Univerzitet u Sarajevu

Prirodno-matematiki fakultet
Odsjek za biologiju

KINETIKA ENZIMSKIH REAKCIJA

-seminarski rad-

Student: Suid Alen

Nastavnik-nosilac modula: Prod.dr. Edhem Haskovid

Enzimska kinetika je podruje biohemije koje prouava brzine hemijskih

reakcija katalizovanih enzimima.
Enzimska kinetika ima kljunu ulogu u otkrivanju lijekova, u
komparativnoj farmakodinamici i kod naina odreivanja lijekova.
U reakcijama koje su katalizovane enzimima uestvuju isti reaktanti i
grade se isti produkti kao u reakcijama koje nisu katalizovane enzimima.
Da bi se neka reakcija odvijala, supstrat treba imati dovoljnu energiju,
odnosno treba da se aktivira do dovoljne energetske razine da bi mogao
predi energetsku barijeru potrebnu za stvaranje produkta. Energiju koja je
potrebna za odvijanje hemijske reakcije (energija aktivacije) oznaavamo
sa ENE.

Enzimski katalizirana
reakcija ima snienu
energiju aktivacije u
odnosu na neenzimatsku
reakciju jer se kompleks
enzim-supstrat nalazi
na vioj energetskoj
razini od slobodnog
supstrata.

Slika 1. Shematski prikaz promjena Gibbsove energije pri

hemijskoj reakciji AB (A= supstrat, ANE*= prijelazno stanje
iz supstrata u produkt (bez enzima), AE*= prijelazno stanje
iz supstrata u produkt (s enzimom), G= promjena
(oslobaanje) Gibbsove energije, EE= energija aktivacije s
enzimom, ENE= energija aktivacije bez enzima)

Brzina enzimske reakcije ovisi o uvjetima pod kojim se reakcija odvija. Faktori
koji utiu na brzinu enzimske reakcije su:
- temperatura
- pH
- koncentracija i ionska jakost pufera

- koncentracija supstrata
- prisutnost koenzima, aktivatora i inhibitora

Temperatura
Na vedinu hemijskih reakcija temperatura utie tako da njihova brzina raste s
povienjem, a opada sa snienjem temperature medijuma u kojoj se reakcija odvija.
Enzimi su kao i ostali proteini termolabilne supstance, te na viim temperaturama
dolazi do njihove denaturacije i postupne inhibicije enzima.
Denaturacija visokom temperaturom je najede ireverzibilna, jer su veze u
molekuli enzima (hidrofobne, vodikove, ionske) slabe te dolazi do otedenja
trodimenzionalne strukture enzimske molekule.
Temperatura optimalne aktivnosti enzima- temperatura na kojoj je enzimatska
aktivnost najveda, i ona se za vedinu enzima nalazi izmeu 30C i 40C.
Pri temperaturi nioj od optimalne enzim je stabilniji i due djeluje, ali je zato
katalizirana reakcija sporija.
Pri temperaturama viim od optimalne reakcija se bre odvija, ali se i enzim bre
inaktivie, pa krade djeluje.

Niske temperature
usporavaju enzimsku
aktivnost, tako da je ona na
oko 0C neznatna, a na jo
niim temperaturama
potpuno prestaje.
Smanjivanje aktivnosti
enzima na niim
temperaturama je
reverzibilno, tj nede se
smanjiti aktivnost enzima
kada se ponovno uspostavi
optimalna temperatura.
Iz ovog razloga niske
temperature (ispod 20C )
se koriste za uvanje enzima.

Razliiti enzimi kod razliitih

organizama funkcioniu u razliitim
uslovima

pH
Aktivnost enzima ovisi o
pH-sredine u kojoj se
reakcija odvija.
Za svaki enzim postoji
optimalan pH, tj.
koncentracija vodikovih
iona pri kojoj je brzina
enzimske aktivnosti
najveda.
Pomjeranjem pH na
kiselu ili baznu stranu od
optimalnog pH
smanjivade se enzimska
aktivnost.
Za najvedi broj enzima
optimalni pH je izmeu
5 i 8.

Koncentracija supstrata
Povedanjem koncentracije supstrata povedava se brzina
enzimske reakcije dok ne dostigne maksimalnu brzinu.

Saturaciona kriva pokazuje

zavisnost brzine reakcije od
koncentracije supstrata..

