalinae e Viperinae se caracteriza por um
complexo efeito hemorrágico (GUTIÉRREZ, 1995; WARREL, 1996).
As hemorragias locais, muito comuns em envenenamentos por serpen-
tes botrópicas, são consequências de lesões nas paredes dos pequenos
vasos sanguíneos (OWNBY et al., 1990). Acredita-se que ocorra pro-
teólise de componentes da lâmina basal da microvasculatura induzida
pelas metaloproteases (BJARNASON; HAMILTON; FOX, 1988). Essa
ação leva à perda da integridade capilar com resultante hemorragia no
local da picada. Gutiérrez et al. (2005) relataram possíveis mecanismos
de ação de SVMPs hemorrágicas durante a danificação de microvascu-
latura, como hidrólise de proteínas de membrana em células endoteliais,
assim como integrinas e caderinas, envolvidas na matriz celular e no
processo de adesão célula-célula.
As SVMPs são enzimas que apresentam uma ampla variedade de
atividades farmacológicas. Dentre estas proteínas, podemos citar a jer-
donatina, uma desintegrina inibidora de agregação plaquetária e a jer-
dohagina, proteolítica sobre protrombina, ambas isoladas da peçonha de
Trimeresurus jerdonii (ZHOU et al., 2004; CHEN et al., 2003; 2004),
uma metaloprotease indutora de apoptose de Gloydius halys (YOU et
al., 2003); a basparina A, ativadora de protrombina, inibidora de agre-
gação plaquetária e indutora de defibrinação de trombos, isolada de B.
asper (LORIA et al., 2003); e a jerdonatina de T. jerdonii, inibidora de
agregação plaquetária (ZHOU et al., 2004).
O isolamento e a caracterização funcional e estrutural da Bjus-
suMP-I, uma metaloprotease hemorrágica de alto peso molecular, com
atividade antibacteriana da peçonha de B. jararacussu foi descrito por
Mazzi et al. (2004), assim como o isolamento da BjussuMP-II, de mes-
ma peçonha, com efeito antitumoral sobre linhagens humanas e murinas
(MARCUSSI et al., 2007), destacando a existência de várias isoformas
destas moléculas nas peçonhas obtidas de uma mesma espécie de ser-
pente, assim como estas também podem ser encontradas em peçonhas
de serpentes pertencentes a diferentes espécies.

Dentre as possíveis utilizações farmacêuticas das MPs estão o tra-
tamento de doenças autoimunes, Alzheimer, infecção por vírus e bacté-
rias, osteoporose, asma, trombose e câncer. Podendo ainda ser aplicadas
como soluções clinicas na prevenção de formação de coágulo sanguíneo
(metaloproteases não hemorrágicas) e também no diagnóstico e inves-
tigação da formação de coágulos. Além das aplicações clínicas, essas
enzimas podem ser utilizadas como ferramentas bioquímicas em estu-
dos moleculares principalmente devido à clivagem específica da ligação
peptídica e resultando na formação de intermediários (RAMOS; SELIS-
TRE-de-ARAÚJO, 2006).
2.2 Desintegrinas
A investigação de peçonhas de serpentes em torno do mundo tem

seu foco direcionado para dois principais objetivos: melhorar os anti-
-venenos existentes e descobrir novos componentes que podem ter apli-
cação na farmacologia de varias doenças. Neste sentido, destacam-se
as desintegrinas que não são alvo da produção de algum anti-veneno,
mas na pesquisa farmacêutica de novos componentes (WALSH; MAR-
CINKIEWICZ, 2011). Poucas proteínas isoladas de peçonhas de ser-
pentes tem se mostrado mais versáteis funcional e estruturalmente do
que as desintegrinas.
A descoberta de desintegrinas de origem natural tem inspirado
pesquisas sobre a interação destas com integrinas, levando a descoberta
de potencias agentes terapêuticos para doenças como trombose arterial,
a angiogênese, metástase tumoral, inflamação, além de outras que se re-
lacionam com integrinas (CALVETE, 2013). Nas peçonhas de serpentes
as desintegrinas atuam inibindo integrinas que atuam como receptores
celulares de superfície, a primeira integrina descoberta data de 1987. E
desde então, a pesquisa com desintegrinas avançou, atualmente, cen-
tenas de desintegrinas foram identificadas e agrupadas de acordo com
suas estruturas e função.
Em termos de estrutura, as desintegrinas são subdividas em mo-
noméricas e diméricas, sendo que o primeiro grupo é subdivido em 3

classes, de acordo com o grau de cisteínas na cadeia polipeptídica. Já as
diméricas são subdividas em homodímeros e heterodímeros. Em se tra-
tando das funções apresentadas, as desintegrinas são divididas conforme
a capacidade em interagir com determinadas integrinas. Três classes têm
sido encontradas, dentre elas, RGD, MLD e R/KTS, cada classe é iden-
tificada a partir do seu motivo. Onde cada um destes motivos representa
uma sequência de aminoácidos, a saber: resíduos de arginina, glicina
e aspartato (RGD), resíduos dos aminoácidos metionina, leucina e as-
partato (MLD) e resíduos de aminoácidos lisina ou arginina, treonina e
serina (R/KTS) (WALSH; MARCINKIEWICZ, 2011). Alguns autores
relatam que as desintegrinas se originam de processamentos pré ou pós
traducionais de MPs, moléculas muito maiores que podem apresentar
em sua estrutura um domínio desintegrina (CALVETE et al., 2013).
2.2.1 Desintegrinas-RGD
A família das desintegrinas RGD, que inibe as funções fisiológicas

de integrinas RGD-dependentes, é o grupo mais numeroso e investiga-
do. As integrinas RGD-reativas são: integrinas αv (receptores de vitro-
nectinas), αIIbβ3 (receptores de fibrinogênio) e a α5β1 (receptores de
fibronectina). Desta forma, algumas desintegrinas RGD apresentam in-
teressantes bioatividades do ponto de vista médico-científico. A maioria
das desintegrinas, pertecem estruturalmente, às moléculas monoméri-
cas, embora o motivo RGD esteja presente em subunidades de molécu-
las diméricas. As homodiméricas expressam um sítio ativo com motivo
RGD, às desintegrinas heterodiméricas também o apresentam, porém
se observa outro motivo que participa da inibição de outras integrinas
(WALSH; MARCINKIEWICZ, 2011).
2.2.2 Desintegrinas-MLD
Outros tipos de desintegrinas também estão presentes nas peço-

nhas de serpentes, que não aquelas antagonistas de integrinas RGD-de-

pendentes. Dentre estas as que inibem integrinas de leucócitos como
α4β1, α4β7 e α9β1, são as maiores famílias. Membros desta família
apresentam um tripeptídeo MLD, na posição onde, em outras desinte-
grinas, está o motivo RGD.
A atividade no motivo MLD para interagir com integrinas α4β1 e
α4β7 foi primeiramente caracterizada com a desintegrina heterodímeri-
ca EC3. De maneira geral, a associação entre a atividade anti-integrinas
α4 e a subunidade MLD expressa, foi revelada em um ensaio de ade-
são celular, com subunidades separadas contendo cisteínas bloqueadas.
As desintegrinas contendo motivos MLD, são menos variadas que as
que possuem motivo RGD. No entanto, algumas já foram identificadas,
como a desintegrina heterodímerica presente na peçonha da serpente
Echis ocellatus, EO5 e semelhante a EC3. A EO5 apresentou um motivo
MLD em sua estrutura. A desintegrina Bitisgabonin-2, encontrada na ví-
bora Bitis gabonica expressou uma subunidade A com sequencia MLD e
outra B, com sequencia RGD. A presença de um grupo RGD, aumentou,
também, a atividade da desintegrina para integrinas RGD-dependentes
(WALSH; MARCINKIEWICZ, 2011).
2.2.3 Desintegrinas R/KTS
As desintegrinas que apresentam motivo R/KTS apresentam alta

seletividade para integrinas α1β1, esta especificidade não é observada
nas desintegrinas RGD e MLD. Integrinas α1β1 pertencem ao grupo dos
receptores de colágeno que são também chamadas de integrinas con-
tendo domínio-I, este domínio está presente na subunidade α, incluindo
200 resíduos de aminoácidos e localizado na parte amino terminal desta
subunidade, sendo este altamente conservado.
As integrinas α1β1 são ligantes mais fisiologicamente específicos
para colágeno do tipo IV, apesar de reconhecer outros tipos incluindo
os XIII e I, esta seletividade é interessante quando considerado outro
receptor de colágeno, o α2β1, que é mais específico para colágeno tipo
I. A presença de receptores de colágeno é observada em processos de

neovascularização e doenças autoimunes (aumento de receptores de co-
lágeno em células imunitárias ativadas). Desintegrinas KTS, que inibem
integrinas α1β1 dependentes são interessantes no desenvolvimentos de
novas drogas antiasmáticas, por inibir a adesão de eosinófilos para colá-
geno IV (WALSH; MARCINKIEWICZ, 2011).
2.3 Serinoproteases
As serinoproteases são muito abundantes nas peçonhas de ser-

pentes principalmente da família Viperidae, onde constituem apro-
ximadamente 20% do total de proteínas contidas na peçonha. Estas
enzimas apresentam diversas funções e podem estar envolvidas na
digestão, ativação do sistema complemento, diferenciação celular e
hemostasia. As serinoproteases sozinhas não são letais, mas contri-
buem para o efeito tóxico quando associadas com outras proteínas da
peçonha. Estas enzimas afetam muitos passos da cascata de coagula-
ção, muitas vezes não especificamente através da degradação proteolí-
tica, mas seletivamente através da ativação ou inativação de fatores de
coagulação envolvidos também na agregação plaquetária e fibrinólise
(BRAUD et al., 2000).
Existem vários tipos de serinoproteases, entre elas as calicreína-
-símile, que tem ação hipotensora liberando bradicinina, e a trombina-
-símile, responsável pela formação do coágulo de fibrina no final da
cascata de coagulação sanguínea.
O interesse médico-científico nas enzimas trombina-símile tem
crescido consideravelmente devido a diferenças específicas quando
comparadas à própria trombina, que é uma enzima multifuncional. Es-
tas serinoproteases são promissoras na clínica médica como agentes
defibrinogenantes, como por exemplo, as enzimas Ancrod (Arwin®),
isolada da peçonha de A. rodhostoma, e a Batroxobina (Defibrase®), da
peçonha de B. atrox, que são utilizadas em pacientes vítimas de trombo-
se, infarto do miocárdio, doenças vasculares periféricas, isquemia aguda
e rejeição de transplante renal (BECKER, 1988; MEIER, 1988).

2.4 Fosfolipases
O grupo das enzimas fosfolipases é heterogêneo e tem a capaci-

dade de hidrolizar uma ou mais ligações éster em glicerofosfolipídios.
Representam as enzimas lipolíticas, fosfodiesterases e acil hidrolíticas.
As fosfolipases apesar de terem por alvo substratos fosfolipídicos, es-
tas variam conforme o sítio de ligação no fosfolipídio, modo de ação e
regulação. Dependendo do sítio de ação nos substratos, as enzimas são
classificadas pelas letras A, B, C e D.
A fosfolipase B catalisa 3 diferentes atividades enzimáticas: sn-1 e
sn-2 hidrolase de ésteres de ácido graxo, lisofosfolipase e transacilase. A
atividade da enzima hidrolase permite quebrar ácidos graxos de ambos
os fosfolipidios e lisofosfolipidios. Já a atividade da transacilase permite
produzir fosfolipídios por transferência de um ácido graxo a um lisofos-
folipidio (RAMRAKHIANI; CHAND, 2011).
As fosfolipases C são fosfodiesterases definidas como capazes de
quebrar ligações glicerofosfato. Podem ser classificadas de acordo com
a especificidade do substrato. Quebram a primeira ligação fosfodiés-
ter do substrato e podem ser encontradas em organismos procariontes
(RAMRAKHIANI; CHAND, 2011).
A segunda ligação fosfosdiéster de um substrato fosfolipídico é
quebrada pela fosfolipase D, capaz de hidrolisar o fosfolipídio esfin-
gomielina em ceramida-1-fofato e colina, sendo chamada também de
esfingomielinase D (KURPIEWSK et al., 1981; MEETEREN et al.,
2004). No entanto, o termo Fosfolipase D é mais adequado, dada sua ca-
pacidade de hidrolisar lisoglicerofosfolipidios como a lisofosfatidilco-
lina em ácido lisofosfatídico e colina, sendo um termo mais abrangente
(LEE; LYNCH, 2004).
Além das tentativas de se compreender o mecanismo de ação des-
tas toxinas animais, a busca de formas alternativas para o tratamento
do envenenamento ofídico tornou-se alvo frequente e importante de di-
versos pesquisadores. As diferentes isoformas de toxinas de peçonhas
podem ser reconhecidas e inibidas por anticorpos policlonais e/ou mo-

noclonais, e moléculas de diversas naturezas, incluindo agentes quelan-
tes, heparina, fatores plasmáticos de origem animal e extratos de plantas
(MELO; OWNBY, 1999; MORS et al., 2000; BORGES et al., 2000;
2001; TRENTO et al., 2001).
2.4.1 Fosfolipases A2
As PLAs compreendem uma família deiversificada de ezimas li-

políticas utilizadas para remover ácidos graxos de fosfolípidos para ge-
rar lisofosfolipidios. Uma PLA1 hidrolisa a ligação éster de um ácido
graxos na posição sn-1 de glicerofosfolipidios, enquanto que fosfoli-
pases A2 hidrolizam a ligação éster de ácidos graxos na posição sn-2
(Figura 2) (RAMRAKHIANI; CHAND, 2011).
As PLA2s (E.C.3.1.1.4) são amplamente distribuídas na nature-
za, podendo ser encontradas em tecidos de mamíferos, venenos de ar-
trópodes e répteis (SOARES; GIGLIO, 2003; SOARES et al., 2004).
Estas enzimas catalisam especificamente a hidrólise de fosfolipídeos na
ligação éster do carbono 2, liberando lisofosfolipídeos e ácidos graxos,
em uma reação dependente de cálcio (ARNI; WARD, 1996; KUDO;
MURAKAMI, 2002). Um dos ácidos graxos que podem ser liberados
é o ácido araquidônico, que é um precursor de lipídios bioativos tais
como prostaglandinas, leucotrienos e tromboxanos, havendo também
evidências da atuação destas enzimas na resposta imunológica, inflama-
ção, proliferação celular e vasoconstricção (CHANG et al., 1977; BO-
MALASKI; CLARK, 1993; MUKHERJEE et al., 1994; HANADA
et al., 1995).

Figura 2. (A) Locais de ação catalítica de fosfolipases na estrutura de
um fosfolipídio; (B) Quebra de um fosfolipídio pela ação enzimática
de fosfolipases.
Fonte: elaborada por Pedro H. S. Cesar, adaptada de Darios (2007).

Independentemente da sua função catalítica primária, as PLA2s
de venenos de serpentes podem induzir diversos efeitos farmacológicos
adicionais como neurotoxicidade pré e/ou pós-sináptica, cardiotoxici-
dade, miotoxicidade, iniciação e/ou inibição de agregação plaquetária,
edema, hemólise, anticoagulação, convulsão e hipotensão (OWNBY,
1998; OWNBY et al., 1999; BALSINDE et al., 1999). As PLA2s re-
presentam uma classe de enzimas versáteis, considerando sua função,
localização, regulação, mecanismo de ação, sequência, estrutura e papel
dos íons metálicos divalentes.
As PLA2s são classificadas (Tabela 5) em quinze famílias que po-
dem ser divididas em cinco categorias: enzimas fosfolipases secretadas
de baixo peso molecular, fosfolipases citosólicas dependentes de cál-
cio, fosfolipases independentes de cálcio, as PFA (fator de agregação
plaquetária) acetil-hidrolases e PLA2s lisossômicas (BURKE; DENNIS
2009).
Tabela 5. Classificação das PLA2, fonte produtora e

principais atividades
Tipo de Mr Tipos de células e Atividade Biológica/

PLA2 (KDa) Distribuição Patologia
Digestão de lipídios,
sPLA2 Pulmão, baço, rim,
14 proliferação e
GIB pâncreas, próstata e ovário
migração celular
Macrófagos, neutrófilos, Artrite reumatoide,
sPLA2
14 pulmão, medula óssea, choque séptico,
GIIA
células de Schwann doença de Crohn’s
sPLA2
Testículos, baço, placenta,
GIIC, D, 14 -17 Anti-bacteriana
timo, músculo esquelético
EeF
Rim, placenta, coração,
sPLA2
55 leucócitos e músculo Anti-viral, inflamação
GIII
esquelético

Artrite, doença
de Alzheimer,
cPLA2 Macrófagos, neutrófilos,
85 inflamação das vias
GIVA (α) células endoteliais
aéreas, degeneração
periférica de nervos
Baço, timo, próstata,
cPLA2
114 testículo, intestino, coração Desconhecido
GIVB (β)
cérebro, pâncreas
cPLA2 Coração, músculo Polarização de
61
GIVC (γ) esquelético macrófagos
cPLA2
GIVD 85 Pele, próstata, cerviz uterino Psoríase
(δ)
Coração, músculo
cPLA2
100 esquelético, tireoide e Desconhecido
GIVE (ε)
testículo
cPLA2 Tireoide, testículo, intestino, Produção de
85
GIVF (ζ) próstata eicosanóides
Anti-viral, Anti-
bacteriana,
sPLA2 Pulmão, placenta, coração, fagocitose, geração
14
GV macrófagos, mastócitos de eicosanoides e
liberação de ácido
aracdônico
iPLA2 Pulmão, coração, leucócitos, Inflamação, apoptose
84-90
GVIA(α) cérebro, plaquetas, pâncreas e crescimento celular
Funcionamento
Coração, cérebro, músculo
de canais iônicos
iPLA2 esquelético, rim, pâncreas,
88 mitocondriais;
GVIB (β) pulmão, próstata, testículo,
polarização de
ovário, placenta
macrófagos
Coração, cérebro, músculo
iPLA2 Remodelação de
63 -77 esquelético, placenta,
GVIC (γ) glicerofosfolipídeo
pulmão, rim, pancreas

Plaquetas, eritrócitos,
sPLA2
45 cérebro, plasma, macró- Aterogênico
GVII
fagos, células T, mastócitos
Baço, timo, próstata, Anti-viral, anti-
sPLA2 testículo, intestino, bacteriana, liberação
14
GX estomago, pâncreas, de ácido aracdônico,
macrófago, pulmão fagocitose
sPLA2 Coração, rim, músculo
20 Anti-bacteriana
GXIIA esquelético, pâncreas
sPLA2 Coração, rim, músculo
20 Desconhecida
GXIIB esquelético, fígado
sPLA2: fosfolipase secretada, cPLA2: fosfolipase citossólica, iPLA2 : fosfolipase

independente de cálcio.
Fonte: David et al. (2012).
As enzimas fosfolipases secretadas estão presentes na peçonha de

serpentes e são enzimas dependentes do íon cálcio e do resíduo de ami-
noácido histidina, na posição 48, no sítio ativo da enzima para poderem
atuar, apresentam baixo peso molecular, seis pontes de dissulfeto con-
servadas e apresentam diferentes comportamentos quando administra-
das em outros organismos.
As PLA2s presentes no citosol têm um maior peso molecular (61 a
114 kDa) e são dependentes do íon cálcio, apresentam também bastante
seletividade quanto a seu substrato atacando principalmente ácidos gra-
xos. As fosfolipases independentes de cálcio apresentam dentro do sítio
catalítico o resíduo de aminoácido serina, na posição 48. PFA acetil-hi-
drolases, hidrolisam o grupamento acetil na posição sn-2 sobre o fator
de agregação plaquetária (PFA), também são enzimas independentes de
cálcio e que apresentam serina no sítio ativo da enzima. As PLA2s li-
sossômicas têm como substrato o grupamento acetil na posição sn-2 do
fosfolipídio sendo que essas enzimas mantém a tríade como base con-
servada Ser-His-Asp e quatro resíduos de cisteína necessários para sua
função (BURKE; DENNIS, 2009).

