UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN ANTONIO ABAD DEL CUSCO

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA IN VITRO Y CITOTOXICIDAD DE LOS

EXTRACTOS ACUOSO Y ETANÓLICO AL 70% DE LAS HOJAS DE Heliotropium arborescens L.
“Hierba del alacrán”.
TESIS PARA OPTAR AL TÍTULO
PROFESIONAL DE QUÍMICO
FARMACÉUTICO.
PRESENTADO POR:
Br. Yordano Salcedo Quispe
ASESORA:
Mgt. Ingrid Vera Ferchau
CO ASESORES:
Dra. María del Carmen Valdez Ortiz
Blgo. Leoncio C. Mariño Herrera
CUSCO-PERU
2017
 INTRODUCCIÓN

Productos
naturales

30%

• Fármacos

• Extractos de
plantas
 Familia Boraginaceae

-Terpenos 130
-Alcaloides pirrolizados Géneros
-Flavonoides Especies
-Naftoquinonas 2600
-Alcaloides pirrolizados
-Flavonoides
250 -Derivados aromáticos
del geranilo
Heliotropium
-Diarreas
-Infecciones H. arborescens
-Parásitos intestinales
-Paludismo
-Úlcera gangrenosas
-Tumores
-Cáncer
 Enfermedades infecciosas

Resistencia bacteriana Cusco

• Movimiento de pacientes 4ta 90% 80%

dentro y entre Instituciones Enfermedades Neumonía Enfermedades
• Apropiación de prescripción de la piel y del del sistema
• Automedicación
tejido genitourinario
• Las medidas excesivas de
control de las infecciones
subcutáneo mayo a julio

-Sequedad -Edad avanzada -Condiciones de

de la piel -Enfermedades pobreza
-Falta de respiratorias -Prácticas de
higiene crónicas hábitos y estilos
-Onfalitis -Diabetes de vida no
-Humedad -Alcoholismo saludable
Meyer et. al 1982 Artemia salina L.

Tóxinas fúngicas
Metales pesados
Toxinas de cianobacterias
Plaguicidas
Micotoxinas
Contaminantes en agua
Toxinas de dinoflagelados
Toxicidad de extractos vegetales
 CAPÍTULO I
GENERALIDADES
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Plantas
Resistencia
bacteriana

Organismos
problema Compañías Metabolitos
Aumento Precaución
Farmacéuticas secundarios

Factores

Heliotropium

• Dosis utilizadas
• Tiempo de tratamiento
• Eliminación de la droga
• Altas posibilidades de
transmisión o contagio
• Estado inmunodeprimido que Agentes antibacterianos naturales
los hace susceptibles a
infecciones
1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

1.3. OBJETIVOS
1.3.1 Objetivo general
Evaluar la actividad antibacteriana in vitro y la citotoxicidad de los extractos
acuoso y etanólico al 70% de las hojas de Heliotropium arborescens L. “Hierba
del alacrán”.

1.3.2 Objetivos específicos

1 Realizar las pruebas preliminares

2 Evaluar la sensibilidad de las bacterias aisladas

3 Determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI)

4 Determinar la concentración mínima bactericida (CMB)

5 Determinar el tipo de extracto, acuoso o etanólico al 70%

6 Determinar la concentración letal media (CL50)

 JUSTIFICACIÓN

De conocimiento De prioridad De aplicabilidad

Reconoce su importancia en los
sistemas de salud en muchos
países en vías de desarrollo,
instando a los estados y
miembros a hacer estudios de
las plantas medicinales
utilizadas por los curanderos
tradicionales y la población
para determinar aquellos que
tengan un efecto satisfactorio,
de manera de incluirlas en la
Farmacopea Nacional
1.5 HIPÓTESIS
Frente a la velocidad con que las
bacterias logran desarrollar la
resistencia a los fármacos
tradicionales, la producción de
nuevas moléculas es lenta y ha
disminuido notoriamente en los
últimos años, por lo que
acontecen casos contra los que no
existe tratamiento eficaz
La presente investigación
busca aportar al conocimiento
científico sobre la existencia de
plantas medicinales con
propiedades antibacterianas
como la especie Helioptropium
arborescens L., la cual podría
ser alternativa de prevención y
tratamiento de las patologías
causadas por S. aureus, S.
pneumoniae, E. coli, K.
pneumoniae, P. mirabilis y P.
aeruginosa.

