TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Khoa Khoa học Tự Nhiên

Bộ Môn Hóa Học

PHÚC TRÌNH THỰC TẬP

HÓA HỌC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN

Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

Triệu Phú Hậu Trần Thị Thúy Vy B2104203
Nguyễn Anh Thư B2110380
Nguyễn Thị Bảo Vy B2110388
Lê Bảo Châu B2110392
 BÀI 1
TÁCH CHIẾT VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT VẬT LÝ CỦA

TINH DẦU CAM, BƯỞI

I. Mục tiêu

- Nghiên cứu một phương pháp tách chiết tinh dầu vỏ quả: chưng cất lôi cuốn hơi
nước.
- Khảo sát các hằng số vật lý, hóa học của tinh dầu.
Tinh dầu vỏ cam, bưởi có thành phần limonene cao. Limonene ngoài khả năng
gây ngán ăn trên sâu và côn trùng có hại (được ứng dụng vào việc diệt côn trùng
gây hại mùa màng), còn có dược tính. Limonene đã và đang được quan tâm nghiên
cứu hoạt tính sinh học với khả năng ức chế tế bào ung thư (khi sử dụng DMBA,
NDEA, thử nghiệm gây tác động sinh khối u tại vú trên động vật).

II. Phương pháp

Thực hiện tách chiết tinh dầu bằng cơ học.

Chiết xuất tinh dầu bằng chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp.

Ôn phương pháp chiết lỏng – lỏng, làm khan hợp chất hữu cơ.
III. Tiến hành
- Cân 100g nguyên liệu vỏ cam tươi, xắt nhỏ.

* Chưng cất lôi cuốn hơi nước

- Đong nước cất, cho cùng nguyên liệu vào bộ chưng cất (tỷ lệ thể tích là 1:2).
- Khởi động máy tăng nhiệt, theo dõi quy trình, ghi nhận kết quả thể tích hứng
theo thời gian.
Chú ý: 5 ml nước chưng cất thu được đầu tiên phải để riêng, đậy lại.

2
 Chưng cất vỏ cam tươi

- Tắt nguồn nhiệt sau 1 giờ kể từ lúc nước trong bộ chưng cất sôi. Sau khi hoàn
thành, chờ nguội 20 phút để tháo và làm vệ sinh bộ chưng cất, đồng thời tiến hành
tách chiết tinh dầu.

Lớp tinh dầu ở trên, lớp nước ở dưới

3
 Kết quả
Tinh dầu vỏ cam có màu vàng nhạt, mùi thơm nhẹ đặc trưng phần vỏ quả, có vị
đắng nhẹ (vì thành phần hóa học của tinh dầu có chứa terpene), cay, ngọt, có
tính sát trùng, phản ứng trung tính với giấy quỳ.
IV. Trả lời câu hỏi
1. Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước tinh dầu vỏ quả như: cam,
bưởi,… có thể thực hiện trong điều kiện nguyên liệu như thế nào? Giải
thích?
- Chưng cất bằng lôi cuốn hơi nước dựa trên sự thẩm thấu, hòa tan, khuếch tán
và lôi cuốn theo hơi nước của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các
mô khi tiếp xúc với hơi nước ở nhiệt độ cao.
Do đó: Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước tinh dầu vỏ quả như cam bưởi,...
có thể thực hiện trong điều kiện nguyên liệu còn nguyên, dạng mảng lớn và không
bị ảnh hưởng quá nhiều bởi nhiệt độ cao. Nguyên liệu nên dùng lúc còn tươi để tránh
hao hục tinh dầu vì tinh dầu có tính bay hơi.
2. Phương pháp tách tinh dầu vỏ quả bằng lực cơ học như ép, vắt… có thể
thực hiện trong điều kiện nguyên liệu như thế nào? Giải thích?
- Các trái thuộc họ Rutaceae như cam, chanh, bưởi, quýt,… có các túi tinh dầu
nằm sát mặt ngoài vỏ và với hàm lượng cao nên có thể dùng lực cơ học để giải phóng
tinh dầu. Sau đó có thể vắt lấy tinh dầu. Tinh dầu thu được trong trường hợp này có
mùi tự nhiên hơn do không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ. Tuy vậy, hiệu suất theo cách
này không cao.
Do đó: Phương pháp tách tinh dầu vỏ quả bằng lực cơ học như ép, vắt... có thể
thực hiện trong điều kiện nguyên liệu còn tươi, ở dạng đã được cắt nhỏ, mỏng

4
 3. Nguyên tắc lóng tách hai chất lỏng từ một hỗn hợp?
* Chiết lỏng - lỏng:
- Chiết lỏng – lỏng là quá trình chuyển một chất ở dạng hòa tan hay huyền phù
từ pha lỏng này sang pha lỏng khác. Tùy theo bản chất của chất cần chiết và môi
trường chúng đang tồn tại mà ta chọn dung môi chiết thích hợp sao cho chỉ hòa tan
chất định chiết mà không hòa tan các chất của môi trường. Quá trình chiết kết thúc
khi chất đã chiết hết. Kiểm tra bằng màu hay sắc ký.
*Nguyên tắc chọn dung môi:
- Dung môi phải chọn là dung môi có khả năng hòa tan lớn hơn dung môi cũ.
- Dễ tách ra khi tinh chế lại thành chất tinh khiết không trộn lẫn vào dung môi
cũ.
- Có sự khác biệt nhiều về tỉ khối so với dung môi cũ.
- Ít có khả năng tạo nhũ và ít nguy hiểm.
- Hai chất lỏng phải không hòa tan vào nhau.
- Có nhiệt độ sôi thấp vì sau khi chiết ta thường dùng phương pháp chưng
cất để tách dung môi ra.
- Dung môi không phân cực (ether dầu hỏa…) hòa tan tốt hợp chất không phân
cực.
- Dung môi phân cực trung bình (diethyl ether, chloroform…) hòa tan tốt hợp
chất phân cực trung bình (hợp chất có nhóm chức eter –O–, aldehyde –CH=O, ceton
–CO–, ester –COO–,…).
- Dung môi phân cực mạnh (metanol…) hòa tan tốt các hợp chất phân cực
mạnh (các hợp chất có chứa nhóm chức –OH, –COOH,..).

