Pocket Guide to Mycological Diagnosis

1st Edition Rossana De Aguiar Cordeiro

(Editor)
Visit to download the full and correct content document:
https://textbookfull.com/product/pocket-guide-to-mycological-diagnosis-1st-edition-ros
sana-de-aguiar-cordeiro-editor/
More products digital (pdf, epub, mobi) instant
download maybe you interests ...

Congenital Hyperinsulinism A Practical Guide to

Diagnosis and Management Diva D. De León-Crutchlow

https://textbookfull.com/product/congenital-hyperinsulinism-a-
practical-guide-to-diagnosis-and-management-diva-d-de-leon-
crutchlow/

Pocket guide to AIDS 1st Edition Bagasra

https://textbookfull.com/product/pocket-guide-to-aids-1st-
edition-bagasra/

The Routledge Pocket Guide to Medical Latin 1st Edition

Stone

https://textbookfull.com/product/the-routledge-pocket-guide-to-
medical-latin-1st-edition-stone/

Pocket guide to stress testing Second Edition Chung

https://textbookfull.com/product/pocket-guide-to-stress-testing-
second-edition-chung/
Merrill’s Pocket Guide to Radiography Bruce Long

https://textbookfull.com/product/merrills-pocket-guide-to-
radiography-bruce-long/

Pocket Guide to Psychiatric Practice Donald W. Black

https://textbookfull.com/product/pocket-guide-to-psychiatric-
practice-donald-w-black/

Pocket Guide to Diagnostic Hematopathology S. David

Hudnall

https://textbookfull.com/product/pocket-guide-to-diagnostic-
hematopathology-s-david-hudnall/

Pocket Guide to Vitreoretinal Surgery Jason N. Crosson

https://textbookfull.com/product/pocket-guide-to-vitreoretinal-
surgery-jason-n-crosson/

Educational Leadership Pearson New International

Edition A Bridge to Improved Practice Paula Cordeiro

https://textbookfull.com/product/educational-leadership-pearson-
new-international-edition-a-bridge-to-improved-practice-paula-
cordeiro/
 Pocket Guide
to Mycological
Diagnosis
 Pocket Guides to Biomedical Sciences
https://www.crcpress.com/Pocket-Guides-to-Biomedical-Sciences/book-series/
CRCPOCGUITOB

The Pocket Guides to Biomedical Sciences series is designed to provide concise,

state-of-the-art, and authoritative coverage on topics that are of interest to
undergraduate and graduate students of biomedical majors, health professionals
with limited time to conduct their own searches, and the general public who are
seeking reliable, trustworthy information in biomedical fields.

Series Editor

Lijuan Yuan, Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia Tech,

Blacksburg, Virginia, USA

Editorial Board

Sascha Al-Dahouk, Federal Institute for Risk Assessment, Germany

Frank Austin, Mississippi State University

K. Balamurugan, Alagappa University, India

Rossana de Aguiar Cordeiro, Universidade Federal do Ceará, Brazil

Lisa Gorski, U. S. Department of Agriculture

Baochuan Lin, U. S. Naval Research Laboratory

Russell Paterson, University of Minho, Portugal

Yiqun Zhou, Roche Pharmaceuticals

Science Publisher

Charles R. Crumly, CRC Press/Taylor & Francis Group

 Pocket Guide
to Mycological
Diagnosis

Edited by
Rossana de Aguiar Cordeiro
CRC Press
Taylor & Francis Group
6000 Broken Sound Parkway NW, Suite 300
Boca Raton, FL 33487-2742

© 2020 by Taylor & Francis Group, LLC

CRC Press is an imprint of Taylor & Francis Group, an Informa business

No claim to original U.S. Government works

Printed on acid-free paper

International Standard Book Number-13: 978-1-138-05594-0 (Hardback)

978-1-138-05593-3 (Paperback)

This book contains information obtained from authentic and highly regarded sources.
Reasonable efforts have been made to publish reliable data and information, but the
author and publisher cannot assume responsibility for the validity of all materials or
the consequences of their use. The authors and publishers have attempted to trace
the copyright holders of all material reproduced in this publication and apologize to
copyright holders if permission to publish in this form has not been obtained. If any
copyright material has not been acknowledged, please write and let us know so we
may rectify in any future reprint.

Except as permitted under U.S. Copyright Law, no part of this book may be reprinted,
reproduced, transmitted, or utilized in any form by any electronic, mechanical, or
other means, now known or hereafter invented, including photocopying, microfilm-
ing, and recording, or in any information storage or retrieval system, without written
permission from the publishers.

For permission to photocopy or use material electronically from this work, please
access www.copyright.com (http://www.copyright.com/) or contact the Copyright
Clearance Center, Inc. (CCC), 222 Rosewood Drive, Danvers, MA 01923, 978-750-
8400. CCC is a not-for-profit organization that provides licenses and registration for a
variety of users. For organizations that have been granted a photocopy license by the
CCC, a separate system of payment has been arranged.

Trademark Notice: Product or corporate names may be trademarks or registered trade-

marks, and are used only for identification and explanation without intent to infringe.
Visit the Taylor & Francis Web site at
http://www.taylorandfrancis.com
and the CRC Press Web site at
http://www.crcpress.com
Contents

Preface vii
Editor ix
Contributors xi
List of Abbreviations xiii

1 Mycological Diagnosis: General Principles 1

Rossana de Aguiar Cordeiro

2 Antifungal Drugs and Susceptibility Testing of Fungi 19

Débora de Souza Colares Maia Castelo-Branco, Glaucia Morgana de
Melo Guedes, and Marcos Fábio Gadelha Rocha

3 Candida spp. 29
Silviane Praciano Bandeira, Glaucia Morgana de Melo Guedes, and
Débora de Souza Colares Maia Castelo-Branco

4 Cryptococcus 39
Luciana Trilles, Márcia dos Santos Lazéra, and Bodo Wanke

5 Trichosporon 47
João Nobrega de Almeida Júnior

6 Malassezia 53
Reginaldo Gonçalves de Lima-Neto, Danielle Patrícia Cerqueira
Macêdo, Ana Maria Rabelo de Carvalho, Carolina Maria da Silva, and
Rejane Pereira Neves

7 Rhodotorula spp. 63
Rejane Pereira Neves, Ana Maria Rabelo de Carvalho, Carolina
Maria da Silva, Danielle Patrícia Cerqueira Macêdo, and Reginaldo
Gonçalves de Lima-Neto

8 Dermatophytes 69
Germana Costa Paixão, Marcos Fábio Gadelha Rocha, Débora de
Souza Colares Maia Castelo-Branco, Raimunda Sâmia Nogueira
Brilhante, and José Júlio Costa Sidrim

9 Aspergillus spp. 83
Reginaldo Gonçalves de Lima-Neto, Patrice Le Pape, and Rejane
Pereira Neves

v
vi    Contents

10 Mucorales 91
Rejane Pereira Neves, André Luiz Cabral Monteiro de Azevedo
Santiago, and Reginaldo Gonçalves de Lima-Neto

11 Sporothrix spp. 99
Anderson Messias Rodrigues, Rosane Orofino-Costa, and Zoilo Pires
de Camargo

12 Histoplasma capsulatum 115

Rosely Maria Zancopé-Oliveira, Claudia Vera Pizzini, Marcos de
Abreu Almeida, and Rodrigo de Almeida Paes

13 Paracoccidioides Complex 125

Zoilo Pires de Camargo and Anderson Messias Rodrigues

14 Coccidioides 135
Rossana de Aguiar Cordeiro

15 Pneumocystis jirovecii 145

Rosely Maria Zancopé-Oliveira, Fernando Almeida-Silva, Rodrigo de
Almeida Paes, and Mauro de Medeiros Muniz

Index 153
Preface

In the past three decades, the epidemiology of fungal infections has changed dramatically.
Along with the AIDS pandemic, extensive medical progress has led to an increase in the
global population of severely immunocompromised patients, who are vulnerable to fungal
pathogens. Since proper diagnosis is considered a pivotal factor for patient management,
routine microbiology laboratories have been overloaded with requests for mycological tests.
This situation has compelled many microbiologists to seek ongoing education in medical
mycology—a field of knowledge neglected in many health courses.

In addition, the science of medical mycology has witnessed tremendous changes since the
1980s. The description of new species and species complexes, the discovery of fungal biofilms
and their importance in pathogenesis, the continuous reports of refractory infections and
antifungal resistance, and the increasing list of opportunistic fungal species have highlighted
the importance of mycological diagnosis.

Cellular and molecular techniques, immunological methods, and more accurate microscopy
equipment are now available to mycology laboratories. Furthermore, information regarding
medical mycology, including identification of specific fungal pathogens, is widely available on
the World Wide Web. Mycologists have to face the challenge of systematizing all this body of
knowledge and applying it in routine diagnosis.

Therefore, this book aims to provide concise and useful information for microbiologists
and professionals interested in the diagnosis of the most relevant fungal species of medical
importance. Potential contributors were chosen based on their personal experience and previous
authorship of widely cited publications on the subject.

We hope this book inspires young mycologists worldwide and contributes to enhancing the
detection of fungal pathogens in routine laboratories.