Michaelis-Menten model enzimski

kataliziranih reakcija

Prema Michaelis-Mentenovoj teoriji enzimska reakcija se

odvija tako da se prvo enzim vee sa supstratom, a zatim se
iz tog kompleksa stvara produkt reakcije uz ponovno
oslobaanje enzima:

E + S ES E + P

E+SES (k1)
E+SES (k-1)
ESE+P (k2)
ESE+P (k-2)

E- slobodan enzim
S- supstrat
ES- enzim-supstrat kompleks
P- produkt

Model vrijedi za jednosupstratnu reakciju (pri emu ES predstavlja sve oblike

kompleksa: od onog oblika u kojem je supstrat nepromijenjen, preko svih
meustanja, do enzim-produkt kompleksa (EP)) te pretpostavlja mjerenje
poetne brzine enzimske reakcije (v0) u uvjetima kada se povratna reakcija
moe zanemariti zbog toga to je *P+=0 i/ili to je k2>>k-2. U praksi, brzinu
reakcije mjerimo nakon to smo pomijeali enzim i supstrat te nakon to se
uspostavi ustaljeno stanje (stalna koncentracija ES kompleksa).

U uslovima kada se moe zanemariti povratna reakcija, poetna brzina

nastajanja produkta proporcionalna je koncentraciji ES kompleksa:

v0 = k2 [ES]
[ES]= [E0][S] / ((k-1+k2)/k1+[S])
[E0+= poetna (ukupna) koncentracija enzima

Najveda brzina reakcije bit de ostvarena kada sve molekule enzima budu u
obliku enzim-supstrat kompleksa. Tu brzinu definiemo kao maksimalnu brzinu
enzimski katalizirane reakcije, a odreujemo je kao:

Vm = k2 [E0]

Michaelisova konstanta (Km) numeriki izraava afinitet enzima prema

supstratu. Km se definira kao ona koncentracija supstrata kod koje je
brzina reakcije jednaka polovici maksimalne brzine, a ovisi o supstratu te o
uvjetima okoline kao to su pH i temperatura.
Km je karakteristian za svaki enzim i supstrat, i za razne enzime iznosi oko
10-2 do 10-6 mol/L3.
Eksperimentalno se odreuje mjerenjem poetne brzine reakcije (v0) kod
razliitih koncentracija supstrata, dok se raunski definira kao:
Km = (k-1+k2) / k1
Uvravanjem jednadbi za ES i Km u jednadbu za Vm dobit demo
Michaelis-Menten jednainu:
v0 = Vm[S] / (Km+[S])

Vm (maksimalna brzina
reakcije) i Km (Michaelisova
konstanta) dva su znaajna
kinetika parametra veoma
korisna za opisivanje svojstava
enzimski kataliziranih reakcija.
Pri visokim koncentracijama
supstrata v0 postaje gotovo
jednaka Vm te je pri tim
uvjetima brzina reakcije
konstantna i neovisna o S.
Dva kinetika parametra (Vm i
Km) definiraju oblik krivulje.
Promatrajudi sliku, moe se
uoiti da je v0=Vm/2 kada je
[S]=Km.
Michaelis-Mentenova krivulja

Linearni oblici Michaelis-Menten-ove jednaine

Svrha kinetikog mjerenja jest odreivanje Km i Vm.
Michaelis-Menten krivulja nije najprecizniji nain za izraunavanje tih
konstanti, stoga su za tu svrhu osmiljeni puno prikladniji linearni oblici
dobiveni transformacijama Michaelis-Menten jednadbe:
Lineweaver-Burk prikaz :
Ovaj prikaz predstavlja reciproni oblik Michaelis-Menten jednaine i
glasi:
1/v0 = Km /V[S] + 1/Vm
Eadie-Hofstee prikaz :
Eadie-Hofstee jednadba izvedena je mnoenjem Lineweaver-Burk
jednaine s v0Vm i glasi:
v0 = -Kmv0/[S] + Vm

Hanes-Woolf prikaz :
Mnoenjem Lineweaver-Burk jednaine sa *S+, dobijemo Hanes-Woolf
jednainu:
[S]/v0 = Km/Vm + [S]Vm

Grafiko odreivanje Km i Vm u tri linearna prikaza:

A) Lineweaver-Burk, B) Eadie-Hofstee i C) Hanes-Woolf

Vrlo je korisno najnovije eksperimentalno odreivanje Km i Vm Eisenthal

Cornish-Bowden metodom, gdje je:
Vm = v0 + Kmv0/[S]

Grafiko odreivanje Vm i Km metodom Eisenthal Cornish-Bowden.

Za svako mjerenje nanose se vrijednosti [S] na os Km i vrijednosti v
na os Vm te se kroz svaki par taaka provue pravac. Km i Vm su
koordinate sjecita pravaca.

Inhibicija enzima
Inhibicija enzima moe biti reverzibilna i ireverzibilna.