5
 *Những lưu ý khi sử dụng bình lóng:
- Trước hết khóa kín bình, đổ dung dịch vào, rồi cho dung môi vào bình lóng,
thường dùng từ 1/5 – 1/3 thể tích dung dịch. Đậy nút, tay phải giữ nắp và bình,
tay trái giữ khóa bình, lắc nhẹ cẩn thận, đảo ngược nhiều lần. Khi lắp áp suất trong
bình tăng lên nên thỉnh thoảng mở khóa bình để cân bằng áp suất với bên ngoài,
sau đó đóng khóa lại, tiếp tục lắc. Khi lắc xong, để bình trên giá, mở nắp và chờ
dung dịch tách thành hai lớp. Mở khóa bình cho lớp chất lỏng phía dưới chảy xuống
một cốc hứng riêng, lớp chất lỏng lớp trên hứng vào một cốc riêng.
*Chú ý:
- Nếu sau khi lắc và lắng, nếu không thấy hai chất lỏng không tách thành hai
lớp ra mà tạo nhũ tương, ta dùng một đũa thủy tinh dài đưa vào trong bình lóng, khuấy
nhẹ dung dịch hoặc cọ xát nhẹ vào thành bình, chổ mặt thoáng dung dịch nhằm phá
vỡ bọt khí để dung dịch nhanh chóng phân thành hai lớp. Ngoài ra, ta có thể thêm
dung dịch NaCl bão hòa tinh khiết vào cho đến khi tách thành hai lớp chất lỏng, hoặc
có thể thêm vào bình lóng khoảng 30ml nước cất.
4. Nguyên tắc làm khan hợp chất hữu cơ?
- Đây là phương pháp loại nước hoặc dung môi ra khỏi sản phẩm hoặc hóa chất ban
đầu.
- Làm khô trong hóa hữu cơ là làm khô nước. Một chất làm khô được gọi là tốt khi
cường độ làm khô mạnh và khả năng làm khô lớn. Cường độ làm khô được đánh giá
bằng áp suất hơi nước của chất đó, khả năng làm khô được đánh giá bằng lượng
nước hấp thụ được.
- Các chất như P4O10, H2SO4 đặc, CaCl2, MgSO4, Na2SO4 đều là các chất làm
khô mạnh. Người ta còn chia chất làm khô thành 3 loại: Acid như P 4O10, H2SO4
đặc...; Base như KOH, NaOH viên... và chất làm khô trung tính: MgSO4, Na2SO4...
tùy theo tính chất của đối tượng được làm khô mà người ta chọn chất làm khô thích
hợp theo nguyên tắc không làm biến chất chất được làm khô về cả tính chất vật lý
lẫn hóa học.

6
 *Chất làm khô phải thỏa mãn các điều kiện sau
- Không có tác dụng hóa học với chất lỏng.
- Có khả năng hút nước mạnh.
- Không hòa tan trong chất lỏng.
- Có tác dụng làm khô nhanh.

5. Nguyên tắc xác định hằng số vật lý tinh dầu nhằm mục đích gì?
Mục đích là để xác định độ tinh khiết của tinh dầu cam thu được, khảo sát được
lượng nước còn lẫn trong tinh dầu, hiệu suất chiết cũng như độ tan của tinh dầu cam.

6. Báo cáo kết quả thực nghiệm:

- Thu được tinh dầu màu vàng nhạt.
- Công thức phân tử: C10H16
- Tên IUPAC: 1-methyl-4-(1-methylethenyl)-cyclohexene

7
 BÀI 2
TÁCH CHẤT BÉO TỪ DẦU THỰC VẬT
(HOẶC MỠ ĐỘNG VẬT)

I. Đại cương
A. Chất béo toàn phần (lipid): gồm nhiều hợp chất, có thể chia làm 3 nhóm
lớn như: các chất béo dầu mỡ, sáp, phospholipid.

* Các chất béo dầu mỡ: gồm các chất acid béo (dạng dầu hoặc hơi sệt),
hydroxyacid, các acetylenic acid và hỗn hợp các glycerid.

- Acid béo: hầu như bao giờ cũng có số carbon chẵn.

Các acid béo dạng dầu có chứa từ 1 đến 6 nối đôi trong phân tử. Trong thiên
nhiên đa số acid béo không no, kể cả những acid không liên hợp quan trọng nhất
(như là acid oleic, acid linoleic, acid linolenic) đều có cấu trúc dạng cis.

Các acid béo no thường có dạng mỡ, sệt hơn. Acid caproic – C6, acid caprylic
– C8, acid capric – C10, acid lauric – C12, aicd myristic – C14, acid panmitic – C16,
acid stearic – C18, acid arachidic – C20, acid behenic – C22 và acid montanic – C28.

Khi chúng ta thực hiện xà phòng hóa chất béo, các acid béo cũng tham gia
phản ứng nên bị biến đổi hóa tính, tạo muối.

Các acid béo cũng tham gia trong phản ứng xà phòng hóa tạo thành muối.
- Acid acetylenic: nhóm hợp chất acid carboxylic dạng dầu luôn có chứa liên
kết ba trong phân tử, (có 1 hoặc 2 liên kết ba liên hợp, hoặc có liên kết ba liên hợp
với liên kết đôi), ngoài ra có thể có thêm các liên kết đôi. Nhóm chất này cũng có
thể gồm các dẫn xuất có oxygen tương ứng.

Ví dụ: acid tariric CH3(CH2)10C ≡ C(CH2)4 COOH, và các hợp chất có cùng
công thức phân tử là acid stearolic CH3(CH2)7C ≡ C(CH2)7 COOH.
8
 Acid ximenynic CH3(CH2)5C = CH–C ≡ C(CH2)7 COOH
- Glycerid: hợp chất không phân cực, khi bị xà phòng hóa tạo thành glycerol
và muối của acid béo. Có 2 loại glycerid: loại đơn glycerid và loại hỗn hợp glycerid.
Ví dụ: Oleodistearin là glycerid hỗn hợp.
* Các chất sáp: chủ yếu gồm các acid béo dây hở, ester của acid béo và các
alcol monohydric, thường chứa từ 24 - 36 carbon. Ví dụ về những chất sáp trong
thiên nhiên như: sáp ong (ngoài acid panmitic có chauws acid cerotic và alcol
melicssylic); mỡ sáp từ lông cừu (lanolin), mỡ sáp trong dầu cá nhà táng –
spermaceti (có chứa alcol cetylic, acid oleic và acid panmitic). Các sáp chịu được
sự xà phòng hóa hơn là dầu và các chất béo.
* Các chất béo là hợp chất hữu cơ biến dưỡng thứ cấp: Sphingomyelin,
phospholipid.
- Phospholipid: có chứa acid phosphoric và một base nito (như cholin hoặc
etanolamin hoặc serin) và một polyhydroxyalcol.
- Sphyngomyelin: có mạch acid béo hóa hợp với một polyhydroxyamin mạch hở tạo
nối amid, và có thể còn có liên kết glycosidic với hydratcarbon.
B. Sterol:

- Sterol là một dạng chất béo thuộc nhóm chất hữu cơ bậc hai, không bị xà
phòng hóa, có cấu trúc hệ vòng cyclopentano perhydrophenanthrene, với nhóm –
OH ở vị trí C–3 trên vòng; và trong số ít trường hợp có cấu trúc biến đổi của hệ
vòng đó. Nhờ cấu trúc này mà cách định tính và định lượng sterol có những phương
pháp riêng.
- Sterol là nhóm chất rất phong phú, có trong động vật, thực vật và nấm men.
Sinh tổng hợp sterol từ chuyển hóa acetate thành squalene, đồng thời có phối hợp
đóng vòng và demethyl hóa. Sterol có thể ở dạng tự do hoặc hóa hợp như ester hoặc
glycosidic.

9
 - Do sterol không tan trong nước và không bị xà phòng hóa nên có thể tách ra
khỏi dung dịch chất béo đã bị xà phòng hóa bằng cách chiết lỏng – lỏng với dung
môi hữu cơ kém phân cực.
C. Tính chất, vai trò và cách khảo sát chất béo:
- Chất béo không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ kém phân cực. Vì
vậy có thể sử dụng các dung môi như: eter dầu hỏa, hexan, chloroform để tách lấy
chất béo từ nguyên liệu khô, hoặc chiết lỏng – lỏng để tách lấy chất béo từ dịch
chiết alcol của nguyên liệu.
- Vai trò của chất béo với cơ thể động, thực vật rất quan trọng. Đặc biệt vai trò
của các sterol khác hẳn các lipid, không những ảnh hưởng trực tiếp lên chủ thể
mà còn ảnh hưởng đến các sinh vật khác có liên hệ đến chủ thể.
II. Mục đích yêu cầu
- Khảo sát sơ bộ thành phần chất béo của dầu đậu nành bằng sắc ký lớp mỏng
(TLC).
III. Tiến hành
1. Chiết chất béo trong đậu nành
- Chuẩn bị: Cân 150g bột khô đậu nành đã giã nhuyễn, cho vào túi vải, để lơi
thể tích túi nhưng cột chặt miệng túi.
- Dùng eter dầu hỏa ngâm bột đậu chiết lấy các hợp chất béo, ngâm chiết 3 lần,
lần lượt với thể tích 200ml, 150ml, 100ml. Khi cho dung môi vào ngâm túi, dùng
đũa khuấy động lên túi 10 phút rồi để yên 5 phút, vắt lấy dịch eter dầu hỏa (mang
bao nhựa để thực hiện). Gom dịch chiết, lọc qua giấy lọc, đong 2/3 thể tích chia cho
bài 3, đem đi cô quay 1/3 dung dịch còn lại.