Professor Rossana de Aguiar Cordeiro

Federal University of Ceará, Brazil

vii
Editor

Rossana de Aguiar Cordeiro is a biologist and undertook her postgraduate training in

Microbiology at the Federal University of Minas Gerais and Federal University of Ceará, both in
Brazil. During the past two decades, she has dedicated her efforts to Medical Mycology, focusing
on emerging fungal infections in Brazil, mainly coccidioidomycosis. She is the first author of more
than 40 original research and review articles and, as an author, has contributed to the books
Molecular Detection of Human Fungal Pathogens and Manual of Security Sensitive Microbes and
Toxins, both published by CRC Press.

ix
Contributors

Fernando Almeida-Silva Zoilo Pires de Camargo

National Institute of Infectology
Fundação Oswaldo Cruz
Brazil
Silviane Praciano Bandeira
Specialized Medical Mycology Center
Department of Pathology and Legal Medicine
Federal University of Ceará
Brazil
Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante
Specialized Medical Mycology Center
Department of Pathology and Legal Medicine
Federal University of Ceará
Brazil
Danielle Patrícia Cerqueira Macêdo
Department of Pharmaceutical Sciences
Center for Health Sciences, UFPE
Brazil
Carolina Maria da Silva
Department of Mycology
Center for Biosciences
Federal University of Pernambuco (UFPE)
Cidade Universitária
Recife, Brazil
Laboratory of Emerging Fungal Pathogens,
Cell Biology Division
Department of Microbiology, Immunology
and Parasitology
Federal University of São Paulo
Brazil
Ana Maria Rabelo de Carvalho
Department of Mycology
Center for Biosciences
Federal University of Pernambuco (UFPE)
Cidade Universitária
Recife, Brazil
Mauro de Medeiros Muniz
National Institute of Infectology
Fundação Oswaldo Cruz
Brazil
Glaucia Morgana de Melo Guedes
Specialized Medical Mycology Center
Department of Pathology and Legal
Medicine
Federal University of Ceará
Brazil

Marcos de Abreu Almeida Débora de Souza Colares Maia

National Institute of Infectology Castelo-Branco
Fundação Oswaldo Cruz Department of Pathology and Legal
Brazil Medicine
Federal University of Ceará
Rossana de Aguiar Cordeiro Brazil
Specialized Medical Mycology Center
Department of Pathology and Legal Medicine Márcia dos Santos Lazéra
Federal University of Ceará National Institute of Infectology
Brazil Fundação Oswaldo Cruz
Brazil
João Nobrega de Almeida Júnior
Central Laboratory Division
Reginaldo Gonçalves de Lima-Neto
Hospital das Clínicas
Department of Tropical Medicine
Faculty of Medicine
Center for Health Sciences, UFPE
University of São Paulo
and
Brazil
Department of Mycology
Rodrigo de Almeida Paes Biosciences Center
National Institute of Infectology Federal University of Pernambuco (UFPE)
Fundação Oswaldo Cruz Brazil
Brazil
Rejane Pereira Neves
André Luiz Cabral Monteiro de Azevedo Department of Mycology
Santiago Center for Biosciences
Department of Tropical Medicine Federal University of Pernambuco (UFPE)
Center for Health Sciences, UFPE Cidade Universitária
Brazil Recife, Brazil

xi
xii    Contributors

Rosane Orofino-Costa Anderson Messias Rodrigues

Dermatology Department Laboratory of Emerging Fungal Pathogens,
School of Medical Sciences Cell Biology Division
Rio de Janeiro State University Department of Microbiology, Immunology
Brazil and Parasitology
Federal University of São Paulo
Germana Costa Paixão Brazil
Center of Health Sciences
State University of Ceará José Júlio Costa Sidrim
Brazil Specialized Medical Mycology Center
Department of Pathology and Legal
Patrice Le Pape Medicine
IICiMed – EA 1155 Cibles et médicaments Federal University of Ceará
des infections de l’immunité et du cancer Brazil
University of Nantes
France Luciana Trilles
National Institute of Infectology
Claudia Vera Pizzini Fundação Oswaldo Cruz
National Institute of Infectology Brazil
Fundação Oswaldo Cruz
Brazil Bodo Wanke
National Institute of Infectology
Marcos Fábio Gadelha Rocha Fundação Oswaldo Cruz
Specialized Medical Mycology Center Brazil
Department of Pathology and Legal Medicine
Federal University of Ceará Rosely Maria Zancopé-Oliveira
and National Institute of Infectology
School of Veterinary Fundação Oswaldo Cruz
State University of Ceará Brazil
Brazil
List of Abbreviations

AD atopic dermatitis
AdoMet/SAM S-adenosylmethionine
AFLP amplified fragment length polymorphism
ARF ADP-ribosylation factor
ART antiretroviral therapy
ASR analyte-specific reagent
AST Antimicrobial susceptibility testing
BAL Bronchoalveolar lavage
BDG 1–3-β-D-glucan
BHI brain heart infusion agar
BSL biosafety level
CDC Centers for Disease Control and Prevention
CF complement fixation
CFW calcofluor white fluorescent stain
CGB l-canavanine glycine bromothymol blue
CLSI Clinical Laboratory Standards Institute
CNS central nervous system
CrAg cryptococcal capsular polysaccharide antigen
CSF cerebrospinal fluid
CVC central venous catheters
DGGE denaturing gradient gel electrophoresis
ECV or ECOFF epidemiological cut-off value
EDTA ethylenediamine tetraacetic acid
EIA enzyme immunoassay
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
EUCAST European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing
FFPE formalin-fixed paraffin-embedded tissue
FISH fluorescence in situ hybridization
FITC fluorescein isothiocyanate
FL folliculitis
FTD fast track diagnostics
GAPDH glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
GMS Gomori methenamine-silver nitrate stain
gp43 glycoprotein of 43,000 daltons (Paracoccidioides antigen)
GXM capsular antigen glucuronoxylomannan from Cryptococcus
HE hematoxylin and eosin
HIV human immunodeficiency virus
HPA H. capsulatum polysaccharide antigen
ID immunodiffusion
IF immunofluorescence
IGS intergenic spacer-1
IRIS immune reconstitution inflammatory syndrome
ISHAM International Society of Human and Animal Mycology
ITS internal transcribed spacer
KL-6 Krebs von den Lungen-6 antigen
KOH potassium hydroxide
LA latex agglutination test
LAMP loop-mediated isothermal amplification
LDH lactate dehydrogenase
LFA lateral flow immunoassay
LSU large subunit
MALDI-TOF MS matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry
MEC minimum effective concentration
MGG May-Grünwald Giemsa
MIC minimum inhibitory concentration
ML maximum likelihood
MLST multilocus sequence typing

xiii
xiv    List of Abbreviations

Msg major surface glycoprotein (Pneumocystis antigen)

NAALADase N-acetylated α-linked acidic dipeptidase (H. capsulatum antigen)
NJ Neighbor-joining
NSA niger seed agar
NWT non-wild type
PAS periodic acid-Schiff
PCM paracoccidioidomycosis
PCP pneumonia by Pneumocystis carinii
PCR polymerase chain reaction
PCR-RFLP PCR-based restriction fragment length polymorphism
PFGE pulsed field gel electrophoresis
PJP Pneumocystis pneumonia
PMF peptide mass fingerprint
PS psoriasis
PV pityriasis versicolor
RAPD random amplification of polymorphic DNA
RCA rolling circle amplification
rDNA ribosomal DNA genes
RIA radioimmunoassay
RSA recombinant synthetic antigen
SADH secondary alcohol dehydrogenase
SD seborrheic dermatitis
SDA Sabouraud dextrose agar
SHP hypersensitivity pneumonitis
SPS sodium polyanethol sulfonate
SSKI saturated solution of potassium iodide
TP tube precipitin Coccidioides antigen
WB Western blot
WT wild type
1
Mycological Diagnosis
General Principles
Rossana de Aguiar Cordeiro

Contents

1.1 Introduction 1
1.2 Collection of clinical specimens 1
1.3 Mycological processing (conventional tests) 5
1.3.1 Direct microscopic examination 5
1.3.2 Culture 5
1.4 Identification 5
1.4.1 Standard culture-based methods: Phenotypical analysis 5
1.4.2 Culture-independent methods 11
1.4.2.1 Molecular diagnosis 11
1.4.2.2 Immunological diagnosis 15
1.4.2.3 Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight
mass spectrometry 15
1.5 Conclusions 18
Bibliography 18

1.1 Introduction

Mycological laboratories have an important role in the complex scenario of understanding the
etiology of fungal infections. They provide information not only related to diagnosis, but also to
the treatment, prevention, and control of mycosis. Through such technical data, it is also possible
to gain insight into the epidemiology of fungal infections, which brings great responsibilities to
the lab staff. Therefore, standardized and internationally validated protocols and routines must
be followed.

In order to achieve these goals, mycological labs need to be equipped with biosafety items:
individual and community barriers must be available (Table 1.1), and personnel must be
engaged in continuous biosafety training. Labs pertaining only to dermatological routines
need to be designed to reach level 2 biological safety criteria. On the other hand, labs with
complex attendance routines, that is, oncological patients, post-transplant patients, and
patients suspected of deep-seated infections, need risk 3 biological safety criteria. Additionally,
mycologists need continued education to become familiar with new fungal species and modern
diagnostic procedures. A general scheme of mycological diagnosis stages is shown in Figure 1.1.

1.2 Collection of clinical specimens

After clinical examination of the patient by physicians, the first step of mycological diagnosis is
to collect clinical specimens. Mycologists should be aware that: (a) specimens must always be
collected from the representative site of infection, (b) collection should preferably be performed
prior to the start of antifungal therapy, (c) the amount of material collected should be suitable
for performing all the required tests, (d) specimens should be transported to the lab and
processed as soon as possible, and (e) all clinical material can be infected with other hazardous

1
2    Pocket Guide to Mycological Diagnosis

Table 1.1 Minimum Biosafety Items Required for Clinical Mycological Laboratories
Primary Barriers Secondary Barriers
Individual
Protection Outside the
Equipment Structural Issues Inside the Lab Lab
Long-sleeved Restricted containment Sinks for hand Self-closing and
laboratory coats areas washing lockable doors
Gowns Class II biological safety Bench tops Eyewash station
Gloves cabinet impervious to Safety shower
Incinerators water and
Masks and respiratory chemicals Fire extinguisher/
apparatus Bioaerosol-contention blanket
equipment Autoclave
Eye protection/safety
goggles Containers for disposal of Sealed windows
sharp materials or windows fitted
Facial protection (face with screens
shields/splatter guard) Mechanical pipetting device
Shoe covers Washable floor
Sturdy furniture

Figure 1.1 Stages of mycological diagnosis in clinical settings.

microorganisms besides fungi. In addition, lab members are responsible for precise identification
(patient’s full name, ID numbers, hospital identification, etc.) of all specimens collected.

Previous to specimen collection, it is necessary to clean the lesions with 70% isopropanol/
ethanol and then dry the areas with sterile gauze by gentle compressing. Inflammatory/mucosal
lesions should be cleaned with sterile water/saline. This procedure considerably reduces the
likelihood of cultivation of non-pathogenic species and also removes ointments and dirt from
the patient’s skin.