As PLA2s miotóxicas isoladas de serpentes do gênero Bothrops,
pertencentes ao grupo II, podem ser subdivididas, em pelo menos, duas
subclasses: (1) as miotoxinas Asp49 que apresentam atividade catalítica
moderada a alta, e (2) as miotoxinas Lys49 com muito baixa ou ne-
nhuma atividade hidrolítica sobre substratos artificiais (OWNBY et al.,
1999). Um grande número destas isoformas miotóxicas de caráter bási-
co foram isoladas de peçonhas botrópicas, no entanto, poucas estruturas
e mecanismos de ação de PLA2s ácidas, que podem afetar a agregação
plaquetária e causar hipotensão arterial, são conhecidos.
Contrário à maioria das peçonhas de serpentes da família Viperi-
dae, os quais induzem alterações cardiovasculares e destruição tecidual
local, o veneno de serpentes do gênero Crotalus possui uma ação fun-
damentalmente neurotóxica e miotóxica, ocasionando frenquentemen-
te quadros clínicos severos. Os principais componentes da peçonha de
cascavel são a crotoxina e a crotamina. A primeira toxina trata-se de um
complexo biomolecular formado por uma PLA2 básica e uma proteína
não tóxica, a crotapotina ou subunidade ácida.
2.5 L-aminoácido oxidases
As L-aminoácido oxidases (LAAO, EC 1.4.3.2) são flavoenzimas

que catalisam a deaminação oxidativa estereoespecífica de um substrato
L-aminoácido para o correspondente a-cetoácido com a produção de
peróxido de hidrogênio e amônia, através da redução de FAD, com o
intermédio de um aminoácido (DU; CLEMETSON, 2002). Sugere-se
que o peróxido de hidrogênio liberado contribua grandemente com os
efeitos tóxicos induzidos por LAAOs.
Venenos de serpentes também apresentam efeito letal sobre
Leishmania spp. (STABELLI et al., 2006; TOYAMA et al., 2006), vi-
rus do HIV (ZHANG et al., 2003) e Plasmodium falciparum (ZIELER
et al., 2001). Estudos demonstraram que venenos de serpentes do gê-
nero Bothrops, encontradas na América do Sul, inibem o crescimento
de Leishmania major, além de induzir apoptose em Trypanosoma cruzi

(DEOLINDO et al., 2005). Nos últimos anos, as LAAOs, representan-
tes da classe de oxidoredutases, têm se tornado objeto de estudos em
imunologia, biologia estrutural e farmacologia.
Os diferentes mecanismos envolvidos na intoxicação resultam
também dos efeitos indiretos de algumas toxinas sobre os sistemas bio-
lógicos. As LAAOs possuem mecanismos complexos e pouco conheci-
dos. Porém, biologicamente, esse grupo de toxinas induz citotoxicidade,
em parte devido ao aumento na produção de peróxido de hidrogênio. Os
estudos farmacológicos descrevem efeitos sobre processos apoptóticos,
citotoxicidade, agregação plaquetária, hemorragia, hemólise e edema
(DU; CLEMETSON, 2002).
2.6 Lectinas do tipo-C
Lectinas do tipo-C são peptídeos biologicamente ativos sem cará-

ter enzimático que estão presentes na maioria das famílias de serpentes
apresentando em geral de 115 a 130 resíduos de aminoácidos e massa
molecular aproximada de 30 KDa. As lectinas são peptídeos dependen-
tes de íons cálcio para desempenhar sua função no organismo, e algu-
mas apresentam a capacidade de se ligar a carboidratos (lectinas verda-
deiras) enquanto outras perderam essa capacidade somente mantendo
sua estrutura molecular semelhante às lectinas verdadeiras (ZINGALI
et al., 1993; CASTRO et al., 1998).
As lectinas encontradas na peçonha ofídica, em sua maioria, não
conseguem se ligar a carboidratos e por isso são consideradas lectinas
símile (estrutura semelhante a lectinas verdadeiras) e não dependem
de cálcio para desempenhar atividade. Sendo que as lectinas do tipo-C
constituem uma família de peptídeos que apresentam estruturas homó-
logas e funções diferentes (MONTEIRO et al., 2003; SHARON et al.,
2003; MORITA, 2004).
As lectinas presentes na peçonha de serpentes podem ser classifi-
cadas em dois grandes grupos: lectinas de baixo peso molecular e lecti-
nas de alto peso molecular. As lectinas de baixo peso molecular apresen-

tam a capacidade de agregar eritrócitos e se ligar a carboidratos, e as de
alto peso molecular a capacidade de agregação plaquetária (TOYAMA
et al., 2001; HAVT et al., 2005).
As lectinas do tipo-C em sinergismo com serinoproteases, meta-
loproteases e desintegrinas atuam alterando fatores na cascata de coagu-
lação e agregação plaquetária que em conjunto com a ação proteolítica
e miotóxica, desenvolvida pelas peçonhas, levam a uma degradação de
proteínas responsáveis pelo hemostasia e consequentemente desencade-
ando distúrbios hemorrágicos e/ou coagulantes (PIKLE, 1998; QUEI-
ROZ, 2008).
2.7 Hialuronidases
Hialuronidases compõem uma classe de enzimas que podem ser

encontradas em quase todas as espécies de serpentes e que tem como
principal função degradar o ácido hialurônico. Essa classe de enzimas
apresenta baixa estabilidade, fator que dificulta trabalhos de isolamento
e caracterização (STERN et al., 2006). Outro fator que dificulta o traba-
lho com essa classe de enzimas é sua baixa concentração expressa em
peçonhas de serpentes (GIRISH, 2009).
O ácido hialurônico é o componente mais abundante da matriz
extracelular dos vertebrados. O ácido hialurônico nos tecidos animais se
liga a glicosaminoglicanas de modo a formar a substância fundamental
dos tecidos conjuntivos. Esse complexo atua na lubrificação de tendões
e cartilagens promovendo uma barreira contra entrada de toxinas e pató-
genos (STERN et al., 2006). A molécula de ácido hialurônico contribui
diretamente para manter o equilíbrio hemostático dos tecidos, intera-
gindo com ligação a proteínas e proteoglicanos, mantendo a integridade
estrutural extracelular, atuando também nos processos celulares básicos,
como por exemplo, adesão, migração e diferenciação celular (BOUGA
et al., 2010).
Terapeuticamente as hialuronidases são utilizadas para promo-
ver uma melhor absorção de fármacos, para aumentar a eficiência de
anestésicos e também para redução de edema decorrente do acúmulo

de ácido hialurônico e água (MARTINDALE, 1982; JOHNSSON et
al., 1999).
As hialuronidases são moléculas essenciais para difusão de toxi-
nas no envenenamento de presas ou vítimas devido a sua capacidade de
fragilizar os tecidos animais e as matrizes extracelulares, dessa forma,
sendo consideradas como “fatores de espalhamento”, contribuindo tan-
to para efeitos locais como para efeitos sistêmicos desencadeados pela
peçonha (GIRISH et al., 2004).
A atividade das hialuronidases é modulada por diversos fatores
ativadores (adrenalina, histamina e fosfatases ácidas) e inibidores (vi-
tamina C, heparina, dicumarinas e flavonoides), sendo que a inibição
dessa classe de enzimas tornaria mais eficiente à soroterapia devido ao
bloqueio da difusão de toxinas dentro do organismo e, dessa forma uma
menor quantidade de soro antiofídico deveria ser administrada na víti-
ma, diminuindo não apenas os efeitos das toxinas, mas também os efei-
tos adversos advindas da própria soroterapia (MENZEL; FARR, 1998;
GIRISH, 2011).

C A P ÍTU L O III
M e t o d o l o g ias em
To x i n o l o g i a : Extração
d e p e ç o n h a s e ven enos;
Carac t e r i z a ç ã o B ioqu ímica
Silvana Marcussi

3. Metodologias em Toxinologia: Extração
de peçonhas e venenos; Caracterização
Bioquímica
3.1 Extração de peçonhas e venenos
3.1.1 Serpentes
P ara a extração da peçonha de serpentes utiliza-se a contenção

do animal por um manipulador experiente e de preferência
responsável pelo serpentário. Nos casos em que a serpente apresenta
grande porte ou mostra-se altamente agressiva é necessário a utilização
de CO2 em pequena quantidade apenas para causar sonolência e dimi-
nuir a agitação do animal. Entretanto, muitos manipuladores experientes
realizam a coleta sem o uso de gás.
Um recipiente de vidro é então apoiado sob as presas para que a
peçonha escorra pelas bordas do mesmo. No caso de extração de peço-
nha de serpentes de tamanho reduzido como, por exemplo, as Micrurus
(corais verdadeiras), a coleta pode ser feita em um pequeno frasco colo-
cado sob cada dente ou mesmo em tubos de 1,5 mL.
Para a contenção de serpentes de grande porte pode-se usar um
cambão com laço (espécie de bastão de ferro ou madeira com um laço
ajustável na extremidade, que permite a contenção do animal seguran-
do-o ao termino da cabeça) (Figura 3); ou um gancho (Figura 4). Já
para serpentes de pequeno porte, pode-se pressioná-la contra a superfí-
cie em que se encontra com o auxílio de um gancho e em seguida contê-
-la com uso das mãos, porém este procedimento requer muita agilidade
e experiência a fim de evitar acidentes. Na Figura 5 pode-se observar
a contenção de uma serpente do gênero Crotalus adulta, para coleta de
peçonha.

Figura 3. Gambão utilizado para contenção de serpentes.
Obtida do site http://www.igapoo.com.br/produtos.php; acesso em: 20 de Março
de 2018.
Figura 4. Gancho para contenção de serpentes.

Obtida do site http://www.igapoo.com.br/produtos.php; acesso em: 20 de Março
de 2018.
Figura 5. Extração de pe-

çonha de Crotalus durissus
terrificus pelo Biólogo Luis
Henrique Anzalone Pedro-
sa, responsável pelo serpen-
tário da USP de Ribeirão
Preto. A peçonha coletada
é submetida à secagem em
dissecador à vácuo de vi-
dro, utilizando sílica para
a absorção da água, obten-
do-se assim, a peçonha na
forma de cristais.
Fonte: foto de Silvana Marsussi.

3.1.2 Escorpiões e aranhas; vespas e abelhas
A peçonha de escorpiões é extraída utilizando-se um sistema que

pode ser produzido de forma artesanal no próprio laboratório de pes-
quisa, para isso são necessários uma placa de vidro, fios de pequeno
calibre (por exemplo, os descartados nas ruas por funcionários de manu-
tenção das empresas telefônicas), uma chapa de metal, um controlador
de voltagem para 12V e uma tira de borracha. A chapa de metal deverá
ser presa ao lado do vidro em um suporte de madeira (tábua, banco ou
mesa), a tira de borracha deverá ser fixada sobre a extensão da chapa de
metal, em suas duas extremidades, e o controlador de voltagem ligado à
tomada deverá conter duas saídas, uma ligada a uma das extremidades
da chapa de metal e a outra ficará livre para tocar no animal, estimulan-
do-o assim a liberar a peçonha (Figura 6 e 7).
Figura 6. Escorpião da espécie Tityus serrulatus pertencente ao ser-

pentário da USP de Ribeirão Preto. A manutenção dos animais é reali-
zada em caixas de polipropileno cujas tampas contêm travas impossi-
bilitando a fuga dos mesmos. Inúmeros orifícios de pequeno diâmetro
presentes nas tampas das caixas permitem a entrada de ar sem possibi-
litar a fuga dos escorpiões. As caixas (± 100 cm comprimento/ 60 cm
altura) são forradas com papel sendo este trocado para a higienização
do recinto a cada sete dias. Uma placa de petri com água e, contendo
um pequeno pedaço de telha (responsável por filtrar a água) é colocada
em cada caixa. Cada caixa comporta aproximadamente 150 escorpiões
da espécie Tityus serrulatus.
Fonte: foto de Silvana Marcussi

A peçonha será extraída colocando um animal por vez, com auxí-
lio de pinças, sobre a chapa de metal preso à borracha. O manipulador
deverá conter os animais firmemente, porém excedendo a pressão su-
portável pelo corpo delicado do escorpião e ao mesmo tempo tocá-lo
com a ponta do fio em uma das membranas que compõe as ligações en-
tre os lobos da falsa cauda. A peçonha de vários animais será acumulada
na placa de vidro até que se tenha quantidade suficiente para raspar ou
dissolver em água, visando a posterior secagem por meio de liofilização.
Figura 7. Sistema utilizado para estimulação elétrica em escorpiões

com a função de facilitar a liberação da peçonha pelos animais durante
a coleta. Abaixo do telson e aguilhão do animal pode-se observar uma
placa de vidro na qual a peçonha de vários animais é acumulada antes
de ser coletada e submetida à liofilização. À direita da imagem pode-se
observar o controlador de energia cuja função é permitir a passagem de
corrente elétrica equivalente a apenas 12V, evitando assim a morte dos
animais.
Fonte: fotos de Silvana Marcussi.
Algumas aranhas maiores podem ser contidas após terem inalado

pequenas quantidades de CO2, e a extração pode ser realizada utilizan-
do-se contenção manual ou com o auxílio de pinças, direcionando as
quelíceras para liberarem a peçonha em um bastão ou pequeno reci-

piente de vidro. Entretanto, para aranhas menores como muitas das que
vivem em colônias, é necessário que estas sejam eutanasiadas utilizando
câmara de gás carbônico ou por congelamento. Nestes casos, a extração
é feita a partir da dissecção e retirada das glândulas de veneno que em
seguida passam por processo de maceração em PBS ou salina, centri-
fugação para retirada dos fragmentos de tecido celular e isolamento da
peçonha, que será posteriormente liofilizada e armazenada a – 4°C (re-
frigerador) ou – 20°C (freezer).
O mesmo procedimento é utilizado para algumas espécies de ves-
pas, que vivem em colônias e devido a seu tamanho reduzido devem ser
submetidas à dissecção para retirada das glândulas de peçonha e isola-
mento da peçonha.
Entretanto, para a maioria das espécies de abelhas, embora, en-
contradas na formação de grandes colônias, um procedimento diferen-
ciado é utilizado. Este procedimento consiste na contenção destes inse-
tos em sua própria colméia utilizando uma tela metálica. A aplicação de
uma leve corrente elétrica a esta tela induz a liberação de peçonha pelas
abelhas que nela tocarem e consequentemente, devido às substâncias
liberadas que induzem o reconhecimento, por parte de todas, de uma si-
tuação de risco eminente e a necessidade de um ataque em massa, logo,
todas as operárias da colônia estarão liberando suas peçonhas na tela.
Em seguida, o material poderá então ser dissolvido em água ultrapura e
submetido à liofilização ou raspado após secagem na própria tela (obs: a
manipulação de qualquer tipo de peçonha seca deve ser feita utilizando
materiais para a proteção pessoal como luvas e principalmente máscara,
evitando penetração cutânea da peçonha e inalação de partículas, res-
pectivamente).
3.1.3 Lagartas (taturanas)
Para as lagartas do gênero Lonomia, o soro contra seu veneno é

produzido e fornecido a algumas regiões específicas do país, onde os
acidentes ocorrem com maior frequência e gravidade. Neste caso, os
animais devem ser eutanasiados para possibilitar a extração do veneno.

O processo consiste na retirada dos pêlos que contém as substâncias
tóxicas e estes são processados através de dispersão em água, agitação e
centrifugação, visando isolar o veneno que em seguida poderá ser seco
por meio de liofilização.
3.1.4 Anêmonas
Procedimento semelhante ao utilizado para Lonomia tem sido uti-

lizado para anêmonas marinhas, em que os tentáculos são extraídos com
o auxílio de um bisturi ou tesoura cirúrgica, dispersos em solução de
PBS ou salina, macerados e submetidos à centrifugação para separação
de fragmentos celulares. A liofilização consiste no método de secagem
mais adequado também para este tipo de veneno.
3.1.5 Sapos, rãs e pererecas
Diferente de todos os animais até então citados, os sapos apre-

sentam suas glândulas produtoras de veneno na região dorsal. Sendo
assim, para extrair o veneno pode-se colocar o animal limpo dentro
de um recipiente, e comprimi-lo visando a liberação do veneno, tam-
bém pode-se fazer necessária a adição de água ou salina sobre o dorso
do animal facilitando assim a coleta do veneno. O veneno contido no
frasco é então submetido à liofilização e armazenado em baixas tem-
peraturas.
3.2 Caracterização bioquímica
3.2.1 Determinação quantitativa de proteínas
As dosagens de proteínas em soluções contendo diferentes con-

centrações podem ser realizadas pelo método do microbiureto, confor-
me descrito por Itzhaki e Gill (1964). Substâncias que contém duas ou
mais ligações peptídicas (ex: proteínas presentes no veneno bruto) pro-
duzem, em meio fortemente alcalino, uma cor violeta quando diluída

com sulfato de cobre. A cor deve-se a formação de complexos de co-
ordenação entre o íon cúprico e quatro grupos amina de duas cadeias
proteicas adjacentes. Para o teste de dosagem de proteínas são necessá-
rios os reagentes descritos abaixo além de um espectrofotômetro e uma
cubeta de quartzo.
Sensibilidade:
¾¾ 0,1 mg – 2 mg (peçonha ou mistura de proteínas a serem do-
sadas).
¾¾ Solução Padrão: albumina de soro bovino, pesar 16mg e dis-
solver em 15 mL de água destilada.
¾¾ Abs em 280 nm = 0,665 = 1,0 mg mL-1 (Absortividade relativa
da albumina de soro bovino).
Realiza-se uma curva de calibração utilizando diferentes concen-

trações de albumina, a partir dessa curva obtém-se um fator e o valor do
fator ficará escrito nos frascos dos reagentes R1 e R2 para ser utilizado
em todas as dosagens de proteínas feitas com esses reagentes. Quando
as soluções terminarem e for necessário fazer mais delas, a curva de ca-
libração com albumina para obtenção do valor do fator também deverá
ser refeita.
Cálculo do fator: deve-se traçar um gráfico em que o eixo Y repre-

senta os valores de absorbância em 280 nm e no eixo X os volumes da
solução de albumina utilizados para as leituras. Traça-se então uma reta
que parte do ponto zero e corta o gráfico formando triângulos com um
ângulo de 90º para cada resultado apresentado no gráfico.
Ex:
Os quadradinhos representam ângulos de 90º de triângulos que
podem ser visualizados dentro dos limites dos pontos traçados no grá-
fico. Os valores correspondentes ao comprimento dos catetos dos triân-
gulos são utilizados para o cálculo dos valores que irão resultar em um
número aproximado para o fator (Figura 8).

Figura 8. Gráfico elaborado com valores de absorção obtidos
experimentalmente para uma curva padrão de albumina.
Assim, para o gráfico apresentado no exemplo, temos:
600 – 0 = 1,304
0,46 – 0
500 – 0 = 1,28
0,39 – 0
500 – 0 = 2,08
0,39 – 0,15
600 – 0 = 1,93
0,46 – 0,15
400 – 0 = 1,6
0,3 – 0,05

Cálculo do fator: 1,304 + 1,28 + 2,08 + 1,93 + 1,6 = fator = 1,6388
5
Todos os triângulos podem ser considerados e os valores obtidos

são utilizados para o cálculo da média que será o valor do Fator.
O fator deve ser escrito nos frascos dos reagentes do microbiu-

reto, sendo utilizado para o cálculo das dosagens protéicas até o término
dos reagentes.
As seguintes soluções deverão ser utilizadas:

¾¾ Reagente 1 (R1) – 500 mL de NaOH a 30% (150 g) (Branco).
¾¾ Reagente 2 (R2) – 250 mL de CuSO4. 5H2O a 1,05% (2,63 g)
+ 1000 mL de NaOH a 38% (380g) (Azul).
Técnica:
¾¾ Branco R1: 1,0 mL de H2O + 1,0 mL R1. Coloca-se o branco
na cubeta e zera-se o espectrofotômetro.
¾¾ Amostras R1: 1,0 mL da solução de proteína (albumina) e 1,0
mL de R1.
¾¾ Determina-se a absorbância das amostras em 310 nm.
¾¾ Branco R2: 1,0 mL de H2O + 1,0 mL R2. Coloca-se o branco
na cubeta e zera-se o aparelho.
¾¾ Amostras R2: 1,0 mL da solução de proteína e 1,0 mL de R2.
¾¾ Coloca-se o branco na cubeta e zera-se o aparelho.
¾¾ Determina-se a absorbância das amostras em 310 nm.
¾¾ Calcula-se o valor da diferença de absorbância das amostras
subtraindo os valores de R1 dos valores de R2 (R2 - R1).
¾¾ Para cada concentração utilizada, a dosagem é feita em tripli-
cata (n=3).
¾¾ Determina-se a concentração de proteínas multiplicando a mé-
dia dos valores de absorbância obtidos com diferentes quanti-
dades da amostra pelo valor do fator.