10
 Ngâm bột đậu nành với eter dầu hỏa Ngâm chiết phần bã với
dichloromethane 2 lần

- Ngâm chiết phần bã đậu nành với diclomethane 2 lần, mỗi lần 100ml dung môi. Thu lấy
dịch chiết, đuổi dung môi bằng máy cô quay thu hồi dung môi, đến thể tích còn khoảng
3ml.

2. Phân tích sắc ký dung dịch chất béo của đậu nành
- Chuẩn bị 2 bản mỏng sắc ký, vạch đường xuất phát và đường mốc đến của
dung môi.
- Trên mỗi bảng mỏng chấm 2 vết sắc ký ứng vói 2 loại dịch chiết thu được:
dịch eter dầu hoả (E) và dịch dichloromethane (C).
- Chuẩn bị giải ly từng bản mỏng trong trong 2 loại hệ dung môi khác nhau.
Dung môi giải ly (1): eter dầu hoả : etyl acetate (0,5:1,5).

11
 Dung môi giải ly (2): dichloromethane : metanol = 99 : 1 (dùng 2ml
dichloromethane và cho vào một giọt metanol).
- Ghi nhận kết quả sắc ký ứng với 2 loại dịch chiết và so sánh khi giải ly trong
2 loại dung môi khác nhau đã nêu.

Dịch chiết sau cô quay Sắc ký lớp mỏng

IV. Báo cáo kết quả
1. Kết quả sắc ký
(1) Dung môi eter dầu hỏa : etyl acetate (0,5:1,5)
(2) Dung môi dichloromethane : metanol (99:1)

* Nhận xét:
- (1) thì chất chạy cao hơn (2).
- Hai chấm ở cả 2 bảng mỏng thì có Rf bằng nhau nhưng với dịch chiết từ eter
dầu hỏa thì đậm hơn dịch chiết từ dichloromethane

12
 *Tìm hiểu về nhóm chất béo dầu mỡ, chất béo biến dưỡng thứ cấp.

- Từ ngàn xưa, người châu Á đã sử dụng đậu nành như một nguyên liệu quen
thuộc để chế biến các món ăn và loại đồ uống khác nhau. Thành phần dinh dưỡng
của đậu nành rất đa dạng và phong phú, giúp mang đến giá trị cao.

- Đậu nành (Glycine max) là một cây họ đậu có nguồn gốc từ Đông Á. Đây là
một loại nguyên liệu quan trọng trong chế độ ăn của người dân châu Á và được sử
dụngtừ rất lâu. Ngày nay, loại đậu này chủ yếu được trồng ở châu Á, Nam và Bắc
Mỹ.

- Người châu Á thường dùng cả đậu nành tươi và khô hoặc ươm thành mầm
đậu nành để chế biến thực phẩm, trong khi đó các sản phẩm đậu nành đã qua chế
biến phổ biến hơn ở nhiều nước phương Tây. Chúng ta có thể bắt gặp rất nhiều sản
phẩm khác nhau bao gồm bột đậu nành, protein đậu nành, đậu phụ, sữa đậu nành,
nước tương và dầu đậu nành. Loại đậu này chứa các chất chống oxy hóa và các
dưỡng chất từ thực vật có lợi cho sức khỏe. Tuy nhiên, nhiều người cũng lo ngại về
tác dụng phụ tiềm ẩn của loại hạt này.
- Thành phần dinh dưỡng của đậu nành

Đậu nành chủ yếu chứa nhiều protein nhưng cũng chứa một lượng lớn đường
và chất béo. Các thành phần dinh dưỡng có trong 100g đậu nành luộc là:

• Calo: 173

• Nước: 63%

• Protein: 16,6g

• Carbohydrate: 12,9g

• Chất xơ: 6g

• Chất béo: 9g

13
 - Chất béo bão hòa: 1,3g
- Chất béo không no đơn nguyên: 1,98g
- Chất béo không no đa nguyên: 5,07g
+ Omega-3: 0,6g
+ Omega-6: 4,47g

- Có hai phương pháp trích ly dầu nành:

• Phương pháp một, dùng máy ép lấy dầu. Phương pháp này đơn giản, dễ thực
hiện nhưng hiệu quả không cao.

• Phương pháp hai, dùng dung môi để ly trích, phương pháp này đòi hỏi quy
trình và công nghệ phức tạp nhưng hiệu suất cao. Phương pháp này được ápdụng
cho quy mô công nghiệp để sản xuất ra dầu nành tinh luyện.
- Để có được dầu tinh luyện như trên thị trường, dầu nành trích ly được từ
phươngpháp trích ly dung môi (n-hexan). Trước đó nguồn nguyên liệu được xử lí
sơ bộ: phân loại, làm sạch, gia nhiệt (ram), cracking...sau đó được chuyển đến công
đoạntrích ly lấy dầu. Dầu được lấy ra được gọi là dầu thô, có chứa nhiều dung môi
và tạp chất tan trong dầu. Dầu thô được đưa vào một hệ thống phân lập lấy dầu phức
tạp, dung môi được làm bay hơi và được tái sử dụng. Để tẩy màu của dầu, dầu được
cho vào đất sét ẩm chuyên dùng cho hấp phụ vài ngày. Tiếp theo, dầu được khử mùi
bằng cách cho bay hơi những chất có mùi, sau đó được làm bền hóa-tinh luyện và
làm sạch dầu (loại nhựa, loại xà phòng...) để được dầu thành phẩm. Trên thị trường,
dầu thành phẩm là hổn hợp của nhiều loại dầu oliu, dầu nành, dầu phộng...