Different devices should be available for specimen collection: swab transport systems, screw-
cap tubes, needles and syringes, scalpels, tweezers and scissors, surgical blades, microscope
slides, etc. (Table 1.2). Clinical specimens should always be collected with sterile devices and
transported to the laboratory inside resistant containers as soon as possible. Laboratories should
Table 1.2 Pre-Analytical Phase: General Procedures to Proper Specimen Collection for Fungal Diagnosis
Transport
Time/
Site Specimen Device Temperature Stability/Temperature
Superficial/ Skin Scalpel Up to 24 hours/ Up to 4 weeks/RT: skin and
mucocutaneous Surgical blade RT (samples nail scrapings, hair
mycoses Microscopic slide must be Up to 24 hours/RT: swabs
Adhesive tape protected from
Swaba (inflammatory/intertriginous lesions) moisture)
Nails Curette
Surgical blade
Hair Tweezers
Scissors
Swaba (inflammatory lesions)
Mucosa (oral, genital) Swaba Up to 6 hours/RT Up to 24 hours/RT
Scalpel
Wounds/abscess Needle and syringe (exudate) Up to 2 hours/RT Up to 24 hours/RT
Swaba
Eye Swaba (pre-moistened with sterile saline) for conjunctiva Immediately/RTd Up to 12 hours/RT
21-guage needle or Kimura spatula for corneac
Microscopic slides and culture media tubes (direct processing
by clinician)
Ear Swaba (external otitis; internal otitis with ruptured drum) Up to 2 hours/RT Up to 24 hours/RT
Syringe (internal otitis with intact drum)c
Subcutaneous Subcutaneous tissues Punch biopsyc and Up to 2 hours/RT Up to 24 hours/RT
mycoses Abscess/ulcer Sterile screw-cap tube/cup with 2 mL sterile saline
Skin/mucocutaneous lesions Needle and syringe (nodular lesions)

(Continued)
Mycological Diagnosis     3
Table 1.2 (Continued) Pre-Analytical Phase: General Procedures to Proper Specimen Collection for Fungal Diagnosis
Transport
Time/
Site Specimen Device Temperature Stability/Temperature
Systemic Abscess/ulcer Punch biopsyc Up to 2 hours/RT Up to 24 hours/RT
mycoses Sterile screw-cap tube/cup
Needle and syringe (exudate)
Blood Blood culture bottles (aerobe): 5–10 mL for adults; 0.5–5 mL Up to 2 hours/RT Up to 6 hours/RTb
for childrenb Up to 24 hours/RT
Blood collection tubes with EDTA or SPS (non-automated procedure)
Microscopic slides
Catheter Surgical blade Immediately/RT Up to 24 hours/4°C
Scissors
Sterile screw-cap tube/cup
4    Pocket Guide to Mycological Diagnosis

Cerebrospinal fluid Sterile screw-cap tube/cup (specimen volume: minimum 2 mL)c Immediately/RT Up to 24 hours/35°C
Bone marrow Sterile screw-cap tube (specimen volume: 1–3 mL)c Immediately/RT Up to 24 hours/RT
Blood collection tubes with EDTA or SPS
Microscopic slides
Pathological fluids Needle and syringe and sterile screw-cap tube (large volumes)c Immediately/RT Up to 24 hours/35°C
(abdominal, pleural, synovial, Note: anticoagulants are necessary for hemorrhagic
etc.—aspirated or drained) specimens.
Sputum Sterile, leak-proof, screw-cap container Immediately/RT Up to 24 hours/4°C
(expectorated/induced)
Bronchoalveolar lavage; Sterile, leak-proof, screw-cap containerc Immediately/RT Up to 24 hours/4°C
bronchial wash/brush;
tracheal aspiration
Urine (midstream) Sterile, leak-proof, screw-cap container Immediately/RT Up to 2 hours/4°C
(specimen volume: minimum 1 mL) (without preservative)
Up to 24 hours/4°C
(with preservative)
Abbreviations: EDTA, ethylenediamine tetraacetic acid; RT, room temperature (25°C–28°C); SPS, sodium polyanethol sulfonate.
a Swabs must be coupled with a suitable swab transport system.
b Automated procedure: check manufacturer guidelines.
c Procedure exclusively performed by clinicians or medical staff.
d Smears should be prepared by applying scrapings to a glass slide in a gentle circular motion; scrapings should also be inoculated directly on culture media. Both proce-

dures should be performed by the physician immediately after specimen collection.

 Mycological Diagnosis     5

define exclusion criteria for clinical samples, such as tissues fixed in formalin, dry swabs, leaking/
broken containers, etc.

1.3 Mycological processing (conventional tests)

1.3.1 Direct microscopic examination

After arrival at the lab, clinical samples are prepared for microscopic examination. Depending
on the material, it may be necessary to perform centrifugation, liquefaction, homogenization,
chopping, and/or staining. Many experts consider microscopic examination of clinical samples
one of the most important steps of the analytical phase of diagnosis, as it allows quick
presumptive results, which may directly impact patient care. However, the success of this step
depends on many issues, such as the biological characteristics of the pathogen (i.e., intracellular
or extracellular lifestyle), the number of microorganisms in the analyzed sample, and the
expertise of the mycologist.

The choice of staining depends on each clinical specimen, but in general, visualization of fungal
structures is possible without staining, mainly in clear samples such as skin scrapings, urine,
respiratory secretions, and cerebrospinal fluid. Unstained wet mounts can be prepared directly
with saline or KOH. Smears must be prepared with a thin layer of clinical specimen. Air-dried
smears need to be heat- or alcohol-fixed for proper staining. Table 1.3 describes the general
procedures and the presumptive diagnosis regarding clinical samples analyzed by microscopy.

1.3.2 Culture
Cultivation of a clinical specimen allows definitive diagnosis of the infectious agent (except
for Pneumocystis carinii and Laccazia loboi). Cultivation also allows antifungal susceptibility
testing. Many fungal species are able to grow on routine bacteriological media (i.e., blood agar,
chocolate agar, MacConkey agar), and the relevance of such findings must be analyzed from
a clinical perspective. Nevertheless, for selective isolation of fungi from clinical specimens, it is
necessary to employ culture media that support fungal growth and suppress bacteria and non-
pathogenic fungal species. Sabouraud agar with or without chloramphenicol and cycloheximide
compose the tripod for fungal isolation in most of the routine mycological labs. It is important
to note that there are differences in cycloheximide tolerance against fungi species. In general,
pathogenic fungi can be classified as “very sensitive,” “moderately sensitive,” and “resistant”
to this antibiotic (Table 1.4). Suggestions of culture media for laboratory processing of different
clinical samples are shown in Table 1.5. Although there are many advantages of using Petri dishes
rather than tubes (larger surface area for isolation of cultures, easier examination and subculture,
easier separation of mixed cultures, etc.), one should bear in mind that Petri dishes are not
recommended because of biosafety issues, especially if Coccidioides or Histoplasma is suspected
in clinical samples. Although recognized as the gold-standard procedure for fungal identification,
use of cultures has limitations: cultures can take many days to show positive growth, and overall,
samples from deep infections, including blood cultures, can show moderate recovery rates.
Table 1.6 describes formulas of common mycological media and general indications of use.

