Scribd Logo
Upload

Welcome to Scribd!

  • Biologie Celulară Și Moleculară LP1

    Uploaded by

    Albert Manta
    2 views11 pages

    Original Title

    Biologie Celulară și Moleculară LP1

    Copyright

    © © All Rights Reserved

    Available Formats

    PDF or read online from Scribd

    Did you find this document useful?

    Is this content inappropriate?

    Report this Document

    Copyright:

    © All Rights Reserved
    Download as PDF or read online from Scribd
    Flag for inappropriate content
    2 views11 pages

    Biologie Celulară Și Moleculară LP1

    Uploaded by

    Albert Manta

    Copyright:

    © All Rights Reserved
    Download as PDF or read online from Scribd
    Flag for inappropriate content
    of 11
    Metode de studiu in Biologia Celular si Moleculara Atunci cnd dintr-un tesut (uman, animal, vegetal) se recolteazi un fragment, se prelucreaza si se examineaz3 la(fiieroseopil fotonic se observa cA acel fragment tisular este alcdtuit din mii de celule, grupate unele léngé altele sau separate de matricea extracelulard (material dens, alcatuit in general de fibre proteice confinute de un “gel” polizaharidic). Fiecare celula are in general un diametru de aproximativ 5-20um: avand in vedere dimensiunea, este dificil de analizat structura interna, nu doar datorita dimensiunii dar si datorita faptului c& celulele sunt transparente si in mare parte lipsite de culoare. Astfel, solutia ‘(Dentrti/a putea analiza structura acestora) este fie de a (Golora/elulele, fie de a utiliza " microscoape adaptate care modifica diverse proprietatifizice ale luminii si mediilor prin care trece astfel incét si le putem analiza fara colorare. a). Modalitatea de examinare a unui preparat microscopic permanent in microscopia fotonicd elasici; imunohistochimia, © Microscopul fotonic clasic: - Este un aparat optic de métit care‘uiilizeazal ea Sursi de radiafie fo“onul, element din spectrul undelor electromagnetice. - oferai detalii despre morfologia luni fesut care|a fost Colorat in predlabil (avand in vedere cx celulele vii nu absorb lumina, fiind astfel invizibile in microscopia fotonicé clasica) prin diferite tehnici de colorare, dintre care cele mai utilizate sunt:/hematoxilin eozina (H&E), Van Gieson, etc. - Puterea de rezolutie (distanfa intre 2 puncte care se pot vedca separat) a acestuia este de 0,2 ym, mai mare decat cea a ochiului uman (2mm) si mai mic& decat cea a microscopului electronic (0,2 nm). - Puterea de mirire a acestora variaza intré!40=2000 ort in fulnchie de obiectivul ulilizat gi se calculeaz& inmultind puterea de mirire a ocularului (standard — 10x/ 10ori) cu puterea de mirire a obiectivului ( de la obiectiv 4x pana la obiectiv 200x ). * prin montarea unor dispozitive speciale la microscopul fotonic obisnuit, se poate Imagine obfinuti la microscopul fotonic clasic, cu un obiectiv 40x, a unei secfiuni de fesut colorate eu H&E 1, Coloana microscopului 2. Piciorul microscopului 3. Platina/masuta microscopului 4. Macroviza 5. Microviza 6.Viza de deplasare anteroposterioara a misufei/probei 7. Viza de deplasare laterala a misufei/probei 8. Ocular 9. Port-ocular 10, Revolver suport obiective IL. Obiective 12. Sistem ajustare condensor 13. Lamp 14. Sistem ajustere a luminii 15. Sistem fixare a lamei_ 16. intrerupator Modalitatea de examinare a unui preparat microscopic permanent in microscopia fotonici clasica: © se asigurii conectarea aparatului la sursa de energie © se roteste sistemul de obiective si se aduce in axul optic Obieetivil/de 10x © se agcazi preparatul biologic colorat pe miisu{a microscopului cu fafa pe care a fost etalatai secfiunea in sus (cea acoperiti de lamela), cu secfiunea (colorata) sub lumina condensorului © se ridicd masuta microscopului utilizéind macroviza pani la o distant’ de aproximativ lem de obiectivul 10x (cele mai multe microscoape au un sistem de siguranfi care nu permite ridicarea mai mult a masufei, dar acesta poate fi absent/defect, de aceea se recomanda atenfie, astfel incét preparatul si nu ajunga in contact cu obiectivul sia sparge lama) © privind prin ambele oculare, depirtandu-le/apropiindu-le (GelllregleazalGistania interpupilar, astfel incdt in cémpul vizual si fie un singur cmp microscopic * privind prin oculare, se coboara misufa microscopului (utilizénd macroviza) pana se objine 0 imagine, care, dupa ce ne asigurdim cA utilizénd macroviza nu putem objine o imagine mai clara, aceasta poate fi clarificat& utiliznd microviza © ATENTIE: ~ dac& in cdmpul microscopului nu se vede un fond alb ci unul intunecat, obiectivul nu este corect pozitionat in axul microscopului. ~ dac se observa un fond alb/luminat dar nu obtinem nicio imagine, am coborat prea repede misuta microscopului © dac& avem o imagine clari cu obiectivul de 10x, se poate examina cu un obiectiv cu 0 putere de mérire mai mare (ffir a mai atinge/utiliza MACROVIZA). Ex: aducem in ax obiectivul de 20x, 40x (chiar dacd ajunge foarte aproape de preparat comparativ cu obiectivul de 10x, atéta timp'cét avem o imagine clara cu obiectivul de 10x, acesta nu va atinge preparatul ) si privind prin ocular, vom vedea ci imaginea se modified, devine mai ‘intunecaté si neclard; utilizand MICROVIZA clarificim imaginea, ajustim condensorul conform obiectivului utilizat si putem ajusta lumina din sistemul de reglaj dac& este necesar, péind imaginea este similard ca si claritate celei vizute cu ajutorul obiectivului de 10x. * ATENTIE: daca nu se obfine o imagine clara cu un obiectiv mai mare decat cel de 10x, inseamna cel mai probabil cd nu afi avut o imagine clara cu cel de 10x, ori nu afi pozitionat lama cu faja pe care a fost etalati sectiunea in sus * Obiectivul de 100x (obiectivul cu imersie) se utilizeaz’ numai ét/6) pleat de lichid de imersie pus pe lama intre preparat ¢i obiectiv © dupa examinarea preparatului cu un alt obiectiv decat cel de 10x, se aduce in axul optic obiectivul 10x, se coboari misuta microscopului suficient cét si putem scoate preparatul de pe masufa $i inchidem microscopul utiliznd intrerupitorul. ¢ Imunohistochimia (Hmunohistochimia (IHC) reprezinta o(tehnicd de evidenfiere si localizare a/antigenelor (Ag) celulare sau tisulare, de la aminoacizi sau proteine pand la agenti infectiosi si populafii celulare specifice. Tehnica cuprinde doua faze: 1)/pregatirea probelor (fixarea specimenului gi prelucrarea fesuturilor) si reactiile imunologice implicate in reactie si 2)(interprelarea si (oaniificareaexpresici atigenuliin esuturile obinite. Desi este mai putin sensbila, permite (Gece mei Kee, tint extrem d (GEpeancere) precum , sau deosebirea leziunilor maligne de cele benigne, diagnostice care nu pot fi stabilite cu certitudine prin examinarea preparatelor colorate cu Hematoxilin-Eozina. in ultimele trei decenii, s-a constatat o cregtere exponential a publicafiilor avand ca subiect aceast’ tehnica, Primi pasi in descoperirea imunohistochimiei au fost realizati de Marrack cénd a produs reactivii impotriva microorganismelor de tifos si holer’, folosind 0 colorafic rosie conjugata cu benzidina. Profesorul Albert H. Coons de la Harvard School of Medicine considera ci detectarea antigenului cauzati de culoarea rosie pe seojiunile de fesut a avut 0 sensibilitate foarte mic in microscopia fotonicd. La inceputul anilor 1940, a demonstrat ca localizarea antigenelor, in special a microorganismelor, este posibila pe sectiunile de fesut folosind anticorpi impotriva Streptococcus