- Chất béo trong đậu nành sẽ được chiết xuất qua ép nóng và tinh chế. Dầu tinh
chế sẽ có màu vàng nhạt, không có vị và chứa hơn 60% axit béo đa không bão hoà.
- Lợi ích của dầu đậu nành: Dầu đậu nành có chứa các loại chất béo không bão
hòa đa, là một loại chất béo tốt cho hệ thống tim mạch. Loại dầu thực vật này cung
cấp dinh dưỡngtốt cho cơ thể, lại không chứa cholesterol giúp ngăn chặn quá
14
trình hình thành mảng bám ở mạch máu, phòng tránh được nguy cơ mắc bệnh về
tim, xơ vữa động mạch.
- Vitamin K có trong dầu đậu nành giúp tăng cường hoạt động của hoạt chất
osteotrophic trong xương giúp tốc độ phục hồi xương nhanh hơn. Vitamin K trong
đậu nành có thể kích thích sự phát triển xương một cách tích cựcvà mạnh mẽ, việc
chuyển sang dùng dầu đậu nành để thay thế cho những loại dầu hiện tại nếu muốn
tránh nguy cơ bị loãng xương.
- Dầu đậu nành chứa một lượng lớn acid béo omega-3, đóng vai trò quan trọng
trong việc tăng cường sức khỏe và ngăn ngừa bệnh mạn tính. Tăng lượng acid béo
omega-3 trong bữa ăn hàng ngày có thể giúp giảm viêm, được cho là có liên quan
đến sự phát triển của các bệnh mạn tính như bệnh tim, ưng thư và đái tháo đường.
Ngoài dầu đậu nành bạn có thể kết hợp nhiều loại thực phẩm khác chứa acid béo
omega-3 như cá hồi, hạt lanh, hạtóc chó…
- Dầu đậu nành rất giàu vitamin E, một chất dinh dưỡng có thể giúp tăng cường
sức khỏe làn da. Vitamin E có thể bảo vệ chống lại tổn thương và giúp điều trị một
số tình trạng xấu của da như mụn trứng cá, viêm da, dị ứng…
- Lưu ý khi dùng dầu đậu nành

• Mặc dù dầu đậu nành mang đến nhiều lợi ích cho sức khỏe, nhưng việc tiêu
thụ quá thường xuyên có thể gây ra những mối nguy hại tiềm ẩn.

• Dầu đậu nành chứa tỷ lệ chất béo omega-6 cao. Mặc dù cả chất béo omega-
6và omega-3 đều cần thiết cho chế độ ăn uống, nhưng hầu hết mọi người tiêu thụ
quá nhiều thực phẩm giàu chất béo omega-6 và quá ít chất béo omega-3. Sự mất cân
này có thể dẫn đến một số tình trạng như béo phì, suy giảm nhận thức…

• Một số nghiên cứu trên chuột cho thấy, chế độ ăn quá nhiều dầu đậu nành
dẫn đến những thay đổi bất lợi về trao đổi chất bao gồm tăng mỡ trong cơ thể, lượng
đường trong máu cao, gan nhiễm mỡ.
15
 BÀI 3
TÁCH CHIẾT STEROL TỪ HỖN HỢP KHÔNG BỊ XÀ
PHÒNG HÓA CỦA CHẤT BÉO
I. Đại cương
Sterol cũng là một dạng chất béo thuộc nhóm chất hữu cơ biến dưỡng thứ cấp,
khác hẳn các chất béo dầu mỡ, và cũng khác nhóm phospholipid. Sterol thường có
cấu trúc hệ vòng cyclopentano perhydrophenantren, với nhóm –OH ở vị trí C–3 trên
vòng; và trong một số ít trường hợp có cấu trúc biến đổi của hệ vòng đó. Nhờ cấu
trúc này mà cách định tính và định lượng sterol có những phương pháp riêng.
Sterol không bị xà phòng hóa nên có thể vẫn giữu được tính chất kém tan trong
nước, không tan trong dung dịch chất béo đã xà phòng hóa, có thể tách ra khỏi hệ
dung dịch bằng cách chiết lỏng lỏng dung dịch này với dung môi hữu cơ kém phân
cực.
II. Mục tiêu
- Sử dụng soxhlet để xà phòng hóa chất béo trong vật liệu → tách rời sterol.
- Sử dụng bình lóng để chiết lỏng lỏng, tách lấy sterol ra khỏi dầu thực vật.
- Khảo sát, so sánh sản phẩm sterol và chất béo ban đầu bằng sắc ký lớp mỏng.
- Thực hiện cách kéo ống vi quản, sắc ký lớp mỏng.

16
 III. Tiến hành
- Chuẩn bị từ trước chất béo trong đậu nành: đã chuẩn bị ở bài số 2.
- Xà phòng hóa dung dịch chất béo của đậu nành: 100 ml dung dịch chất béo,
thêm 100 ml methanol và 25 g KOH, cho vào bộ đun hồi lưu, đun trong 1 giờ.
- Sau đó cho thêm 50 ml nước cất vào thu được hỗn hợp. Hỗn hợp này chia làm 2
phần, chiết 3 lần, mỗi lần với 50 ml eter dầu hỏa.

Chiết với eter dầu hỏa

- Tinh chế hỗn hợp sterol

Dịch chiết eter dầu hỏa rửa với 50 ml nước muối bão hòa, và làm khan bằng
Na2SO4 khan, lọc. Dung dịch eter dầu hỏa được cô quay thu hồi dung môi đến còn
3-5ml cho ra cốc, và ngâm đá, thu lấy tủa. Kết tinh lại: hòa tan kết tủa này trở vào

17
lại 3ml chloroform đã đun nhẹ (50ᴼC), sau đó lọc qua phễu giấy lọc, ngâm lạnh đặt
vào tủ hút để bay hơi, thu được kết tủa sterol.
- Sắc ký bản mỏng khảo sát sơ bộ thành phần sterol

Chuẩn bị bản mỏng sắc ký, vạch đường xuất phát và đường mốc đến của dung
môi. Chấm sắc ký 3 vết: dung dịch chất béo của đậu nành (1), dịch chiết eter dầu
hỏa (2), dung dịch khi ngâm kết tủa sterol đã kết tinh (lấy 1 ít ngâm vào 1ml eter
dầu hỏa) (3).
Chuẩn bị hệ dung môi giải ly là CHCl3 : CH3OH (2ml CHCl3 nhỏ 1 giọt
CH3OH)

Đặt bản mỏng sắc ký vào cốc giải ly, chờ đến khi dung môi dâng lên cao đến
vạch mốc của dung môi đã gạch sẵn trên bản. Lấy bản đã giải ly xong hong khô trên
bếp điện. Xem kết quả của giải ly bản mỏng: Bản mỏng hoặc soi đèn UV, hoặc hiện
hình vết: đem nhúng vào thuốc hiện hình vết, hơ nhẹ và sấy trên bếp điện (120ᴼC)
đến khi hiện màu vết, ghi nhận kết quả.
IV. Kết quả
1. Kết quả màu sắc
Sterol (2) và (3) thu được hiện trên bản mỏng với các vết tròn, rõ không kéo
vệt so với dung dịch chất béo đậu nành (1). Sterol trước và sau kết tinh lại không có
sự khác biệt nhiều, nhưng vết sterol sau khi kết tinh lại (3) rõ và ít tạp hơn một chút
so với trước khi kết tinh (2). Nguyên nhân là do quá trình kết tinh lại, lọc nóng đã
loại đi một số tạp chất có trong sterol trước nên vết sterol sau khi kết tinh sẽ rõ và ít
tạp chất hơn.

18
 2. Tìm hiểu và viết báo cáo về nhóm chất sterol trong sữa đậu nành.
Sterol là những ancol thường ở thể rắn, có cấu trúc 27 – 29 nguyên tử carbon,
nhưng đều có chung khung sườn cơ bản là khung gonan và một nhóm thế alkyl ở
mạch nhánh ở C–17.

19
 Sterol phân bố rất rộng, được tìm thấy trong động vật có xương sống, không
xương sống và sau đó tìm thấy trong thực vật, cả trong các loại nấm men. Sterol
thường có mặt song song với các alkaloid hoặc saponin khác trong động thực vật.
Nhóm sterol thực vật (phytosterol): Sistosterol (có các đồng phân α, β,
gamma), stigmasterol, alpha stigmasterol, campesterol, brassicasterol... Các sterol
thực vật có trong tất cả các bộ phận của cây nhưng nhiều nhất ở các hạt có dầu, dưới
dạng tự do hoặc ester. Một số ít ở dạng glycosid.