Los extractos acuoso y etanólico al 70 % de las hojas de Heliotropium arborescens L. poseen

actividad antibacteriana contra bacterias aisladas Gram positivas y Gram negativas y no
presentan citotoxicidad sobre Artemia salina.
 CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO Y CONCEPTUAL
2.1 ANTECEDENTES

Leos C. Estudio de la actividad biológica de los extractos de tres plantas de

la familia Boraginaceae [Tesis Doctoral]. Universidad Autónoma de Nuevo
León; 2010.

Objetivo
Método y Resultados
Estudiar la actividad
biológica de los
El diseño fue experimental, la actividad Conclusión
extractos de tres
antimicrobiana se determinó por el método de
plantas de la familia
difusión en placa y el ensayo de toxicidad
Boraginaceae.
mediante el ensayo de letalidad sobre Artemia Los extractos no mostraron
salina. Los resultados obtenidos fueron que actividad bactericida ni son toxicos
los tres extractos no mostraron actividad sobre Artemia salina.
bactericida contra los microorganismos
evaluados, asimismo no mostraron toxicidad
mediante el ensayo de letalidad sobre Artemia
salina..
 Azuero A. Análisis del efecto antimicrobiano de doce plantas medicinales de uso
ancestral en el Ecuador [Tesis]. El oro: Universidad Técnica de Machala; 2015
Objetivo

Analizar el
Método y Resultados
efecto
antimicrobiano
de doce plantas El diseño fue experimental, para el ensayo de la actividad
medicinales de Conclusión
antibacteriana se utilizó el medio de cultivo Muller Hinton y las cepas
uso ancestral en de Escherichia coli, Pseudomona aeruginosa y Staphylococcus
el Ecuador aureus realizándose dos pocillos mediante los cuales se formaron sus Se concluye que estas
respectivos halos de inhibición, un pocillo se usó para colocar el plantas constituyen
medicamento que sirvió para combatir las bacterias, en este caso una fuente promisoria
ciprofloxacina, y en otro pocillo el extracto metanólico de la planta. de compuestos
Los resultados obtenidos para el efecto antibacteriano de las doce antimicrobianos de
plantas medicinales contra la cepa Escherichia coli determino que gran valor
todas presentaron efecto con valores que van desde 6.9 mm hasta farmacológico.
10.2 mm. El efecto antibacteriano de las doce plantas medicinales
contra la cepa Pseudomona aeruginosa determino que todas estas
plantas presentaron efecto antibacteriano cuyos valores que se
presentaron van desde 6.3 mm hasta 8.1 mm. El efecto
antibacteriano de las doce plantas medicinales en contra de la cepa
Staphylococus aureus determino que diez plantas mostraron su
efecto a excepción del Cedròn (Aloysia citriodora) y Guaviduca (Piper
carpunya) quien sus efectos fueron nulos, los valores de las diez
plantas fueron desde 6.2 mm hasta 8.4 mm.
 Peña N. Química y farmacología de Cordia collococca (Boraginaceae) [Tesis].
Maracaibo: Universidad del Zulia; 2007

Objetivo
Método y Resultados
Determinar la
química y Conclusión
El diseño fue experimental, la actividad antibacteriana se evaluó mediante
farmacología de
ensayos de inhibición de crecimiento in vitro, según una modificación de la
Cordia collococca
técnica de Kirby-Bauer. La toxicidad sobre Artemia salina se determinó Los extractos acuoso e
(Boraginaceae)
mediante la técnica descrita por Meyer y Col. Los resultados obtenidos para isopropanólico
los extractos acuoso e isopropanólico no son tóxicos sobre Artemia salina a presentan actividad
concentraciones por debajo de 1000 ppm. Se realizó un estudio de antibacteriana y no son
susceptibilidad antimicrobiana resultando activo el extracto acuoso sobre 7 tóxicos sobre Artemia
cepas de las 13 cepas bacterianas utilizadas, mientras que el hidroalcohólico salina.
mostró efecto sobre tres cepas.
 Pérez L. Aislamiento y caracterización de compuestos de plantas del Noreste de
México con actividad contra cepas de Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus
aureus y Haemophilus influenzae. [Tesis Doctoral]. Universidad Autónoma de Nuevo
Leon: 2015