pneumoniae colorafi cu fluorescein, ce au fost vizualizate ulterior prin lumind ultravioleta (microscopie fluorescent2). _Punerea in evidenfii a antigenelor in THC se face prin utilizarea unor anticorpi(Ac) ce (Geeaose situsul antigenic. Deoarece anticorpii au specificitate inalté, acestia se vor lega strict de antigenul cercetat. Reacjia antigen-anticorp este observatii folosind fie detectarea cromogen, in care o enzimi conjugati la anticorp (de exemplu, diaminobenzidini- DAB) cliveaz un substrat pentru a produce un precipitat colorat, fie detectia cu fluorescenfa, in care ‘un fluorocrom este conjugat la un anticorp ce va fi ulterior vizualizat la microscopia cu fluorescent. Utilitate medical pra Brandizaeg considera cd imunomarcajul markerilor celulari reprezinta o modalitate de a vorbi cu celulele”, deoarece permite identificarea nu numai a originii histologice a celulei, ci indica si functia sa in vivo, atunci cand este investigata cu anticorpii corespunzitori, prin urmare, constituie unul dintre pilonii cercetarii biomedicale. Reacfille imunohistochimice) pot fi utilizate in diferite situatii in daboratoarele de “cereetare sau anatomic patologicé. Cele mai importante sunt: diagnosticul neoplaziilor -nediferentiate morfologic, subtiparea neoplaziilor (de exemplu, limfoamele, carcinoame); -caracterizarea site-ului primar al neoplaziilor maligne, sia indicatiilor terapeutice ale unor boli; De asemeni, aceastd metod& poste fi utiliza: iS Sas a, utili pentru diagnosticul precis al tumorilor dar poate oferi informafii si despre GaaaiWitatea Oi ae pen 5 tumora stadializaté ca fiind intr-un stadiu incipient/localizat, care prezinti o anumiti imunoreactivitate in cazul unor molecule folosite ca biomarkeri, ne pot sugera faptul c& acea tumorai este una agresiva gi va trebui tratatéi corespunziitor. Werner si colegii au ajuns la concluzia ci G@HUBORISOGHEMA este ollmelodeldeD si contribuie la conduite chirurgicale si terapeutice, cu un nigel SSHAHEGE CORT HERES gE. Imagine obtinuté prin tehnica imunohistochimic8, unde se observa la nivelul membranei bazale, nuclear dar gi citoplasmatic imunoreactivitatea a B-defensinei-I (colorarea cu maro) in displazia cervical »). Microscopia prin fluoreseenfii; imunofluorescenfi. (Hiuoreseenfa reprezinta o indus& de variate forme de excitatie asupra materiei, (de unde si denumirea de ,,lumini rece”). Emisia luminoasé spontand are loc atunci cénd substanfa fluorescent a absorbit un fascicul Iuminos sau alti radiaie electromagnetic de o lungime de unda diferita. De obicei radiajia emis are 0 lungime de und mai mare si implicit o energie mai redusd decdt radiafia absorbiti. Daca insd intensitatea radiafiei absorbite este mai mare, este posibil ca un electron sa absoarba doi fotoni iar aceast absorbiie st determine emisia unei radiafii cu lungime de unda mai micd decat cea a radiafei absorbite, Cel mai evident exemplu de fluorescenji este proprictatea une Substanfe Care) iradiat cu un fasiuil de ultraviolete, mite radiafi eu lungime de und mai mate, implicit in spectral vizibil. is, fluorescenta este un fenomen prin care moléculélé Sensibile emit fotoni ) (emit (Gata dae cha fag ar oa SS induse prin factori fizici (absorbtia unei radiatii electromagnetice), mecanici (frecare) sau mecano-chimici. contin grupiri chimice numite Gromofori care determin’ aceasta proprietatc. Clasificarea fluorescentei Fluorescenta primard) seu Sito NiereSeenfs — substanje care\€mnit spontan in spectrul vizibil daca sunt iradiate cu ultraviolete (UV). Exemple: @lOrofila)lipeoluleolagenul) Fluorescenta Seeundaré — substante care devin fluorescent rimaildupaleelsunD (GREE TERPSTRA SUBSTAN, normal MGGHESGERLED denumitz flioroerom — exemple: acridin orange. Se