Trong 100g đậu nành có từ 300 – 400 mg sterol thực vật. Thành phần chính
của sterol trong đậu nành gồm có β – sistosterol (53 – 56%), campesterol (20 – 23%)
và stigmasterol (17 – 21%). Cấu trúc của những sterol này giống với cholesterol
nhưng khác nhau ở mạch nhánh. Sistosterol có một nhóm ethyl và campesterol có
một nhóm methyl ở vị trí 24 của cholesterol, stigmasterol có một nối đôi ở vị trí 22
– 23 của sistosterol.
* β – sistosterol

Là chất bột màu trắng, dạng sáp, mùi dễ chịu, không tan trong nước và tan
trong alcohol.

Ứng dụng:
Khi tồn tại một mình cũng như ở dạng hợp chất với các phytosterol tương tự,
β – sistosterol làm giảm lượng cholesterol và đôi khi còn được dùng để chữa tăng
cholesterol máu. β – sistosterol ngăn cản cholesterol hấp thu vào ruột. Khi sterol
20
được hấp thu vào ruột, được vận chuyển bởi các lipoprotein và kết hợp với màng tế
bào. Các phytosterol và phytostanol đều ngăn chặn sự hấp thu cholesterol cả trong
chế độ ăn uống và cholesterol trong mật, làm giảm mức độ LDL và cholesterol trong
huyết tương. Bở vì cấu trúc giống nhau, sistosterol chiếm chỗ của cholesterol trong
mật và trong chế độ ăn ở dạng các hạt micelle tạo ra từ lumen ruột, điều này làm
cho lượng cholesterol hấp thu vào cơ thể giảm.
Kỹ thuật hóa học:
Trong nhiều năm, người ta đã sử dụng sistosterol như một chất hóa học trung
gian do thiếu một hóa chất để tấn công vào mạch nhánh để khử mạch nhánh đi.
Nhiều nhà khoa học đã nỗ lực để khám phá ra một vi ống pseudomonas rất có hiệu
quả trong việc chuyển đổi cấu trạng. Sự lên men tiêu hóa toàn bộ các mạch nhánh
no ở C – 17 để tạo thành hỗn hợp sản phẩm 17 – keto bao gồm
dehydropiandrosterone.
Tác dụng phụ:
Tránh dùng β – sistosterol cho phụ nữa mang thai và cho con bú, bởi vì có
nhiều ảnh hưởng đối với trẻ chưa sinh và trẻ mới sinh.

Những người bị sitpsterolemia, một bệnh về dự trữ chất béo β – sistosterol

hiếm. Bởi vì những người bị bệnh này có rất nhiều β – sistosterol và các chất béo
có liên quan, dung thêm β – sistosterol sẽ làm cho tình trạng xấu hơn.
Nồng độ β – sistosterol trong máu cao làm liên quan đến sự gia tăng bệnh tim
nghiêm trọng đối với những người có tiền sự bị đau tim.

Làm mất trật tự gene:

Trong khi các phytosterol thường có ích, nhưng khi hấp thụ nhiều sẽ gây ra sự
mất trật tự trên nhiễm sắc thể gene lặn.
Phytosterol tăng cao và bị hấp thu quá mức ở mô sẽ gây ra hội chứng động
mạch vành sớm và gân xanthoma.
21
 Tiền chất của sự đồng hóa steroid boldenone:
β – sistosterol là tiền chất của sự đồng hóa steroid boldenone. Boldenone
undecylenate thường được dùng trong thuốc thú y để kích thước sinh trưởng ở gia
súc nhưng nó cũng là steroid đồng hóa được sử dụng nhiều nhất trong thể thao. Điều
này dẫn đến sự nghi ngờ là một vào vận động viên thử nghiệm dương tính với
boldenone undecylenate đã không lạm dụng hormone này mà đã dùng những thực
phẩm giàu sistosterol.
* Stigmasterol

Stigmasterol không tan trong nước mà tan hầu hết trong các dung môi hữu cơ
có chứa nhóm chức alcohol.

Hiện diện:
Stigmasterol là một sterol thực vật không no, có trong dầu thực vật hay dầu
đậu nành, hạt nho và trong nhiều cây thực vật dược như cây cỏ Trung Quốc
Ophiopogon japonicas và nhân sâm Mỹ. Stigmasterol cũng có trong nhiều loại rau
củ, cây họ đậu, hạt. Dầu ăn chứa nhiều Stigmasterol hơn rau củ. Các phytosterol
chủ yếu bị phân cắt trong mật.
Ứng dụng:

Stigmasterol được sử dụng làm tiền chất cho việc sản xuất progesterone bán
tổng hợp, một hormone có giá trị với người, giữ vai trò sinh lý quan trọng trong các

22
cơ chế điều tiết và tái tạo các mô liên quan đến ảnh hưởng của estrogen và corticoid.
Stigmasterol còn được dùng như là tiền chất của vitamin D3.

Các nghiên cứu:

Các nghiên cứu cho thấy Stigmasterol có thể có ích trong việc ngăn chặn ung
thư ở buồn trứng, tuyến tiền liệt, vú và ruột kết. Các nghiên cứu cũng cho thấy một
chế độ ăn nhiều phytosterol có thể ức chế sự hấp thu cholesterol và làm giảm mức
cholesterol trong huyết thanh bằng cách cạnh tranh với quá trình hấp thu ở ruột. Các
nghiên cứu trên động vật trong phòng thí nghiệm cho thấy động vật được cho ăn
stigmasterol thì cả cholesterol và sistosterol giảm tương ứng là 23% và 30%, trong
thời gian hơn 6 tuần, Các nghiên cứu trên đã chứng minh rằng stigmasterol ức chế
nhiều chất trung gian viêm và chất trung gian thoái hóa chất nền liên quan mật thiết
đến viêm xương khớp do thóa hóa sụn. Stigmasterol còn có khả năng chống oxy
hóa, hạ đường huyết và ức chế tuyến giáp.
Tiền chất của boldenone:
Tương tự như sistosterol, stigmasterol là một steroid, đồng thời cũng là tiền
chất của sự đồng hóa steroid boldenone. Boldenone undecylenate thường được dùng
trong thuốc thú y để kích thích sinh trưởng ở gia súc nhưng nó cũng là steroid đồng
hóa được sử dụng nhiều trong thể thao.
* Campesterol

23
 Campesterol là một phytosterol có cấu trúc tương tự như cấu trúc cholesterol.
Campesterol có trong nhiều loại rau củ, trái cây, các loại hạt và hạt giống nhưng với
hàm lượng thấp. Trong chuối, ớt, lựu, cà phê, bưởi, dưa leo, củ hành, lúa mạch,
khoai tây và cỏ chanh có chứa từ 1 – 7 mg Campesterol/100g phần ăn được. Trong
dầu canola và dầu bắp có từ 16 – 100 mg Campesterol/100g. Hàm lượng
Campesterol nhiều hay ít tùy thuộc vào sự ảnh hưởng của điều kiện địa lý và môi
trường phát triển của cây. Sự khác nhau về giống cũng gây nên sự khác nhau của
các sterol thực vật. Nhiều giống mới hiện đang được nghiên cứu nhằm tạo ra giống
chứa nhiều Campesterol và các sterol thực vật khác.

Campesterol đuọc cô lập lần đầu từ hạt nho Brassica campestris và tên của nó
cũng được đặt theo tên của cây này. Campesterol có tính kháng viêm, có khả năng
ức chế các chất trung gian viêm và chất trung gian thoái hóa chất nền liên quan mật
thiết đến viêm xương khớp do thóa hóa sụn.