Os valores de absorbâncias resultantes das leituras devem estar
entre 0,1 e 0,8 nm (intervalo de segurança).
São utilizadas várias quantidades da amostra proteica a fim de se
obter uma curva de concentrações, aumentando assim o grau de confia-
bilidade dos resultados obtidos nas dosagens.
3.2.2 Cromatografia de troca iônica em CM-Sepharose
A cromatografia de troca iônica em CM-Sepharose possibilita a

separação das moléculas de acordo com sua carga (proteínas de caráter
positivo, negativo ou neutras). A resina CM-Sepharose, Carboxi-Metil-
-Sepharose é uma trocadora aniônica, dotada de cargas positivas, pos-
sibilitando assim, a retenção de moléculas com cargas opostas, ou seja,
negativas. Durante a cromatografia o eluente, também chamado de fase
móvel, é a solução responsável pelo arraste das moléculas através da
resina cromatográfica. Inicialmente, o eluente apresenta baixa concen-
tração de sal para que não interfira na interação de cargas que ocorre
entre as partículas da resina e as moléculas proteicas de cargas opostas
(que compõem a peçonha), entretanto, após a passagem pela coluna das
moléculas sem carga ou com carga positiva, é necessário aumentar o
potencial iônico do eluente para que as moléculas de cargas negativas,
retidas pela resina, sejam liberadas. Na Figura 9 é mostrado um exemplo
de cromatografia em resina de troca iônica.

Figura 9. Técnica cromatográfica em resina de troca iônica.
Fonte: elaborada por Pedro H. S. Cesar, adaptada de Nelson e Cox (2014).

Procedimentos experimentais: 300 mg de peçonha de serpente serão
dissolvidos em 1,5 mL de solução eluente (bicarbonato de amônio, AM-
BIC, 0,05 M, pH 8,0) e centrifugados por aproximadamente 10 minutos
a 1000xg (para retirada de lipídios e partículas não proteicas). Em segui-
da, o sobrenadante é aplicado na coluna e o pellet descartado. A coluna
de vidro com CM-Sepharose (2 cm de diâmetro x 20 cm de comprimen-
to) é equilibrada na solução eluente. O pH deve ser acertado com gelo
seco, e a resina (CM-Sepharose) vertida na coluna inclinada, evitando a
formação de bolhas, além de preencher o espaço superior da coluna com
tampão de forma que a resina encontre-se empacotada e protegida de ex-
posição ao ar, o que resultaria em ressecamento. Inicia-se a eluição com
gradiente linear de concentração, com tampão bicarbonato de amônio
0,05 a 1,0 M, pH 8,0. As frações são coletadas em tubos através de um
coletor automático e a leitura é feita em 280 nm no espectrofotômetro
(ANDRIÃO-ESCARSO et al., 2000; SOARES et al., 2000a;b). O fluxo
de eluição pode ser definido e controlado por uma bomba peristáltica liga-
da diretamente à coluna cromatográfica e ao coletor de frações. Para cada
cromatografia são elaboradas fichas técnicas como demonstrado a seguir.
Descrição do Experimento:
Volume por tubo:
Fluxo: .... mL/min. ou .... mL/h
3.2.3 Cromatografia por exclusão molecular
Como nas demais modalidades cromatográficas, esta cromatogra-

fia empregada para separação de moléculas de acordo com seus pesos
moleculares, faz uso de uma fase móvel e uma fase estacionária. A úni-
ca diferença é a ausência de interação química ou física do analito (ex:
componentes de peçonhas; compostos naturais – principalmente proteí-
nas e peptídeos) com a fase estacionária ou com a fase móvel.
O processo de fracionamento da amostra ocorre pelo material po-
roso (resina) utilizado como fase estacionaria, geralmente utiliza-se síli-

ca ou uma espécie de polímero (sephadex; substâncias poliméricas que
apresentam ligações cruzadas). Os poros presentes na fase estacionária
geralmente apresentam um diâmetro que permite a eluição diferencial
de moléculas com diversos pesos. Moléculas de maior peso molecular
eluem primeiro, pois não conseguem entrar pelos poros presentes nas
partículas de resina, e como não percorrem o labirinto da fase estacio-
nária acabam perfazendo um caminho alternativo por entre as partículas
de resina.
As resinas utilizadas neste método geralmente são compostas por
partículas cujos poros possuem diâmetro entre 5 a 10 μm (HOLLER,
2009). Moléculas com menor peso molecular adentram o labirinto da
fase estacionária por meio dos poros presentes nas partículas de resina,
perfazendo assim um caminho mais longo e demorado, sendo eluídas
ao final do processo (EWING, 1990). Na Figura 10 pode-se observar
um exemplo de cromatografia com princípio de separação por exclusão
molecular.

Figura 10. Técnica cromatográfica em resina com separação por
exclusão molecular.
Fonte: elaborada por Pedro H. S. Cesar, adaptada de Nelson e Cox (2014).

Procedimentos experimentais: os mesmos procedimentos men-
cionados para a cromatografia de troca iônica são válidos na execução
da técnica de exclusão molecular. A única diferença está na fase móvel,
utilizada para eluir as amostras, sendo a cromatografia realizada apenas
em bicarbonato de amônio, AMBIC, 0,05 M, pH 8,0, sem a utilização de
gradiente de concentração.
ADENDO: outras técnicas cromatográficas, como por exemplo, croma-

tografia de afinidade (utilizando ligantes específicos para determinadas
classes de enzimas, como por exemplo, anticorpos), também tem sido
amplamente utilizada em pesquisas na área de toxinologia. A CLAE
(cromatografia líquida de alta eficiência; realizada em altas pressões)
geralmente é utilizada para isolamento de moléculas presentes em amos-
tras parcialmente purificadas por outras técnicas, confirmação do grau
de pureza das amostras, isolamento de moléculas a partir de amostras
raras e pouco volumosas, ou ainda para determinação das estruturas das
moléculas isoladas fazendo uso de padrões comerciais para comparação.
3.2.4 Eletroforese em gel de poliacrilamida com agentes

desnaturantes e determinação do peso molecular
estimado
A eletroforese em gel de poliacrilamida é realizada conforme a

técnica descrita por Laemmli (1970), utilizando-se SDS (dodecil sulfato
de sódio) e β-mercaptoetanol como agentes desnaturantes. Obs: o SDS
também apresenta como função atribuir cargas negativas às moléculas
proteicas de forma que suas cargas nativas estejam nulas durante a ele-
troforese, permitindo que a migração diferencial no gel esteja apenas
relacionada a massas moleculares diferentes. Na preparação dos géis
de poliacrilamida a 6% (empilhamento) (Quadro 1) e 12% (separação)
(Quadro 2) serão utilizadas as seguintes soluções:

Quadro 1. Reagentes e proporções para elaboração do gel de separação
(gel de baixo):
QUANTIDADE
REAGENTES
(poliacrilamida 12%)
Água MilliQ 3,3 mL
30% acrilamida 4,0 mL
1,5M Tris-HCl pH 8,8 2,5 mL
10% SDS 100 μL
10% Persulfato Amônio 100 μL
TEMED 4 μL
Quadro 2. Reagentes e proporções para elaboração do gel de

empilhamento (gel de cima):
REAGENTES QUANTIDADE
(poliacrilamida 6%)
Água MilliQ 2,75 mL
30% poliacrilamida 800 μL
1,5M Tris-HCl pH 8,8 500 μL
10% SDS 40 μL
10% Persulfato Amônio 40 μL
TEMED 4 μL
Caso as malhas do gel fiquem grandes, as bandas da amostra fi-

carão muito baixas, para corrigir, basta aumentar a concentração da po-
liacrilamida para 15% e 9% para os géis de corrida e empacotamento,
respectivamente.
Uma solução tampão estoque (5X) de Tris é preparada a 0,12M
contendo glicina a 1,24M e SDS 10% (m/v) pH 8,3, sendo diluída para
1X e utilizada como tampão de corrida para o cátodo e para o ânodo.

Solução estoque para corrida eletroforética: Tris-Glicina Buffer 5X
Tris-base 15,1g
Glicina 94g
Solução de SDS 10% 50mL
Completar o volume com água destilada para 1 L.
Elaboração do gel
1. Preparar poliacrilamida estoque: (Acrilamida:bis-Acrilamida)
19:1 g (m:m) e adicionar 73 mL de água mili-Q para a obten-
ção de poliacrilamida a 30%. Agitar até dissolução completa
ou deixar em repouso por tempo superior à 12 horas. Esta so-
lução pode ser guardada por 15 dias à 4°C em frasco âmbar.
2. Uma vez pronta a solução estoque de poliacrilamida 30% pro-
cede-se por acrescentar em um pequeno béquer os reagentes
do gel de separação na ordem e nas quantidades citadas no
quadro acima.
c. Antes de acrescentar o Tris-HCl pH 8,8 e o Persulfato
Amônio é importante homogeneizar a solução estoque
destes reagentes.
d. Ao acrescentar o TEMED haverá poucos segundos até co-
meçar o processo de polimerização do gel. Neste momen-
to deve-se utilizar uma pipetadora de 5 mL, homogeneizar
a mistura final aspirando e ejetando, para logo em seguida
acrescentar no suporte do gel.
e. Deve-se acrescentar o gel até faltar aproximadamente 1,5
cm para o limite do suporte do gel. Completar esse volu-
me usando água destilada para uniformizar o gel e aguar-
dar a polimerização no escuro (aprox. 1 hora).
f. Após, recomenda-se cobrir o gel com algumas folhas de
papel toalha encharcadas com água. O gel ao se polimeri-
zar pode perder muita umidade e impossibilitar a migra-
ção das proteínas.

3. Após a polimerização do gel, despejar a água e secar o excesso
com papel filtro e proceder a etapa seguinte.
4. Assim como feito no gel anterior, o gel de empacotamen-
to segue os mesmos princípios, respeitando as quantidades e
concentrações dos reagentes.
5. Adicionar o pente para delimitar os poços onde serão adicio-
nadas as amostras e aguardar aproximadamente 30 a 40 minu-
tos para a polimerização total.
6. Cobrir este gel com as folhas de papel toalha encharcadas para
evitar a desidratação
7. Adicionar o tampão de corrida na cuba (em cima e embaixo).
Deixar o gel por alguns minutos em contato com este tampão
antes de retirar o pente. Em seguida, movimente o pente para
os lados com cuidado, retirando-o lentamente para acrescentar
as amostras.
Preparo das amostras
Tampão desnaturante de amostra para proteínas

(MANIATIS, 1982)
• Tris-HCL 0,5 M pH 6,5
• 2% SDS
• 3,5% β-mercaptoetanol
• 10 mg azul de bromofenol
• Adicionar alguns cristais de sacarose para dar densidade às
amostras
As amostras serão dissolvidas em água destilada e deionizada, e

em seguida, será adicionado o tampão da amostra (4 µL em 20 µL de
amostra). Posteriormente, as amostras serão aquecidas por 5 minutos à
100ºC e acrescidas de sacarose, sendo posteriormente aplicadas ao gel
de poliacrilamida. O b-mercaptoetanol é um agente redutor, que quando
adicionado às amostras cliva as interações dissulfeto presentes na prote-
ína, enquanto que o SDS cliva interações de hidrogênio.

1. Uma vez que o gel está pronto e o pente foi retirado, adicionar
as amostras nos poços lentamente para evitar que estas subam
e se dispersem no tampão de corrida (vf: 15µL).
2. Quando o azul de bromofenol, marcador de corrida, chegar
próximo à borda das placas a corrente elétrica poderá ser des-
ligada finalizando a corrida. Nas condições mencionadas, à
aproximadamente 90-110 V as corridas duram em média 3:30
horas.
3. Em seguida o sistema deve ser desmontado, o gel retirado e
submetido à coloração (solução de Coomassie G250 Brillant
por 40 minutos aproximadamente) e descoloração (solução de
ácido acético 20%) permanecendo conservado nesta solução
até avaliação e documentação.
No quadro 3 são mostrados alguns exemplos de padrão de pesos

moleculares que podem ser utilizados para determinação das massas re-
lativas das frações proteicas das amostras submetidas à eletroforese.
Quadro 3. Padrão de pesos moleculares

(marcador molecular, Da)*.
Sigma, Dalton Mark VII-L
Albumin, bovine 66,000
Albumin, egg 45,000
Glyceraldehyde-3-phosphate; 36,000
Dehydrogenase, rabbit muscle
Carbonic Anhydrase, bovine 29,000
Trypsinogen, bovine 24,000
Trypsin inhibitor, soybean 20,100
a-Lactalbumin, bovine milk 14,200
*qualquer outro padrão de peso molecular poderá ser utilizado, seguindo os mes-
mos procedimentos para o cálculo dos pesos moleculares de bandas referentes a prote-
ínas desconhecidas, em estudo.

A mobilidade eletroforética relativa de cada banda será determina-
da em centímetros e a massa molecular será calculada, relacionando-se a
mobilidade eletroforética relativa com o logarítmo do peso molecular do
padrão (NELSON; COX, 2014). Na Figura 11a é mostrado um exemplo
de cuba de eletroforese vertical para proteínas e na Figura 11b um gel
de eletroforese em poliacrilamida corado com azul de coomassie G250.
Figura 11. (a) Imagem ilustrativa de uma cuba de eletroforese vertical

para proteínas Fonte: elaborada por Pedro H. S. Cesar, adaptada de
Nelson e Cox (2014). (b) Imagem ilustrativa de um gel de eletroforese
elaborado com poliacrilamida. Amostras: (1) Padrão de peso
molecular; (2) metaloprotease BjussuMP-II isolada de
Bothrops jararacussu.
Fonte: foto de Silvana Marcussi.

C A P ÍTU L O IV
M e t o d o l o gias em
To x i n o l o gia:
A t i v i d a d e s in vitro
Silvana Marcussi
Tatiane Silva de Abreu

4. Metodologias em Toxinologia:
Atividades in vitro
4.1 Atividade fosfolipásica
Atividade sobre lecitinas da gema do ovo e hemólise indireta
U m dos métodos para se avaliar a atividade das fosfolipases é

através da quebra das lecitinas presentes na gema do ovo em
um meio contendo ágar ou agarose. Este método preciso e de baixo custo
desenvolvido por Gutiérrez et al. (1988) permite ainda a avaliação da
hemólise de forma indireta através do acréscimo de eritrócitos no preparo
do gel. As quantidades para cada metodologia encontram-se na Tabela 9.
O sangue humano utilizado durante os testes de hemólise indireta
é imediatamente diluído em tampão PBS (30 mL) e as células lavadas
3 vezes com centrifugações de 1500xg por 10 minutos, para volumes
aproximados de 10 mL de sangue. Após as centrifugações, o plasma é
desprezado e os eritrócitos utilizados na composição do gel.
Para a padronização da dose adequada a cada experimento é ne-
cessário determinar a dose hemolítica mínima (DheM). A quantidade de
amostra (µg) a ser considerada como a DheM corresponde a quantidade
responsável pela formação de um halo de aproximadamente 15 mm de
diâmetro no gel. Após a determinação da DheM, podem ser realizados
ensaios de caracterização enzimática diversificando variáveis como pH
e temperatura, além da interação com íons e inibidores. Na Figura 12
pode-se observar uma imagem ilustrativa de uma placa de petri conten-
do gel elaborado para verificação de atividade hemolítica indireta.
Procedimentos experimentais:
Materiais:
• Solução de CaCl2 (0,01 M)
• Gema de ovo (1:3 PBS, pH 7,2; NaCl 0,12 M e fosfato 0,04
M); retirar a película que separa a gema da clara

• Eritrócitos
• Agarose ou ágar bacteriológico (1%)
• Azida de sódio (0,005%)
• Balança analítica; banho maria; micro-ondas; placas de petri;
béquer de 500 mL ou 1000 mL; provetas; bastão; tubo (falcon)
de 50 mL
Quadro 4. Valores de referência para a preparação das placas contendo

os géis para determinação das atividades fosfolipásica
e hemolítica em meio sólido.
Quantidade Ágar PBS Azida de CaCl2 Gema de Eritrócitos
de placas (g) (mL) sódio (g) (mL) ovo (mL) (mL)
1 0,55 25 0,1 0,25 1,1 1,1
2 0,80 50 0,1 0,50 1,4 1,4
3 1,05 75 0,1 0,75 1,7 1,7
4 1,30 100 0,1 1,00 2,0 2,0
5 1,55 125 0,1 1,25 2,3 2,3
6 1,80 150 0,1 1,50 2,6 2,6
7 2,05 175 0,1 1,75 2,9 2,9
8 2,30 200 0,1 2,00 3,2 3,2
9 2,55 225 0,1 2,25 3,5 3,5
10 2,80 250 0,1 2,50 3,8 3,8
11 3,05 275 0,1 2,75 4,1 4,1
12 3,30 300 0,1 3,00 4,4 4,4
13 3,55 325 0,1 3,25 4,7 4,7
14 3,80 350 0,1 3,50 5,0 5,0
15 4,05 375 0,1 3,75 5,3 5,3
16 4,30 400 0,1 4,00 5,6 5,6
17 4,55 425 0,1 4,25 5,9 5,9
18 4,80 450 0,1 4,50 6,2 6,2

Preparação seguindo valores de referência apresentados no
quadro 4:
1. Centrifugar o sangue a 1500xg por 10 minutos, descartar o

plasma e acrescentar o dobro do volume de plasma descartado
de PBS. Repetir esta etapa por 3 vezes.
2. Separar os eritrócitos do PBS e medir o volume obtido - Dis-
solver a agarose ou ágar em PBS e agitar frequentemente para
obter uma suspensão transparente, sem deixar ferver.
3. Esfriar até 70-75ºC e acrescentar o cloreto de cálcio; agitar.
4. Deixar o meio esfriar até 55-60ºC; acrescentar a azida de sódio
e a gema de ovo; agitar.
5. Para a avaliação da hemólise indireta, deixar esfriar até 45-
50ºC; agitar suavemente e acrescentar os eritrócitos.
6. Colocar 27 mL à 30 mL de meio em placas niveladas; eliminar
as bolhas com o auxílio de uma ponteira.
7. Esperar solidificar e elaborar os poros no meio, 4-5 mm de
diâmetro (podem ser feitos com auxílio de uma ponteira de
1000 μL no tamanho do poro, Figura 13), para aplicação das
amostras.
8. Após a aplicação das amostras, as placas são colocadas em um
saco plástico ou um recipiente fechado contendo um algodão
úmido (para evitar ressecamento) e permanecem dentro da es-
tufa a 37ºC, por aproximadamente 12 horas.
9. Avaliação é realizada pela medição com uma régua do diâme-
tro do halo formado.
*Ovos que possuem a gema clara podem dificultar a visualização do teste. Aconselha-
-se aumentar a quantidade da gema de ovo ou optar por um de gema com coloração
amarela mais intensa (galinha caipira).
Princípio do método: Quando a amostra testada apresenta atividade

fosfolipásica, ela agirá quebrando os fosfolipídios presentes na gema do
ovo e com isso, são liberados ácidos graxos que fazem com que o meio

ao redor torne-se ácido, o que resulta em lise dos eritrócitos sanguíneos.
Assim, forma-se um halo translúcido em torno da amostra, que contrasta
com o gel que apresenta coloração avermelhada.
Figura 12. 1 – Corta-se a ponteira de 1000 μL horizontalmente a uma

altura que volume no meio tenha aproximadamente 50 – 60 μL de
volume. 2 – Com a ponteira cortada perfura-se o meio quando este
estiver solidificado e firme. Após a perfuração retirar os
pedaços de gel com auxílio de uma agulha.
Fonte: elaborado por Pedro H. S. Cesar.
4.2 Atividade proteolítica adaptada em meio sólido
Géis para avaliação de proteólise seguindo valores de referência

apresentados no quadro 5
A metodologia é uma adaptação do método proposto por Gutiér-
rez et al. (1988), e as modificações utilizadas correspondem à substitui-
ção da agarose por ágar, e do substrato. Assim, podemos retirar a fonte
de lecitinas (gema de ovo) da composição do gel e adicionar caseína ou
colágeno, elastina, gelatina, entre outras.

Reagentes:
1. A concentração final de caseína na placa será de 0,027% (com

base no volume de ágar), esse valor foi adaptado à partir dos
valores estabelecidos para o meio líquido de Van Der Walt e
Joubert (1971). Para tanto, para um total de 12 placas, dissol-
ver 0,1914 g de caseína em 4 mL de tampão Tris-HCl 50 mM,
pH 9,6 para se obter uma solução 0,06 M em Tris-HCl 50 mM,
pH 9,6.
2. Deixar em leve agitação overnight à 30°C.
3. Dissolver 3 g de ágar em 296 mL PBS, e aquecer em forno mi-
cro-ondas com intervalos de 30 segundos seguido de agitação
com um bastão. OBS: Deve-se tomar cuidado durante esse
processo pois o recipiente pode aquecer demais, ademais,
se a solução ferver, pode ocorrer derramamento no inte-
rior do micro-ondas e modificar o volume de solução.
4. Deixar o meio resfriar até 55 – 60°C e adicionar 0,1 g azida
sódica (para até 20 placas) e a caseína (proporcional à quanti-
dade de placas).
5. Após a homogeneização do meio, acrescentar rapidamente 27
mL em placas de Petri.
6. Uma vez solidificado o meio, fazer 9 poços na placa como mos-
trado na metodologia da atividade fosfolipásica (Figura 12).
7. De acordo com cada experimento, as amostras a serem adicio-
nadas nos poços podem ser incubadas previamente com algum
agente inibidor ou indutor de proteólise. Normalmente o tem-
po de incubação é em torno de 30 minutos.
8. Todos os tratamentos inclusive os controles positivos (agente
proteolítico) e os controles negativos (PBS) são feitos em tri-
plicatas.
9. Adicionar os tratamentos de modo que em cada poço contenha
30 μL de volume final
10. Uma vez adicionados os tratamentos as placas permanecerão
em câmara de cultura por 12 horas à 37°C.