pot detecta astfel substante care devin fluorescente —(@eizijaucleich(ADN — fluorescent albastra cu DAPI: 4-6 diamino-2-fenil-indol) (@6lagenh fibre elastics) (Microseopul eu fiuorescenfA este un tip de microscop conventional la care se adauga diferite componente si proprietifi care fi ameliorezeazi functiile. Spre deosebire de alte microscoape optice care speculeazi caracteristicele elementelor preparatului biologic (aborbfia luminii, gradienti de faz, birefingenfi), microscopia prin fluorescent poate forma sau secundard). Utilitate medical practic gi in cercetare Spectrul vizibil (spectrul optic) (EpHOAntaGOMenial epeetului clecuOMaaneneIee. (Gate NetectaE(OeHINNUAAM. in condifii normale, ochiul uman percepe in aer lungimile de und din domeniul 380-750nm. Substant cu fMORESenf Ea: 1, igen a. Porfirine ~ fluorescenti rosie — apar ca spoturi rogii pe fond negra b. Pigmenti carotenoizi— fluorescenfé verde — apar ca spoturi verzi pe fond negra ©. Cromolipidele ~ fluorescent galben-verde ~ apar ca spoturi galben verzi pe fond negru 4. Lipofuscina — fluorescent rogu-maro 2 ~ fluorescenfi albastra 3. Bacilul Koch — factorul etiologic al tuberculozei— fluorescenta verde strilucitoare 4. 5. Anmintbiogen — adrenalin nOraAreHAliNa>- fluorescengi verde ‘Substante cu fluorescentii cu fluorescent secundard (care devin fluorescente GUpe i acridin — orange ~ AO sau DAPI, de exemply): 1, @eigimcleics a. ADN fluorescent verde/albastri cu DAPI b. ARN —fluorescenta rosie 4: @NUleieGEBRlor— Foorescenj verde Marcarea simpla fluorescent secundara secundara se realizeaz prin @finitaiea (de exemplu, (DAPI sc cupleaza pe molecula de) (ADWueterminand o fluorescent albastri). 2 FuSTESCEIMA absoarbe radiatiile de culoare albastra si reda o fluorescent verde. (RHOUAMINA absoarbe radiatiile de culoare verde restituind o fluorescenté rosie. Rezultatele mare&tii fluorescente variazi in functie de elementele subcelulare implicate. Examinarea prin aceasti metodi permite delimitarea precisi a componentelor intracelulare marcate SEES (fluorescenfi secundaria), coeficientul de difuziune al acestor substanfe,caracteristicile mecanismelor de transport, interacfiuni posibi cu alte biomolecule. Modificarile de fluorescent induse de variatia unor parame locali permite! 7 potenfial de membrana sau polaritatea celulelor vii. se bazeazi pe folositea anticorpilor conjugati chimic cu 0 “Substan{i fluorescent (fluorofor sau flucrocrom) cum ar fi izotiocianatul de fluoresceina (FITC ~ fluorescein isothiocyanate) pentru a evidenjia un anumit antigen (ag int). La cxaminarea cu microscopul cu fluorescenti, fluoroforul permite vizualizarea antigenului int in proba biologica, sub forma de particule fluorescente. in 1950, Coons si Kaplan au utilizat anticorpi specifici marcafi cu fluorescein& pentru identificarea antigenelor tisulare. fn 1957, Holborow, Weir $i Johnson au folosit pentru prima data (tehinica imunofluorescenfei pentru a demonstra ca Gerul pacienfilor LE pozitivi confine anticorpi care produc o fluorescent nuclear omogent iturile umane. (Caen aR PRR (cr, renin COONS) _RIF directa foloseste un singur anticorp (Ac) anti-ag finti (anticorp primar). Ac primar este conjugat direct cu-un fiuorofor, iar prezenta antigenului finta in proba de testat se va evidentia prin vizualizarea fluorescenjei, ca urmare a fixirii Ac marcat cu fluorofor la antigenul jinta. Aceast& metoda poate fi utilizat in scopul identificérii virusurilor (virusurile (Gripale, virusul rabic etc.) precum $i @ microorganismelor (E. Coli, pneumococi, stafilococi etc.) orientat impotriva Ag finta; secundar = orientat impotriva ac primar si marcat cu fluorofor). in cazul in care ag tint este prezent in proba de testat, ac primar se va