1.4 Identification

1.4.1 Standard culture-based methods: Phenotypical analysis

Although parasitic structures seen by direct examination and primary culture findings may be
suggestive of some species, most of the time it is necessary to perform further biochemical and
physiological tests to achieve proper fungal identification. Traditional identification tests rely on
morphological analysis of conidia/spores and filamentous structures, combined with carbohydrate
and nitrogen assimilation and carbohydrate fermentation tests. Pigment production, enzymatic
activity, morphological dimorphism, thermotolerance, and lipodependence are also employed
for phenotypical identification of pathogenic fungi. Tests can be performed manually—
by cultivation of fungal isolates individually in proper culture media—or by automated or
Table 1.3 Analytical Phase: General Procedures for Direct Microscopic Analysis of Clinical Specimens and Most Common Microscopic Findings
Procedure and Basic
Site Sample Principle
Superficial/ Keratinous (skin, hair, KOH (10%–30%)
mucocutaneous nails) and tissue samples KOH slowly digests and clears the
mycoses Material should be reduced to tissues, allowing fungi
small fragments. visualization.
Microscopic observation KOH (20%)–DMSO (40%)
should be performed after 30 DMSO causes rapid keratolysis,
minutes of chemical digestion allowing immediate analysis.
(minimum). KOH (10%) with Calcofluor
white
Calcofluor white is a non-specific
fluorochrome dye that binds to
cellulose and chitin present in the
fungal cell wall and septa.
Requires a fluorescent microscope
equipped with filters bellow
400 nm (ultraviolet) excitation
filter. All fungi, including
Pneumocystis cysts, display a
brilliant apple-green/blue-green
fluorescence when viewed under
ultraviolet or blue light.
Most common Findings/Preferred
Method Presumptive Diagnosis
Hyaline, septate hyphae that break up into Dermatophytes: Microsporum,
rectangular arthroconidia (skin)/KOH. Trichosporum, Epidermophyton
Round blastoconidia; hyaline, septate, thin Candida spp.
hyphae, and/or pseudohyphae (skin, nail, and Note: only C. albicans and
mucosae)/KOH. C. dubliniensis produce true
hyphae.
Hyaline, septate hyphae, blastoconidia, and Trichosporon spp.
rounded arthroconidia (nail).
White, cream-colored, or light-brown
irregular nodules formed by yeast cells and
hyphae; nodules easily detached from the
hair shaft (scalp, beard, moustache, axillae,
6    Pocket Guide to Mycological Diagnosis
genitals, eyebrows, and eyelashes)/KOH.
Hyaline, septate, and tortuous hyphae with Malassezia spp.
blunt ends and budding blastoconidia similar
to “spaghetti and meatballs” (skin and nail)/
KOH.
Hyaline, septate, and tortuous hyphae with Hyalohyphomycetes
acute angle branching; sometimes Aspergillus spp., Fusarium spp.
chlamydoconidia are seen (superficial: nail;
mucocutaneous: nasal mucosa, paranasal
sinuses, eye)/KOH.
Dark nodules firmly attached to hair sheath; Piedraia hortae
nodules are formed by septate brown hyphae
and round asci containing 2 to 8 hyaline
fusiform ascospores/KOH.
Brown-pigmented, septate, tortuous hyphae Hortaea werneckii
(skin)/KOH.
(Continued)
Table 1.3 (Continued) Analytical Phase: General Procedures for Direct Microscopic Analysis of Clinical Specimens and Most Common Microscopic Findings
Site Sample
Subcutaneous Biopsies
mycoses Samples should be reduced to
small fragments; imprinting or
impression smears could also
be performed.
Papules, nodules,
abscesses, ulcers
Samples should be reduced to
small fragments; imprinting or
impression smears could also
be performed.
Procedure and Basic
Principle
KOH (10%–30%)
Grocott-Gomori Methenamine
silver stain
Carbohydrates in the fungi cell
wall are oxidized and then release
aldehyde groups, which react
with silver nitrate, reducing it to
metallic silver. All fungal
structures are seen in brown-black
color on a green background.
Gram
Yeast cells allow crystal violet to
penetrate the cell; decolorizer
cannot remove the dye and cells
appear blue/purple.
Filamentous fungi have thicker
cell walls that block crystal violet
penetration; decolorizer can
damage the cell wall and then
safranine diffuse inside some
fungal cells. Hyphae may be
stained pale-pink.
Hematoxylin and eosin—HE
(histology)
The basic dye hematoxylin colors
the basophilic cellular nucleic
acids in a blue-purple hue; eosin
colors intracellular and
extracellular proteins bright pink.
Calcofluor white-Evans blue
Evans blue is a counterstain that
reduces background fluorescence
of cells and tissues under blue
light (not UV).
Most Common Findings/Preferred
Method
Thick-walled, multiseptate round cells with
brown color (“muriform cells”)/KOH.
Hyaline, coenocytic, or pauciseptate,
ribbon-like, large hyphae with acute angle
branching/HE/Grocott-Gomori silver stain/
PAS/Calcofluor.
Brown-pigmented, septate hyphae/KOH/
Fontana Masson.
Yellow, white, brown, or red grain diameter
formed by delicate, branched filaments
measuring nearly 5 µm and long chains of
spores/KOH/Gram stain.
Black, pale, or yellow grains seen as a mass
of septate hyphae of nearly 5 µm thick
surrounded by intercellular cement/KOH/
Gram stain.
Small, cigar-shaped, and budding yeast cells
(2 to 6 µm in diameter); no filaments are
observed/KOH/HE/Grocott-Gomori silver
stain/PAS.
Globose or lemon-shaped yeast cells in
chains connected each other by tubules
(isthmus); no filaments are observed/
Grocott-Gomori silver stain.
Presumptive Diagnosis
Fonsecaea spp., Cladosporium
spp., Rhinocladiella spp., Exophiala
spp.
Zygomycetes/mucorales: Mucor
spp., Rhizopus spp., Rhizomucor
spp.
Cladosporium spp., Alternaria spp.,
Curvularia spp., Rhinocladiella spp.,
Exophiala spp., Phialophora spp.
Actinomadura madurae,
A. pelletierii, Nocardia spp.,
Streptomyces spp.
Black grains: Madurella spp.,
Leptosphaeria spp., Curvularia
spp., Exophiala spp., Phialophora
spp.
Pale, white, yellow grains:
Pseudallescheria boydii,
Acremonium spp., Aspergillus spp.
Sporothrix spp.
Notes
1. The number of yeast cells is
scarce in the majority of
cases; false negative results
are common.
2. The Splendore-Hoeppli
phenomenon may be seen in
histological sections stained
by Hematoxylin and eosin.
Lacazia loboi
Mycological Diagnosis     7
(Continued)
Table 1.3 (Continued) Analytical Phase: General Procedures for Direct Microscopic Analysis of Clinical Specimens and Most Common Microscopic Findings
Procedure and Basic
Site Sample Principle
Systemic mycoses Biopsies KOH (10%–30%)
Samples should be reduced to Gram
small fragments; imprinting or
impression smears could also Wright-Giemsa
be performed. Acidic-nuclear components are
turned blue; basic components of
the cells are seen orange to pink.
Hematoxylin and eosin (HE)
Grocott-Gomori Methenamine
silver stain
Calcofluor white-Evans blue
Fontana-Masson (histology)
Melanin reduces ionic silver to
metallic silver in alkaline solution;
gold chloride tones the metallic
silver from light brown to black. A
control slide should be run
through a depigmentation test
before silver impregnation.
Periodic acid-Schiff—PAS
(histology)
Periodic acid oxidizes
carbohydrates with hydroxyl
group or amino/alkylamine group
resulting in aldehydes that react
with Schiff’s reagent, forming an
insoluble magenta to pink colored
complex.
Most Common Findings/Preferred
Method Presumptive Diagnosis
Budding round to oval blastoconidia; thin Candida spp.
filaments (hyphae and/or pseudohyphae)
may be present/KOH/HE/Grocott-Gomori
silver stain/PAS.
Small intracytoplasmic round to ovoid cells Histoplasma capsulatum
with a small light halo around them (“false
capsule”)/HE/PAS.
Round to globose cells with multiple Paracoccidioides spp.
synchronous buddings (“Mickey Mouse” or
“pilot’s wheel” form). Catenulate yeasts may
be seen; hyphae are absent/KOH/HE/
Grocott-Gomori silver stain.
8    Pocket Guide to Mycological Diagnosis
Hyaline, septate hyphae with acute angle Aspergillus spp.
branching (45°); conidial heads may be seen
in pulmonary cavitary lesions/KOH/HE/
Grocott-Gomori silver stain.
Round to oval refractile cells, yeast may be Cryptococcus neoformans
seen inside giant cells or extracellularly. C. gattii
Narrow budding yeasts with teardrop format
surrounded or not by a clear halo/Fontana
Masson/PAS/Grocott-Gomori silver stain.
Large spherules filled with multiple Coccidioides immitis
endospores; ruptured spherules/Grocott- Coccidioides posadasii
Gomori silver stain/PAS/HE.
(Continued)
Table 1.3 (Continued) Analytical Phase: General Procedures for Direct Microscopic Analysis of Clinical Specimens and Most Common Microscopic Findings
Site Sample
Blood bone marrow, blood,
buffy coat
Prepare at least two smears for
each sample.
Cerebrospinal fluid
Samples should be concentrated
by centrifugation; wet mounts
and smears are prepared with
the obtained pellet.
Pathological fluids
(abdominal, pleural, synovial,
etc.—aspirated or drained)
Samples must be concentrated
by centrifugation; wet mounts
and smears are prepared with
the obtained pellet.
Sputum
(expectorated/induced)
Samples should be mixed
previously with n-acetylcysteine
or dithiothreitol for liquefaction.
Samples should be concentrated
by centrifugation.
Procedure and Basic Most Common Findings/Preferred
Principle Method Presumptive Diagnosis
Wright-Giemsa Intracellular (macrophages/neutrophils) round Histoplasma capsulatum
or oval yeasts with a small light halo around
them (“false capsule”). Fungal cytoplasm is
seen as light stained blue, and the polar
nucleus retains the dye intensely.
Budding round to oval blastoconidia; thin Candida spp.
filaments (hyphae and/or pseudohyphae) Note: Candida is rarely seen in
branched or not may be present. blood smears.
India ink/Nigrosin Tear-shaped or round cells with narrow-based Cryptococcus neoformans
Negative staining: live cells and buds surrounded by a large bright halo C. gattii.
capsular cells do not allow dye (capsule) with a black background/India ink.
diffusion.
Round to oval budding blastoconidia/Gram. Candida spp.
Gram
Gram Budding round to oval blastoconidia Candida spp.
Grocott-Gomori Methenamine associated or not with thin septate filaments
silver stain (hyphae and/or pseudohyphae)/Gram/
Calcofluor/Grocott-Gomori silver stain.
Calcofluor White stain
Wright-Giemsa
Gram Large yeast-like cells (up to 30 µm) round to Paracoccidioides spp.
KOH (10%–30%) oval; multiple buds are seen in a “pilot
wheel” configuration /KOH/Grocott-Gomori
Grocott-Gomori Methenamine silver stain/Calcofluor.
silver stain
Large spherules filled with multiple Coccidioides immitis
Calcofluor plus KOH endospores; ruptured spherules/KOH/ Coccidioides posadasii
Wright-Giemsa Grocott-Gomori silver stain/Calcofluor.
(Continued)
Mycological Diagnosis     9
Table 1.3 (Continued) Analytical Phase: General Procedures for Direct Microscopic Analysis of Clinical Specimens and Most Common Microscopic Findings
Site Sample
Bronchoalveolar lavage;
bronchial wash/brush;
tracheal aspiration
Samples should be concentrated
by centrifugation.
Systemic mycosis Urine (midstream)
Samples should be concentrated
by centrifugation; wet mounts
and smears are prepared with
the obtained pellet.
Skin/mucocutaneous lesions
(after dissemination)
Procedure and Basic Most Common Findings/Preferred
Principle Method Presumptive Diagnosis
Thin-walled spherules or thin-walled cells with Pneumocystis jiroveci
“deflated ball” shape; collapsed crescent-
shaped cysts and cysts with dark staining
areas/Grocott-Gomori silver stain/Giemsa.
Hyaline, septate hyphae with branching at Aspergillus spp.
45°/KOH/Grocott-Gomori silver stain/
Calcofluor.
Narrow-budding yeast cells; variably sized oval Cryptococcus neoformans
or round cells; bright halo (capsule) may be C. gattii
seen/KOH/Grocott-Gomori silver stain.
Gram Budding round to oval blastoconidia Candida spp.
KOH (10%–30%) associated or not with thin septate filaments
(hyphae and/or pseudohyphae)/Gram/KOH.
10    Pocket Guide to Mycological Diagnosis
If large debris are observed in the
pellet.
KOH (10%–30%) See descriptions above. Histoplasma capsulatum
Grocott-Gomori Methenamine Cryptococcus neoformans
silver stain C. gattii
Paracoccidioides spp.
Periodic acid-Schiff—PAS Coccidioides immitis
(histology) Coccidioides posadasii
Fontana Masson
 Mycological Diagnosis     11

Table 1.4 Variation in Sensitivity to Cycloheximide among Fungi Species

Very Sensitive
0.1 mM (0.02 mg/mL)
Aspergillus spp.
(including A. nidulans)
Penicillium spp.
Scytalidium
hyalinum/S. dimidiatum
Cryptococcus
neoformans
Cryptococcus gattii
Candida krusei
Candida utilis
Candida auris
Rhodotorula glutinis
Trichosporon ovoides
a Variable sensitivity among strains.
Moderately Sensitive
0.18–1.8 mM
(0.05–0.5 mg/mL)
Candida parapsilosisa
Candida tropicalisa
Candida glabrataa
Scopulariopsis spp.
Cladosporium spp.
Scedoporium apiospermum
complex
Trichosporon cutaneum
Trichosporon inkin
Trichosporon mucoides
Zygomycetes
Resistant
>1.8 mM (>0.5 mg/mL)
Candida albicans, C. dubliniensis
Trichophyton spp.
Microsporum spp.
Epidermophyton floccosum
Sporothrix schenckii species complex
Histoplasma capsulatum
Coccidioides immitis/C. posadasii
Paracoccidioides brasiliensis species
complex
Fusarium solani species complex
Fusarium fujikuroi species complex
Acremonium spp.
Scopulariopsis spp.
Exophiala dermatitidis
Fonsecaeae pedrosoi
Hortaea werneckii

semi-automated systems (API 20 C AUX, bioMérieux; Vitek, bioMérieux; RapID Yeast Plus system,
ThermoFisher; MicroScan rapid yeast identification panel, Siemens Healthcare; etc.). Most such
platforms, however, are designed only for yeast identification. Chromogenic media are also
widely used in clinical labs for presumptive identification of Candida spp., being especially useful
for visualization of mixed cultures (yeast/bacteria contamination).