11. Coloração do gel
Solução de amido black:
A- Preparar a solução colorante adicionando 5 mg de amido
black em 200 mL de água destilada.
B- Adicionar esta solução nas placas contendo o meio de ca-
seína. Aguarde 3 minutos e retire o corante (pode ser reuti-
lizado)
12. Leve à capela e acrescente uma solução de 20% de ácido acé-
tico para retirar o excesso de coloração. Aguarde um período
de 6 horas, em média, até que os halos se tornem visíveis e seja
possível medi-los.
Quadro 5. Valores de referência para a preparação das placas

contendo os géis para determinação das atividades
proteolítica em meio sólido.
Quantidade de Ágar PBS Caseína
placas (g) (mL) (g)
1 0,55 25 0,0319
2 0,80 50 0,0464
3 1,05 75 0,0609
4 1,35 100 0,0783
5 1,65 125 0,0957
12 3,30 300 0,1914

Figura 13. Formação dos halos em um meio contendo caseína e
corado com amido black por 6 horas. Os halos translúcidos formados
são derivados da ação proteolítica de uma peçonha de serpente. Nos
locais onde não se observa um halo translúcido, estão os controles
negativos contendo somente PBS.
Fonte: foto de Mateus W. F. Eleutério.
4.3 Atividade hemolítica direta
a) Em meio sólido: elabora-se um gel semelhante ao citado

na metodologia da atividade fosfolipásica (item 4.1), com a
substituição da gema de ovo por eritrócitos em solução de
PBS, respeitando as mesmas quantidades. O sangue venoso,
de seres humanos sadios, é coletado usando vacutainer con-
tendo citrato de sódio (0,109 mol/L) na proporção 1:10 (citrato
de sódio:sangue; v:v). O sangue é centrifugado a 1500xg por
15 minutos a temperatura de 12°C. O sobrenadante é retirado
e denominado plasma rico em plaquetas (PRP). A parte pobre
em plaquetas contendo os eritrócitos é lavada 2 vezes com um
volume igual de PBS e centrifugada nas condições descritas
anteriormente, descartando-se o sobrenadante contendo restos
do plasma, a cada centrifugação.
Após a solidificação do gel são feitos orifícios de tamanho uni-
forme (Figura 13). As amostras são aplicadas em volume final de 40 µL
contendo somente o PBS (controle), amostras de peçonhas, proteínas

isoladas dissolvidas em PBS ou qualquer outra substância que se pre-
tenda testar.
Os géis contendo as amostras são incubados em estufa a 37ºC por
12 horas. A formação de halo translúcido ao redor do orifício no gel é o
indicativo de atividade, onde os halos são medidos em milímetros para
a quantificação da atividade hemolítica.
Na Figura 14 pode-se observar uma imagem ilustrativa de uma
placa de petri contendo gel elaborado para verificação de atividade he-
molítica direta em meio sólido.
Figura 14. Imagem ilustrativa de uma placa de petri contendo gel ela-
borado para verificação de atividade hemolítica direta em meio sólido
ou atividade hemolítica indireta.
Fonte: foto de Anderson A. Simão.
b) Em meio liquido: Esta atividade será avaliada turbidimetri-

camente usando suspensão de eritrócitos humanos, de acordo
com protocolo previamente descrito por Torres et al. (2001).
1. O sangue será coletado de voluntários saudáveis em tubos
a vácuo contendo anticoagulante (heparina) e imediata-
mente centrifugado a 1500xg por 10 minutos para separa-
ção do plasma.
2. Os eritrócitos então obtidos serão lavados com 50 mM
Tris-HCl contendo 104 mM NaCl, pH 7,4, mais 20 mM
CaCl2 e 0,1% NaCO3. A absorbância da solução de eri-

trócitos será ajustada para aproximadamente 1,4 em λ =
540 nm.
3. As análises serão realizadas após incubação com as amos-
tras por 20 minutos a 30°C, seguindo por centrifugação a
4000xg por período de 15 minutos e calibração da absor-
bância do sobrenadante em 540 nm.
4.4 Atividade Trombolítica
1. Coletar o sangue em seringa, sem a presença de qualquer anti-

-coagulante e colocá-lo em um béquer.
2. Adicionar a cada um dos “poços” da placa de microtitulação
100 μL de sangue.
3. Nesta atividade cada tratamento é feito em triplicatas.
4. Aguardar a formação dos trombos (45-60 minutos).
5. Pipetar 30 μL dos tratamentos nos poços de cada repetição.
6. Utilizar um agente trombolítico e PBS (30 µL) como controles
positivo e negativo, respectivamente.
7. Em seguida, os coágulos serão incubados por 24 horas a 37°C
em estufa, dentro de um saco plástico contendo algodão ume-
decido (evitar que resseque).
8. Após incubação, a atividade trombolítica será estimada base-
ando-se no tamanho do coágulo remanescente.
9. Volumes de líquido liberados dos trombos serão coletados e
medidos, utilizando-se uma micropipeta. Sendo a soma do vo-
lume de sangue mais o da amostra avaliada (130 µL), conside-
rada como 100% de lise.
Para a realização deste teste coleta-se o sangue de um doador

voluntário, sem adição de anticoagulantes e aplicam-se alíquotas do
sangue imediatamente em placas de microtitulação (100 µL/poço),
aguardando o tempo necessário para formação do coágulo sanguíneo.
A amostra a ser avaliada é aplicada sobre os trombos, em triplicata, se-
guindo com incubação de 40 a 60 minutos a 37°C. A atividade é quan-

tificada pela medida do volume de líquido liberado pelo trombo. Para
avaliar a inibição do efeito de dissolução de trombos pode-se proceder
de duas formas: 1- incubação do composto (possível inibidor) com o
trombo (30 minutos a 37°C) e posterior adição de um agente trombo-
lítico (peçonha ou medicamento) seguindo com incubação de 40 a 60
minutos a 37°C; 2- incubação do composto (possível inibidor) com o
agente trombolítico (peçonha ou medicamento) (30 minutos a 37°C) e
posterior aplicação da mistura sobre o trombo seguindo com incubação
de 40 a 60 minutos a 37°C.
4.5 Atividade Hemaglutinante
O ensaio da atividade hemaglutinante foi descrito por Jaffé (1969)

e Figueiros et al. (1997), sendo que o substrato para as enzimas a serem
avaliadas no ensaio são eritrócitos humanos.
1. O sangue humano ou animal deve ser coletado com adição
de anticoagulante e imediatamente centrifugado (1500xg
por 10 minutos), sendo o sobrenadante descartado e as célu-
las suspensas em solução salina 0,85% (Na2HPO4; KH2PO4;
NaCl).
2. A suspensão celular será submetida a mais 3 lavagens (centri-
fugações de 1700 xg por 15 minutos) em solução salina sendo
em seguida diluída (1:20 v/v sangue: solução salina) e distri-
buída (100 µL/poço) em uma placa de microtitulação.
3. A incubação na presença das amostras é realizada por tempo
igual ou superior a 90 minutos à 37°C.
4.6 Atividade coagulante e anticoagulante
A avaliação da atividade coagulante é feita através da medição

do tempo médio de coagulação do plasma humano ao ser incubado
com uma amostra. O sangue total deve ser coletado em tampão citrato
a uma proporção de 9:1 (sangue: tampão, v:v) e centrifugado a 1500xg
por 10 minutos e lavados 3 vezes com PBS, como citado na atividade

hemolítica em meio sólido. Uma vez obtido o plasma, este pode ser ar-
mazenado por até duas semanas em freezer à -20 °C ou até seis meses
em freezer à -70°C.
DCM – Dose coagulante mínima. É a dose de uma substancia que
se deseja testar capaz de induzir a coagulação em um tempo de 1 minuto
– 1 minuto e 25 segundos. Essa dose deve ser ajustada através de dilui-
ções ou mesmo concentrando o preparo para se adequar à análise que se
deseja fazer. É necessário realizar esta padronização estabelecer padrões
de qualidade e uniformidade nos experimentos. Todos os tratamentos e
proporções serão calculados com base nesse valor.
Ensaio:
1. Ligar o banho-maria e estabelecer temperatura para 37°C.
2. Colocar o plasma citratado dentro do banho-maria para acli-
matização (aproximadamente 15 minutos).
3. Preparar tubos de ensaio (de tamanho uniforme) em grade su-
porte e colocá-los dentro do banho.
4. Adicionar dentro de cada tubo 200 µL de plasma.
5. Todas as amostras inclusive os controles são feitos em tripli-
catas.
6. Realizar os controles:
* Controle positivo 1 – 50 µL de CaCl2 0,1 M - esperar apa-
recer sinais de coagulação do plasma (entre 2 a 5 minutos).
* Controle positivo 2 – Amostra de interesse na DCM.
* Controle negativo - PBS.
7. Após adicionar os tratamentos, cada tubo deve ser levemente
agitado em banho, e parcialmente vertido de modo que o plas-
ma umedeça as paredes do tubo.
8. Cronometrar o tempo gasto para cada amostra iniciara a cas-
cata de coagulação.
* Esta etapa precisa ser avaliada de modo uniforme. O iní-
cio da coagulação é o momento no qual o plasma se torna
um grumo viscoso e escorre com dificuldade pela parede
do tubo.

9. O potencial dos compostos em inibir a coagulação será avalia-
do com adição dos tratamentos ao plasma citratado, incubação
entre 5 a 10 minutos e posterior adição de solução de cloreto
de cálcio com contagem do tempo.
10. O tempo necessário para a formação do coagulo será medido
em segundos, sendo que a inibição (atividade anticoagulante)
será observada de acordo com o aumento médio do tempo da
coagulação em relação ao controle contendo apenas CaCl2.
4.7 Teste de degradação do fibrinogênio
A degradação do fibrinogênico é realizada segundo a técnica des-

crita por Edgar e Prentice (1973), com algumas modificações de acor-
do com Rodrigues (2001). Para este ensaio serão realizadas incubações
prévias das moléculas de fibrinogênio (60 µg) com o composto a ser
avaliado (2 horas a 37ºC), em volume final de 30 µL. Após incubação, as
soluções serão submetidas à tratamento de desnaturação com adição de
6 µL de Tampão Desnaturante de Amostra para Proteínas (MANIATIS,
1982) conforme descrito no item 3.2.4, e banho de ebulição por 5 minu-
tos. Caso as amostras não apresentem atividade proteolítica a possível
inibição de proteases poderá ser avaliada.
Para tanto, as peçonhas brutas de B. jararacuçu, B. moojeni, B.
alternatus ou B. atrox, por exemplo, poderão ser utilizadas como fer-
ramentas de indução de proteólise (pois correspondem a ricas fontes de
proteases). Este ensaio ainda permite avaliar duas vertentes: 1- intera-
ção de compostos naturais com moléculas de fibrinogênio (visando a
proteção de sua estrutura), avaliada por incubação do fibrinogênio com
os compostos durante 30 minutos a 37ºC e posterior adição de peçonha
com incubação por mais 2 horas; 2- interação de compostos naturais
com proteases presentes nas peçonhas (visando a inibição da atividade
enzimática), avaliada por incubação prévia dos compostos com peçonha
30 minutos a 37ºC e posterior adição do fibrinogênio com incubação por
mais 2 horas. Este ensaio permite avaliar diferentes proporções entre in-
dutores de proteólise e inibidores, assim como variações no meio reacio-

nal, considerando pH (ex: 2,5; 3,5; 4,5; 5,5; 7,0; 8,0 e 10,0), temperatura
de incubação (-20; 4; 25; 37; 50; 60; 80; 90; 100ºC), presença de íons
divalentes (ex: Ca, Zn, Mg e Mn), assim como a presença de agentes
quelantes de metais ou inibidores em geral. Na Figura 15 é mostrado um
gel de poliacrilamida contendo uma molécula intacta fibrinogênio com
os monômeros que compõem esta proteína e, o resultado obtido após a
incubação de uma molécula de fibrinogênio com a peçonha de Bothrops
moojeni.
Figura 15. Degradação do fibrinogênio. (1) Molécula de fibrinogênio

onde alfa, beta e gama representam os monômeros que compõem a
proteína. (2) Fibrinogênio incubado com a peçonha de Bothrops moo-
jeni; degradação parcial das cadeias alfa e beta. (3) Peçonha de B.
moojeni. (a) Bandas correspondentes a proteínas da peçonha. (b) Fibri-
nopeptídios formados pela degradação de moléculas de fibrinogênio.
Fonte: Mariana A. Braga.
4.8 Atividade de L-aminoácido oxidase
O ensaio da atividade de L-aminoácido oxidase é conduzido pelo

preparo da solução estoque que consiste da adição de 50 µL do subs-
trato da enzima (orto-difenilacridina 0,001%) em 5 mL de tampão L-

leucina (pH 8,0) e 8 µL de peroxidase. Transfere-se 500 µL da solução
estoque em um tubo de ensaio e adiciona a enzima isolada de LAAO
ou a peçonha bruta. Após 15 minutos com a adição de 50 µL de H2SO4
2 M e realiza-se a leitura espectrofotométrica em 490 nm (OKUBO et
al., 2012).
4.9 Atividade sobre o BAPNA (atividade enzimática de

serinoproteases)
A quantificação das unidades de enzima por minuto é realizada uti-

lizando-se o substrato cromogênico Benzoil-DL-arginil-p-nitroanilida (BAP-
NA), substrato sintético que ao ser degradado gera coloração amarela
que pode ser quantificado como indicativo da ação de serino proteases.
Antes de iniciar o experimento os tubos e as soluções precisam estar

ambientados à 37 °C e esta temperatura deve ser mantida até o fim da
análise
1. Diluir o substrato BAPNA a 1% em Tris-HCl 0,1 M pH 8,1

preparado em PBS e adicionar 0,294% de CaCl2.
2. Adiciona-se 500 µL da solução de Tris-HCl + BAPNA em
cada tubo contendo as amostras.
3. Aproximadamente 10 µg de peçonha bruta são suficientes para
visualizar a atividade, entretanto um screening de concentra-
ções é o mais recomendado para a realização deste ensaio,
possibilitando definir a menor dose responsiva a ser utilizada
nos testes de inibição.
* BRANCO – Um tubo preparado com 500 µL da solução
de Tris-HCl + BAPNA + Quantidade igual ao volume de
amostra (peçonhas, fármacos, produtos químicos, entre
outros).
4. Disparar o cronometro e manter os tubos sob leve agitação,
até atingirem coloração levemente amarelada (1 hora e 30 mi-
nutos).

5. Uma vez atingida à coloração, para-se a reação com 500 µL de
ácido cítrico 10%.
6. Realiza-se a leitura da amostra em um espectrofotômetro à
415 nm após a calibração do aparelho com o BRANCO.
O experimento segue com a leitura das amostras e o cálculo das

Unidades/minuto, sendo que 0,09 nm de absorbância = U/min. Uma
unidade de atividade enzimática será definida como a quantidade de en-
zima presente na amostra que é capaz de liberar 1 mol de p-nitroanilida
por minuto.
Para os ensaios de inibição de serinoproteases os compostos a
serem avaliados podem ser incubados previamente com as peçonhas,
em diferentes proporções, por 30 minutos a 37ºC com posterior ava-
liação da atividade. Controles deverão ser realizados utilizando apenas
os compostos em teste, possibilitando assim a verificação de possíveis
interferências nas leituras espectrofotométricas.
4.10 Avaliação de interações com Hialuronidases
Para avaliar possíveis ligações de diferentes compostos à estru-

tura de hialuronidases ou quebra das moléculas enzimáticas, utiliza-se
o método de eletroforese em gel de poliacrilamida (Laemmli, 1970),
conforme descrito no item 3.2.4. A técnica consiste na observação do
perfil de migração eletroforética das moléculas de enzima, hialuroni-
dases, previamente incubadas com os compostos a serem avaliados.
A enzima pode ser obtida comercialmente em farmácias (Hyalozima;
Apsen Farmacêutica S/A) e dissolvida conforme instruções do fabri-
cante para uma concentração de 4.000 UTR. Para cada amostra utiliza-
-se 12 µL da solução enzimática. Após incubação dos compostos com
as enzimas, por 30 minutos a 37ºC, adiciona-se 6 µL de tampão de
amostra (MANIATIS, 1982) não desnaturante, ou seja, sem adição
de β-mercaptoetanol em sua composição. O volume final de incubação
é de 30 µL sendo utilizado PBS para padronizar os volumes. Alguns
cristais de sacarose são adicionados às amostras, visando aumentar a

densidade destas, com subsequente homogeneização e aplicação nos
poços do gel.
4.11 Inibição da Succinato Desidrogenase avaliada em

extrato de fígado de frango
Preparo das soluções

Tampão Fosfato 0,1 M pH 7,4
Solução A: NaH2PO4 – 5,56 g para 200mL
Solução B: Na2HPO4.12H2O – 71,7 g para 1 L
Misturar 190 mL da solução A com 810 mL da solução B. Acertar

o pH para 7,4 e completar o volume para 2 L. Para acertar o pH utilizar
soluções de NaOH e HCl.
Preparo do Substrato I (sem adição do inibidor)

272 mL de água
160 mL de tampão fosfato 0,1 M
32 mL de succinato de sódio 0,1 M
16 mL de KCN 0,05 M
DCPI 0,0004 M (o volume de DCPI vai depender da absorbância:

ir adicionando de 1 em 1 mL até absorbância 600 nm. Como referência
medir a absorbância do DCPI puro.
a. Succinato de sódio 0,1 M: pesar 2,7 g de succinato de sódio

diluir em 50 mL do tampão fosfato 0,1 M, acertar o pH para
7,4 e depois completar o volume com tampão para 100 mL.
b. KCN: pesar 0,325 g de cianeto de potássio em uma balança
que esteja dentro de uma capela. Usar luvas e máscaras. Diluir
em 50 mL do tampão fosfato 0,1 M acertar o pH para 7,4 e
depois completar o volume com tampão para 100 mL.
c. DCPI: pesar 0,021 g de DCPI e diluir em 20 mL de tampão.

Preparo do Substrato II (Contendo o inibidor)
240 mL de água
160 mL de tampão fosfato 0,1 M
32 mL de succinato de sódio 0,1 M
16 mL de KCN 0,05 M
32 mL de ácido malônico 0,1 M
DCPI 0,0004 M (O volume de DCPI vai depender da absorbância:

ir adicionando de 1 em 1 mL até absorbância entre 600 nm. Para ter uma
ideia medir a absorbância do DCPI puro).
a. Ácido malônico 0,1 M: Pesar 1,04 g de ácido malônico diluir

em 50 mL de tampão fosfato 0,1 M, acertar o pH para 7,4 e
depois completar o volume com tampão para 100 mL.
Enzima
a. Bater no liquidificador 1 fígado de galinha fresco com 100 mL
de solução de sacarose 0,25 M em tampão fosfato 0,05 M pH
7,4.
b. Filtrar em gaze dobrada ou em tecido organza. Transferir
para tubos Falcons de 15 mL e centrifugar a 1400xg por 30
minutos.
c. O sobrenadante é descartado e ao sedimento adiciona 100 mL
de solução de sacarose 0,25 M em tampão fosfato 0,05 M pH
7,4 e homogeneíza (no agitador mecânico).
d. Diluir para uso (mais ou menos 20 x). Solução de sacarose
0,25 M em tampão fosfato 0,05 M pH 7,4. Misturar 100 mL do
tampão 0,1 M e 100 mL de água. Adicionar 8,55 g de sacarose.
Ácido malônico 0,3 M

Pesar 6,24 g de ácido malônico e diluir em 100 mL do tampão
fosfato 0,1 M, acertar o pH para 7,4 e depois completar o volume com
tampão para 200 mL.

