15.11.2017.

INTEGRIRANI PREDDIPLOMSKI I DIPLOMSKI STUDIJ

DENTALNE MEDICINE P21
STANIČNA
TEMELJNI GENETIČKI MEHANIZMI:
BIOLOGIJA
REPLIKACIJA DNA
S
GENETIKOM
voditelj:
prof.dr.sc. Alena
Buretić-Tomljanović

SEMIKONZERVATIVNA
(polusačuvana)
REPLIKACIJA DNA

stari DNA lanac

novi DNA lanac

DOKAZ SEMIKONZERVATIVNE
DNA REPLIKACIJE DNA replikacija je precizna

• Greške su vrlo rijetke zahvaljujući

posebnostima enzima DNA POLIMERAZE
(1 u 109 repliciranih dušičnih baza)
• U čovjeka to znači tri greške po
haploidnom genomu (3x109 baza)
• Replikacija DNA se događa tijekom S-faze
staničnog ciklusa

1
 15.11.2017.

IZVORIŠTA REPLIKACIJE MULTIPLA IZVORIŠTA REPLIKACIJE

D.melanogaster: 5000
stanice sisavaca: 20 000
• U stanicama sisavaca postoji
više tisuća izvorišta
replikacije – u bakterijskom
kromosomu samo jedno ORIGIN RECOGNITION COMPLEX
is a six-subunit protein complex at
• U izvorištu replikacije eukaryotic origins of replication.[4]
nastaju dvije replikacijske ORC binding to chromatin is
Replikacijski viljuške koje se pomiču u regulated through the cell cycle.[
mjehurić suprotnim smjerovima

• Redosljed replikacije
pojedinih dijelova
kromosoma je
visokokoordiniran
Usporeni lanac • brzina replikacije: E. coli 10 000 b/min
Vodeći lanac • eukariotska stanica: 500-5000 b/min

eukariotski kromosomi
MULTIPLA IZVORIŠTA REPLIKACIJE sadrže brojna izvorišta
cijeli genom se ne kopira istovremeno replikacije udaljena
približno 100,000 bp

HETEROKROMATIN
se kopira se u kasnoj S
potrebna za pravilnu
fazi segregaciju
kromosoma tijekom
stanične diobe
EUKROMATIN
se kopira u ranoj S fazi

sprečava pojavu “ljepljivih

krajeva” iI skraćivanje
kromosoma
• ORI mjesta se aktiviraju u skupinama (clusteri)
• tijekom S faze aktiviraju se nove skupine izvorišta
replikacije

OKAZAKIJEVI FRAGMENTI RNA sinteza novog

REPLIKACIJSKA VILJUŠKA (na usporenom lancu)
primer RNA primera

upravo kalup usporenog DNA polimeraza

sintetizirani lanca dodaje na novi RNA primer
DNA lanci Smjer kretanja
replikacijske
viljuške helikaza i
kalup usporenog kalup vodećeg
lanca lanca SSB proteini DNA polimeraza
dovršava DNA odsječak

Vodeći lanac Usporeni lanac

RNA primer se izrezuje i
sintetizira se sintetizira se
zamjenjuje s DNA
kontinuirano diskontinuirano

DNA ligaza ispuni “urez”

i poveže dva Okazakijeva
fragmenta

DNA replikacija 5’ 3’
nukleotidi se dodaju na nespareni 3’-OH kraj DNA
lanca

2
 15.11.2017.

U replikaciji DNA sudjeluje DNA helikaza DNA helikaza putuje duž jl DNA
i razdvaja lance u dl DNA
multienzimski kompleks koji sadrži
(hidrolizira ATP)
DNA POLIMERAZU

DNA primaza
DNA helikaza
SSB proteini (engl. single strand
binding proteins)
DNA topoizomeraza
DNA ligaza

DNA primaza
Inicijacija Sinteza DNA pol. nastavlja
DNA kalup sinteze RNA RNA klice dodavati nukleotide
Započinje polinukleotidni lanac
vežući dva ribonukleozid
trifosfata RNA

Sintetizira RNA primer ili klicu DNA

DNA primaza DNA polimeraza
(kratak polinukleotidni lanac) i
stvara spareni 3’-OH kraj za
U kojem smjeru radi DNA primaza? DNA polimerazu

5’ 3’