Objetivo

Método y Resultados
Aislar y caracterizar
los compuestos de El diseño fue experimental, para determinar la actividad
plantas del Noreste de Conclusión
antibacteriana se realizó por el método de microdilución
México con actividad en caldo, se probó la actividad antibacteriana de 68
contra cepas de extractos (la mayoría metanólicos), contra Staphylococcus
Streptococcus Los extractos metanólicos
aureus y Haemophilus influenzae (una cepa resistente y
pneumoniae, presentan actividad
una sensible a antimicrobianos β-lactámicos de cada
Staphylococcus aureus antibacteriana, además el
microorganismo) y contra dos cepas resistentes de
y Haemophilus fraccionamiento biodirigido
Streptococcus pneumoniae. Los resultados obtenidos de
influenzae. de extractos de hojas de
los extractos de las plantas de Cordia boissieri, Shinnus
Cordia boissieri permitió
molle, Ceanothus coeruleus, Chrysactinia mexicana y
identificar varias fracciones
Cyperus alternifolius resultaron con actividad notable
activas y el aislamiento de
contra algunos de los microorganimos. El fraccionamiento
compuesto puro.
biodirigido Cordia bosissieri monitoreada por la técnica
de bioautografa permitió aislar un compuesto puro y dos
fracciones activas contra las cepas de Staphylococcus
aureus y Streptococcus pneumoniae.
 Velazquez C. Estudio fitoquímico y actividad antimicrobiana de Tiquilia canescens
[Tesis]. Universidad Autónoma de Nuevo León: 1997.

Objetivo

Estudiar la Método y Resultados

fitoquímica y
la actividad
El diseño fue experimental, las pruebas de actividad antimicrobiana se
antimicrobian Conclusión
realizaron in vitro por el método de difusión en placa determinándose
a de Tiquilia
canescens. actividad antimicrobiana de los extractos hexano, cloroformo y metanol
en los siguientes microorganismos: Salmonella typhi, Shigella disenteriae,
De los 3 extractos de la
Escherichia coli, Vibrio cholerae, Yersinia enterocolítica, Bacillus cereus,
parte aérea de Tiquilia
Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes, activándose en caldo
canescens, sólo el
BHI por 22 horas a 37° C). Los resultados obtenidos fueron que para el
hexánico demostró
extracto hexánico con un concentración de 6mg/mL los microorganismos
tener efecto inhibitorio
fueron inhibidos, siendo los más susceptibles S. aureus, Y. enterocolítica,
sobre todas las
Vibrio cholerae y Shiguella boydii, mientras que con los extractos
especies bacterianas a
cloroformico y metanólico los microorganismos no fueron inhibidos. En el
una concentración de 6
extracto clorofórmico se detectó presencia de alcaloides por reacciones
mg/mL
químicas (Dragendorff), mientras que en el extracto metanólico se
determinó la presencia de quinonas (Borntrager).
2.2 BASES TEÓRICO CIENTÍFICAS
2.2.1 Heliotropium arborescens L.

Nombres comunes Hierba del alacrán, heliotropo, docto, vainilla de jardín,

agerú, chakchacuay, cheki chikay
Descripción taxonómica
A
División : Magnoliophyta
Clase : Equisetopsida
Subclase : Magnoliida
Orden : Boraginales
Familia : Boraginaceae
Género : Heliotropium
Especie : Heliotropium arborescens L.

Descripción botánica
B C
Distribución geográfica

Especie endémica de Centro américa y Sudamérica. Se encuentra

distribuida en Colombia, Ecuador, Perú y Bolivia. En nuestro país
está en la zona andina desde los 2000 hasta los 3000 msnm

Usos tradicionales

Infusión, sirve para bajar la fiebre y para tratar el desplazamiento

del útero. Además se usa en la cistitis, arterioesclerosis y como
cicatrizante y antiséptico en úlceras varicosas
2.2.2 Descripción de las bacterias en estudio -Causa enfermedad tanto por la
producción de toxinas como por la
inducción de la inflamación piogénica
-evadir la fagocitosis, producir
Descripción y proteínas de superficie que median en
características la adherencia de las bacterias a los
generales. tejidos del hospedador y producir
destrucción tisular por medio de la
elaboración de toxinas específicas y
enzimas hidrolíticas.