lega de acesta, iar ac secundar marcat cu fluorofor se va fixa la randul lui de ac primar. Aceasti variant a IF descrisi intr-o multitudine de eritematos) pentru prima oar ‘in 1948 de c&tre Hargraves, Richmond si Morton. Totusi, determinarea celulelor lupice s-a dovedit a fi Cele mai importante aspecte nucleate descrise la examenul prin fluorescen{a indirect sunt: © ASPECT NUCLEAR OMOGEN; fluorescenta omogeni difuzi a intregului nucleu in interfaza celular; intensitatea fluorescenfei este mai pronunfati in regiunea cromozomiali Ja celulele in mitoza; citoplasma este ngaiva. Rascal el aD comun si lupusul indus medicamentos, dar mai pitat). Antigenele implicate sunt: ADN duibli catenar (dsDNA), histone, Ku. * ASPECTUL NUCLEAR OMOGEN INELAR: similar cu cel nuclear omogen, dar cu i marginale nucleare in interfaza celular; citoplasma este negativa. Este un aspect intalnit comun in LES, mai ales in forma activa. Antigenul este reprezentat de dsDNA. ¢ ASPECT MATRICE NUCLEARA: fluorescenfa patala ce di nastere unei refele nuclearé “(spongioase in interfaza celulara. Acest aspect se poate intalni in LES, boala mixta de fesut) conjuctiv sau in Antigencle implicate sunt proteine ribonucleare heterogene . © ASPE distributie uniforma in interfaza celular. Apare in LES, sindromal Sj6gren, sclerodermie, miozita si boala mixta de fesut conjunctiv. Antigenele sunt reprezentate de SS-A, SS-B, Ku, Ki si Mi-2. © ASPECT PATAT GROSIER: fluorescenta nuclear patat cu aspect grosier in interfaza celular. Apare in LES, boala mixti de jesut conjunctiv, sindroame overlap, sindrom Raynaud $i psoriazis. Sunt implicate urmitoarele antigene: Ul-saRNP sau Sm (proteine ribonucleare mici). ASPECT DE TIP CENTROMER: fluorescenta nucleard patatd cu aspect fin in interfaza celular; fn cursul mitozei fluorescenfa este prezenti la nivelul cromozomilor. Apare in principal in sindromul CREST. ASPECT NUCLEOLAR OMOGEN: ‘fluorescenta omogen a nucleolilor. Apare in ‘scletodermie, mioziti, sindrom overlap miozita-sclerodermie. Antigenul este constituit din complexul PM-Scl eu rol in biosinteza ribozomilor. ASPECT NUCLEOLAR PATAT: fluorescenja patati a nuclelolilor; in cursul mitozei fluorescenja este prezenti la nivelul cromozomilor, cu dowd aspecte posibile: omogen (antigenul este reprezentat de Scl-70 — ADN topoizomeraza 1) si punctat (antigenele implicate sunt ARN polimeraza I si NOR-90); este asociat cu sclerodermia. ASPECT NUCLEOLAR *IN_GRAMEZI” (CLUMPY™): fluorescenja nucleolari in blocuri. Este intilnit in ‘selerodermie; antigenul implicat este fibrilarina — 0 proteind alcalina asociata cu ribonucleoproteina nucleolari U3-snRNPs. ASPECT DE PUNCTE NUCLEARE: fluorescenta punctiform& (aproximativ 10 puncte/nucleu) care apare in nucleoplasma separat de nucleoli. Se asociaza clinic cu: ‘ciroza biliar& primitiva, sindromul Sjégren, ocazional LES. Antigenele implicate includ complexe de multiproteine (Sp-100), cu rol insuficient cunoscut. ASPECT CENTRIOL/CENTROZOM: fh sub forma de spoturi fine la cei 2 poli ce corespund fusului mitotic. Apare 1 SEED oe rar in sclerodermic, sindromul Sjégren sau sindromul CREST. Antigenul este reprezentat de centrozom = sistem de microtubuli ce are rol in formarea fusului mitotic. ASPECT MEMBRANA NUCLEARA: fluorescenta find inelard a membranei nucleare cu sciderea intensitSfii fluorescenfei in nucleoplasma. Apare in hepatita cronic asociata sau nu cu vasculit ‘Antigenele implicate sunt polipeptide care furnizeaza situsuri de ancorare pentru cromozomi in interfaza celulara: laminine A, BI, B,C. ASPECT PCNA (PROLIFERATING CELL NI EAR ANTIGEN): fluorescenja patata variabila (prezenti doar in unele celule) in interfaza celular. Apare la 3-6% dintre pacienfii cu LES. Ca antigen