Ireverzibilnu inhibiciju ili trovanje enzima izazivaju mnogi teki metali, neki kationi
i anioni.
Karakteristino za ireverzibilnu inhibiciju jest kompletan gubitak enzimske aktivnosti
nakon nekog vremena, osim ako je inhibitor bio prisutan u manjoj koncentraciji
nego enzim.
Enzimska aktivnost koja je inhibirana ireverzibilnim inhibitorom se ne moe
povratiti nikakvom fizikalnom metodom, ali ju je mogude povratiti odreenim
kemijskim metodama
.

Reverzibilna inhibicija je posljedica djelovanja inhibitora na kinetiku reakcije

izmeu enzima i supstrata i ona moe biti:

- kompetitivna
- nekompetitivna
- akompetitivna

Kompeticijski inhibitor je po svojoj strukturi slian supstratu. Vee se na aktivno

mjesto enzima te tako konkurira supstratu pri vezivanju na slobodni enzim - zbog
toga poveava prividnu vrijednost Km. Djelovanje kompeticijskog moe se prikazati
jednainama:
Kmi = Km (1 + [I]/Ki)
Vmi = Vm

Nekompeticijski inhibitor vee se na enzim na mjestu razliitom od aktivnog

mjesta, mijenjajudi time njegovu strukturu. Osim to se moe vezati na enzim,
vee sa i na ES kompleks, ime smanjuje prividnu vrijednost Vm. Djelovanje
nekompeticijskog inhibitora prikazuju jednaine:
Kmi = Km

Vmi = Vm / (1 + [I]/Ki)

Akompeticijski inhibitor se ne vee na slobodni enzim, nego na neki drugi oblik

(npr. ES kompleks) te zbog toga smanjuje prividnu vrijednost i Km i Vm.
Djelovanje akompeticijskog inhibitora prikazuju jednaine:

Kmi = Km (1 + [I]/Ki)

Vmi = Vm / (1 + [I]/Ki)

Tipove inhibicije moemo

jednostavno razlikovati
mjerenjem ovisnosti v0 o S
prikazom u LineweaverBurk dijagramu, uz uvjet
da su sva mjerenja
izvrena pri konstantnoj
koncentraciji inhibitora.

Grafiko odreivanje
tipova reverzibilne
inhibicije u LineweaverBurk dijagramu. Takastom
linijom prikazan je pravac
koji odgovara reakciji u
prisutnosti: A)
nekompetitivnog, B)
kompetitivnog i C)
akompetitivnog inhibitora.

Aktivacija
Da bi neki enzim oitovao svoju
punu aktivnost, esto je
potrebno da se aktivira.

Najedi aktivatori su razni ioni.

Npr. amilazi je potreban aktivator

Cl-1, arginazi Co+2 itd.

U sluaju enzima koji sadre SH-grupe kao

aktivatori slue sulfhidrilni spojevi, koji tite
SH-grupe enzima od oksidacije.

Takav je primjer enzim kreatinkinaza, koja za svoje optimalno

djelovanje treba glutation ili Nacetilcistein.

Polisupstratne enzimske reakcije

Michaelis-Mentenova jednaina je osnovna kinetika jednaina za
monosupstratne enzimske reakcije.
Meutim, ima enzimskih reakcija u kojima enzim reagira sa dva ili tri supstrata i
u kojima nastaju dva ili vie produkata reakcije.
Mehanizam takvih reakcija je sloeniji, ali ako varira koncentracija jednog
supstrata, koncentracije drugih su konstantne, onda za varirani supstrat takoer
vrijedi Michaelis-Mentenov izraz:

Za enzime koji reaguju sa dva supstrata postoje 2 mehanizma:

Ping-pong
mehanizam

Mehanizam
ternarnog
kompleksa

Kod ternarnog kompleksa, oba supstrata se

istovremeno vezuju za enzim stvarajudi EAB-kompleks.
Vezivanje supstrata za enzim moe biti nasumino ili se
supstrati veu odreenim rasporedom.
Enzimi koji djeluju po ovom mehanizmu su glutation Stransferaze, dehidrofolat-reduktaze i DNK-polimeraze.

Kod ping-pong mehanizma enzim reagira naizmjenino

sa supstratima prelazedu u dva enzimska oblika (E i E*)
kao to ping-pong loptica prelazi as na jednu as na
drugu stranu:

Literatura

Diklid V., Kosanovid M. & Nikoli J., (1997). Biologija sa humanom

genetikom, Medicinska knjiga, Beograd.
Miholjid M. Et al., (1988). Biohemija, Svjetlost, Sarajevo.
traus B., (1992). Medicinska biohemija, Medicinska naklada, Zagreb.