1.4.2 Culture-independent methods

Presumptive diagnosis of fungal infections can also be achieved by molecular or immunological
methods.

1.4.2.1 Molecular diagnosis – Diagnosis based on molecular techniques has as potential

applications the identification of pathogens in non-cultivable materials (such as histological
specimens already fixed), as well as the detection of microorganisms directly in clinical specimens,
contaminated clinical specimens, and mixed cultures. Molecular techniques are also important
alternatives to the conventional diagnosis of high-risk pathogens, such as Coccidioides spp. and
Histoplasma capsulatum, since they can eliminate the handling of infectious cultures and allow
the detection of fungal DNA before seroconversion.

The extraction of nucleic acids from fungal pathogens in clinical samples can be performed
with commercial kits that allow obtaining fungal DNA and/or RNA after lysis of the sample and
adsorption of nucleic acid in affinity columns. These kits involve easy-to-manipulate protocols
with quick results, but their use is limited to only a few clinical samples, such as blood, serum,
or biopsies. This issue can be problematic, especially for the diagnosis of some deep mycoses
for which respiratory manifestations are the main findings and fungemia is rare. In this way, the
viability of molecular techniques using blood as the only biological sample is very questionable.
In addition, lung biopsies are difficult to obtain and are not considered preferential samples for
the diagnosis of deep mycoses. In laboratory routine, it is important to choose a method also
able to test fungal cultures.

In order to ensure the precise identification of a given microorganism, it is necessary to determine

the genetic regions that can be used as a diagnostic target. Molecular tests based on genes
12    Pocket Guide to Mycological Diagnosis

Table 1.5 Suggestion of Culture Media for Laboratory Processing of Different Clinical
Samples and More Common Fungal Species Isolated
Clinical Samples
Keratinous samples
(skin, hair, nail, ear)
Swabs
(oral cavity, nose, eye,
vagina, urethra, wounds,
ulcer, external ear)
Blood
Sputum and respiratory
samples
Liquor
Tissue, biopsy
Urine and other body fluids
(except liquor)
Pus and other exudates
Feces
Suggested Media Most Likely Isolates
Sabouraud dextrose Skin: Candida, Trichosporon,
agar (SDA), SDA with dermatophytes, Malassezia
chloramphenicol Hair: Trichosporon, Piedra,
(SDAc), SDA with dermatophytes, Malassezia
choramphenicol and
cycloheximide (SDAcc) Nail: Candida, Trichophyton,
Acremonium, Aspergillus, Fusarium,
Dixon or Sabouraud Scopulariosis, Scytalidium, Malassezia
dextrose agar with
olive oil for Malassezia Ear: Aspergillus, Candida, Malassezia
spp.
SDA, SDAc, SDAcc Aspergillus, Candida, Fusarium,
Rhizopus
Aerobic blood culture Candida, Cryptococcus, Trichosporon,
bottles Histoplasma (filamentous fungi are
rarely isolated)
SDA, SDAc, SDAcc, Candida, Cryptococcus, Coccidioides,
BHI agar (brain heart Histoplasma, Aspergillus,
infusion agar) Paracoccidioides, Mucor
SDA, SDAc, SDAcc Candida, Cryptococcus, Coccidioides,
Histoplasma
SDA, SDAc, SDAcc, Subcutaneous and systemic
BHI agar pathogens
SDA, SDAc, SDAcc, Urine: Candida, Cryptococcus
BHI agar Chest, abdominal, and synovial fluids:
Aspergillus, Candida
Bone marrow: Histoplasma, Candida,
Cryptococcus
SDA, SDAc, SDAcc, Subcutaneous and systemic
BHI agar pathogens plus Trichophyton
schoenleinii
SDA, SDAc, SDAcc Candida spp.

present in multiple copies per genome—such as the cluster of ribosomal DNA genes (rDNA)—
show high sensitivity but may present moderate specificity. Genes for fungal rDNA are arranged
as repeating units formed by different informative sequences and therefore are considered
relevant molecular markers for identification of many fungi species (Figure 1.2). Molecular
identification can also be targeted to genetic sequences present in single copies per genome.
Tests with this approach may have less sensitivity, but generate very specific results, of great
importance in laboratory diagnosis. Examples of non-rDNA loci used for fungal identification
are: translation elongation factor 1α (for Fusarium, Trichoderma, Mucorales, etc.), cytochrome
oxidase 1 (for Penicillium spp.), calmodulin (for Aspergillus spp., Sporothrix spp.), yeast-phase
genes RYP (for Histoplama capsulatum), etc.

Among the various molecular techniques employed in mycology, polymerase chain reaction is
probably the most applicable in clinical laboratories. Molecular identification protocols based on
this technique generally have high sensitivity, low cost, and reproducible results.

Throughout this work, the reader will be presented with the most common techniques for the
molecular diagnosis of pathogens generally found in mycology laboratories.
Table 1.6 Descriptive Formulas of Common Mycological Media and Indications of Use
Medium Formula Indications of Use
BHI Brain heart (infusion) 10 g/L; Pancreatic digest of casein 16 g/L; Peptic digest Primary recovery of fastidious pathogenic fungi from clinical
of animal tissue 5 g/L, Sodium chloride 3.0 g/L; Disodium phosphate 2.5 g/L; samples.
Dextrose 2.0 g/L; Cycloheximide 0.5 g/L; Chloramphenicol 0.05 g/L;
Agar 13.5 g/L
Final pH (25°C) 7.4 ± 0.2
Bird seed agar Guizotia abyssinica seeds 50 g/L; Creatinine 1 g/L; Dextrose 1 g/L; Subculture of suggestive colonies of Cryptococcus.
(Niger seed agar/ Monopotassium phosphate 1.0 g/L; Chloramphenicol 0.05 g/L; Agar 15 g/L Selective isolation and differentiation of Cryptococcus
Staib agar) Final pH (25°C) 6.7 ± 0.2 neoformans from other yeasts, including other Cryptococcus
species.
Caffeic acid agar Ammonium sulfate 5 g/L; Dextrose 5 g/L; Yeast extract 2 g/L; Dipotassium Subculture of suggestive colonies of Cryptococcus.
phosphate 0.8 g/L; Magnesium sulfate 0.7 g/L; Caffeic acid 0.18 g/L; For the selective isolation and differentiation of Cryptococcus
Chloramphenicol 0.05 g/L; Ferric citrate 0.02 g/L; Agar 15 g/L neoformans and C. gattii from other yeasts.
Final pH (25°C) 6.5 ± 0.2
CHROMagar Peptone 10.2 g/L; Chromogenic mix 22 g/L; Chloramphenicol 0.5 g/L; Subculture of suggestive colonies of Candida.
Candida Agar 15 g/L Selective and presumptive differential identification of
Final pH (25°C) pH: 6.1 ± 0.2 C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei.
CGB agar Glycine 10 g/L; Potassium phosphate 1 g/L; Magnesium sulfate 1 g/L; Subculture of suggestive colonies of Cryptococcus.
Bromothymol blue 0.4 g/L; L-Canavanine sulfate 30 mg/L; Thiamine HCl Selective and presumptive differential identification of
1 mg/L; Agar 15 g/L Cryptococcus gattii from other Cryptococcus spp.
Final pH (at 25°C) 5.8 ± 0.1 C. gattii can grow in the presence of L-canavanine and utilize
glycine as sole carbon source; bromothymol is an indicator
that changes the color of the medium from yellow-green to
cobalt blue in alkaline pH.
Corn meal agar Cornmeal (infusion) 50 g/L; Tween 80 10 mL/L; Agar 15 g/L For demonstration of chlamydospore production by Candida
with Tween 80 Final pH (25°C) 6.0 ± 0.2 albicans.

(Continued)
Mycological Diagnosis     13
Table 1.6 (Continued) Descriptive Formulas of Common Mycological Media and Indications of Use
Medium Formula Indications of Use
Dermatophyte test Papaic digest of soyabean meal 10 g/L; Dextrose 10 g/L; Phenol red 0.2 g/L; Primary recovery of dermatophytes from clinical samples.
agar Agar 2 g/L; Cycloheximide 0.5 g/L; Gentamicin 0.1 g/L; Chloramphenicol Dermatophytes appear as pink-red; saprophyte fungi
0.1 g/L (non-dermatophytes) can be recognized by the absence of
Final pH (25°C) 5.5 ± 0.2 color change from yellow to red.
Dixon agar Malt extract 30 g/L; Ox bile 20 g/L; Mycological peptone 5 g/L; Glycerol Primary recovery of Malassezia spp. from clinical samples.
mono-oleate 2.5 g/L; Tween 40 10 mL; Agar 15 g/L
Final pH (25°C) 5.4 ± 0.2
Modified Sucrose 30 g/L; Sodium nitrate 2 g/L; Magnesium glycerophosphate 0.5 g/L; Induction of chlamydospore production by Candida albicans.
Czapek-Dox Potassium chloride 0.5 g/L; Dipotassium sulfate 0.35 g/L; Ferrous sulfate Subculture of Aspergillus spp. and Penicillium spp.
0.01 g/L; Agar 12 g/L
Final pH (25°C) 6.8 ± 0.2
SABHI agar Beef heart (infusion) 125 g/L; Calf brain, (infusion) 100 g/L; Dextrose 21 g/L; Primary recovery of pathogenic fungi from clinical samples.
14    Pocket Guide to Mycological Diagnosis