Staphylococc Patogenia e
Resistencia
us aureus inmunidad

-Producción de lactamasa β
-Alteraciones en el blanco
Betalactámico -Flora normal humana
-El mecanismo de resistencia a la -la nariz y a veces, en la piel
vancomicina se considera si la MIC -15 %
es 16 μg/ml, se relaciona con un
Epidemiología
-5%
incremento en la síntesis de pared
celular y alteraciones de la misma
 -Polisacárido capsular y el anticuerpo
anticapsular
-El ácido lipoteicoico, la neumolisina,
Descripción y la hemolisina
características -Anticuerpo dirigido contra el tipo
generales. capsular del neumococo específico
anticuerpo se enlaza con la superficie
capsular, los mecanismos de la vía
clásica depositan C3b, lo cual permite
la fagocitosis

Resistencia
Streptococcus Patogenia e
pneumoniae inmunidad

-5 a 40 %
-Alteración de las PBPs -5 millones de niños
afectando la afinidad por los -otitis media enfermedad
antibióticos β lactámicos casi universal de la infancia
-Pero son más comunes en
Epidemiología
los niños pequeños (menos
de 2 años) y en ancianos
(mayores de 60 años)
 Descripción y
características
generales. adhesinas y exotoxinas.
Pili P; fimbrias Dr

Resistencia
Escherichia Patogenia e

coli
inmunidad

-Inactivación enzimática,
-Alteraciones en el sitio
-Aíslan de pacientes con
blanco y
sepsis.
-Alteraciones de la Epidemiología
-Gastroenteritis
permeabilidad
-Responsables de más
del 80 % de las ITU
 Descripción y
características
generales.

-Cápsula antifagocítica
-Pilosidades

Resistencia
Klebsiella Patogenia e

pneumoniae inmunidad

De todas las enterobacterias,

Klebsiella se encuentra entre
las más resistentes a los
antimicrobianos
-10 % de los individuos sanos
-factores condicionantes como
Epidemiología edad avanzada, enfermedades
respiratorias crónicas, diabetes, o
alcoholismo
 -Enzima ureasa
-Ureasa hidroliza la urea de la
Descripción y orina para formar amoníaco, que
características aumenta el pH y ayuda a la
generales. formación de piedras (cálculos)
de estruvita que están
compuestos de fosfato amoniaco
magnésico

Resistencia
Proteus Patogenia e
mirabilis inmunidad

-Aguas residuales, en el suelo,

-Otras bacterias del género
Proteus por lo común son
resistentes a la ampicilina y
cefalosporinas
en la materia orgánica y como
comensal en la flora intestinal
-Miembro más frecuente de
Epidemiología este género infección del tracto
urinario como cistitis y
pielonefritis
 Descripción y -La bacteria se adhiere a las
características mucosas o la piel y las coloniza,
generales. produce invasión local y enfermedad
sistémica, procesos favorecidos
Adhesinas toxinas y enzimas

Pseudomona Patogenia e
Resistencia
aeruginosa inmunidad

-Se encuentra en la piel y en las áreas

-Resistencia intrínseca a
húmedas, y puede colonizar el sistema
muchos antibióticos
respiratorio superior de los pacientes
-La mutación de las proteínas
hospitalizados
porinas constituye el principal
-Causa entre el 10-20 % de las
mecanismo de resistencia
Epidemiología infecciones nosocomiales y en muchos
asimismo, sintetiza diferentes
hospitales, es la causa más común de
β-lactamasas que pueden
neumonía nosocomial
inactivar numerosos
-Una vez que se ha establecido, es
antibióticos β-lactámicos
prácticamente imposible de erradicar
2.2.3 Actividad antibacteriana