Incubações e controles: para todos os testes faz-se necessário a
realização de controles contendo apenas o substrato I, e apenas o subs-
trato II, padronizando volumes e diluições do extrato mitocondrial para
obtenção de uma absorção a 600 nm. Tempos de incubação também
devem ser padronizados, sendo estes variáveis entre 0 e 10 minutos.
Incubações do extrato mitocondrial com os possíveis interferentes
(compostos naturais, químicos ou sintéticos) podem ser realizadas antes
da adição do substrato I ou antes da adição do substrato II (verificar a in-
teração de compostos com a enzima succinato desidrogenase impedindo
a ligação do substrato ou a ação do inibidor).
Os substratos I e II também podem ser incubados com os possíveis
interferentes antes da adição do extrato mitocondrial (verificar a intera-
ção de compostos com o substrato succinato ou com o inibidor ácido
malônico).
Os cálculos para a atividade enzimática devem ser realizados se-
gundo Lambert-beer (A = Ɛ. b. c), no qual o Ɛ (coeficiente de absorti-
vidade molar), correspondente à absortividade de 21500 µmol.L-1.cm-1
do DCPI no comprimento de onda de 600nm (BARDAWEEL et al.,
2011), b é o caminho óptico e a concentração (c) é a própria atividade
da enzima em U. mL-1 e a porcentagem de inibição (I %) é a diferença
desta atividade.

C A P ÍTU L O V
To x i n o l o g i a : E n saios
d e c i t o t o x i cidad e,
g e n o t o x i c i d ad e e
m u t a g ê n ese
Silvana Marcussi
Larissa Fonseca Andrade Vieira
Tatiane Siva de Abreu

5 . Metodologias em t o x i no l o g i a :
Ens aios de citotox i c i da de ,
genotoxicidade e m ut a g ê ne s e
5.1 Teste de citotoxicidade
O teste de citotoxicidade possibilita a escolha de concentrações

passíveis de induzirem efeitos farmacológicos ou tóxicos
sem afetar o desenvolvimento e multiplicação celular. Uma curva de
diferentes concentrações será utilizada para avaliar o efeito de venenos
ou toxinas sobre linfócitos do sangue periférico em cultura. As concen-
trações testadas serão escolhidas baseando-se em resultados de citoto-
xicidade, apoptose e necrose celular, induzidas por diferentes venenos
e toxinas, descritos anteriormente, sendo escolhidas concentrações de-
crescentes a partir das descritas.
O método do MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenylte-
trazolium Bromide] é utilizado para avaliar a viabilidade celular. Esse
método é baseado na transformação e quantificação colorimétrica do
MTT (MOSMANN, 1983). A cadeia respiratória e o sistema transpor-
tador de elétrons são hábeis em reduzir MTT e outros sais de tetrazólio,
formando cristais violetas conhecidos como cristais de formazan, não
solúveis em água. Estes cristais podem ser dissolvidos com adição de
1-propanol ou SDS (dodecil sulfato de sódio) e sua quantidade determi-
nada espetrofotometricamente como uma estimativa do número de mi-
tocôndrias funcionais e consequentemente do número de células viáveis
na amostragem avaliada.
Uma solução estoque de MTT (5 mg MTT/mL de água filtrada)
será filtrada em membrana estéril e armazenada por no máximo 2 sema-
nas a 4°C. A reação colorimétrica será iniciada com adição de MTT às
células (concentração final, 0,5 mg mL-1). A quantidade de linfócitos em
cultura será estimada por contagem em câmara de Neubauer e ajustada
para 2x104, distribuindo aproximadamente esse valor para cada poço

de uma placa de 96 poços contendo 100 µL de meio de cultura RPMI
(sem vermelho de fenol). As células receberão tratamentos com as di-
ferentes toxinas ou venenos em concentrações variadas, permanecen-
do em estufa de cultura celular por 16 horas. Ao término da incubação
será adicionado MTT que permanecerá em contato com as células por
3 horas a 37°C. Em seguida, serão adicionados 100 µL de isopropanol.
A densidade óptica (DO) será medida em espectrofotômetro a 560 nm.
Um controle branco será feito utilizando apenas isopropanol, sendo lido
e subtraído dos valores obtidos para as demais amostras.
5.1.1 Teste de viabilidade celular
A partir do método de exclusão que utiliza azul de Trypan (Sigma

pp. 1885) a 0,4% para corar as células não viáveis, as culturas serão ava-
liadas após incubação em diferentes períodos de tempo com diferentes
concentrações de venenos ou toxinas. Alíquotas das culturas celulares
contendo diferentes tratamentos serão coletadas e utilizadas para mon-
tagem de lâminas, possibilitando a avaliação da viabilidade celular. O
azul de Trypan tem maior afinidade por proteínas do soro do que por
proteínas celulares, portanto as células deverão ser lavadas e ressuspen-
didas em meio ou salina antes da contagem. Para que testes como os
de mutagenicidade e genotoxicidade sejam validados é importante que
os compostos testados não estejam interferindo nos ciclos celulares. As
células coradas e não coradas serão contadas em câmara de Neubauer
(4 quadrantes centrais da câmara serão contados) e o cálculo será feito
pela aplicação da seguinte fórmula: Número de células por mL = total
de células contadas X fator de diluição X 104.
5.1.2 Teste do micronúcleo em células humanas in vitro
a) Cultura de linfócitos a partir de sangue total

O teste de micronúcleo pode ser realizado de acordo com a técnica
de Moohead et al. (1960) com modificações, conforme descrito a seguir.
Aproximadamente 15 mL de sangue periférico humano serão coletados,

para cada experimento, por punção venosa de indivíduos saudáveis (não
fumantes, com idade entre 18-35 anos e que não receberam medicamen-
tos recentemente). Os voluntários (de 5 a 10) receberão o convite para
participar da pesquisa e os esclarecimentos necessários sobre a coleta
do sangue, a utilização desse material durante os testes e a importân-
cia do projeto para a ciência e a medicina. Todos os ensaios realizados
com utilização de sangue humano deverão passar por prévia avaliação
e aprovação de uma Comissão de Ética em Pesquisa com humanos e os
voluntários deverão assinar termo de consentimento livre e esclarecido
para participação na pesquisa.
O sangue total será processado até 4 horas após a coleta. Em um
frasco de cultura contendo 5 mL de meio RPMI a 80% contendo uma mis-
tura de antibióticos (penicilina e estreptomicina), 20% de soro fetal bo-
vino e 4% de fitohemaglutinina A, será adicionado aproximadamente 0,5
mL de sangue, incubando a 37°C em estufa com 5% de CO2 por 24 horas.
As culturas de linfócitos serão mantidas por 72 horas não necessi-
tando de trocas gasosas durante o experimento.
Os tratamentos serão adicionados às culturas 24 horas após o iní-
cio do cultivo e consistirão de diferentes proteínas isoladas ou vene-
nos brutos em diversas concentrações, escolhidas com base nos testes
preliminares de viabilidade celular. A droga mutagênica utilizada como
controle será a cisplatina (6 µg mL-1), um antitumoral adquirido comer-
cialmente. Para o controle negativo, serão adicionados 50 µL de salina
(diluente das amostras) nas mesmas condições das culturas tratadas com
toxinas ou venenos.
Embora os linfócitos tenham crescimento e multiplicação como
células livres, os frascos serão levemente agitados a cada 24 horas a par-
tir do início das culturas para possibilitar um maior contato das células
com os tratamentos realizados, tanto com as toxinas e venenos quanto
com a citocalasina (bloqueador da citocinese).
Após 44 horas a contar do início das culturas, serão adicionados 6
µg de citocalasina por mL da cultura e os frascos serão conservados na
estufa por mais 28 horas. A citocalasina é um inibidor de polimerização
da proteína actina requerida para a formação do anel de microfilamen-

tos que induz a contração do citoplasma e clivagem da célula em duas
células filhas (citocinese) (CARTER, 1967). No teste do micronúcleo in
vitro, o uso da citocalasina B, conforme proposto por Fenech e Morley
(1985), leva ao bloqueio da citocinese, mas não da divisão nuclear, re-
sultando em um acúmulo de células binucleadas a partir de células que
passaram por apenas um ciclo de divisão, independentemente do grau de
sincronia e de proporção de células em divisão. Adicionalmente, células
que passaram por mais de um ciclo celular podem ser observadas nas
formas tri ou multinucleada.
Ao final de 72 horas, as culturas serão transferidas para tubos falcon
de 15 mL e centrifugadas a 212xg, por 9 minutos. Os sobrenadantes se-
rão descartados, e as suspensões de células serão desprendidas dos tubos
com o auxílio de pipetas Pasteur descartáveis, sendo puxadas para dentro
das mesmas. Em seguida serão adicionados 5mL de solução hipotônica
gelada a cada tubo (citrato de sódio, C6H5Na3O7 . 2H2O a 0,034 M) e as
células serão soltas ao mesmo tempo, permanecendo nessa solução por
5 minutos enquanto serão levemente agitadas com pipetas. A solução de
citrato de sódio torna as células túrgidas, e nesse passo do procedimento
a agitação não pode ser brusca para que as células não se rompam.
Ao término dos 5 minutos em solução hipotônica, serão adicio-
nados 500 µL de fixador (metanol/ácido acético 3:1), sendo o conteúdo
dos tubos novamente agitado 40x e centrifugado a 212xg por 9 minutos.
O sobrenadante será descartado, o sedimento desprendido do tubo e pu-
xado para dentro da pipeta, seguindo com adição de 5mL de fixador e
agitação de mais 40x. Formaldeído será acrescentado (25 µL) para auxi-
liar na preservação do citoplasma, repetindo a agitação 20x.
O processo anterior de centrifugação, descarte do sobrenadante,
desprendimento das células, adição de fixador e agitação 40x, será repe-
tido 2 vezes, utilizando fixador 3:1, sem o formaldeído. Nas duas últi-
mas centrifugações o descarte do sobrenadante não é feito apenas despe-
jando-o, mas sim pela retirada com auxílio de pipeta Pasteur, impedindo
a perda de células. Por fim, o sobrenadante será descartado de forma que
reste aproximadamente 1mL no tubo, sendo novamente agitado. A sus-
pensão de células será então gotejada (5 a 6 gotas/lâmina) sobre lâminas

previamente lavadas e permanecerão secando a temperatura ambiente.
Serão montadas 3 lâminas para cada tratamento. A lavagem das lâminas
será realizada com detergente neutro (Extran a 5%; Merck), sendo as lâ-
minas esfregadas várias vezes com esponja macia, enxaguadas em água
abundante, reenxaguadas 3x em água filtrada sendo mantidas em mesma
água a temperatura de 4ºC, até serem utilizadas. As lâminas podem per-
manecer na geladeira por período de 1 a 2 dias antes da realização do teste.
As lâminas contendo as células serão finalmente coradas com so-
lução de Giemsa a 5% (8 mg de Giemsa em pó mais 500 mL de glicerol
e 1000 mL de metanol tamponado, pH 6,8) em tampão Sorensen (fosfa-
to de potássio monobásico 0,06 M + fosfato de sódio dibásico 0,06 M,
pH 6,8) por 7 minutos, colocadas em estantes para secar em temperatura
ambiente e observadas ao microscópio de luz para contagem de células,
utilizando lentes de imersão em óleo.
Giemsa é um corante pancrômico (para esfregaços sanguíneos), ou
seja, composto por uma mistura de corantes de características neutras,
dependentes do pH da solução corante, que em condições apropriadas
coram os componentes nucleares e citoplasmáticos dos leucócitos, com
predominância de tons azulados diversos, quando básicos. Esse corante
é uma mistura de azur II (mistura equimolar de azur 1 e azul de metile-
no) e eosinato de azur II (corante formado pela combinação equimolar
de azur 1, azul de metileno e eosinina amarelada). Essas características
do corante Giemsa podem ser encontradas no site do fabricante (www.
doles.com.br).
b) Análise das lâminas e determinação da frequência de mi-

cronúcleos
As lâminas previamente codificadas serão analisadas em teste
cego, em microscópio de luz, com aumento de 1000 vezes. Os critérios
de avaliação dos micronúcleos, os números de células avaliadas e os cál-
culos realizados para determinar a presença ou não de efeito mutagêni-
co induzido pelos compostos testados, seguirão protocolo previamente
descrito por Fenech (2008). Serão contadas 500 células por tratamento
sendo consideradas células mono, bi, tri e multinucleadas (Figura 16).

Serão contadas 1000 células binucleadas/indivíduo/tratamento, obser-
vando-se a presença ou ausência de micronúcleo. Os valores das células
com diferentes quantidades de núcleos serão utilizadas para o cálculo do
IPBC (índice de proliferação celular) que indica se o desenvolvimento
e multiplicação celulares mantiveram-se normais após os tratamentos,
quando comparados com o controle composto por cultura não tratada. O
cálculo do IPBC será feito a partir da seguinte fórmula:
IPBC = 1 (mono) + 2 (bi) + 3 (tri + multi)

________________________________________
500
A presença de micronúcleos será avaliada apenas em células binu-

cleadas por terem sofrido apenas uma divisão celular, sendo os efeitos
mutagênicos passiveis de serem observados na primeira geração de cé-
lulas a partir das que receberam os tratamentos.
Figura 16. Fotomicrografias obtidas no teste do micronúcleo em

linfócitos de sangue periférico humano. (1) a. Célula binucleada; b.
Célula binucleada com micronúcleo.
Fonte: Fenech (2008). (2) a. Célula mono; b. tri e c. tetra-nucleadas.
Fonte: fotos de Silvana Marcussi.

5.1.3 Teste do cometa em leucócitos humanos
a) Obtenção de leucócitos humanos e realização do teste do

cometa
Para o teste do cometa utiliza-se a metodologia de Singh et al.
(1988), conforme descrita a seguir. Os testes serão realizados a partir de
sangue total com posterior análise apenas dos leucócitos isolados du-
rante o tratamento das lâminas. Os voluntários para doação de alíquotas
de sangue devem apresentar as mesmas características definidas para o
teste do micronúcleo, sendo necessários de 3 a 6 voluntários, conside-
rando a reprodutibilidade dos resultados, sendo o sexo dos voluntários
indiferente. Testes piloto devem ser realizados com a finalidade de defi-
nir o tempo adequado de cultivo e tratamento das células uma vez que as
amostras testadas poderiam estar atuando sobre alguma fase específica
do ciclo celular dos leucócitos.
O tratamento será então realizado com apenas uma amostra em
diferentes tempos de cultivo (7 horas em G1; 24 horas em S e 48 horas
em G2) para que se possa escolher o período de cultivo das células mais
adequado para a realização dos testes. O ensaio também pode ser rea-
lizado sem cultivo celular, utilizando o sangue para as incubações ime-
diatamente após sua coleta, para tanto, são utilizados 300 µL de sangue
diluídos em 300 µL de salina tamponada em fosfato (PBS), acondicio-
nados no escuro, em câmara de cultivo celular a 37ºC, em tubos de 1,5
mL, adicionados dos tratamentos.
As células permanecerão na presença dos tratamentos por 4 horas,
sendo em seguida utilizadas para o preparo das lâminas, antes que o
sistema de reparo celular possa atuar. Será necessária uma suspensão
celular com aproximadamente 106 células/mL para trabalhar com 5 a 10
mil células por lâmina, embora sejam avaliadas apenas 100 nucleoides
por tratamento.
A solução de lise será preparada e mantida a 4°C. A agarose de
baixo ponto de fusão (LMP) será derretida em microondas e transfe-
rida para banho-maria a 37°C. As luzes do laboratório permanecerão
apagadas durante os passos seguintes, em que aproximadamente 20 µL

de cada cultura celular serão transferidos para microtubos (este volume
poderá sofrer alterações uma vez que deve ser padronizado após a reali-
zação de ensaios pilotos) contendo 100 µL de agarose LMP.
A mistura será homogeneizada e colocada sobre a lâmina com
agarose NMP, sendo coberta com a lamínula. As lâminas permanece-
rão na geladeira por 10 minutos, a lamínula será então retirada e a lâ-
mina mergulhada na solução de lise recém-preparada, permanecendo
nesta solução por no mínimo 2 horas. Como controle positivo será uti-
lizada a doxorubicina (2 µg mL-1), uma droga antitumoral genotóxica
fotossensível.
b) Eletroforese
A solução tampão de eletroforese será preparada na véspera do
experimento e conservada a 4°C, a cuba de eletroforese será mantida
em sala com baixa temperatura ambiente, e as lâminas serão retiradas da
solução de lise sendo mantidas em solução de eletroforese por 20 minu-
tos a 4ºC e em seguida transferidas para a cuba de corrida eletroforética.
A fonte de eletroforese será programada com voltagem fixa de 25 V e
miliamperagem de 300 mA para cuba com capacidade para 33 lâminas,
e o tempo de corrida deve ser fixado em 20 minutos.
Após a corrida, as lâminas serão retiradas da cuba e colocadas
novamente em um suporte horizontal permanecendo em solução de
neutralização por 25 minutos. As lâminas permanecerão em estantes
apropriadas até que estejam totalmente secas. O DNA será em seguida
precipitado em etanol a 100% por 3 minutos, e seco em temperatura
ambiente. O armazenamento deve ser feito em caixas para lâminas his-
tológicas, em local seco, sem luminosidade e a temperatura ambiente.
c) Coloração e análise
A coloração será feita com brometo de etídio, ou outro corante
apropriado para DNA, na concentração de 20 µg mL-1. Para isso, serão
colocados 100 µL da solução de uso sobre cada lâmina, protegidas da
luz, cobertas com uma lamínula e imediatamente analisadas em micros-
cópio de fluorescência com aumento de 200 a 400x. A coloração pode

manter-se razoável por algumas horas, se as lâminas forem mantidas em
recipiente umedecido e opaco.
Os padrões dos cometas serão analisados por escore visual. Após
a análise, as lâminas e lamínulas deverão ser descartadas para evitar que
se misturem com outras não contaminadas com brometo, caso este seja
o corante utilizado. De acordo com Collins et al. (1997), as células anali-
sadas devem ser classificadas conforme a extensão do dano no DNA em
cinco categorias: sem danos (dano<5%), baixo nível de dano (5-20%),
médio nível de dano (20-40%), alto nível de dano (40-95%) e totalmen-
te danificada (dano>95%). Essas categorias poderão ser discretamente
redistribuídas neste protocolo, buscando uma melhor adequação ao tipo
de análise realizada por escore visual e aos resultados observados. Dessa
maneira, os valores que representam os níveis de danos no DNA consi-
derados de alto nível e totalmente danificado serão substituídos respec-
tivamente por 40-85% e dano >85%.
De acordo com o comprimento da cauda em relação ao diâmetro
da cabeça, os cometas podem ser classificados em: classe 0 sem cauda
(dano <5%), classe 1 com comprimento da cauda menor do que o di-
âmetro da cabeça do cometa (dano de 5-20%), classe 2 com cauda de
comprimento igual a uma vez o diâmetro da cabeça do cometa (dano de
20-40%), classe 3 com cauda de comprimento maior que uma e menor
que duas vezes o diâmetro da cabeça do cometa e classe 4 com cauda de
comprimento maior que duas vezes (Figura 17).

Figura 17. Distribuição dos tipos de cometa classificados como 0
(<5% de dano), 1 (5 – 20% de dano), 2 (20 – 40% de dano), 3 (40 –
85% de dano) e 4 (>85% de dano), descrito por Collins et al. (1997) e
adaptado por Eleutério et al. (2012). Exemplos de classes de cometa
obtidas pelo grupo de pesquisa do laboratório de Bioquímica sob a
orientação da Profa. Silvana Marcussi.
5.1.4 Teste do Cometa em células vegetais
Para a realização do teste do cometa em células vegetais, as raí-

zes são coletadas após 48 horas de exposição de sementes de Lactuca
sativa ou Allium cepa às soluções teste, em sequida segue-se o proto-
colo descrito por Jovtchev et al. (2001), com algumas adaptações. São
preparadas três lâminas por tratamento a partir de pontas de raízes (5-10
mm) tratadas. As raízes são trituradas, utilizando lâmina de bisturi, em
300 µL de PBS a 1% à 4ºC e os núcleos filtrados utilizando nylon com
mesh de 50 µm. Lâminas de microscópio, cobertas com uma fina cama-
da de agarose com ponto de fusão normal (1%), recebem as amostras
de núcleos tratados (30µL) acrescidos de agarose com baixo ponto de
fusão (1%), na proporção de 1:1. As lâminas são cobertas com lamínula
e permanecem a 4ºC por 5 minutos para solidificação do gel, sendo em

seguida retiradas as lamínulas e as lâminas imersas em solução de lise
(30 mM NaOH, 0,5 mM EDTA, pH 11,8) onde devem permanecer por
dez minutos em temperatura ambiente. Em seguida, as lâminas devem
ser lavadas em tampão TBE 1X (90 mM Tris-borato, 2 mM EDTA, pH
8,4), três vezes com duração de 5 minutos cada lavagem. As lâminas são
então colocadas em uma cuba de eletroforese horizontal contendo solu-
ção de corrida (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 13). A eletroforese
é realizada por período de 15 minutos a 25 V (300mA) a temperatura
ambiente.
Após a corrida, as lâminas são então desidratadas em etanol abso-
luto por período de 5 minutos e secas ao ar. Uma alíquota de 15 µL de
iodeto de propídio diluído a 0,1% é colocada sobre cada lâmina e estas
cobertas com lamínula permitindo a coloração das massas de DNA e ob-
servação destas em microscopia de fluorescência (520-560 nm) em au-
mentos de 200 e 400X. Um total de 300 nucleoides devem ser contados
e classificados, de 0 a 4, para cada tratamento, considerando os níveis de
fragmentação descritos por Collins et al. (1997).
As unidades arbitrárias (0-400; onde 0 = sem danos e 400 = 100%
de danos) são calculadas de acordo com a equação (1 x número de nu-
cleoides classificados como 1) + (2 x número de nucleoides classifica-
dos como 2) + (3 x número de nucleoides classificados como 3) + (4
x número de nucleoides classificados como 4), conforme descrito por
Collins et al. (1997).
5.1.5 Avaliação de efeitos de compostos naturais (peçonhas)

sobre o ciclo celular de células meristemáticas de
Lactuca sativa ou Allium cepa
a) Coleta e fixação do material
Sementes comerciais de Lactuca sativa ou Allium cepa serão co-

locadas para germinar, em placas de petri forradas com papel filtro e
umedecidas com água destilada, por período de 24 horas a temperatura
de 24ºC acondicionadas em câmara de cultivo celular.