Neopeptone 5 g/L; Proteose peptone 5 g/L; Sodium chloride 2.5 g/L; Disodium Blood enhances the recovery of fastidious fungi and also the
phosphate 1.25 g/L; Chloramphenicol 0.05 mg/L or Gentamycin 40 mg/L; in vitro conversion of Histoplasma capsulatum to the yeast
Cycloheximide 500 mg/L; Agar 15 g/L. phase.
It is recommended to add 10% sterile sheep blood before dispensing into Petri
dishes.
Final pH (25°C) 7.0 ± 0.2
Sabouraud Dextrose 20 g/L; Peptone 10 g/L; (Pancreatic digest of casein 5 g/L; Peptic Primary recovery of pathogenic fungi from clinical samples.
dextrose agar 2% digest of animal tissue 5 g/L); Agar 15 g/L
Final pH (25°C) 5.6 ± 0.2
Addition of chloramphenicol 0.05 g/L and cycloheximide 0.5 g/L suppress the
growth of bacteria and saprophytic fungi.
Sabouraud Dextrose 40 g/L; Pancreatic digest of casein 5 g/L; Peptic digest of animal Primary recovery of Malassezia spp. from clinical samples.
dextrose agar with tissue 5 g/L; Olive oil 20 mL, Tween 80 2 mL; Agar 15 g/L
olive oil Final pH (25°C) 5.6 ± 0.2
Another random document with
no related content on Scribd:
jonka hän oli saanut senaattorivainajalta, ja joka oli väljänlainen
laihalle Kello-Mikolle, mutta siitä huolimatta arvon mukainen asu
puhemiehelle.

Jo aukeni kansliahuoneen ovi ja rovasti tuli paitahihasillaan

verannalle.

— Hyvää huomenta!

— Huomenta, huomenta!

Iisakki kumarsi niin syvään, että pitkät hiukset valahtivat silmille ja

Eedla niiasi vielä syvempään, sipaisten suortuvia huivinsa alle.

— Huomenta vaan, rovasti, virkkoi kellonsoittaja. Tässä tulee taas

yksi pari liittoaan vahvistamaan herra rovastin luokse. Aina sitä minä
saan olla vaan liehtaamassa näitä arvoisäntiä siihen aviosäätyyn.

— Vai naimisiin se jo Iisakki aikoo… ja vielä näin kesäkuumalla,

naureskeli rovasti.

— Kerranhan sitä on siihenkin säätyyn astuttava, virkkoi Kello-

Mikko juhlallisesti ja lisäsi:

— Ennenhän sitä mies vuoden lehmättä kuin Mittumaarina

eukotta.

Käytiin sisään ja oli sangen juhlallista.

— No tämä Iisakki sitten ottaa avioksi tämän Miirun Eedlan? kysyi

rovasti.

— Niinhän tämä nyt ottaa, vastasi puhemies. Ja nuhteettomia ja

kunniallisia ovat molemmat.
 — Otanhan minä, vahvisti Iisakki.

Mutta eteisestä oli kuulunut raskaita askeleita ja Rietula astui

huohottaen sisään ja hänen perässään kauppias Kilpummi, jonka
Rietula oli saanut puhemiehekseen. Rietula oli juuri astunut
huoneeseen, kun Iisakki sanoi Eedlan ottavansa, ja hän karjaisi:

— Etkä ota!

Iisakki hätkähti niin, että oli vähällä istuimeltaan pudota. Rovastikin

katsoi ihmetellen Rietulaa, jonka leuka tärisi mielenkuohusta.
Kellonsoittaja katseli suu auki rauhan häiritsijöitä.

— Tämä Kyrmyniska aikoo riistää minulta morsiamen, mutta

minäpä en nyt sitä annakaan, puhui Rietula. Jo on siinä mies, kun ei
saa itselleen omituista, kun pitää riistää toiselta… ja sitten vielä kuin
varkain lähtee pappilaan.

Iisakin luontokin jo nousi, eikä hän sitä nyt katsonut tarpeelliseksi

hillitä, kun oli näin tiukka paikka kyseessä. Tulipunaisena kasvoiltaan
nousi hän seisomaan ja kivahti:

— Tämä Eedla on minun ja minä sitä olen katsellut paljon

ennemmin kuin sinä, ja kun Eedlan äiti kerran antoi sinulle potkut,
niin ei luulisi kehtaavan enää tulla tällaiseen pyhään paikkaan. Ja
kun kerran Eedla on suostunut lähtemään minun kanssani pappilaan
ja kun kerran minä rakastan Eedlaa, niin minulla on oikeus myöskin
saada tyttö aviokseni.

— Juuri niin, herra rovasti, vahvisti kellonsoittaja. Se on laki ja

oikeus, että Iisakki saa Eedlan, kun kerran sen on jo pappilaankin
tuonut.
 — Älä sinä, vanha varis, puhu laista ja oikeudesta, puhkui Rietula.
Tottakai minä tiedän lain ja oikeuden, kun olen lautamies.

Kello-Mikonkin viha nousi jo korkeampaan asteeseen. Vaikka hän

oli laiha, oli hän voimissa väkevä ja kykeni käymään käsiksi
julmimpaankin mieheen, jos niikseen tuli.

— Saanko minä heittää Rietulan ulos, herra rovasti? kysyi hän

lähentyen
Rietulaa.

— Älä satuta käsiäsi lautamieheen, kivahti Rietula. Muuten laki lyö

sinua raskaasti.

— Antaahan nyt olla, virkkoi rovastikin. Jos tässä selvittäisi

muutenkin. Istukaahan nyt ja olkaa hosaamatta, kehoitti hän
asianomaisia.

— No, kumpaisenko tämä morsian nyt sitten oikein on? kysyi

rovasti.

— Minun se on, vahvisti Rietula.

— Eipäs kuin minun, ja minulle on Eedla lupautunut tulemaan,

puolustautui Iisakki.

— Mutta Eedla sanoi minulle siellä Ala-Rietulan ladon takana…

— Milloinka sinä olet minun morsiantani siellä kuljettanut, kivahti

Iisakki.

— Olehan siinä… siellä ladon takana, että kyllähän minä

mieluummin… joo… tuota lautamiehen ottaisin, mutta kun se
Kyrmyniska tuppasi väkisten ne kihlansa…

— Sanoppas, Eedla, annoinko minä väkipakolla ne kihlat,

keskeytti Iisakki. Kun otit kellonkin ja ihastelit, että koreapa on ja
panit kaulaasi ja…

— En minä häntä tiedä, enkä muista niin tarkkaan, sanoi Eedla.

— Pitäisi ne toki muistaa semmoiset asiat.

— Onko tämä Rietula sitten ennemmin puhunut niistä asioista

Eedlalle, kyseli rovasti naureskellen.

— Onhan tämä joskus monkattanut, että pitäisi muka naimisiin, ja

on tämä antanut karamelleja, kun…

— No ei nyt niistä, keskeytti Rietula, vaan sanoppas, Eedla, nyt

oikein sydämesi pohjasta, kumpainenko meistä on parempi sinun
mielestäsi?

Eedla mietti hetkisen ja arveli:

— Eipä taida olla mitään väliä.

— No johan nyt, työlästyi Rietula, mutta sinähän sanoit silloin

siellä maantiellä että… mitenkä se nyt olikaan?

— No, kumpaisenko näistä nyt Eedla tahtoo aviokseen? kysyi

rovasti.

— Min' en tahdo kumpaistakaan. Nämä ukothan ne rupesivat

tahtomaan, kivahti Eedla.

— Mutta kumpaisenko nyt ottaisit mieluummin?

 — Minulla ei ole mitään väliä, kumpaisen nyt vaan rovasti antaa,
arveli
Eedla lattialautoja katsellen.

Iisakki heilahti kärsimättömästi ja rovasti hymyili edelleen. Mutta

kellonsoittaja virkkoi kunnioittavasti seisoalleen nousten:

— Kun nämä sulhaset ovat puhuneet jo minun mielestäni

tarpeeksi, niin jos nyt puhemiehet jatkaisivat. Ja minä otan nyt
ensiksi puhevuoron:

Kun tulin tänne tänä aamuna näitä avioon aikovia avustamaan,

huomasin minä ilokseni, miten onnellisena ja rakkaudessa he istuivat
tuossa verannan portailla. Eedlan käsi oli Iisakin kaulalla ja…

— Eläpä nyt! Vaikka Iisakki pani kätensä minun olkapäälleni ja

minä sysäsin sen siitä pois, keskeytti Eedla.

— Kyllä se oli Eedlan käsi, joka oli Iisakin kaulalla, jatkoi Kello-
Mikko, ja nämä puhuivat, minä varmasti kuulin sen, että syntyy siinä
Mikkolassa…

— No ne nyt ovat semmoiset turhia puheita, aloitti nyt kauppias

Kilpummi keskeyttäen kellonsoittajan ja röyhistäen rintaansa. Tässä
on nyt vaan kysymys siitä, kuka on ensiksi saanut aviolupauksen
Eedlalta, ja jos se on tämä lautamies, niinkuin minusta tuntuu, niin
painele silloin, Iisakki, ovesta ulos ja jätä meidät rauhaan!

Mutta nyt näytti Iisakki jo hätäytyvän:

— Minä en anna Eedlaa teille jumalattomille, jotka tulette kuin

haaskalinnut ryöstämään toisen saalista ja…
 — Kuka tässä on haaskalintu, kiehahti Rietula ja kina jatkui
hillitysti edelleen.

Pappilaan oli tullut vierailemaan auskultantti Kennäs ja rovasti oli

poistunut hetkiseksi sisähuoneisiin hänen kanssaan juttelemaan.
Palattuaan ja istuttuaan pöydän ääreen kysyi rovasti:

— Tuleeko tästä mitään selvää?

Kellonsoittaja nousi istuimeltaan, sylkäisi mällin suustaan ja

pyyhkäisten hikeä otsaltaan virkkoi:

— Ei, hyvä herra rovasti, tästä tule nyt mitään selvää. Ja tämä on
ensimäinen kerta, kun minä haalaan tällaista naimaväkeä pappilaan,
ja herra rovasti tietää, että minä olen parhaani tehnyt tässä asiassa,
mutta järkipuhe ei näy heihin pystyvän ja siksi minä alankin tällä
kertaa jo kyllästyä koko tehtävään.