“Es la capacidad que posee un fármaco o compuesto natural de inhibir el

crecimiento de microorganismos”. Generalmente los compuestos que poseen
dicha actividad vienen a tener un gran interés a nivel mundial, ya que con ellos
se puede controlar y hasta eliminar las infecciones provocadas por los
microorganismos

2.2.3.1 Determinación de la actividad antibacteriana in vitro

El antibiograma es una técnica que permite estudiar in vitro la actividad de un

determinado microorganismo frente a uno o varios antibióticos, traduciendo,
en una primera aproximación, su resultado como factor predictivo de la eficacia
clínica.
La sensibilidad de un microorganismo a un antibiótico se puede determinar de
un modo cualitativo, indicando la categoría de susceptibilidad (sensible,
intermedio o resistente); o de un modo cuantitativo, determinando el valor de
la concentración mínima inhibitoria (CMI) y la concentración mínima bactericida
(CMB).
2.2.4 Citotoxicidad

Es la capacidad que tiene ciertas sustancias de destruir o lesionar las células

tisulares. Todas las sustancias con efectos tóxicos, por variados que éstas sean,
son compuestos químicos complejos que provocan enfermedades, o en muchos
casos muy graves, ocasionan la muerte según la dosis ingerida. (40)
Entre las sustancias tóxicas que contienen muchas plantas se encuentran
alcaloides, glicósidos cardiotónicos, saponinas y terpenos

Ensayo de citotoxicidad general en Artemia Salina

Uno de los biomodelos más utilizados en las etapas preliminares de la

investigación fitoquímica, es el bioensayo de letalidad frente a Artemia salina,
desarrollada en 1982 por Meyer y Col. (42)

El procedimiento consiste en exponer a nauplios (larvas) de A. salina a

compuestos activos y/o extractos de plantas, para determinar valores de
concentración letal media (CL50). Sin embargo, los valores obtenidos de CL50, no
advierten una actividad fisiológica o biológica en particular, son los indicadores
de toxicidad a nivel celular los que pueden orientar investigaciones más
específicas
 CAPÍTULO III
MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 MATERIALES
Material biológico
A B C

Equipos
Materiales de laboratorio
A B

C D
Medios de cultivo.
A B

Solventes y reactivos.

A B

Ámbito de estudio
3.2 METODOLOGÍA
3.2.1 Tipo de investigación Se determinó la relación causa-efecto,
considerando como causa el tipo de
extracto y como efecto la
concentración mínima inhibitoria
Cuasi- (CMI), concentración mínima
bactericida (CMB) y la sensibilidad así
experimental como la concentración letal media
(CL50).

Describe la relación entre dos o

Transversal más variables.
.

Se realizó con los datos obtenidos

Prospectivo en un momento puntual en el
futuro.
3.2.2 Diseño de la investigación

Determinación de la sensibilidad bacteriana

Diseño con postprueba únicamente y grupo control.
G1 X1 O1
G2 X2 O2
: : :
G k X k Ok
Gk+1 Xk+1 Ok+1
Gk+2 Xk+2 Ok+2

Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI)

Diseño con postprueba únicamente y grupo control.

G1 X1 O1
G2 X2 O2
: : :
Gk Xk Ok
Gk+1 Xk+1 Ok+1
Gk+2 Xk+2 Ok+2
Determinación de la concentración mínima bactericida (CMB)
Diseño con postprueba únicamente y grupo control.

G1 X1 O1
G2 X2 O2
: : :
Gk Xk Ok
Gk+1 Xk+1 Ok+1

Determinación de la concentración letal media (CL50)

Diseño con postprueba únicamente y grupo control.

G1 X1 O1
G2 X2 O2
: : :
Gk Xk Ok
Gk+1 Xk+1 Ok+1
VARIABLES IMPLICADAS
VARIABLES NO IMPLICADAS
3.2.4 Criterios de inclusión y exclusión
De las bacterias
De la muestra vegetal

• Criterios de inclusión
• Planta • Criterios de inclusión
debidamente
certificada • Cepas de bacterias
• Hojas en buen estado certificadas
de la especie vegetal • Criterios de exclusión
de Heliotropium • Tubo de ensayo y Placa
arborescens L. Petri con la
• Criterios de exclusión Macrodilución que
• Hojas en mal estado de presente algún tipo de
conservación. daño o rajadura en su
estructura durante el
proceso de incubación.

