Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa

protein BclA của vỏ bào tử vi khuẩn

Bacillus anthracis

BỘ MÔN: KỸ THUẬT GEN

GVHD: PSG.TS TRẦN LIÊN HÀ
Thành viên nhóm
• Nguyễn Thu Ngân 20162893
• Đào Thanh Mai 20162621
• Phan Thị Khánh Linh 20162471
NỘI DUNG

Tại sao phải sản xuất protein BclA?

Quá trình tách dòng gen mã hóa BclA

Biểu hiện gen mã hóa đoạn CTD của protein BclA

Tại sao phải sản xuất protein
BclA?
Tại sao phải sản xuất protein BclA

• Bệnh Than là một bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng do vi khuẩn gọi
là Bacillus anthracis gây ra
Trong những cuộc chiến nó được coi là vũ khí sinh học nhằm sát hại
đến chính con người với một cách lây lan hàng loạt và có khả năng
tử vong cao nếu không được phát hiện nhanh.
Vào tháng 9 và tháng 10,năm
2001, nhóm khủng bố Al Qaeda
một loạt bức thư chứa bào tử vi
khuẩn bệnh than gửi tới bưu
điện,cơ quan công quyền và văn
phòng truyền thông , khiến 5
người thiệt mạng và gây hoang
mang trong dư luận.
• Vi khuẩn B.anthracis được Robert Koch phân lập từ năm
1877
vi khuẩn than hình thẳng, hai đầu vuông, có kích thước từ
11,5 310m, thường xếp thành từng chuỗi giống như
cây tre, bắt màu Gram (+)
Có khả năng tồn tại trong tự nhiên dưới dạng bào tử trong
thời gian hơn 10 năm, có khả năng chịu nhiệt lên đến
160⁰C trong 5 phút và 100⁰C trong 10 phút.
Bào tử của B. anthracis bao gồm các lớp chính sau: lõi (spore core), vỏ
lõi (cortex), vỏ bào tử (exosporium)
Lớp vỏ bên ngoài lõi là peptidoglucan dày trong đó gồm nhiều loại
protein khác nhau, thường chứa protein lắp ráp và các yếu tố quy
định hình thái
Lớp áo bào tử chứa protein BclA
Phương pháp phát hiện
B.anthracis được xác định chủ yếu dựa vào đặc điểm sinh học và
hình thái học.
Sau đó,phương pháp PCR phát hiện nhanh hơn , có tính chọn lọc và
mức độ chính xác cao.
Bộ sinh phẩm thử nhanh được chế tạo cho phép xác định trực tiếp
bào tử thông qua protein trên vỏ của chúng.
Trong protein BclA có 1 vùng có tên CTD:có cấu trúc bậc 3 ổn định,
nằm thò ra ngoài bề mặt bào tử B.anthracis, đây là lợi thế để phát
hiện nhanh bào tử mà không cần tách chiết và phá vỡ bào tử.
Quá trình
tách dòng và
biểu hiện gen
mã hóa protien BclA
Nghiên cứu tách dòng gen mã
hóa protein BclA
CÁC B Ư ỚC CỤ THỂ
1
2
3
4
5
Tách chiết DNA genome của vk Bacillus anthracis
• Nuôi cấy vk qua đêm ở nhiệt độ 37°C
• Phá vỡ màng tế bào bằng lysozyme
• Thêm EDTA để ức chế proteinase và nuclease, proteinase K thủy phân màng và
protein nội bào
• Thêm phenol/choloroform/isoamylalcohol loại bỏ mảnh vỡ tb và protein biến tính
(kết tủa)
• Ly tâm thu DNA
• Làm sạch và kiểm tra bằng điện di agarose (điện di thấy có một băng DNA của vk
đậm nét có kích thước lớn, không có vệt sáng phía dưới => không có DNA, RNA đứt
gãy)
Phản ứng PCR - Cặp mồi được lựa chọn
Chuẩn bị vector biểu
hiện pET32a
• Cho phép cài đoạn DNA cần
thiết
• có khả năng tái bản không
phụ thuộc vào sự phân chia
của tế bào
• tồn tại trong tế bào vật chủ
qua nhiều thế hệ không gây
biên đổi bộ gen của tế bào
vật chủ
Ghép nối gen

• Vector pET32a(+) và sản phẩm PCR sau điện di được ủ với enzyme
cắt hạn chế Nco I, Xho I, nước ion vô trùng và đệm ở 37°C
• Sản phẩm thu nhận được từ gel agarose đã làm sạch sẽ được trộn
với đệm, nước vô trùng ủ ở 16°C để T4 – ligase gắn các điểm nối
trên sợi DNA
Biến nạp vào vi khuẩn
Kiểm tra biến nạp
Kiểm tra ghép nối gen
• Lấy ngẫu nhiên khuẩn lạc trên đĩa có ampicillin, cấy chuyển vào môi
trường LB lỏng + amp, nuôi qua đêm và tiến hành tách plasmid
• Điện di kiểm tra trên gel agarose thu được 2 băng DNA (vòng và
xoắn), nếu bằng hoặc cao hơn so với mẫu đối chứng thì chứng tỏ có
đoạn DNA ngoại lai chèn vào vector
• Ủ plasmid tách được với enzyme BamH I ở 37°C thu sản phẩm rồi
điện di gel agarose. Nếu kết quả thu được một vạch bằng và 1 vạch
cao hơn mẫu đối chúng thì mẫu khuẩn lạc đó có gen ngoại lai
• Giải trình tự gen để chắc chắn gen mã hóa vùng CTD của protein
BclA được chèn vào đúng trình tự
Biểu hiện gen mã hóa đoạn CTD
của protein BclA
CÁC B Ư ỚC CỤ THỂ
 Vector biểu hiện pET32a(+)