Serão coletadas no máximo 8 sementes, que apresentem pontas de
raízes com tamanho inferior a 1mm, sendo estas transferidas para uma
placa de petri contendo um segmento pequeno (~ 1 cm de diâmetro) de
papel filtro. O segmento de papel será embebido com 500 μL da amostra
a ser avaliada e em seguida a placa será vedada com parafilme, para evi-
tar evaporação e consequente ressecamento e, acondicionada em câmara
de cultivo celular por 24 horas.
As raízes serão então coletadas e fixadas em Carnoy (3 partes de
álcool etílico/ 1 parte de ácido acético). O volume de fixador utiliza-
do deverá ser aproximadamente 3x o volume das sementes. O primeiro
volume de fixador será substituído após 10 minutos e após 1 hora será
realizada a segunda substituição do fixador. A fixação deve ocorrer por
no mínimo 24 horas possibilitando a posterior confecção das lâminas.
b) Preparo da Lâmina
As raízes serão lavadas por 5 minutos em placa de petri conten-

do água destilada (3 lavagens, descarta-se a água cuidadosamente, para
evitar a sucção de sementes, com o uso de uma pipeta Pasteur de poli-
propileno). As raízes são então separadas com o auxílio de uma pinça
ou bisturi e colocadas em HCl 1M por 10-13 minutos em banho maria
a 60ºC.
As raízes serão então transferidas para uma placa de petri conten-
do água gelada a fim de sessar a hidrólise. Em seguida, os meristemas
das raízes serão picotados, com o auxílio de um microscópio estere-
oscópico (lupa), sobre uma lâmina de vidro, utilizando como meio de
montagem das lâminas ácido acético e orceína ou carmim.
Após a montagem o material será coberto com uma lamínula de
24x24 mm, sendo esta ajustada com leves batidas, na região inferior,
utilizando um pincel. As lâminas serão então envolvidas em 3 tiras de
papel de filtro e pressionadas com o polegar.
Obs: A montagem das lâminas utilizando como meio ácido acéti-
co e orceína ou carmim, permite que a coloração seja antecipada durante
os processos de montagem. O próximo passo seria flambar a lâmina

(passar a lâmina 3 vezes seguidas, rapidamente sobre uma chama) para
melhor penetração do corante nas células. A lamínula pode ser vedada
(processo de lutagem) com aplicação de resinas especiais ou base de
unha em suas extremidades, evitando assim que o oxigênio do ar promo-
va a degradação do corante e permitindo que a lâmina tenha um tempo
de vida útil de aproximadamente 10 dias. Caso a lamínula não seja ve-
dada a lâmina deve ser avaliada em no máximo 2 dias.
c) Coloração com Giensa
Para coloração com Giensa a lâmina deve ser mergulhada em ni-

trogênio líquido por 1 minuto e em seguida a lamínula deve ser removi-
da com o auxílio de uma gilete (tocar uma das extremidades da lamínula
com o polegar, em seguida inserir a gilete abaixo da extremidade tocada
e utilizá-la como alavanca para remover a lamínula; esse processo re-
quer cuidado para evitar que a lamínula se quebre). Em seguida a lâmina
será mergulhada na solução de Giensa (Solução estoque: 1 g de Giensa
dissolvido em 54 mL de glicerina a 60ºC durante 90 minutos, deixar
esfriar em temperatura ambiente, adicionar 84 mL de metanol, deixar
descansando em frasco âmbar por no mínimo uma semana e por fim, fil-
trar com uso de papel de filtro e funil; Solução de uso: 1 mL da solução
estoque diluído em 30 mL de tampão *Sorensen) por 5 minutos.
* Preparação do tampão Sorensen:

1. preparar uma solução de KH2PO4 à 0,06 M; pesar 8,1654 g de
fosfato de potássio monobásico (anidro) e dissolver em 1 L de
água deionizada.
2. preparar uma solução de Na2HPO4 à 0,06 M; pesar 21,4884 g
de fosfato de sódio bifásico e dissolver em 1L de água deioni-
zada. Preparar a solução final misturando volumes iguais das
duas soluções para obter pH igual ou próximo a 6,8.
Outra coloração aplicável para este tipo de ensaio é a realizada

com Schiff (MONDIN; AGUIAR-PERECIN, 2009). Para esta colora-

ção as raízes devem ser mergulhadas no reativo de Schiff por período de
2 horas precedendo o preparo das lâminas.
d) Avaliação
A lâmina será avaliada em microscópio óptico com observação se-
guindo um padrão em ziguezague, evitando a sobreposição dos campos
observados. Todas as células em interfase, nas diferentes fases mitóticas
e alterações no ciclo celular serão contadas. Para cada tratamento serão
avaliadas de 5 a 10 lâminas com contagem entre 500 a 1000 células por
lâmina.
5.1.6 Avaliação de fragmentação de DNA usando eletroforese

em gel de agarose (células meristemáticas de Lactuca
sativa ou Allium cepa)
a) Coleta do material
A coleta do material será realizada conforme descrito no item
5.1.5a.
OBS: Soluções e reagentes necessários

–– Tampão de extração – CTAB 2%, NaCl 1,4 M, TrisHCl 0,1 M,
pH 8,0 e EDTA 20 mM.
–– Fenol:Clorofórmio Isoamil (FCIA)
–– Isopropanol (mantido a -20ºC)
–– Etanol 70% e Etanol absoluto
–– Tampão TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM) (mantido
a -20ºC)
–– Tampão TBE 1x (Tris 0,89 M, EDTA 0,02 M, Ácido Bórico
0,89 M)
b) Extração de DNA vegetal
Para a extração de DNA vegetal será utilizada a metodologia pro-

posta por Doyle e Doyle (1990). O tampão de extração será aquecido

em banho maria a 65oC. Sementes frescas (sem fixação) serão coleta-
das e maceradas com uso de um almofariz até a obtenção de um pó. O
material será transferido para um tubo de 1,5 mL e suspenso em 650
μL de tampão de extração (apenas adicionar quando o tampão estiver
atingido a temperatura de 65ºC). A amostra será homogeneizada com
uso de um vortex e em seguida permanecerá em banho maria a 65ºC por
30 minutos. Após este período serão adicionados 650 μL de Fenol:Clo-
rofórmio:Isoamilíco seguindo com homogeneização (verter o tubo 50x)
e centrifugação por 10 minutos a 1800xg.
Ao término destes procedimentos o conteúdo do tubo deverá apre-
sentar-se em três fases claramente distinguíveis (Figura 18), duas fases
líquidas intermediadas por uma fase contendo resíduos sólidos. Com
muito cuidado, utilizando-se uma pipeta Pasteur, coletar a primeira fase
aquosa e transferi-la para outro tubo, sendo as demais fases descartadas.
Figura 18. Representação das fases obtidas durante o processo

de extração do DNA.
Fonte: elaborada por Silvana Marcussi.
Ao tubo contendo a amostra de DNA serão adicionados 500 μL

de Isopropanol gelado (-20°C) seguindo com homogeneização (verter o
tubo levemente 50x) e repouso overnight a -20°C. Em seguida a amostra
será submetida à centrifugação por 10 minutos a 1800xg resultando na
formação de pellets aderidos às paredes e ao fundo do tubo. O sobrena-

dante deve ser descartado cuidadosamente com o auxílio de uma pipeta
Pasteur, evitando tocar no pellet. O pellet de DNA será então suspenso
em 1 mL de etanol 70%, centrifugado por 10 minutos a 1800xg, com
posterior descarte do sobrenadante e suspensão do pellet em etanol ab-
soluto. A última lavagem será realizada com centrifugação por 5 mi-
nutos a 1800xg, descarte do sobrenadante e secagem do pellet (o tudo
permanecerá vertido sobre um papel filtro por período de 30 minutos).
O pellet será suspenso, com o auxílio de um pipetador automático,
em aproximadamente 20 μL de tampão TE (o volume de tampão varia
de acordo com o tamanho do pellet, pellets grandes requerem um volu-
me maior de TE). O DNA extraído pode ser armazenado a -20ºC.
O tampão TE também pode ser acrescido de RNAses, nesse caso
deve-se incubar o tubo, contendo a amostra de DNA, a 37ºC por 4 horas.
c) Gel de Agarose
O gel de agarose será preparado a 1,5% em tampão TBE 1x (aque-

cer a mistura em microondas até obtenção de solução translúcida).
Esfriar a solução (mas não deixa-la atingir o ponto de solidificação),
adicionar 2,5 μL de Brometo de etídio (agente intercalante de DNA alta-
mente carcinogênico), verter a solução na cuba de eletroforese, posicio-
nar corretamente o pente e esperar a polimerização do gel.
d) Corrida eletroforética
Uma alíquota contendo 2 μL da solução de DNA será transferida

para um tudo contendo 1 a 5 μL do Load Dye (a quantidade varia de
acordo com o tipo de Load Dye, sendo esta dependente das especifica-
ções do fabricante) e o volume será completado para 10 μL com água
ultrapura.
A cuba de eletroforese será preenchida com TBE 1x até a submer-
são do gel. As amostras serão então aplicadas nos poços formados no gel
e a corrente elétrica ligada a 80V durante 1 hora permitindo a migração
das moléculas.

Obs: devem ser também avaliados o perfil eletroforético de um controle
negativo (sementes germinadas em água destilada) e de um padrão de
fragmentação de DNA (obtido comercialmente).
5.1.7 Extração de DNA de leucócitos humanos
Todo o material usado durante o experimento deverá ser autocla-

vado e manipulado em baixa luminosidade e temperatura. O método
consiste em uma adaptação do protocolo da EMBRAPA (2007) e uma
metodologia mais atual o protocolo de Lahiri e Nurnberger (1991) no
primeiro e segundo procedimento respectivamente. Dois procedimentos
de extração estão descritos a seguir:
Primeiro Procedimento:
1. Coleta-se 20 mL de sangue em tubos com anticoagulante
EDTA 15%. Recomenda-se utilizar 2 tubos falcon contendo
10 mL de sangue em cada um. Adiciona-se 20 mL de solução
de hemólise A (Tris-HCl 10 mM pH 7,6, MgCl2 5 mM, NaCl
10 mM) em cada tubo contendo 10 mL de sangue, deixando
em repouso durante 3 horas à temperatura ambiente.
2. Após o repouso, procede-se por uma centrifugação à 900xg du-
rante 20 minutos à 4° C, dispensando o sobrenadante e suspen-
dendo o pellet resultante em 5 mL de tampão de hemólise A.
3. Realiza-se uma nova centrifugação à 800xg por 10 minutos à
4° C, esse procedimento deve ser repetido até obter-se somen-
te uma massa branca de células no fundo do tubo.
4. O precipitado de células brancas é então suspendido em 500 µL
do tampão de hemólise A e centrifugado a 16000xg à 4° C por
1 minuto. O pellet obtido é então ressuspendido em 500 µL da
solução de hemólise B (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 10 mM,
NaCl 100 mM, SDS 0,5%) misturando a solução no vortex.
5. Feito a agitação em vortex, adicionar 50 µL de uma solução
de tripsina (20 mg mL-1), agitar levemente e incubar à 55°C
overnight.

6. Decorrido o período de incubação adicionar 240 µL de NaCl
5M e resfriar por 15 minutos em banho de gelo. Agitar a so-
lução por inversão até obtenção de coágulos de proteínas para
em seguida centrifugar a amostra contendo coágulos proteícos
à 16000xg à 4°C por 15 minutos.
7. Separa-se sobrenadante e acrescenta-se etanol gelado em 2x o
volume do sobrenadante.
8. Por fim a solução é submetida à centrifugação à 16000xg à
4°C por 15 minutos obtendo-se o precipitado de moléculas de
DNA.
Segundo Procedimento:
1. Coleta de sangue total em um tubo Vacutainer contendo 100
µL de EDTA 15%.
2. Transferir 5 mL de sangue para um tubo de centrifugação de
15 mL (Falcon) e adicionar-se 5 mL de tampão de baixa sali-
nidade contendo Tris-HCl 10 mM pH 7,6, KCl 10 mM, MgC12
10 mM e EDTA 2 mM (TKM l).
3. Adicionar 125 µL de Nonidet P-40 (NP-40, Sigma) ou IGE-
PAL (Solução 10%) para lisar a membrana plasmática e cario-
teca. Misturar bem invertendo diversas vezes.
4. Centrifugar a 800xg durante 17 minutos à temperatura am-
biente (TA)
5. Verter lentamente fora o sobrenadante e guardar o sedimento
nuclear (pelete pequena no fundo do tubo) e lava-se o sedi-
mento em 5 mL de tampão e centrifuga-se TKM1 por 17 mi-
nutos à 800xg.
6. Suavemente ressuspender o sedimento (pelete) em 0,8 mL de
tampão de elevado teor de sal contendo 10 mM de Tris-HC1
pH 7,6, KCl 10 mM, MgCl2 10 mM, NaCl 0,4 M e EDTA 2
mM (TKM 2).
7. Adicionar 50 µL de SDS a 10% e, em seguida, misturar cuida-
dosamente toda a suspensão por pipetagem e para trás diversas
vezes e incuba-se durante 10 minutos a 55 ° C. Cuidado com

a formação de bolhas. Transferir com a pipeta de Pasteur para
um tubo de 2 mL (Ependorf).
8. Adicionar 0,30 mL de NaCl a 6 M no tubo e misturar bem por
3 minutos.
9. Centrifuga-se a 12000xg durante 5 minutos, em microcentrí-
fuga.
10. Guardar o sobrenadante que contém DNA e descartar o sedi-
mento de proteína precipitada na parte inferior do tubo.
11. Em um tubo de 15 mL, adicionar ao sobrenadante 2 volumes
de etanol a 100% à Temperatura Ambiente e inverter o tubo
várias vezes até que o DNA precipite. Se levar ao freezer por
10 minutos ajudará na precipitação. Uma centrifugação a
1800xg por 5 minutos também poderá ajudar.
12. Remover as fitas de DNA precipitado e colocá-los em um tubo
de microcentrífuga contendo 1 mL de gelo frio de etanol 70%.
Com a ajuda de uma ponteira com a extremidade cortada aspi-
rar para outro tubo de 2 mL (Ependorf)
13. Centrifugar durante 5 minutos a 12000xg a 4°C.
14. Secar o sedimento em um DNA Speed-Vac e ressuspender em
100 µL ou até 500 µL água a 65°C durante 15 minutos.
15. Medir a concentração de DNA espectrofotometricamente nos
comprimentos de onda de 260 nm e 280 nm e avaliar a qua-
lidade do DNA por eletroforese em gel de agarose a 1%. A
proporção A260/A280 ideal é entre 1,8 e 2,1 que refere-se à
relação DNA/Proteína.
Uma vez obtido o DNA na metodologia anterior em quantidade

e qualidade adequada, procede-se para a avaliação da fragmentação do
DNA. O ensaio se baseia no potencial de um dado agente em promo-
ver a fragmentação do material genético, entretanto, é possível também
avaliar o potencial deste agente em proteger o DNA contra um agente
degradante. A avaliação dessa metodologia é feita através de uma corri-
da eletroforética que será descrita a seguir.

Figura 19. Foto demonstrativa de amostras de DNA extraído pelo
segundo procedimento descrito, submetidas à eletroforese em gel de
agarose a 1%.
5.1.8 Ensaio de Fragmentação de moléculas de DNA

obtidas de leucócitos humanos
Preparo das amostras para corrida em Gel de Agarose

Gel de Agarose 10%
Prepara-se uma solução de agarose a 10 % em água destilada
qsp, com quantidade adequada ao volume do gel que se deseja preparar
(*Obs.: Preparar uma quantidade um pouco maior do que o que se pre-
tende usar, pois durante o processo de polimerização ocorre evaporação
da água). O gel de agarose é levado ao micro-ondas em potência média
por 4 minutos para a polimerização do gel. Após este tempo o gel deve
estar transparente, indicando que está pronto. Deixe resfriar até 37°C,
e acrescente 5 µL do corante Gel Red Unisafe (20.000x) para cada 100
mL de gel. Após esta etapa transferir o gel para a cuba de eletroforese de
corrida de DNA, colocar os pentes para formação dos poços onde serão
incubadas as amostras.

Tampão de amostra
*Ficoll 400/Glicerol...................0,3 g
EDTA 500 mM pH 8,0..............20 µL
Azul de bromofenol...................25 mg 0,25%
Xileno cianol.............................25 mg 0,25%
Água qsp....................................10 mL
* O Ficoll pode ser substituído por Glicerol, sua utilidade é apenas aden-
sar a solução.
Observação: Ponteiras, água MiliQ, Béqueres, Tubos de 2 mL, tubos

de 15 mL, Soluções de PBS, TKM1 TKM2, NACl 6M são autoclavadas
por 30 minutos à 121°C.
Programa da Corrida
A corrida será conduzida a 130 v e 300 mA por 3:30 horas. O tam-
pão de corrida utilizado é TEB Diluído 5X (Tris 121,1 g, EDTA 3,72 g
e ácido bórico 51,3 g, água qsp 1000 mL).

C A P ÍTU L O V I
To x i n o l o gia:
A t i v i d a d e s in vivo
Silvana Marcussi
Tatiane Siva de Abreu
Tássia Flávia Dias Castro

6. Metodologias em To x i no l o g i a :
Atividades in v i v o
6.1 Indução de edema
P ara avaliação da indução de edema os animais serão distribu-

ídos para teste em grupos de 3 camundongos Swiss machos
(18-22 g). No ensaio, serão injetados via intradérmica (i.d) na região
intraplantar da pata direita (Figura 20) 50 µL de soluções contendo so-
mente o PBS (controle), e amostras com 10 µg de peçonha bruta de ser-
pente (ex: B. jararacussu) dissolvidas em PBS ou peçonha previamente
incubada com possíveis inibidores (30 minutos à 37°C). Previamente,
será feita a leitura das patas antes da inoculação das amostras (tempo 0
hora). Em seguida, será realizada a mensuração das patas em diferen-
tes intervalos de tempo de 30 minutos, 1 hora e 3 horas (de cada valor
obtido será subtraído o valor inicialmente aferido no tempo 0 hora). O
aumento da área na pata dos camundongos será medido com um paquí-
metro de baixa pressão 0,01 mm (Mytutoyo, Japão) e expresso em por-
centagem direta de edema induzido (STABÉLI et al., 2006). No quadro
6 é mostrado um esquema para montagem dos resultados do experimen-
to da indução do edema.
Figura 20. Imagem representativa de injeção intraplantar (subplantar)

realizada na pata de camundongos para testes de edema.

Quadro 6. Esquema demonstrativo para montagem e coleta dos
dados experimentais do teste de edema de pata.
Diâmetro da pata (mm)
Amostras
0h 30min 1h 3h
Bothrops jararacussu (10 µg)
Bothrops jararacussu (10 µg) +
composto a ser avaliado
PBS (50 µL) (Controle)
6.2 Atividade hemorrágica
A atividade hemorrágica será descrita segundo método de Nikai

et al. (1984). Amostras contendo peçonha de serpente (Ex: B. jararaca)
diluída em 50 µL de solução salina, ou peçonha previamente incubada
com possíveis inibidores (30 minutos à 37°C) serão injetadas por via
intradérmica no dorso de camundongos machos (Figura 21) de 18 a 22 g
(n=3). Os animais serão distribuídos em grupos de 3 animais, e 3 horas
após a injeção os animais serão eutanasiados com CO2, as peles removi-
das e os halos hemorrágicos medidos em dois ângulos retos (diâmetros)
e expressos em mm. No quadro 7 é apresentado um esquema para mon-
tagem dos resultados do experimento da indução de hemorragia.
Figura 21. Imagem representativa de injeção intradérmica realizada

em camundongo para testes de hemorragia.