Hội chứng tim mạch:

Những năm 1950, lần đầu tiên sterol thực vật đã được chứng minh là có ích
trong việc làm giảm LDL cholesterol. Kể từ đó, nhiều nghiên cứu đã ghi nhận lại
những lợi ích của chế độ ăn uống có phytosterol, bao gồm campesterol.
Các nhà nghiên cứu cho rằng campesterol cạnh tranh với cholesterol, vì vậy
làm giảm sự hấp thu cholesterol vào ruột. Các sterol thực vật cũng có thể hoạt động
trực tiếp trong các tế bào ruột và ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển protein. Thêm
vào đó, có thể có ảnh hưởng đến sự tổng hợp cholesterol vận chuyển protein qua tế
bào gan qua một quá trình gồm ester hóa cholesterol và ester hóa lipoprotein, tổng
hợp cholesterol và khử đi lipoprotein có chứa apolipoprotein B100.
Hàm lượng trong huyết thanh của campesterol và tỉ lệ của campesterol và
cholesterol đã được sử dụng để đo lường những ảnh hưởng xấu tới tim mạch. Một
vài nghiên cứu cho thấy hàm lượng càng cao thì tim mạch càng ít gặp nguy hiểm.
Tuy nhiên, hàm hượng quá cao có thể tiềm tàng những nguy hiểm cao hơn, ví dụ
24
mất trật tự gene và sitosterolemia. Các nghiên cứu dựa trên hàm lượng huyết thanh
đã có mâu thuẫn. Một phân tích meta gần đây cho thấy không có mối quan hệ rõ
ràng nào và nếu có thể các nghiên cứu trước đã kết luận dựa trên các nhân tố khác.
Ví dụ, người có hàm lượng campesterol cao hơn lên quan đến chế độ ăn gồm nhiều
trái cây, hạt theo thực đơn của người Địa Trung hải và vì vậy ít nguy hiểm hơn so
với những người khác ăn nhiều thực phẩm nhiều chất béo. Sự hấp thu cholesterol ở
ruột thay đổi giữa các cá nhân khác nhau và có thể hấp thu nhiều phytosterol hơn
liên quan đến việc hấp thu nhiều LDL hơn.
Mặc dù các nghiên cứu trên người cho thấy việc tiêu thụ các phytosterol có thể
làm giảm mức độ LDL, tuy nhiên không có đủ bằng chứng để đưa phytosterol vào
điều trị cholesterol máu. Thực tế, cần nhiều nghiên cứu sâu hơn để chứng minh cho
lập luận này và đang được tiến hành. Các nghiên cứu trên động vật cho thấy
campesterol và các phytosterol khác có thể làm giảm kích các mảng bám bị xơ vữa,
nhưng chưa có dữ liệu nào chứng minh tiêu thụ phytosterol trong các tiện ích lâm
sàng ví dụ như giảm xơ vữa động mạch, các bệnh về tim mạch hay tử vong.
Các tác dụng phụ:
- Làm giảm hàm lượng beta – carotene.
- Làm giảm hàm lượng lycopene.
- Làm giảm hàm lượng vitamin E.
- Làm tăng nguy cơ bệnh xơ vữa và bệnh tim mạch.

25
 BÀI 4
PHÂN TÍCH SẮC KÝ DẦU BÉO THỰC VẬT

I. Đại cương
- Trong một số loài thực vật có chứa nhiều hợp chất béo dạng dầu, một số
loàiđộng vật có các chất béo dạng mỡ và sáp, một số loài nấm men có các chất béo
sterol.
- Tuy nhiên, ngoài các chất béo, các hợp chất kém phân cực khác cũng có thể
tồn lại các chất khác dưới dạng dầu như là tetraterpene, xantopil khi còn đang là
hỗn hợp trích từ thực vật. Trong hỗn hợp dầu béo thực vật, số lượng các hợp chất
thường nhiều hơn 2 chất.

- Các hợp chất dầu béo như alcohol, acid béo và ester trong hoa quả cũng có
vai tròtạo màu và mùi thơm cho thực vật đó.
II. Mục đích yêu cầu
- Phương pháp ngâm dầm: ngâm chiết các hợp chất có trong cơm quả gấc.
- Phương pháp chiết lỏng-lỏng: tách chiết các nhóm chất có tính phân cực
khácnhau từ dịch chiết alcohol tổng, với các dung môi hữu cơ thường dung.
- Khảo sát sơ bộ thành phần hợp chất trong các dung môi chiết khác nhau bằng
sắcký lớp mỏng (SKLM, thin layer chromatography).

- Phân tích sơ bộ thành phần chất béo dạng dầu của quả gấc bằng sắc ký
cột hở(SKC, open column chromatography).

26
 III. Cách tiến hành
1. Chiết chất béo trong quả gấc
- Chuẩn bị: Cơm quả gấc gâm rượu, rót ra cốc có dung tích 80mL. Chia làm 2 phần
không bằng nhau, phần ít (10ml) đem đi đun cách thủy khoảng 30 phút, để sử dụng cho
sắc ký lớp mỏng. Phần còn lại (70ml) dùng cho chiết tách dầu gấc.

- Cho 30mL nước vào phần chứa 70mL rượu gấc, khuẩy đều. Dùng ether dầu hỏa
chiết tách với dung dịch rượu gấc, 2 lần chiết mỗi lần dùng 70mL ether dầu hỏa. (Khi
cho dung môi vào bình lóng, lắc nhẹ rồi để yên, lóng tách lấy lớp trên, có thể dùng đũa
thuỷ tinh khuấy đều 5 phút rồi để yên 5 phút). Gom dịch chiết ether dầu hỏa, làm khan,
cô quay thu hồi dung môi, thu được dầu gấc.
Chú ý: Cô quay đến còn thể tích khoản 10mL, khoảng 2mL chấm sắc ký lớp mỏng,
phần còn lại cô cạn hơn để sắc ký cột.
- Ngâm chiết phần dung dịch rượu gấc đã tách béo với ethyl acetate 2 lần, mỗi lần
với 50mL dung môi. Gom dịch chiết, cô quay thu hồi dung môi, thu được cao EA.

2. Chấm sắc ký các dung dịch chiết có độ phân cực khác nhau của quả gấc
- Chuẩn bị bản mỏng sắc ký, chấm lên mỗi bản mỏng 3 vết: dịch ngâm alcohol, dầu gấc và
dịch chiết ethyl acetate.

- Chuẩn bị hệ giải ly:

+ Dung môi giải ly 1: ether dầu hỏa : ethyl acetate 1:1

+ Dung môi giải ly 2: dichloromethane : methanol 9:1
- Lần lượt giải ly mỗi bản mỏng trong 1 loại dung môi đã nêu.

- Đem bản mỏng đã giải ly ra khỏi bình triển khai, chờ khô, soi đèn UV hoặc nhúng vào
dung dịch thuốc hiện hình vết, chờ khô và sấy trên bếp điện 120°C đến khi hiện các vết.
- Lưu kết quả sắc ký bản mỏng.

27
 * Kết quả:
- Màu sắc của các vết trên sắc ký lớp mỏng

+ Cao chiết ether dầu hỏa có màu vàng.

+ Cao chiết với ethyl acetate có màu vàng cam.