• Vị trí khởi đầu sao chép

ori
• Vị trí đánh dấu
• Vị trí chèn gen lạ
• Vùng RBS
• Vùng điều hòa
E. Coli
Ưu điểm: dễ nuôi cấy, phân chia tế bào nhanh và chấp nhận nhiều
loại vector
Nhược điểm:
• Khó biểu hiện protein > 50 kD, giàu cysteine, có nhiều S-S hay
protein biến đổi cấu trúc sau dịch mã vd: quá trình glycosyl hóa,…
• Tiết và tạo protein ngoại bào tương đối thấp.
• Một số gây bệnh, tạo độc tố khi biểu hiện gen của sinh vật bậc cao.
• Protease nội bào phân hủy protein ngoại lai.
Xử lí E. Coli

Khả năng gây bệnh : biến đổi di truyền.

Protease phân hủy protein ngoại lai.

• Cho protein ngoại lai tiết ra ngoài bằng cách dùng đoàn tín hiệu
tiết=> không phải lúc nào cũng làm được.

• Tạo chủng biểu hiện mang gen đột biến mã hóa các protease.
Chủng biểu hiện E.coli BL21

• Là một chủng đột biến gen mã hóa cho ion protease (một protein
nội bào) và ompT protease (một protease định khu ở màng ngoài)
=>không còn khả năng thủy phân protein.

• DNA genome chứa gen mã hóa T7-RNA polymerase-gen có nguồn

gốc từ bacteriophage T7 dưới sự điều khiển của promotor lac.
Tiến hành biểu hiện gen

1. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli BL21 bằng phương pháp sốc
nhiệt ( tương tự như tách dòng gen).

2. Nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có Ampicillin ở 37°C=> tăng

sinh khối vi khuẩn, chọn lọc E.coli chứa plasmid.

3. Bổ sung IPTG, tiếp tục nuôi cấy ở điều kiện 25°C . Sau đó ly tâm
thu lấy tế bào.
Bố trí Tiêu đề và Nội dung với Biểu đồ
Chuỗi 1 Chuỗi 2 Chuỗi 3
6

0
Danh mục 1 Danh mục 2 Danh mục 3 Danh mục 4
4. Kiểm tra việc biểu hiện: Ly tâm dịch thu được, thêm nước khử ion
vô trùng và đệm phá mẫu protein. Xử lý mẫu ở 100°C. Điện di trên
gel polyacrylamide.
5. Kiểm tra dạng protein: dịch thu được để ở -72°C, sau đó sốc nhiệt
ở 65°C trong vài phút, ly tâm thu dịch và cặn tế bào cho riêng rẽ
vào các ống đã có nước khử ion vô trùng và đệm phá mẫu protein,
xử lý ở 100°C rồi đem điện di trên gel polyacrylamide.
6. Tinh sạch protein tái tổ hợp theo phương pháp sắc ký ái lực bằng
cột HisTrap. Kiểm tra sản phẩm tinh sạch bằng điện di.
7. Định lượng protein tái tổ hợp bằng phương pháp Bradford.
Phương pháp sắc ký ái lực
 1. Các ion liên kết với các hạt
Sepharose để nhồi vào cột.
2. Protein tái tổ hợp liên kết đặc
hiệu với còn các phần tử
khác được rửa trôi theo dịch
đệm.
3. Rửa protein tái tổ hợp tách ra
khỏi cột nhờ dung dịch đệm
có pH thích hợp.
Lợi ích của His-tag.
•  giúp dễ dàng tinh sạch.
• Vì kích thước nhỏ, trình tự axit amin này không gây đáp úng miễn
dịch khi đưa protein tái tổ hợp vào cơ thể=> không cần loại đuôi
His-tag sau tinh sạch.
• Tương tác giữa đuôi His-tag với không phụ thuộc cấu trúc bậc bốn
của protein=> quá trình tinh sạch dễ dàng hơn ngay cả khi protein bị
biến tính.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. German L.Rosano(4/2014), Eduardo A Ceccarelli; “Recombinant
protein expression in Escherichia coli: advances and challenges”;
Frontiers in microbiology.
2. Khuất Hữu Thanh,(2006),” Kỹ thuật gen –Nguyên lý và ứng
dụng”,Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội.
3. Phùng Huyền Nhung(2012), Nghiên cứu tách dòng và biểu hiện
gen mã hóa protein BclA của vỏ bào tử vi khuẩn Bacillus
anthracis.Luận văn thạc sỹ khoa học chuyên ngành công nghệ sinh
học.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
4. Nguyễn Thu Hiền1 , Hoàng Thị Thu Hiền1 , Khuất Hữu Thanh2 ,
Nguyễn Huy Hoàng1* 1Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm KH
& CN Việt Nam,(2013),Chọn dòng và biểu hiện gen keratinase
trong Escheriochia coli BL21(DH3) từ vi khuẩn Bacillus , Tạp chí
sinh học 2013.