Rovasti hymähti.

— Tulisikohan selvä, jos me tässä perustaisimme pienen sovinto-

oikeuden. Minulla sattui olemaan vieraana tuomari ja jos minä
kutsun hänet puheenjohtajaksi? esitti hän.

— Suostutaan, lupasi Rietula, mutta Iisakki puolusteli

epätoivoisena asiaansa.

— Ei tässä tarvita tuomareita eikä oikeuksia, ei muuta kuin rovasti

panee minut ja Eedlan kuulutuksiin.

— Miks' ei, jos vaan morsian sanoo siihen suostuvansa, lupasi

rovasti.
 — No, rakas Eedla, sano nyt sille, että suostunhan minä, supatti
Iisakki Eedlan korvan juuressa.

Mutta Eedla vaikeni kuin muuri ja sormeili vain kihlakellonsa

ketjua.

— No, perhana! pääsi Iisakilta. Kaikkia tuppisuita tässä…!

— Jos minä kutsun tuomarin, vai mitä? kysyi rovasti hymyillen.

— Kutsukaa, hyvä rovasti, vaikka maaherra. En minä nyt ole

itsekään selvillä tästä Eedlasta, vaikeroi Iisakki.

Rovasti meni sisään ja tuli kiusallinen hiljaisuus. Kärpäset vain

surisivat kansliahuoneessa ja napsuttelivat kattoon. Iisakki puri
vihaisesti sikaarin päätä suuhunsa.

Auskultantti Kennäs tuli sisään rovastin seuraamana. Istui pöydän

ääreen ja muhoillen aloitti kuulustelun. Äsken oli hän jo avonaisesta
ovesta kuullut asianomaisten keskustelun ja kysyi nyt Iisakilta:

— No, milloinka Iisakki katseli Eedlaa sillä silmällä että

vaimokseen?

— Se oli… tuota, se oli silloin, kun oli se Korpijoen

osuuskauppakokous Miirussa.

— Muistatteko päivän?

— Eikö liene ollut perjantai, arveli Iisakki.

Kilpummi sipatti jotain Rietulan korvaan ja Rietula virkkoi

seisoalleen nousten:
 — Herra puheenjohtaja ja korkea oikeus. Saanen sanoa, että minä
katselin Eedlaa jo paljon aikaisemmin sillä silmällä. Se oli Marian
päivä, kun kävin Miirussa ja silloin minä sen päätin, että otan Eedlan.

Mutta Rietula valehteli nyt kouraantuntuvasti. Lukija muistaa, että

Rietula meni Miiruun osuuskauppakokoukseen hetkistä myöhemmin
kuin
Iisakki, joka oli joen sillalla katsellut Eedlaa pesupuuhissaan
ja tehnyt valintansa. Mutta Kilpummi oli neuvonut tämän valheen
Rietulalle, joka sitä häikäilemättä käytti nyt hyväkseen.

— Kyllä sitä minäkin oikeastaan katselin jo aikaisemmin, aloitti

Iisakki hätäisesti.

— Mutta itsehän myönsitte katsoneenne myöhemmin, huomautti

Kennäs ja kysyi Eedlalta:

— Katseliko tämä Rietula teitä silloin Marian päivänä.

— En minä niin tarkkaan muista, mutta kyllä tämä Mooses kävi

meillä Marian päivänä ja istua kyönätti koko päivän ja näytti
vahtaavan sinne karsinapuolelle, todisti Eedla ja veti huivinsa
solmua tiukempaan leuan alle.

— Korkea oikeus ja herra tuomari, nyt kuulette asian Eedlan

omasta suusta ja minä pyydän oikeuden mukaista päätöstä tästä
asiasta.

— No kumpaisenko nyt Eedla haluaisi miehekseen? kääntyi

Kennäs kysymään hymyillen morsiamelta.

— Eipä ole mitään väliä, laukaisi Eedla.

 — Siis määrää asian, että se, joka on katsellut Eedlaa ensiksi,
tulee hänet myöskin saamaan, ja kun Rietula on tehnyt sen ensiksi,
kuuluu näin ollen Eedla Rietulalle. Ja tämä on oikeuden päätös.

— Mutta kun Eedla on ottanut kihlatkin jo minulta, virkkoi Iisakki

alakuloisesti.

Rovasti käveli hyvätuulisena kanslian permannolla ja kysyi

muhoillen
Eedlalta:

— Onko Eedla istunut Iisakin kanssa kahdenkeskisessä paikassa?

— Istutuinhan sitä siellä Miirun tupakkamaassa Vapun päivänä,

kiirehti
Iisakki selittämään, mutta Eedla kivahti ihmeen terävästi:

— Se on vale! Minähän käänsin tupakkamaata ja Iisakki istui ihan

yksin siankaukalolla.

— No, onko tämä Rietula sitten istunut Eedlan kanssa, kysyi

Kennäs hymyillen.

Rietula ei virkkanut sanaakaan, mutta Eedla virkkoi empimättä:

— On istuttu.

— Asia on siis selvä ja minä julistan päätöksen.

Seurasi pieni hiljaisuus, ja Kennäs niisteli hyvin kuuluvasti

nenäänsä. Iisakki istui kuin ankaran iskun saaneena, mutta Rietula
röyhisteli rintaansa. Hän oli jo varma siitä, mille puolelle oikeuden
vaaka tulisi kallistumaan. Eedla pyöritteli peukaloitaan ja
kellonsoittaja tuijotti vihaisesti lattiaan.

— Peruuttamaton päätös on tässä asiassa seuraava: lautamies

Rietula on huomattu ensiksi aikoneen avioliittoon Eedlan kanssa ja
tulee siis hänet saamaan. Eedlan on kumminkin annettava Iisakille
hänen antamansa kihlat takaisin.

— Jo tuli nyt perhanat, jurahti Iisakki ja haukkasi ison palan

sikaaria poskeensa. Hetkisen hän näytti asiata aprikoivan, mutta
pian hän rauhoittui ja virkkoi:

— Jaa, Mikkolan isäntä ei ole kuunaan yhden akan vaivanen. Kun

sinä, lunttu, teit tällaisen hävittömyyden vanhalle miehelle, niin pidä
ne kihlat palkastasi. Ei tarvitse Rietulankaan uusia ostaa!

Ja puheensa vahvikkeeksi purautti Iisakki vahvan tupakkasyljen,

joka sattui vahingossa Eedlan hameelle.

Eedla oli riisunut korunsa ja laskenut ne pöydän kulmalle.

Vastahakoisesti näytti Iisakki ne ottavan, mutta otti kumminkin ja pisti
housujensa taskuun ja sen tehtyään astui ulos, paukauttaen kanslian
oven kiinni mennessään, niin että seinät huojahtivat.

— Jopa tuli lain mukainen päätös, riemuitsi Rietula.

— Oliko se ihme, kun minä olin puhemiehenä, kehuskeli Kilpummi.

Jos huonomman miehen sait, niin huonosti kävi.

Pappilan sisähuoneista kuului vallatonta naurua, mutta Rietula

pantiin kuulutuksiin Eedlan kanssa.
XVIII.

Iisakki seisoi rattailla, löi ohjasperillä hevosta ja hihkaisi. Kotimatka

alkoi olla jo puolessa, ennenkuin Iisakki rauhoittui ja painui istumaan.

— Olenpa hullu, kun hevoseen vihani viskaan, mutisi hän.

Jos jutkauttivat, ja kyllähän ne nyt jutkauttivatkin oikein aikatavalla,

niin mitäpä tuosta. Kaipa se niin oli sallittu, että Eedlan koikale ei
joutunut minun leipiini.

Jo kaivoi Iisakki rakkaan piippunsa, rakkaimman kaikista

maailmassa, ja saatuaan sen käryämään, rauhoittui kokonaan.

— Hoh… hoo, olipa surullinen loppu sillä naima-asialla, huokasi

vielä kumminkin.

Hevonen sai nyt kävellä myötä- ja vastamäet ja Iisakki mietti otsa

kurtussa, mistä nyt lähtisi eukonpuolta paremmalla onnella itselleen
koettamaan.

— Onhan niitä akkoja siellä Korpijoen jos Kolmonkin puolella,

mutta mikä niitä kaikkia… Vaikka lieneeköpä heillä niin suurta eroa,
akka kuin akka. Jos vaikka ottaisin sen Möttösen Taavan. Tosin se
on Kolmon puolella, mutta kyllä kai Taava tulisi sieltäkin.

Uudelleen painui Iisakki miettimään ja harkitsi asiaa joka puolelta.

Noustiin Kilpismäen päälle ja siihen näkyi jo kotikylät ja päivässä

välkkyvä joki niiden välissä. Näkyivät talot peltojensa keskeltä ja
maantie keltaisena nauhana.

Hiljainen tuuli leyhytteli etelän mailta ja syleillen ensin suvista

metsää, veti juovan Kolmojärven pintaan, joka näkyi lähempää kylien
eteläpuolella. Olivatpahan nuotalla Ylä-Rietulan rannassa.

Mietittyään vielä tovin, oli Iisakki tehnyt päätöksensä. Hän menee

nyt samaa tietä Möttöseen ja puhuu asian selväksi Taavalle. Nuori
ihminenhän se vielä… ja järkevämpi kuin Eedla. Ja hän oli kuullutkin
Sarvi-Kaisalta, että Taava tulisi mielellään Mikkolaan emännäksi.

Iisakki nykäisi hevosen juoksuun. Alkoi jo kotikylä puiden välistä

näkyä. Miirun pellolla aurasi renki kesantopeltoa. Näkyi sitten
pysäyttävän hevosensa ja alkoi laulaa surunvoittoisesti:

"Rikkaat ne riiaa hopealla ja komeilla kartanoilla, vaan

renkipoika se heilinsä ottaa lantin kolikoilla.

Ja on niitä tyttöjä muualla, ei tämän kylän emännillä. Ja on

niitä heiloja rakkaampia tuolla Karjalan kankahilla".

— Juuri niin! ilostui Iisakki kuunnellessaan renkipojan laulua.

On tosiaankin tyttöjä, jos akkojakin, muualla, ei vaan Korpijoella.

Ja kun tuli Mikkolan tiehaara, iski Iisakki tammaa lautaselle ja ajoi
joen sillalle, niin että silta kumeasti jyrähti. Ajoi siitäkin vielä
eteenpäin ja käänsi hevosensa Möttösen tielle.