Quadro 7. Esquema demonstrativo para montagem e coleta dos dados
experimentais do teste de hemorragia.
Amostras Halo hemorrágico (mm)
Bothrops jararaca (10 µg)
Bothrops jararaca (10 µg) +
composto a ser avaliado
PBS (50 µL) (Controle)
6.3 Atividade miotóxica
Para a avaliação da atividade miotóxica grupos de 5 camundon-

gos machos Swiss (18-22 g) serão injetados via intramuscular (i.m) no
músculo gastrocnêmio direito (Figura 22) com diferentes doses (µg) de
peçonha bruta dissolvidas em 50 µL de PBS ou peçonha previamente
incubada com possíveis inibidores (30 minutos à 37°C) em diferentes
proporções. Os controles receberão somente PBS e, três horas depois,
o sangue dos camundongos será coletado, por corte na extremidade da
cauda, em capilares heparinizados (tendo uma das extremidades dos tu-
bos fechada com massa de modelar) e imediatamente centrifugados.
A atividade da enzima creatina cinase será determinada utilizan-
do-se 4 µL de plasma com 1,0 mL de reativo pelo CK-UV 47-20 ciné-
tico dissolvido em água destilada, por 3 minutos a 37ºC e realizando-se
leituras a 340 nm nos intervalos de 0 e 3 minutos. A atividade creatina
cinase será expressa em unidades/litro, sendo que uma unidade consiste
no resultado da fosforilação de um nanomol (nmol) de creatina por mi-
nuto (SOARES, 2000).

Figura 22. Imagem representativa de injeção intramuscular,
realizada em músculo gastrocnemius direito de camundongo,
para testes de miotoxicidade.
6.4 Ensaios de inibição
Os ensaios de inibição podem ser realizados com incubação pré-

via de toxinas/venenos/peçonhas com os inibidores por diferentes tem-
pos (30 minutos, 1 hora, 3 horas, 12 horas ou 24 horas) a 37ºC para ve-
rificar se há interação entre moléculas indutoras e possíveis inibidoras.
Pode ser realizada também a adição desses inibidores a soros obtidos
comercialmente, sendo possível avaliar, se os inibidores aumentam a
eficiência do soro anti-peçonha, principalmente sobre os efeitos locais
induzidos. Outra possibilidade que está sendo explorada recentemente
é a administração do inibidor, nos animais, em diferentes tempos após a
injeção da peçonha e/ou toxina.
Dentre os inibidores naturais que têm sido testados por inúmeros
toxinologistas podemos citar: extratos de plantas e compostos isolados
destas, proteínas isoladas de plasma de serpentes e marsupiais, com-
postos isolados de esponjas marinhas, vitaminas e a heparina. Alguns
exemplos de inibidores artificiais são: EDTA, EGTA e outros agentes
quelantes de metais, fenantrolina, PMSF, aprotinina, íons metálicos e
moléculas sintéticas elaboradas com base em moléculas naturais.
Alguns compostos promovem inibições específicas como é o caso
do BPB (brometo de p-bromofenacila) que promove alquilação do re-

síduo His48 (pertencente a tríade catalítica que coordena a ligação ao
cofator Ca2+), na estrutura de fosfolipases A2, resultando em perda da
atividade catalítica com consequente perda ou redução de outras ativi-
dades biológicas induzidas por estas enzimas.
6.5 Teste do cometa em brânquias de peixes
Obtenção das células de brânquias de Danio rerio (zebrafish)
Peixes de pequeno porte como o zebrafish são de fácil manutenção

em ambiente laboratorial devido ao grande número de exemplares que
podem ser acondicionados em tanques pequenos. Tanques com 20 L de
capacidade podem atender a manutenção de 40 peixes, considerando
cada tanque como uma unidade experimental. Os animais expostos a
diferentes agentes (físicos, químicos ou biológicos), podem ter, ao tér-
mino do experimento, pequenas alíquotas de seu sangue utilizadas para
a realização do teste cometa (5 µL por lâmina). Entretanto, considerando
as dificuldades de obtenção do sangue, o pequeno volume passível de
ser coletado e demais ensaios que requerem a utilização do sangue, a
avaliação do cometa em células de brânquias torna-se de grande valia,
uma vez que permite a fácil obtenção de maior quantidade de material
biológico.
Para a realização do cometa com células branquiais, as brânquias
dos peixes serão coletadas por dissecção e colocadas em tubos de 1,5
mL, cada tubo continha as brânquias de 2 animais. Em seguida, serão
adicionados 500 µL de soro fetal bovino em cada tubo, procedendo com
maceração das brânquias com o auxílio de um bastão de vidro. Amos-
tras de 50 µL de cada suspensão celular serão transferidas para tubos
contendo 300 µL de agarose de baixo ponto de fusão a 1% (low melting
point), homogeneizadas e aplicadas sobre 3 lâminas (100 µL por lâmi-
na), previamente recobertas por uma fina camada de agarose normal a
1%. Todos os passos seguintes reproduzem fielmente a metodologia do
cometa, previamente descrita para a avaliação de leucócitos de sangue
humano (item 5.1.3).

R E F ER Ê N C IA S
BI BL IO G R Á F IC A S
AMBADE VN, BORKAR JL, MESHRAM SK. Homicide by direct

snake bite: a case of contract killing. Medicine, Science and the
Law, v. 52, p.40-43, 2012.
ANDRIÃO-ESCARSO SH, SOARES AM, RODRIGUES VM, ANGU-
LO Y, DIAZ C, LOMONTE B, GUTIÉRREZ JM, GIGLIO JR.
Myotoxic phospholipases A2 in Bothrops snake venoms: effect
of chemical modifications on the enzymatic and pharmacological
properties of bothropstoxins from Bothrops jararacussu. Bioche-
mie, v. 82, p. 755-763, 2000.
ARNI RK, WARD RJ. Phospholipase A2 – A structural review. Toxi-
con, v. 34, p. 827-841, 1996.
BALSINDE J, BALBOA MA, INSEL PA, DENNIS EA. Regulation
and inhibition of phospholipase A2. Annual Review of Pharma-
cology Toxicology, v. 39, p. 175-89, 1999.
BARRAVIEIRA B. Acidentes por serpentes do gênero Bothrops, La-
chesis e Micrurus. Aquivo Brasileiro de Medicina, v. 65, p. 345-
355, 1991.
BECKER GJ. Ancrod in glomerulonephritis. Quarterly Journal of
Medicine, v. 69, p. 849-50, 1988.
BERNARDE PS, GOMES JO. Serpentes peçonhentas e ofidismo em
Cruzeiro do Sul, Alto Juruá, Estado do Acre, Brasil. Acta Amazô-
nica, v. 42, p. 65-72, 2012.
BJARNASON JB, HAMILTON D, FOX JW. Studies on the mecha-
nism of hemorrhage production by five proteolytic hemorrhagic
toxins from Crotalus atrox venom. Biological Chemistry Hoppe
Seyler, v. 369, p. 121-129, 1988.
BOMALASKI JS, CLARK MA. Phospholipase A2 and arthritis. Ar-
thritis and rheumatism, v. 36, p. 190-198, 1993.

BORGES MH, SOARES AM, RODRIGUES VM, ANDRIÃO-ESCAR-
SO SH, DINIZ H, HAMAGUCHI A, QUINTERO A, LIZANO S,
GUTIÉRREZ JM, GIGLIO JR, HOMSI-BRANDEBURGO MI.
Effects of aqueous extract of Casearia sylvestris (Flacourtiaceae)
on actions of snake and bee venoms and on activity of phospho-
lipases A2. Comparative Biochemistry and Physiology- Part
B. Biochemistry and Molecular Biology, v. 127, p. 21-30, 2000.
BORGES MH, SOARES AM, RODRIGUES VM, OLIVEIRA F,
FRANSHESCHI AM, RUCAVADO A, GIGLIO JR, HOMSI-
-BRANDEBURGO MI. Neutralization of proteases from Both-
rops snake venoms by the aqueous extract from Casearia sylves-
tris (Flacourtiaceae). Toxicon, v. 39, p. 1863-1869, 2001.
BOUGA H, TSOUROS I, BOUNIAS D, KYRIAKOPOULOU D, STA-
VROPOULOS MS, PAPAGEORGAKOPOULOU N, THEO-
CHARIS DA, VYNIOS DH. Involvement of hyaluronidases in
colorectal câncer. BMC Cancer, v. 10, p. 499, 2010.
BRASIL. Ministério da Saúde. Fundação Osvaldo Cruz. Sistema Na-
cional de Informações Toxico Farmacológicas. Disponível em:
<http://www.fiocruz.br/sinitox_novo/cgi/cgilua.exe/sys/start.ht-
m?infoid=105&sid= 107>. Acesso em: 01/02/2010.
BRASIL. Ministério da Saúde. Portal da Saúde. SINAN NET. Disponí-
vel em: <http://dtr2004.saude.gov.br/sinanweb/tabnet/dh? sinan-
net/animaisp/bases/animaisbrnet.def>. Acesso: 5/09/2012a.
BRASIL. Ministério da Saúde. Portal da Saúde. Casos de acidentes por
serpentes. Brasil, Grandes Regiões e Unidades Federadas. 2000
a 2011. Disponível em: <http://portalsaude.saude.gov.br/portal-
saude/arquivos/tab_cas_serpentes_br_gd_reg_2000_2011.pdf>.
Acesso: 5/09/2012b.
BRASIL. Ministério da Saúde. Portal da Saúde. Acidentes por Ser-
pentes. Disponível em: <http://portalsaude.saude.gov.br/por-
talsaude/texto/5817/783/acidentesporserpente s.htm>. Acesso:
5/09/2012c.
BRAUD S, BOM C, WISNER A. Snake venom proteins acting on
hemostasis. Biochimie, v. 82, p. 851-859, 2000.

BURKE JE, DENNIS EA. Phospholipase A2 Biochemistry. Cardiovas-
cular Drugs Therapy, v. 23, p. 49-59, 2009.
CALVETE JJ. The continuing saga of snake venom disintegrins. Toxi-
con, v. 62, p.40-49, 2013.
CARTER SB. Effects of Cytochalasins on Mammalian Cells. Nature, v.
213, p. 261-264, 1967.
CASTRO HC, DUTRA DL, OLIVEIRA CAA, ZINGALI RB. Both-
roalternin, a thrombin inhibitor from the venom of Bothrops alter-
natus. Toxicon, v. 36, p.1903-12, 1998.
CINTRA AC, DE TONI LG, SARTIM MA. Batroxase, a new metal-
loproteinase from B. atrox snake venom with strong fibrinolytic
activity. Toxicon, v. 60, p. 70-82, 2012.
CHANG CC, SU MJ, LEE JD, EAKER D. Effects of Sr2+ and Mg2+
on the phospholipase A and the presynaptic neuromuscular
blocking actions of beta-bungarotoxin, crotoxin and taipoxin.
Naunyn Schmiedebergs Archives Pharmacology, v. 299, p.
155-61, 1977.
CHEN RQ, JIN Y, WU JB, ZHOU XD, LI DS, LU QM, WANG WY,
XIONG YL. A novel high molecular weight metalloproteinase
cleaves fragment F1 of activated human prothrombin. Toxicon, v.
44, p. 281-287, 2004.
CHEN RQ, JIN Y, WU JB, ZHOU XD, LU QM, WANG WY, XIONG
YL. A new protein structure of P-II class snake venom metallopro-
teinases: it comprises metalloproteinase and disintegrin domains.
Biochemical and Biophysical Research Communications, v.
310, p. 182-187. 2003.
COLLINS A, DUSINSKÁ M, FRANKLIN M, SOMOROVSKÁ M,
PETROVSKÁ H, DUTHIE S, FILLION L, PANAYIOTIDIS M,
RASLOVÁ K, VAUGHAN N. Comet assay in human biomoni-
toring studies: reliability, validation, and applications. Environ-
mental and Molecular Mutagenesis, v. 30, p. 139-4630, 1997.
DARIOS F, CONMELL E, DAVLETOV B. Phospholipases and fatty
acid signaling in exocytosis. Journal Physiology, v. 585, p 699–
704, 2007.

DAVID S, GREENHALGH AD, LÓPEZ-VALES R. Role of phospho-
lipase A2s and lipid mediators in secondary damage after spinal
cord injury. Cell Tissue Research, v. 349, p. 249–267, 2012.
DENNIS EA. The Enzymes, edited by P.D. Boyer Academic Press. v.
16, p. 307-353, 1983.
DEOLINDO P, TEIXEIRA-FERREIRA AS, MELO EJ, ARNHOL-
DT AC, SOUZA W, ALVES EW, DAMATTA RA. Programmed
cell death in Trypanosoma cruzi induced by Bothrops jararaca ven-
om. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 100, p. 33-38, 2005.
DOYLE JJ, DOYLE JL. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Fo-
cus, Rockville, v. 12, p.13–15, 1990.
DU XY, CLEMETSON KJ. Snake venom L-amino acid oxidases. Tox-
icon, v. 40, p. 659-65, 2002.
EDGAR W, PRENTICE CRM. The proteolytic action of ancrod on
human fibrinogen and its polypeptide chains. Thrombosis Re-
search, v. 2, p. 85-95, 1973.
ELEUTÉRIO MWF, TRENTO MVC, BARROSO AR, MARCUSSI S.
Evaluation of DNA damage in human lymphocytes induced by the
venom of Lachesis muta. SIMPOSPEQ, In: Ribeirão Preto, 2012.
EWING GW. Métodos Instrumentais de Análise Química. v. 2, 5 edi-
ção, Edgard Blucher LTDA, São Paulo, SP, Brasil 1990.
FERREIRA SH. Angiotensin Converting Enzyme: History and Rele-
vance. Seminars in Perinatology, v. 24, p. 7-10, 2000.
FENECH M. The micronucleus assay determination of chromosomal
level DNA damage. Methods in Molecular Biology, v. 410, p.
185-216, 2008.
FENECH MA. MORLEY AA. Measurement of micronuclei in lympho-
cytes, Mutation Research, v. 147, p. 29-36, 1985.
FIGUEIROS M, LAJOLO FM. Effect of chemical modification of Pha-
seolus vulgares lectins on their biological properties. Journal
Agricultural Food Chemistry, v. 45, p. 639-643, 1997.
FOX JW, SERRANO SMT. Structural considerations of the snake ven-
om metalloproteinases, key members of the M12 reprolysin fami-
ly of metalloproteinases. Toxicon, v. 45, p. 969–985, 2005.

FOX JW, SERRANO SMT. Timeline of key events in snake venom
metalloproteinase research. Journal Proteomics, v. 72, p. 200-
209, 2009.
FRANÇA FOS, MÁLAQUE CMS. Acidente Botrópico. In: Animais
Peçonhentos no Brasil: Biologia, Clínica e Terapêutica dos aci-
dentes. p. 72-86, 2003.
GANS C. Physiology of the Reptília. Londres: Academy Press. v. 12, 1978.
GIRISH KS, SHASHIDHARAMURTHY R, NAGARAJU S, GOWDA
TV, KEMPARAJU K. Isolation and characterization of hyaluroni-
dase a “a spreading factor” from Indian cobra (Naja naja) venom.
Biochime, v. 86, p. 193-202, 2004.
GIRISH KS, SHASHIDHARAMURTHY R, NAGARAJU S, GOWDA
TV, KEMPARAJU K. Hyaluronidase inhibitors: a biological and
therapeutic perspective. Current Medicinal Chemistry, v. 16, p.
2261-2288, 2009.
GIRISH KS, KEMPARAJU K. Overlooked issues of snakebite manage-
ment: time for strategic approach. Current Topics in Medicinal
Chemistry, v. 11, p. 2494-2508, 2011.
GUTIÉRREZ JM, AVILA C, ROJAS E, CERDAS L. An alternative in
vitro method for testing the potency of the polyvalent antivenom
produced in Costa Rica. Toxicon, v. 26, p. 411-13, 1988.
GUTIÉRREZ JM, RUCAVADO A. Snake venom metalloproteinases:
their role in the pathogenesis of local tissue damage. Biochimie,
v. 82, p. 841-50, 2000.
GUTIÉRREZ JM. Clinical toxicology of snakebite in central America.
In: Meier, J., White, J. (Eds.), Handbook of Clinical Toxicology
of Animal Venoms and Poisons. CRC Press, p. 667–668, 1995.
GUTIÉRREZ JM, RUCAVADO A, ESCALANTE T, DÍAZ C. Hem-
orrhage induced by snake venom metalloproteinases: biochemi-
cal and biophysical mechanisms involved in microvessel damage.
Toxicon, v. 45, p. 997–1011, 2005.
HAKANSSON L, VENGE P. The combined action of hyaluronic acid
and fibronectin stimulates neutrophil migration. Journal of Im-
munology, v. 135, p. 2735-2739, 1985.

HANADA K, NISHIJIMA M, AKAMATSU Y, PAGANO RE. Both
sphingolipids and cholesterol participate in the detergent insolu-
bility of alkaline phosphatase, a glycosylphosphatidylinositol-an-
chored protein, in mammalian membranes. The Jounal of Biolo-
gical Chemystri, v. 270, p. 6254-6260, 1995.
HAVT A, TOYAMA MH, DO NASCIMENTO NR, TOYAMA DO, NO-
BRE AC, MARTINS AM, BARBOSA PS, NOVELLO JC, BOS-
CHERO AC, CARNEIRO EM, FONTELES MC, MONTEIRO
HS. A new C-type animal lectin isolated from Bothrops pirajai
responsible for the snake venommajor effects in the isolated kid-
ney. The International Journal Biochemistry and Cell Biology,
v. 37, p.130-141, 2005.
HOLLER FJ, SKOOG DA, CROUCH SR. Princípios de análise ins-
trumental. Bookman, 2009.
ITZHAKI RF, GILL DM. A microbiuret method for estimating proteins.
Analytical Biochemistry, v. 9, p. 401-410, 1964.
JAFFÉ, W. G. Hemagglutinins. In: Liener, I. E. Toxic constituents of
plant foodstuffs. Academic Press, Ney York. p. 69-101, 1969.
JOHNSSON C, HÄLLGREN R, LINDBOM LO, TUFVESON G. Ede-
ma treatment during cardiac allograft rejection. Journal of Heart
and Lung Transplantation, v. 18, p. 1238-1242, 1999.
JOVTCHEV G, MENKE M, SCHUBERT I. The comet assay detects
adaptations to MNU-induced DNA damage in barley. Mutation
Research, v. 493, p. 95-100, 2001.
KAMIGUTI AS, ZUZEL M, THEAKSTON RD. Snake venom me-
talloproteinases and disintegrins: interactions with cells. Brazilian
Journal of Medical Biological Research, v. 31, p. 853-62, 1998.
KNUDSON CB, TOOLE BP. Hyaluronate cell interations during diffe-
rentiation of chich-embryo limb mesoderm. Developmental Bio-
logy, v. 124, p. 82-90, 1987.
KREIL G. Hyaluronidases - A group of neglected enzymes. Protein
Science, v. 4, p. 1666-1669, 1995.
KUDO I, MURAKAMI M. Phospholipase A2 enzymes. Prostaglan-
dins and other lipid mediators, v. 68, p. 3-58, 2002.

LAEMMLI UK. Cleavage of structural proteins during the assembly
of the head of bacteriophage T4. Nature, v. 227, p. 680-685,
1970.
LEE S, LYNCH KR. Brown recluse spider (Loxosceles reclusa) venom
phospholipase D (PLD) generates lysophosphatidic acid (LPA).
Biochemistry Journal, v. 391, p. 317–323, 2005.
MANIATIS T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edi-
tion). Spiral-bound – 1982. ISBN: 978-1-936113-42-2.
MARCUSSI S, BERNARDES CP, SANTOS-FILHO NA, MAZZI
MV, OLIVEIRA CZ, IZIDORO LF, FULY AL, MAGRO AJ,
BRAZ AS, FONTES MR, GIGLIO JR, SOARES AM. Molec-
ular and functional characterization of a new non-hemorrhagic
metalloprotease from Bothrops jararacussu snake venom with
antiplatelet activity. Peptides, v. 28, p. 2328-39, 2007.
MARCUSSI S, SANTOS PR, MENALDO DL, SILVEIRA LB, SAN-
TOS-FILHO NA, MAZZI MV, DA SILVA SL, STÁBELI RG,
ANTUNES LM, SOARES AM. Evaluation of the genotoxicity of
Crotalus durissus terrificus snake venom and its isolated toxins on
human lymphocytes. Mutation Research, v. 724, p. 59-63, 2011.
MARCUSSI S, STÁBELI RG, SANTOS-FILHO NA, MENALDO DL,
SILVA PLL, ZULIANI JP, CALDERON LA, DA SILVA SL, AN-
TUNES LM, SOARES AM. Genotoxic effect of Bothrops snake
venoms and isolated toxins on human lymphocyte DNA. Toxicon,
v. 65, p. 9-14, 2013.
MARTINDALE: the extra pharmacopoedia. Pharmaceutical Press,
28th. Ed. London, 1982, 1940.
MATSUI K, TAKEDA K, YU ZX, TRAVIS WD, MOSS J, FER-
RANS VJ. Role for activation of matrix metalloproteinases in
the pathogenesis of pulmonary lymphangioleiomyomatosis. Ar-
chives of Pathology and Laboratory Medicine, v. 124, p. 267-
75, 2000.
MATSUI T, FUJIMURA Y, TITANI K. Snake venom proteases affect-
ing hemostasis and thrombosis. Biochimica Biophysics Acta, v.
1477, p. 146-56, 2000.