- Kết quả sắc ký bản mỏng: Từ trái sang phải lần lượt là các vết của dịch
ngâm alcol của gấc, dầu gấc và dịch chiết ethyl acetate.
Dung môi giải ly 1: ether dầu hỏa : ethyl acetate = 1:1

Dung môi giải ly 2: dicloromethane : metanol = 9:1

3. Sắc ký cột dung dịch dầu béo của gấc
- Chuẩn bị cột sắc ký, cho gòn vào cột, ngâm silica gel (5g) trong dung môi
eter dầu hỏa 10ml, khuấy thành huyền phù đồng nhất trước khi nạp cột.
- Nạp cột ướt, nạp mẫu là dầu gấc đã cô sệt chừng 2ml.
+ Dung môi giải ly cột (1): eter dầu hoả
+ Dung môi giải ly cột (2): eter dầu hoả:etyl acetate = 1:1
+ Dung môi giải ly cột (3): etyl acetate
- Lần lượt hứng các phân đoạn giải ly trong các cốc khác nhau

Sắc ký cột dung dịch dầu béo của gấc

28
 Sản phẩm (phân đoạn 1, 2, 3)

Giải thích:
- Do eter dầu hoả là dung môi kém phân cực nên các vết sản phẩm phân bố đều
trên bảng mỏng.
- Ethyl acetate là dung môi phân cực hơn nên vết trên bảng mỏng cao hơn và
phân bố không đều.

29
 BÀI 5

TÁCH CHIẾT ALKALOID TOÀN PHẦN CHIẾT PIPERIN

TỪ HẠT TIÊU ĐEN
I. Mục tiêu:
- Giúp sinh viên nắm được các kiến thức liên quan đến alkaloid như: phương
pháp tách chiết, tính chất hóa học, hoạt tính.
- Hướng dẫn thực hiện sắc ký bản mỏng.
- Ôn luyện cho sinh viên kỹ năng kết tinh lại.
II. Tiến hành:
- Hạt tiêu đen (khoảng từ 10 đến 15g) dạng bột cho vào túi vải, sau đó chiết
nóng với 150 mL etanol 95o bằng shoxlet trong 1 giờ. Lọc lấy dung dịch thu được,
cô cạn bằng cách đun cách thủy đến khi thu được cặn (khan nước).

Chiết bằng máy Soxhlet Lọc lấy dung dịch

Thêm 20 mL dung dịch 10% KOH trong metanol vào cặn ở trên, để yên 15 phút, lọc
lấy dung dịch.
- Piperin kết tinh từ dung dịch sau một đêm.

Muốn kết tinh nhanh piperin phải lọc nóng

- Xác định hình dạng, màu sắc của tinh thể và đo nhiệt độ nóng chảy của tinh
thể thu được.

30
 - Tính toán hiệu suất của quá trình chiết.

- Sắc ký: Hòa tan tinh thể trong diclorometan, chấm lên bản mỏng sau đó giải
ly trong diclorometan có 3 giọt metanol. Sấy khô bản mỏng rồi nhúng bản mỏng
vào hỗn hợp H2SO4 20% trong CH3OH. Sấy khô bản mỏng và quan sát vết hiện trên
bản mỏng.

III. Kết quả:

Tìm hiểu và viết báo cáo về nhóm alkaloid trong hạt tiêu:
- Alkaloid trong hạt tiêu là nhóm hợp chất tự nhiên trong phân tử có chứa
nguyên tố Nitrogen ở dạng vòng (Alkaloid thật) hoặc không ở dạng vòng
(protoalkaloid), hiện diện khá nhiều trong các họ thực vật với cấu trúc và hoạt tính
sinh học đa dạng.
- Piperine cùng với đồng phân của nó – chavicine là một alkaloid, chất tạo nên
vị cay cho tiêu đen (Piper nigrum) và tiêu lốt (Piper logum). Piperine có dạng hình
kim đơn tà; tan ít trong nước nhưng tan nhiều trong dung môi hữu cơ như alcohol,
ether, chloroform,… tỉ khối: 1.193 g/cm3. CTPT: C17H19NO3.
31
 Piperine Chavicine

- Piperine được sử dụng trong dân gian như một thuốc diệt côn trùng. Ngoài
ra, nó còn có một số hoạt tính sinh học như chống trầm cảm ở chuột; ức chế nhiều
enzyme quan trọng trong chuyển hóa và vận chuyển thuốc. Piperine có thể làm tăng
tính sinh khả dụng (biovailability) của curcumin lên 2000% ở người. Gần đây, các
nhà khoa học đã khám phá ra rằng piperine có thể kích thích các sắc tố trong da,
cùng với việc tiếp xúc với ánh sáng UVB.
- Piperine có thể được cô lập trong năng suất tốt từ hạt tiêu đen mặt đất, được
tạo thành từ 5 – 9% alkaloid bao gồm piperine, piperettine và piperanine và xuất
phát từ trái cây sấy khô.

32
 BÀI 6
TÁCH CHIẾT FLAVONOID CHIẾT HESPERIDIN TỪ VỎ
CAM BƯỞI

I. Đại cương
Flavonoid là những hợp chất dạng C6–C3–C6, trong đó phần mạch C6 là vòng
benzene, mạch C3 có thể hở hay đóng kín với mạch C6 thành vòng pyran, (nhóm 9C
này gọi là hệ chromen); ngoài ra, từ các vị trí C–1, C–2 hoặc C–3 của mạch 3C này
có liên kết đơn với vòng C6 kế tiếp. Dựa vào sự biến đổi thể trạng oxy hóa trên nhóm
C3 và trên toàn phần tử, các flavonolid được chia thành nhiều lớp hợp chất khác
nhau: chalcon, dihydrochalcon, auron, flavon, flavan, flavan-3,4-diol,
anthocyanidin, catechin,..
Nhóm hợp chất có mang nhóm carbonyl tại carbon đầu tiên của mạch 3C trong
hệ thống chromen thì trong tên gọi có từ “on”, ví dụ như nhóm flavon, flavonol,
flavanonol, isoflavon, chalcon. Tùy vào vị trí của liên kết giữa họ chromen với mạch
thơm thứ hai mà flavon được chia thành eu-flavon, iso-flavon hay neo-flavon.
Các hợp chất có mang nhóm hydroxy thì tên gọi có từ “ol”, ví dụ như nhóm
flavonol, flavanonol. Các nhóm hydroxyl hầu như bao giờ cũng thấy ở các vị trí 5
và 7 ở vòng benzene thứ nhất (vòng A), còn vòng benzene thứ hai (vòng B) thường
mang các nhóm hydroxyl và alkoxyl ở vị trí 4’, hoặc 3’ và 4’ hoặc 2’ , 3’ và 4’.
Các hợp chất flavonoid thường có ở trong cây dưới dạng glycoside, trong đó
có 1 hoặc nhiều nhóm hydroxyl được hỗn hợp với hydratcarbon, oza. Các glycoside
của các hợp chất flavonoid có thể mang đường trên mỗi một nhóm hydroxyl có sẵn.
Các flavonoid có ở trong tất cả các bộ phận của cây, bao gồm cả quả, phấn,
hoa rễ, gỗ lỏi. Các hợp chất này có hoạt tính sinh học khá đa dạng, một ít flavon có
tác dụng kích thích tim, một số flavanon glycoside như hesperidin có tính làm bền

33
mao mạch yếu, những flavonol có nhiều nhóm hydroxyl có tác dụng lợi tiểu, chống
sự oxy hóa, auxin có tác dụng kích thích lúa mì nảy mầm... Các chất màu flavonoid
thu hút côn trùng đến thụ phấn cho hoa, làm cho quả có vẻ nổi bật thu hút động vật
đến ăn, giúp dễ phát tán hạt giống trong quả.