Del Crustáceo

• Criterios de inclusión
• Ficha técnica de los
Huevos de Artemia
Salina sp.
• Criterios de exclusión
• Huevos de Artemia
salina que no
eclosionaron después
de la incubación.
3.3 PROCEDIMIENTO DE LA INVESTIGACIÓN.
FLUJOGRAMA N° 01: Procedimiento de la investigación

C
3.3.8 Determinación de la actividad antibacteriana de los extractos

Determinación de la sensibilidad bacteriana

A. Preparación del inóculo.

Se seleccionó 3 a 4 colonias y se diluyó en 5 mL de Caldo Tripticasa Soya, se incubó a 37 °C hasta alcanzar la turbidez
equivalente de 0,5 de la escala Mac Farland (aproximadamente 2 horas), para ello se realizó el ajuste de la turbidez
del inóculo bacteriano y se hizo coincidir con el tubo 0.5 de la escala Mac. Farland (equivalente a 1,5x10 8 UFC/mL),
por comparación visual con el estándar contra un fondo blanco con líneas negras como contraste.

B. Preparación de la solución madre (SM)

Se pesó 600 mg de los extractos acuoso y etanólico al 70 % de las hojas de Heliotropium arborescens L. y se disolvió
en 6 mL de DMSO, obteniéndose una concentración de 100 mg/mL de cada extracto.

C. Preparación de las placas y procedimiento

Se prepararon placas Petri conteniendo 20 mL aproximadamente de Agar Muller Hinton. Luego con un hisopo seco y
estéril se sembró el inóculo bacteriano en toda la superficie de las placas Petri siguiendo cuatro direcciones
diferentes para conseguir una buena inoculación bacteriana y se dejó reposar durante 15 minutos. Luego se hizo
hoyos de 5 mm de diámetro con una pipeta Pasteur en cada una de las placas Petri con Agar Mueller Hinton.
Después se colocó 50 μL de las diferentes concentraciones de los extractos: 100, 50, 25, 12.5 y 6.25 mg/mL, en cada
hoyo. Finalmente se incubó cada placa, por 24 horas a 37 °C

D. Evaluación y Registro:
Se determinó después de 24 horas, se midió el halo de inhibición con la ayuda de una regla metálica
Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI).
A. Preparación del inóculo.
Se seleccionó 4 a 5 colonias bien aisladas y se preparó una suspensión directa en Caldo Tripticasa
Soya. La suspensión preparada se ajustó de inmediato a la escala 0.5 de Mac Farland, a partir de un
cultivo de 24 horas en Agar Tripticasa Soya.

B. Preparación de los tratamientos:

Se preparó una batería de 9 tubos (7 tratamientos, 1 control positivo y un 1 control negativo)
conteniendo 1 mL de caldo Tripticasa Soya. El tubo con inóculo y caldo Tripticasa Soya fue el control
positivo, mientras que el tubo solo con caldo Tripticasa Soya fue el control negativo. Se tomó 1 mL de
la solución madre (agitada y homogenizada) luego se llevó al tubo N° 1 y así sucesivamente hasta el
tubo N° 7, desechando el sobrenadante de este último. Luego se agregó a cada tubo 100 μL de
inóculo bacteriano mezclando adecuadamente.

C. Evaluación de registro
Se incubó cada unidad durante 24 horas a 37 °C. Después de la incubación, la ausencia de
crecimiento, detectada por la falta de turbidez (comparándola con el control positivo y control
negativo), el tubo con la menor concentración de extracto, se designó como la CMI.

Determinación de la concentración mínima bactericida (CMB).