Horttanaisen akka oli maantiellä ja huomattuaan, että Iisakki ajeli

yksin kirkonkylästä, huusi hänen jälkeensä:

— Ähä!… Olipa sillä Miirun tyttärellä paremmat haltijat. Pitkän

nenän nyt sait, Kyrmyniska!

Iisakki ei ollut kuulevinaankaan. Sitoi hevosensa Möttösen

portinpieleen ja astui tupaan.
XIX.

Ala-Rietulan Vernand oli myöskin hiljaisuudessa suunnitellut

poikansa avioliitto-asiaa. Hesekiel oli täyttänyt jo viidennenkolmatta
vuotensa, eikä näyttänyt vieläkään minkäänlaisia oireita edes
isälleen, että aikoisi tyttöasioihin kajota. Ja Vernand tämän
itsepäisyyden nähtyään ja kerran siitä jo puhuttuaankin pojalleen
tuloksettomasti, päätti ottaa Hesekielin eukkopuuhat omiin käsiinsä.

Suunniteltuaan perusteellisesti asiaa, oli hän tullut siihen varmaan

vakaumukseen, että parempaa aviota ei hän voisi pojalleen saada,
kuin Möttösen Taava. Tämä tyttölapsi oli vuosi sitten täyttänyt
neljännenkymmenennen ikävuotensa, mutta siitä huolimatta näytti
nuorekkaalta terveessä lihavuudessaan.

Ja eräänä päivänä sanoi Vernand pojalleen, että nyt on sopiva

morsian tiedossa ja nyt sitä on mentävä kysymään.

— Missähän tuo olisi? jurahti poika ja katseli alta kulmain isäänsä.

— Möttösessä… Se Taava…

Enempää ei isä selittänyt, eikä mitenkään ylistänytkään morsianta.

Tottapahan poika itse älyää, miten onnellisen ja kaikinpuolin
edullisen valinnan hän oli tehnyt.

— Vanhapa on, jurahti poika, mutta isä arveli:

— Joutaa olla… onhan siihen sijaan rikas ja lihava.

— Mitäpä sillä vanhalla lihalla, urisi poika edelleen, mutta Vernand

päätti katkaista kaikki murinat ja karjasi:

— Vai vanha… kun mies on kuin lammas akka-asioissa ja vaivaa

semmoisilla vanhaa isäänsä, niin vielä sitten ilkeää jorista. Pistä
ehjemmät housut jalkaasi, nyt sitä mennään!

Eikä poika enää vastustellut.

Ja nyt istui Vernand poikansa kanssa Möttösen tuvassa, kun

Iisakki astui sisään.

Taava pesi karsinapuolella astioita eikä voinut aavistaa, että kauan

odotetut kosijat olivat vihdoinkin tulleet, vieläpä kaksikin samalla
kertaa.

Vernand oli poikineen hetkistä aikaisemmin istahtanut penkille,

kun
Iisakki sitoi hevosensa portin pieleen. Ei ollut asiataan vielä ehtinyt
Taavalle selvittää.

Vernand ilostui nähdessään Iisakin astuvan tupaan. Kun oli

hetkinen ilmoista juteltu, siirtyi Vernand Iisakin viereen ja alkoi hiljaa
supatella:

— Tämä meidän Hesekiel kun meinaa tätä Möttösen Taavaa

niinkuin eukokseen, niin etkö rupeisi puhemieheksi? Ei sattunut
tässä muitakaan.

Mutta Iisakki karjasi heti niin että tupa kajahti:

— En!

Ja siirtyi peräpenkille istumaan, sadatellen mielessään

tämänpäiväistä huonoa onneaan. Hän oli valmis uskomaan, että
Taava ottaa mieluummin Hesekielin kuin hänet.

Oli painava hiljaisuus, jonka rikkoi vain pihamaalta kuuluva kukon

laulu. Taava oli aavistanut jotain erikoista tapahtuvaksi ja käynyt
vaihtamassa vaatteita. Nyt tuli hän koreana penkille ikkunan pieleen
istumaan ja jäi odottamaan.

Vernand siirtyi hänen viereensä ja alkoi suu naurun mareessa

supatella
Taavalle:

— Kun siinä meillä ei ole vakituista emäntää, niin talouskin menee

rempalleen. Olisi tämä Hesekiel jo naimaijässä, vaan ei pahus kajoa
naisihmisiin, vaikka olen sitä toivonut. Ota sinä Hesekiel ja muuta
sinne meille, niin hoitelet sitäkin taloutta siinä.

Iisakki istui peräpenkillä ja puri mälliä vihoissaan. Luonto pyrki jo

laukeamaan, mutta koetti sitä vielä pidätellä, ja se ponnistus sai
miehen ankarasti hikoomaan.

Taava odotti, että Iisakki puhuisi asiansa. Tosin hän tiesi, että
Iisakki oli aamulla varhain mennyt Eedlan kanssa pappilaan, mutta
kuullut myöskin, että Rietula läksi jälestä ajamaan ja Taava oli
melkein varma siitä, että Rietula oli vienyt Iisakilta morsiamen. Iisakki
taisi nyt olla uusilla yrityksillä Möttösessä.
 Vernandin korvallisille nousi myöskin hiki.

— … koko toljake tuo poika, kun ei puhu mitään.

Ja pojalleen:

— No ottaisitko sinä tämän Taavan, jos se niinkuin suostuisi…

Poika katseli kenkäinsä kärkiä ja jurahti:

— Mikäpä tuossa muukaan auttanee… ja kun siitä yhtämittaa

minulle jurnutetaan.

Mutta Iisakki ei jaksanut enää pidättäytyä. Viittasi Taavan luokseen

ja virkkoi kuin hengästyneenä:

— Tuletko sinä Mikkolaan?… ja otatko sinä kihlat…? ja sopiiko,

että ensi sunnuntaina kuulutetaan…? ja annatko sinä korvalle tuota
Hesekieliä vai pitääkö minun…?

Taava löi kämmenensä yhteen.

— Kävipäs se niin kuin minä siitä unestani ennustin! Ja toki minä

tulen Mikkolaan ja olisin tullut jo kymmenen vuotta aikaisemmin, kun
olisit pyytänyt. Ja se sopii hyvin että ensipyhänä…

Ja Taava riensi kuin tuuliaispää keittämään kihlajaiskahvia.

Mutta Vernand sanoi pojalleen:

— Nyt sinä sait Taavalta rukkaset.

— Enhän minä ole kosinutkaan, kivahti Hesekiel. Itsehän sitä

tolkutit.
 Kun Ala-Rietulan isäntä oli poikineen lähtenyt kihlajaiskahvit
juotuaan, nousi hetken perästä myöskin Iisakki kotiin aikoen. Mitä
teki silloin Taava? Rajun riemunsa vallassa syöksähti Iisakin kaulaan
ja puristi niin, että Iisakki oli tukehtua. Tuli siinä Iisakkikin laskeneeksi
kätensä Taavan vyötäiselle ja kun tunsi pehmeän vartalon kätensä
alla, niin jopa villi ilo leimahti silmäkulmassa.

— Oli onni, että jäi sen Eedlan kanssa. Sinustahan minä, näen
mä, pidänkin.

— Rakas Iisakki!

— Rakas Taava!

Ja kun Iisakki nousi rattaille ja käänsi maantielle, niin jopa hihkaisi,

mutta tällä kertaa rintaa paisuttavasta riemusta.
XX.

Korpijoen osuuskaupan hallituksen puheenjohtajana oli Iisakki ja

Kolmon uuden kaupan Rietula, mutta aviopuuhat olivat vieneet
miesten ajan ja ajatukset niin, että tuskin kertaakaan joutivat
kokouksissa käymään ja sitäkin vähemmin valvomaan kaupan
asioita. Kauppoja hoitivat kirjanpitoa taitamattomat miehet,
varsinkaan Nuusperi Korpijoen puolella ei ollut ollenkaan perillä
kirjanpidosta.

Mutta miehet ajattelivat, että kunhan saadaan emännät taloon, niin

sitten joutaa paremmin pitämään kauppojen asioita silmällä.

Kylien välit olivat käyneet yhä kireämmiksi.

Miksi meni Iisakki kosimaan Möttösen Taavaa ja miksi Rietula ei

tyytynyt oman kylän naisväkeen, vaan otti Miirun Eedlan?
Kumpainenkin heistä oli tehnyt rikoksen, jota eivät kyenneet
sovittamaan. Rietulaa haukuttiin jo aivan omalla pihallaan ja Iisakille
sateli pistopuheita korpijokelaisilta.

Miirun Eveliina, kuultuaan, miten pappilassa oli käynyt, oli

nostanut kauhean elämän ja uhkasi nyt edelleen vävypoikaansa. Ja
tavattuaan eräänä päivänä Iisakin maantiellä, alkoi pauhata:
 — Siin' on mies, kun antaa morsiamensa toiselle? Kaikki lampaat
ne vielä eukkoa itselleen honikoivatkin! Eikö sinulle emäntä
kelvannut muualta, kun piti Kolmon puolelta mennä hakemaan.

Iisakki hymähteli ja virkkoi:

— Eedla ei ollut sallittu minulle. Ja eikö ne vaimonpuolet liene yhtä

kärtyisiä ja suulaita Korpijoenkin puolella.

Rietulalta kyseltiin röyhkeästi, että milloinka hän tuo sen "variksen

pelätin" sieltä Miirusta. Rietula kirosi ja sanoi tuovansa silloin kun
tahtoo ja ettei hänen asiansa kyläläisiä liikuta.

Ja siihen se aina kerrakseen loppui, mutta sopivassa tilaisuudessa

alkoi uudelleen.

Mikkolassa valmisteltiin suurenmoisia häitä. Äkäinen sonnikin oli

saanut kuoliniskun ja kirkonkylästä haettiin keittäjä ja paistaja.

Kun Rietulassa kuultiin Mikkolan häävalmistuksista, päätteli isäntä,

että kahta komeammat hän laittaa Eedlan tupaan tuliaiset.

Kyläläiset seurasivat jännityksellä kumpaisenkin talon

häävalmistuksia. Suutari Horttanainen julisti itselleen ja akalleen
useita päiviä kestävän paaston saadakseen nauttia Rietulan
juhlaruuista perusteellisesti.

Kunhan vaan häät olisivat jo piankin joutuneet.