Đa số flavonoid có tính phân cực khá cho đến mạnh.

Phương pháp lý trích là ngâm chiết với dung môi phân cực và nước.

Tham khảo: Qui trình chiết Flavonoid toàn phần bằng dung dịch kiềm
(pH=12),
Công đoạn này được thực hiện trong cốc thủy tinh 1000 ml và dùng muỗng
khuấy, trộn đều liên tục với các điều kiện sau:
- Tỷ lệ dung môi so với nguyên liệu là: 4/1 - 6/1 (Thể tích/Khối lượng);
- pH của hỗn hợp chiết: 11 – 12 (dùng giấy pH kiểm tra dung môi trước)

- Nhiệt độ chiết trong công nghiệp: 30 – 40 °C; còn trong phòng thí nghiệm có
thể dùng dung dịch kiềm đun nóng đến 70 - 80 °C rồi ngâm để thúc đẩy nhanh quá
trình chiết.
- Thời gian ngâm chiết là 1 giờ.

Sau khi kết thúc giai đoạn chiết sẽ lọc bỏ bã và tạp chất không tan đã có lẫn
trong lúc chiết, thu được dịch lọc. Điều chỉnh pH của dịch lọc này về giá trị 4,5 -
5,0 bằng dung dịch HCl 0,1N, Để kết tinh trong 24 giờ. Lọc thu Flavonoid toàn
phần.
* Dung môi giải ly đối với hợp chất flavon thường là hệ phân cực mạnh. Ví dụ:
cloroform : metanol : acid acetic (7 : 3 : 2 giọt)
n- butanol : acid acetic : nước (4 : 1: 5) theo thể tích

34
* Tìm hiểu về glycosid của flavan
- Hesperidin là glycosid của flavanon có tên thông thường là hesperitin với
phần đường rutin. Sự giảng giải hesperidin bằng acid H2SO4, cho ra các hợp chất
sau:
Hesperidin Hesperitin + Rhamnose + Glucose

II. Mục tiêu

- Việc nghiên cứu tách, chiết các chất thuộc nhóm flavonoid, thuộc nhóm chất
hữu cơ phân cực, cần có phương pháp riêng biệt so với các bài tách chiết hợp chất
hữu cơ phân cực yếu hơn thường gặp.

- Thực nghiệm tách và tinh chế hesperidin (một lọai dược phẩm, còn gọi là
vitamin P2) từ nhóm flavonoid toàn phần liệu từ vỏ cam hoặc bưởi.

- Áp dụng các phương pháp chiết tách và kết tinh cô lập sản phẩm hữu cơ.
III. Phương pháp
- Chiết flavonoid toàn phần bằng alcol sau khi loại béo cho nguyên liệu.

- Tách chiết flavanon glycoside từ flavonoid toàn phần bằng alcol - acid.

- Kết tinh lại tinh chế sản phẩm.

IV. Tiến hành

1. Chiết Flavonoid toàn phần bằng phương pháp loại béo, ngâm alcol
Cách chiết flavonoid này được thực hiện với một số trường hợp nguyên liệu

- 50g bột nguyên liệu khô cho vào bình cầu lắp ống sinh hàn ngược. Thêm vào
0.15 lít eter dầu hỏa, đun cách thuỷ trong 30 phút. Sau đó dịch lọc đem cô quay thu
lấy chất béo.

35
 Lọc dịch qua giấy lọc
- Bột nguyên liệu để khô, thêm vào 0.25 lít metanol, đun hồi lưu 30 phút (dùng
bộ bình cầu có lắp ống sinh hàn ngược hoặc dùng bộ soxhlet để thực hiện).
- Dung dịch thu được đem lọc, cô quay đến thể tích 5ml dạng siro, chứa
flavonoid toàn phần.

Dịch dạng siro thu được

2. Tách hesperidin từ flavonoid toàn phần. Tinh chế sản phẩm
- Dùng 10ml acid HCl 2M đun nóng (nhỏ từ từ) cho vào siro này, kiểm tra đến
pH= 4 – 5, đun cách thủy trong 5 phút, lọc nóng. Hesperidin tách ra là bột vô định
hình.
37
 Hesperidin dạng bột vô định hình
- Lọc qua giấy lọc, rửa với nước.

- Chú ý: Vì cần thời gian để kết tinh có hiệu suất cao, nên cần thiết lưu mẫu
cho buổi thí nghiệm sau trở vào làm khâu kế tiếp, chấm sắc ký mỏng.
V. Kết quả
1. Phương pháp tách chiết flavonoid
Các flavonoid có độ hòa tan khác nhau tùy theo số nhóm hydroxy và các nhóm
thế khác có trong cấu trúc hóa học, nên rất khó có một phương pháp chung để trích
ly flavonoid ra khỏi cây. Sau đây là một số phương pháp thông dụng:

a. Tủa flavonoid bằng dung dịch acetate chì (CH3COO)2Pb

Cao chiết được hòa tan vào dung dịch 10% ethanol nước chứa trong một erlen.
Từ từ rót vào erlen này một dung dịch nước 10% acetate chì, khuấy nhẹ đều sẽ có
tủa flavonoid. Lọc thu lấy tủa. hòa tan tủa trở lại vào dung dịch alcol loãng, khuấy
nhẹ cho thành một dung dịch đồng nhất, rót thêm vào dung dịch nước bão hòa
Na2SO4 nhằm loại bỏ tủa chì PbSO4. Lọc lấy dung dịch nước trong, đuổi nước bằng
cô quay chân không thu được cao thô chứa flavonoid toàn phần. Sắc ký cột để tách
riêng các flavonoid.
38
 Sơ đồ 1. Quy trình chiết tách flavonoid khỏi cây bằng dung dịch acetate chì

b. Hấp thu flavonoid bằng than hoạt tính

Cho than hoạt tính vào dung dịch cao chiết nhằm hấp thu flavonoid. Lọc lấy
than. Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ từ phân cực yếu đến phân cực mạnh,
thí dụ ethyl eter, ethyl acetate, methanol, nước nóng, phenol 7%... để chiết các
flavonoid có tính phân cực khác nhau.

c. Tách phân đoạn các flavonoid bằng các dung dịch kiềm có độ kiềm khác
nhau

Các flavonoid do có mang nhiều nhóm –OH phenol nên có thể tan được trong
dung dịch kiềm. Dựa vào nguyên tắc này, sử dụng các dung dịch kiềm loãng hoặc
nước vôi để chiết flavonoid ra khỏi cây cỏ, sau đó dung dịch chiết được acid hóa để
trả flavonoid về dạng –OH tự do.
39
 Tiến hành: Hòa tan cao chiết vào dung môi hữu cơ thích hợp thí dụ
chloroform, ethyl acetate… Tiếp theo, thực hiện sự chiết lỏng-lỏng dung dịch này
với dung dịch nước kiềm 5-10% như: dung dịch borat natri, NaHCO3, Na2CO3…
Các dung dịch nước kiềm được gộp chung lại, và được acid hóa. Sử dụng dung môi
hữu cơ phù hợp để chiết tách các flavonoid ra khỏi dung dịch nước. Làm khan nước
bằng CaCl2, Na2SO4… Đuổi dung môi thu được cao thô chứa flavonoid toàn phần.
Sắc ký cột để tách riêng các flavonoid.

Sơ đồ 2. Quy trình tách phân đoạn flavonoid bằng các dung dịch kiềm có độ kiềm
khác nhau

40