DNA primaza je vrsta RNA polimeraze

jedan kraj DNA lanca ne može

rotirati oko drugoga kraja

SSB proteini (engl. single strand binding proteins) DNA topoizomeraza

DNA topoizomeraza I
(Tyr u aktivnom mjestu)
brza rotacija
DNA heliksa

veže se kovalentno
i stvara “urez” u
fosfatno-šeć.okosnici

uslijedi rotacija jednog

DNA lanca oko drugoga

Proteini koji destabiliziraju heliks uklanja zavoje u DNA heliksu

3
 15.11.2017.

uslijedi rotacija jednog

DNA lanca oko drugoga DNA ligaza
DNA topoizomeraza Prekid između susjednih
Okazakijevih fragmenata
RNA klica

reakcija je reverzibilna
uslijed uspostave kovalentne brza rotacija
veze s enzimom DNA heliksa

polimeraza dodaje deoksiribonukleotide RNA klicu uklanja 5’ 3’ egzonukleaza

spontano nastaje nova

fosfodiesterska veza,
enzim se otpušta
Uspostavljanje fosfodiesterske veze
pomoću DNA ligaze

uklanja zavoje u DNA heliksu Uspostavlja fosfodiestersku vezu – troši ATP

DNA POLIMERAZA DNA POLIMERAZA

glavni enzim koji sintetizira DNA glavni enzim koji sintetizira DNA

Supstrati DNA polimeraze:

dATP Sintetizira u smjeru 5’ 3’
dCTP
dGTP Posjeduje važnu egzonukleaznu aktivnost u
dTTP smjeru 3’ 5’ – samokorigirajući enzim

Egzonukleazna aktivnost DNA Egzonukleazna aktivnost DNA

polimeraze polimeraze
ugradnja rijetkog
tautomernog oblika
u smjeru 3’ 5’ – u smjeru 3’ 5’ –
nukleotida samokorigirajući enzim sinteza se nastavlja
ugradnjom prave baze
samokorigirajući enzim

“povratak” ometa
normalno sparivanje s T

polimeraza izrezuje
krivi nukleotid
3’-5’ egzonukleaznom
aktivnošću

4
 15.11.2017.

Dvije DNA polimeraze rade u stanicama eukariota Multienzimski kompleks DNA polimeraze kreće se u
jednom smjeru
kalup vodećeg lanca
Kalup vodećeg lanca
novosintetizirani DNA lanac

DNA polimeraza DNA polimeraza DELTA

na vodećem lancu na vodećem lancu
Novosintetizirani DNA lanac roditeljski DNA heliks

Roditeljski DNA heliks

DNAprimaza
Novi Okazakijev fragment
započinje ovdje
SSB protein DNA helikaza
DNA helikaza
RNA klica kalup usporenog lanca
DNAprimaza
Okazakijev fragment RNA
klica
SSB protein DNA polimeraza ALFA
Okazakijev na usporenom lancu
novosintetizirani
Kalup usporenog lanca fragment (upravo završava
DNA lanac
Okazakijev fragment)
DNA polimeraza na usporenom lancu
(upravo završava Okazakijev fragment) smjer kretanja replikacijske
viljuške
Smjer kretanja multienzimskog kompleksa

Spekulativni model replikacije kromatina Replikacija telomera –

ima li E.coli prikazani problem? ima li E.coli prikazani problem?

enzim
TELOMERAZA
je
REVERZNA
https://www.youtube.com/watch?v=AJNoTmWsE0s
https://www.youtube.com/watch?v=PYQnbUwOwB0
TRANSKRIPTAZA
https://www.youtube.com/watch?v=MjfIWzufq_I

ORGANIZACIJA TELOMERA PREDLOŽENA STRUKTURA

TELOMERE
Što je telomera?
TELOMERU čine jednostavni ponavljani DNA sljedovi na
krajevima kromosoma

ULOGA: osigurati stabilnost i linearnost

kromosoma (neophodne su za replikaciju
linearnih DNA molekula)
Kvasci Electron Micrograph of a Mouse
Telomere
Saccharomyces cerevisiae G1 3T
Schizosaccharomyces pombe G2 -5TTAC
Praživotinje
Tetrahymena GGGGTT
Dictyostelium G1- 8A Ponovljeni sljedovi (102-103)u
Biljke telomerama
Arabidopsis AGGGTTT sadrže nakupine G ostataka u jednom
lancu
Sisavci
Čovjek AGGGTT