Se realizó un sembrado estriado en la placa con Agar Tripticasa Soya de todas las diluciones y luego se
incubó de 35 a 37 °C por 24 horas. Finalizando este tiempo se observó la ausencia o presencia de
crecimiento, luego se tomó como la CMB a la mayor dilución de los extractos, a la cual al subcultivarse
redujo el crecimiento del inóculo inicial en un 99,9 %
3.3.9 Bioensayo de citotoxicidad en Artemia salina sp.
Determinación de la concentración letal media (CL50)

A. Obtención de Nauplios

Se depositó aproximadamente 50 mg de huevos de artemia salina en un Erlenmeyer con 350

mL de agua de mar artificial (3.5 g de sal marina comercial por cada 100 mL de agua potable),
previamente oxigenada por una hora con la ayuda de un motor. Se incubaron los huevos de
Artemia salina en un lugar con luz (artificial o natural) durante 48 horas a 27,5±2.5 °C.
Transcurrido el tiempo se extrajeron los nauplios con la ayuda de una pipeta descartable, y se
mantuvo en 50 mL de agua de mar artificial oxigenada.

B. Preparación de extractos.
Se pesó 20 mg del extracto acuoso y etanólico al 70 % y se diluyeron en 2 ml de DMSO, a partir
de esta se prepararon soluciones a diferentes concentraciones: 1000, 100, 10 y 1 μg/mL, se
tomó de la solución madre 500, 50, 5 y 0.5 μL en un tubo de ensayo, luego se llevó a un
volumen de 5 mL con agua de mar artificial. Se realizó un control, el blanco que contuvo 2 mL
de DMSO más 3 mL de agua de mar artificial. Luego se adicionaron 10 nauplios a cada tubo.
Finalmente se incubaron los tubos a 23 °C, con fotoperiodo de 12 horas de luz/12 horas de
oscuridad

C. Evaluación y Registro
se contó y anotó el número de individuos muertos. El “criterio de muerte” fue la inmovilidad de
los apéndices por más de 5 segundos, esto fue observado con un microscopio.
 CAPÍTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIONES
4.1 DETERMINACIÓN DE LAS PRUEBAS PRELIMINARES DE LAS HOJAS DE Heliotropium
arborescens L. “Hierba del alacrán”

4.1.1 PORCENTAJE DE HUMEDAD

TABLA N° 1. Resultados del contenido de humedad

Según Solorzano K. 2014, se halla dentro de

los límites establecidos menor al 10 %, lo que
indica mayor estabilidad de las drogas.

4.1.2 PORCENTAJE DE EXTRACCIÓN

TABLA N° 2. Resultados del rendimiento de los extractos acuoso y etanólico al 70%

Leos C. 2010 determinó el

porcentaje de rendimiento del
extracto metanólico de H.
amplexicaule por el método
de maceración obteniéndose
un rendimiento 7.12 %
4.1.3 PRUEBAS FITOQUÍMICAS CUALITATIVAS

TABLA N° 3. Resultados del Tamizaje Fitoquímico del extracto acuoso y etanólico al 70%

Según Peña N., 2007 en su estudio fitoquímico del extracto acuoso de C. collococca determinó que los
componentes mayoritarios de esta especie son los flavonoides, compuestos fenólicos, alcaloides, terpenos y
quinonas

Según Peña N., 2007 determinó que los componentes mayoritarios del extracto hidroalcohólico de C.
collococca son los compuestos fenólicos, flavonoides, compuestos nitrogenados, terpenos. Lo cual es
comparable con esta investigación porque también se encontraron en abundante cantidad los compuestos
fenólicos, flavonoides. Sin embargo Leos C., 2010 determinó que los componentes mayoritarios del extracto
metanólico de H. amplexicaule son los triterpenos y compuestos esteroidales, esteroles y metilesteroles,
alcaloides, azúcares y oxihidrilos fenólicos. Estos resultados difieren con esta investigación.

Según estos resultados los flavonoides y los compuestos fenólicos son sintetizados por las plantas en
respuesta a una infección microbiana los flavonoides más lipófilos probablemente sean los que quebrantan la
membrana celular, los taninos puede estar relacionado con su capacidad para inactivar la adhesión
bacteriana, enzimas etc
4.2 DETERMINACIÓN DE LA SENSIBILIDAD BACTERIANA.

TABLA N° 4. Resultados de los diámetros de los halos de inhibición del extracto acuoso y
etanólico al 70% de las hojas de Heliotropium arborescens L. frente a Staphylococcus aureus.