MATSUI T, HAMAKO J. Structure and function of snake venom tox-
ins interacting with human von Willebrand factor. Toxicon, v. 45,
p. 1075-87, 2005.
MAZZI MV, MARCUSSI S, CARLOS GB, STÁBELI RG, FRAN-
CO JJ, TICLI FK, CINTRA AC, FRANÇA SC, SOARES AM,
SAMPAIO SV. A new hemorrhagic metalloprotease from Both-
rops jararacussu snake venom: isolation and biochemical charac-
terization. Toxicon, v. 44, p. 215-23, 2004.
MAZZI MV, MARCUSSI S, CARLOS GB, STÁBELI RG, FRAN-
CO JJ, TICLI FK, CINTRA AC, FRANÇA SC, SOARES AM,
SAMPAIO SV. A new hemorrhagic metalloprotease from Both-
rops jararacussu snake venom: isolation and biochemical charac-
terization. Toxicon, v. 44, p. 215-23, 2004.
MCLANE MA, JOERGER T, MAHMOUD A. Disintegrins in health
and disease. Frontiers in Bioscience, v. 1, p. 6617-37, 2008.
MEETEREN LAV, FREDERIKS F, GIEPMANS BNG, PEDROSA
MFF, BILLINGTON SJ, JOST BH, TAMBOURGI DV, MOO-
LENAAR WH. Spider and Bacterial Sphingomyelinases D Target
Cellular Lysophosphatidic Acid Receptors by Hydrolyzing Lyso-
phosphatidylcholine. The Journal of Biological Chemistry, v.
279, p. 10833–10836, 2004.
MEIER J, ADLER C, WEISS N. Determination of batroxobin levels
in the plasma of guinea pigs after epicutaneous and intravenous
applications. Toxicon, v. 26, p. 964-966, 1988.
MELO PA, OWNBY CL. Ability of wedelolactone, heparin, and pa-
ra-bromophenacyl bromide to antagonize the myotoxic effects of
two crotaline venoms and their PLA2 myotoxins. Toxicon, v. 37,
p. 199-215, 1999.
MENZEL EJ, FARR C. Hyaluronidase and its substrate hyaluronan:
biochemistry, biological activities and therapeutic uses. Cancer
Letters, v. 131, p. 3-11, 1998.
MINISTÉRIO DA SAÚDE, Brasil. Manual de Diagnóstico e Trata-
mento de Acidentes por Animais Peçonhentos. Brasília: Funda-
ção Nacional de Saúde, 2001.

MONDIN M, AGUIAR-PERECIN MLR. Coloração pelo Método de
Feulgen. 2009. Protocolo disponibilizado pelos autores no sítio:
http://www.genetica.esalq.usp.br/citogenetica/protocolos/Feul-
gen.pdf.
MONTEIRO RQ, FOGUEL D, CASTRO HC, ZINGALI RB. Sub-
unit dissociation, unfolding, and inactivation of bothrojaracin, a
C-type lectin-like protein from snake venom. Biochemistry, v.
42, p. 357-373, 2004.
MOORHEAD PS, NOWELL PC, MELLMAN WJ, BATTIPS DM,
HUNGERFORD DA. Chromosome preparations of leukocytes
cultured from human peripheral blood. Experimental Cell Re-
search, v. 20, p. 613-616, 1960.
MORITA T. C-type lectin-related proteins snake venom. Current Drug
Targets Cardiovascular and Haematological. Disorders, v. 4,
p. 357-373, 2004.
MOSMANN T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and surviv-
al: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of
Immunological Methods, v. 65, p. 55-63, 1983.
MUKHERJEE AB, MIELE L, PATTABIRAMAN N. Phospholi-
pase A2 enzymes: regulation and physiological role. Biochemical
Pharmacology, v. 48, p. 1-10, 1994.
NELSON DL, COX MM. Princípios de Bioquímica de Lehninger. 6ª
Ed. Artmed, 2014.
NIKAI T, MORI N, KISHIDA M, TSUBOI M, SUGIHARA H. Isola-
tion and characterization of hemorrhagic toxin g from the venom
of Crotalus atrox (western diamondback rattlesnake). The Ame-
rican Journal Tropical Medicine Hygiene, v. 34, p. 1167-1172,
1985.
OKUBO BM, OSMAR NS, LUDOVICO M, DIEGO GG, WILLIAM
FP, CARLA LB, CARMEL SR, HORTÊNCIA HSH, SIMONI
CD, OCATVIO LFRANCO, SUSANA EM. Evaluation of an
Antimicrobial L-Amino Acid Oxidase and Peptide Derivatives
from Bothropoides mattogrosensis Pitviper Venom. Plos One, v.
7, 2012.

OWNBY CL. Structure, Function and Biophysical Aspects of the Myo-
toxins from Snake Venoms. Journal of Toxicology, v. 17, p. 213-
238, 1998.
OWNBY CL, NIKA T, IMAI K, SUGIHARA H. Pathogenesis of
hemorrhage induced by bilitoxin, a hemorrhagic toxin isolated
from the venom of the common cantil (Agkistrodon bilineatus bi-
lineatus). Toxicon, v. 28, p. 837-46. 1990.
PAL SK, GOMES A, DASGUPTA SC, GOMES A. Snake venom as
therapeutic agents: from toxin to drug development. Review ar-
ticle. Indian Journal of Experimental Biology, v. 40, p. 1353-
1358, 2002.
PIKLE H. Trombinlike enzymes snakes venom: an updated inventory.
Trombosis Haemostatis, v. 79, p. 675-683, 1998.
PINHO FMO, PEREIRA ID. Ofidismo. Revista da Associação Medi-
ca Brasileira, v. 47, p. 24–29, 2001.
PIRRELLO R, CHEN CT, THOMAS SH. Initial experiences with sub-
cutaneous recombinant human hyaluronidase. Journal of Pallia-
tive Medicine, v. 10, p. 861-4, 2007.
QUEIROZ GP, PESSOA LA, PORTARO F, FURTADO MFD, TAM-
BOUGI D. Interspecific variation in venom composition and tox-
icity of Brazilian snakes from Bohrops genus. Toxicon, v. 52, p.
842-851, 2008.
RAMOS OH, SELISTRE-DE-ARAUJO HS. Snake venom metallo-
proteases--structure and function of catalytic and disintegrin do-
mains. Comparative Biochemistry Physiology- Part C. Toxi-
cology Pharmacology, v. 142, p. 328-46, 2006.
RAMRAKHIANI L, CHAND S. Recent Progress on Phospholipases:
Different Sources, Assay Methods, Industrial Potential and Patho-
genicity. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 164, p.
991–1022, 2011.
ROCHA SM, BERALDO WT, ROSENFELD G. Bradykinin, a hypo-
tensive and smooth muscle stimulating factor released from plas-
ma globulin by snake venoms and by trypsin. American Journal
Physiology, v. 156, p. 261-273, 1949.

SANT’ANA CD. Caracterização funcional e estrutural de uma
nova serinoprotease do veneno de Bothrops jararacussu. Dis-
sertação de mestrado, Universidade de São paulo, 2005.
SHARON E, SHARON N, BEN-TAL N. Evolutionary analysis reveals
collective properties and specificity in the C-type lectin and lec-
tin-like domain superfamily. Proteins, v. 53, p. 44-55, 2003.
SILVA IT, ANA PQM, NÁGILA RTD. Antioxidant and inflammatory
aspects of lipoprotein-associated phospholipase A2 (Lp-PLA2): a
review. Lipids in Health and Disease, v. 10, p. 170, 2011.
SILVEIRA GL, LIMA MGF, REIS GB, PALMIERI MJ, AN-
DRADE-VIEIRA LF. Toxic effects of environmental pollutions:
comparative investigation using Allium cepa L. and Lactuca sati-
va L. Chemosphere, v. 178, p. 359-367, 2017.
SINGH NP, McCOY MT, TICE RR, SCHEIDER EL. A simple tech-
nique for quantitation of low levels of DNA damage in individual
cells. Experimental Cell Research, v. 175, p.184-191, 1988.
SITPRIJA V. Animal toxins and the kidney. Natura Clinical Practice
Nephrology, v. 4, p. 616-627, 2008.
SOARES AM, ANDRIÃO-ESCARSO SH, ANGULO Y, LOMONTE
B, GUTIÉRREZ JM, MARANGONI S, TOYAMA MH, ARNI
RK, GIGLIO JR. Structural and functional characterization of
myotoxin I, a Lys49 phospholipase A(2) homologue from Both-
rops moojeni (Caissaca) snake venom. Archives of Biochemistry
and Biophysics, v. 373, p. 7-15, 2000a.
SOARES AM, GUERRA-SÁ R, BORJA-OLIVEIRA CR, RODRI-
GUES VM, RODRIGUES-SIMIONI L, RODRIGUES V, FON-
TES MR, LOMONTE B, GUTIÉRREZ JM, GIGLIO JR. Struc-
tural and functional characterization of BnSP-7, a Lys49 myotoxic
phospholipase A(2) homologue from Bothrops neuwiedi pauloen-
sis venom. Archives of Biochemistry and Biophysics, v. 378, p.
201-209, 2000b.
SOARES AM, GIGLIO JR. Chemical modifications of phospholipases
A2 from snake venoms: effects on catalytic and pharmacological
properties. Toxicon, v. 42, p. 855-868, 2003.

SOARES AM, FONTES MRM, GIGLIO JR. Phospholipases A2 myo-
toxins from Bothrops snake venoms: Structure-Function Relation-
ship. Currents Organic Chemistry, v. 8, p. 1677-1690, 2004.
SOUZA DH, EUGENIO LM, FLETCHER JE, JIANG MS, GARRATT
RC, OLIVA G, SELISTRE-DE-ARAUJO HS. Isolation and struc-
tural characterization of a cytotoxic L-amino acid oxidase from
Agkistrodon contortrix laticinctus snake venom: preliminary crys-
tallographic data. Archives Biochemical Biophysics, v. 368, p.
285-90, 1999.
STABELLI RG, AMUI SF, SANT’ANA CD, PIRES MG, NOMIZO
A, MONTEIRO MC, ROMÃO PR, GUERRA-SÁ R, VIEIRA
CA, GIGLIO JR, FONTES MR, SOARES AM. Bothrops moo-
jeni myotoxin-II, a Lys49-phospholipase A2 homologue: an exam-
ple of function versatility of snake venom proteins. Comparative
Biochemistry Physiololy. Part C Toxicology Pharmacology, v.
142, p. 371-81, 2006.
STERN R, CSÓKA AB. Mammalian hyaluronidases. 2000. Disponí-
vel em: <http://www.glycoforum.gr.jp/science/hyaluronan/hapdf/
HA15.pdf>. Acesso em 09 nov. 2010.
STERN R, JEDRZEJAS MJ. Hyaluronidases: their genomics, structu-
res, and mechanism of action. Chemical Reviews, v. 106, p. 818-
839, 2006.
STOCKER K. Snake venom proteins affecting hemostasis and fibri-
nolysis. In: Stocker, K. (Ed). Medical use of Snakes Venom Pro-
teins. CRC Press Boca Raton, FL, 97-160p., 1990.
SWENSON S, MARKLAND FSJR. Snake venom fibrin(ogen)olytic
enzymes. Toxicon, v. 45, p. 1021-39, 2005.
TEIXEIRA CDEF, FERNANDES CM, ZULIANI JP, ZAMUNER
SF. Inflammatory effects of snake venom metalloproteinases. Me-
mórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 100, p. 181-184, 2005.
TOOLE BP, MUNAIM SL, WELLES S, KNUDSON CB. Hyaluro-
nate-cell interactions and growth factor regulation of hyaluronate
synthesis during limb development. Ciba Found Symposy, v.
143, p. 138-145, 1984.

TORRES M, AGUILAR MB, FALCON A, SANCHEZ L, RAD-
WAN FFY, BURNETT JW, HEIMER-DE LA COTERA EP,
ARELLANO RO. Electrophysiological and hemolytic activity
elicited by the venom of the jellyfish Cassiopea xamachana. To-
xicon, v. 39, p. 1297-1307, 2001.
TRENTO EP, GARCIA OS, RUCAVADO A, FRANÇA SC, BATALINI
C, ARANTES EC, GIGLIO JR, SOARES AM. Inhibitory prop-
erties of the anti-bothropic complex from Didelphis albiventris
serum on toxic and pharmacological actions of metalloproteases
and myotoxins from Bothrops asper venom. Biochemical Phar-
macology, v. 62, p. 1521-1529, 2001.
TOYAMA MH, TOYAMA DDEO, PASSERO LF, LAURENTI MD,
CORBETT CE, TOMOKANE TY, FONSECA FV, ANTUNES
E, JOAZEIRO PP, BERIAM LO, MARTINS MA, MONTEI-
RO HS, FONTELES MC. Isolation of a new L-amino acid oxi-
dase from Crotalus durissus cascavella venom. Toxicon, v. 47, p.
47-57, 2006.
TOYAMA MH, CARNEIRO EM, MARAGONI S, AMARAL MEC,
VELLOSO L.A BOSCHERO AC. Isolation and characterization
of a convulxina-like protein from Croatalus durissus collineatus
venom. Journal of Protein Chemistry, v. 20, p. 662-671, 2001.
VAN DER WALT SJ, JOUBERT FJ. Studies on puff adder (Bitis arien-
tans) venom: I: Purification and properties of protease A. Toxicon,
v. 9, p. 153-161, 1971.
VARANDA EA, GIANNINI MJS. Bioquímica de venenos de serpen-
tes. In: Venenos. Aspectos clínicos e terapêuticos dos acidentes por
animais peçonhentos. BARRAVIERA, B., p. 205–223, 1999.
WALSH EM, MARCINKIEWICZ C. Non-RGD-containing snake ve-
nom disintegrins, functional and structural relations. Toxicon, v.
58, p. 355–362, 2011.
WANG WJ, SHIH CH, HUANG TF. A novel P-I class metalloproteinase
withbroad substrate-cleaving activity, agkislysin, from Agkistro-
don acutus venom. Biochemical Biophysical Research Commu-
nications, v. 324, p. 224–230, 2004.

WARREL DA. Clinical features of envenoming from snake bites. In:
Bon, C., Goyffon, M. (Eds.), Envenomings and their Treatments.
Editions Foundation Marcel Mérieux, Lyon, p. 63–76, 1996.
YOU WK, SEO HJ, CHUNG KH, KIM DS. A novel metalloprotea-
se from Gloydius halys venom induces endothelial cell apoptosis
through its protease and disintegrin-like domains. The Journal
Biochemistry, v. 134, p. 739-49. 2003.
YU Z, ZHOU N, ZHAO C, QIU J. In-Gel Determination of L-Ami-
no Acid Oxidase Activity Based on the Visualization of Prussian
Blue-Forming Reaction. Plos One, v. 8, e55548, 2013.
ZHANG YJ, WANG JH, LEE WH, WANG Q, LIU H, ZHENG YT,
ZHANG Y. Molecular characterization of Trimeresurus stejnege-
ri venom L-amino acid oxidase with potential anti-HIV activity.
Biochemical Biophysical Research Communication, v. 309, p.
598-604, 2003.
ZHANG H, TENG M, NIU L, WANG Y, WANG Y, LIU Q, HUANG
Q, HAO Q, DONG Y, LIU P. Purification, partial characterization,
crystallization and structural determination of AHP-LAAO, a no-
vel L-amino-acid oxidase with cell apoptosis-inducing activity
from Agkistrodon halys pallas venom. Acta Crystallographia D
Biological Crystallographica, v. 60, p. 974-7, 2004.
ZHOU XD, DING CH, TAI H, JIN Y, CHEN RQ, LU QM, WANG
WY, XIONG YL. A novel disintegrin, jerdonatin, inhibits platelet
aggregation and sperm-egg binding. Comparative Biochemistry
Physiology- Part B. Biochemistry and Molecular. Biology, v.
139, p. 117-22. 2004.
ZIELER H, KEISTER DB, DVORAK JA, RIBEIRO JM. A snake
venom phospholipase A(2) blocks malaria parasite development
in the mosquito midgut by inhibiting ookinete association with
the midgut surface. Jorunal of Experimental Biology, v. 204, p.
4157-67, 2001.
ZINGALI RB, JANDROT-PEERRUS M, GUILLIN MC, BON C. Bo-
throjaracin, a new thrombin inhibitor isolated from Bothrops jara-
raca venom: Characterization and mechanism of thrombin inhibi-
tion. Biochemistry, v. 32, p. 10794-10802, 1993.

ISBN: 978-85-5522-280-1
9 788555 222801

Miolo Toxinologia

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Miolo Toxinologia

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

ORGANIZADORES:

Análises toxicológicas na avaliação de Produtos

1ª edição: maio de 2018

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Toxinologia: fundamentos e métodos. Análises toxicológicas na

121 p.; 16x23cm.

1. Biologia, ciências da vida. 2. Toxinologia. I. Título

Índice para catálogo sistemático:

2 Toxinologia: Fundamentos e Métodos

Toxinologia: Fundamentos e Métodos 3

4 Toxinologia: Fundamentos e Métodos

Toxinologia: Fundamentos e Métodos 5

A construção desta obra teve como propósito apresentar uma

6 Toxinologia: Fundamentos e Métodos

Toxinologia: Fundamentos e Métodos 7

8 Toxinologia: Fundamentos e Métodos

I n tro d u ç ã o a Toxin ologia

Toxinologia: Fundamentos e Métodos 9

E stima-se que ocorram cinco milhões de casos de acidentes ofí-

10 Toxinologia: Fundamentos e Métodos

Tabela 1. Distribuição geográfica de serpentes da família

Toxinologia: Fundamentos e Métodos 11

Adaptada de: Bernarde e Gomes (2012); The Reptile Database (2013).

Tabela 2. Distribuição geográfica de serpentes da família

12 Toxinologia: Fundamentos e Métodos

Toxinologia: Fundamentos e Métodos 13

14 Toxinologia: Fundamentos e Métodos

Toxinologia: Fundamentos e Métodos 15

16 Toxinologia: Fundamentos e Métodos

A s proteínas de peçonhas podem apresentar atividades en-

Toxinologia: Fundamentos e Métodos 17

18 Toxinologia: Fundamentos e Métodos

Toxinologia: Fundamentos e Métodos 19

20 Toxinologia: Fundamentos e Métodos

Tabela 3. Exemplos de medicamentos sintetizados a partir

Adaptada de: Mello (2011).

Toxinologia: Fundamentos e Métodos 21

As enzimas proteolíticas presentes nas peçonhas de serpentes

22 Toxinologia: Fundamentos e Métodos

SVMP do tipo P-I já foram descritas com diversas atividades,

Toxinologia: Fundamentos e Métodos 23

Tabela 4. Enzimas relacionadas às alterações hemostáticas, isoladas de

24 Toxinologia: Fundamentos e Métodos

Toxinologia: Fundamentos e Métodos 25

A investigação de peçonhas de serpentes em torno do mundo tem

26 Toxinologia: Fundamentos e Métodos

A família das desintegrinas RGD, que inibe as funções fisiológicas

Outros tipos de desintegrinas também estão presentes nas peço-

Toxinologia: Fundamentos e Métodos 27

2.2.3 Desintegrinas R/KTS

As desintegrinas que apresentam motivo R/KTS apresentam alta

28 Toxinologia: Fundamentos e Métodos

As serinoproteases são muito abundantes nas peçonhas de ser-

Toxinologia: Fundamentos e Métodos 29

O grupo das enzimas fosfolipases é heterogêneo e tem a capaci-

30 Toxinologia: Fundamentos e Métodos

As PLAs compreendem uma família deiversificada de ezimas li-

Toxinologia: Fundamentos e Métodos 31

32 Toxinologia: Fundamentos e Métodos

Tabela 5. Classificação das PLA2, fonte produtora e

Tipo de Mr Tipos de células e Atividade Biológica/

Toxinologia: Fundamentos e Métodos 33

34 Toxinologia: Fundamentos e Métodos