este implicat ciclina, cu rol in replicarea gi repararea ADN- ului. Aspect pele rosier Aspect de fp ceniromer Aspect nucieotar Aspect nucleolar ‘Aspeot de puncte: ‘Aspeo! membrane ‘omogen patat (Sck70) nucleate nucleera ‘Aspect patal fin Aspect polar Aspect retoular ‘Aspect fbnlar dens groser Jn concluzie, ‘pattern-ul fluorescenfei nucleare reflect specificitatea pentru diferite - afectiuni. Astfel, imunofluorescenta indirect’ permite diagnosticul primar in cazuri clinice incerte, tionitorizarea tratamentului (prin ttrul ANA) si poate furiza informasii decisive pentru investigaiile ulterioare. prezint& o valoare mare diagnostica, fiind mai iefting comparativ cu are sunt ins mai specifice. Imunofluorescenta este utilizata pe\scari larg in practica medical curenté pentru(idenifificareal depozitelor de molecule tn _fesuturile patologice, pentru cum any = Ac anticitoplasmatici antineutrofilici si in (de exemplu detectarea Ac antitreponemici prin FTA), ©). Alte modalitifi de studiu: microscopia in contrast de faz $i microscopia in lumind polarizati — utilitate medical practic& gi in cercetare, Microscopia in contrast de fazi Celulele sunt alc&tuite din aproximativ 70% api, 15% proteine, 6% ARN si cantitafi mici de lipide, ADN si molecule de mici dimensiuni. Din moment ce niciuna din aceste clase de molecule nu este colorata si nu impiedica transmiterea Iuminii gi astfel nu se pot da vizualiza detalii ale acestor celule fira artificii tehnice. “Microscopul in contrast de faz {in care gradul de luminozitate sau intunecime a regiunii unui reine CO a deplascazi cu o vitezd mai mica intr-un mediu cu un indice de refractie mai mare. in cazul microscopului in contrast de faz, un diafragm anular genereazi un con de lumina in lentilele condensoare si astfel ilumineaza specimenul. Fascicolul de fotoni trece prin specimen in lentilele obiectivului iar fascicolul neobstruat de specimen, trece prin placa de faz ce nu transmite decat 0 mica parte a luminii. Fascicolul care trece prin specimen va fi refractat impreund cu proportia de fascicol care nu trece prin specimen. Ulterior, atét -fascicolul refractat edt si cel nerefractat sun tra a forma vnngues sn GSES HESS ee uncheck eS Utilitate medical practici si in cercetare: Acest tip de microscopic este foarte util pentru a studia: ~ celule izolate, sau fragmente foarte fine de fesut; permite examinarca celulelor vii, nefixate, comportamentul lor in contact cu diversi factori (hormoni, factori de crestere, diverse droguri ete.); ‘in celulele vii, nefixate, a fusului de diviziune si a cromozomilor; - scoate in evident detalii de structurd care nu se pot observa cu miscroscopul fotonie obisnuit: ete; ~ Cider ea CelulelOF FiMOFAIE}dinamica si comportamentul lor in culturi de celule. *prin tehnici de digitalizare, in care aceeasi celuli este fotografiaté la intervale regulate de timp, se poate realiza un {filim? in care se observa modul in care se comport celula, a) celuld epitelialt in microscopic 'b) macrofag in microscopie tn contrast de fazi ‘n contrast de fiz Lumina naturala sau artificiala este 0 unda electromagneticd care vibreazi in toate direcfiile, intr-un plan perpendicular pe traiectoria de propagare. Daci aceast& lumina este filtrata cu un filtru tt ea va vibra ns ° na assis 4 deine lumina rola a analiza probe ce posed proprietatea de (GolaeiZARTE? Gal Polatizonsi unui analizor|pentra birefringent’. Birefringenta : polarizare diferita care se propagi cu o vitezi diferita si poate fi de mai multe tipuri: : eristale anizotrope, minerale, produsi chimici normali sau sintetici microtubulii ADN, proteine fibrilare | (caracteristice fibrelor de par) aracteristic& cristalelor proteice sau lipidice ‘

    You might also like