Según la Escala de Duraffourd

Peña N. 2007 demostró la actividad antibacteriana de C. collococca por el método de la técnica de difusión en agar, empleando un
extracto acuoso frente a cepas de S. aureus ATCC 25923, el cual presentó actividad antibacteriana a una concentración de 5mg con
un halo de inhibición de 9 mm

Leos C. 2010 evaluó la actividad antibacteriana de los extractos metanólicos de H. amplexicaule, C. moreolosana y B. officinalis
frente a S. aureus por el método de difusión en placa, los cuales no presentaron actividad a una concentración de 40 mg/mL
colocando 10 μL del extracto. Al igual que Peña N. 2007 evaluó la actividad antibacteriana de C. collococca por el método de la
técnica de difusión en agar, empleando un extracto hidroalcohólico frente a cepas de S. aureus ATCC 25923, el cual no presentó
actividad antibacteriana. Mientras que Azuero A. 2015 demostró que con el extracto metanólico de Borajo officinalis tuvo una
actividad bactericida contra S. aureus con un halo de inhibición de 8.4 mm a una concentración de 40 mg/mL colocando 25 μL del
extracto, la actividad antibacteriana fue inferior a este estudio. En comparación con la investigación de Velazquez C. 1997,
determinó la actividad antibacteriana del extracto hexánico de Tiquilia canescens sobre S. aureus por el método de difusión en
placa, con halos de inhibición de 48 mm a una concentración de 7.5 mg/mL colocando 60 μL del extracto, la actividad
antibacteriana fue mayor a este estudio
TABLA N° 5. Análisis de la varianza (ANOVA) TABLA N° 6. Pruebas de múltiples rangos para tamaño de
para tamaño de halo de S. aureus por halo de S. aureus por concentración de extracto etanólico
concentración de extracto etanólico al 70%. al 70% de Heliotropium arborescens.

GRÁFICO N° 1. Comparación del tamaño de halo en S. aureus por el extracto etanólico al 70%.
T a m a ñ o h a lo S . a u re u s (m m )

27

24

21

18

15

12

9
Oxacilin 100 50 25 12.5 6.25

Concentracion extracto etanolico

TABLA N° 7. Resultados de los diámetros de los halos de inhibición del extracto acuoso y
etanólico al 70% de las hojas de Heliotropium arborescens L. frente a Streptococcus
pneumoniae.

Según la Escala de Duraffourd

TABLA N° 12. Análisis de la varianza (ANOVA) para tamaño de halo de S. pneumoniae por
concentración de extracto etanólico al 70%.
TABLA N° 8. Pruebas de múltiples rangos para tamaño de halo de S. pneumoniae
por concentración de extracto etanólico al 70% de Heliotropium arborescens.

GRÁFICO N° 2. Comparación del tamaño de halo en S. pneumoniae por el

extracto etanólico al 70%.
T a m a ñ o h a lo S . p n e u m o n ia e (m m )

40

35

30

25

20

15

10

0
Ampicilina 100 50 25 12.5 6.25

Concentracion extracto etanolico

TABLA N° 9. Resultados de los diámetros de los halos de inhibición del extracto acuoso y
etanólico al 70% de las hojas de Heliotropium arborescens L. frente a Escherichia coli.

Según la Escala de Duraffourd

Peña N. 2007 evaluó la actividad antibacteriana de C. collococca por el método de la técnica de difusión en agar,
empleando un extracto acuoso frente a cepas de E. coli ATCC 25922, el cual no presentó actividad antibacteriana.
Leos C. 2010 determinó la actividad antibacteriana de los extractos metanólicos de H. amplexicaule, C. moreolosana
y B. officinalis frente a E. coli por el método de difusión en placa, los cuales no presentaron actividad a una
concentración de 40 mg/mL colocando 10 μL del extracto. Al igual que Peña N. 2007 ha evaluado la actividad
antibacteriana de C. collococca, empleando un extracto hidroalcohólico frente a cepas de E. coli ATCC 25922, el cual
no presentó actividad antibacteriana. Mientras que Azuero A. 2015 determinó que con el extracto metanólico de
Borajo officinalis tuvo una actividad antibacteriana contra E. coli con un halo de inhibición de 7.7 mm a una
concentración de 40 mg/mL, la actividad antibacteriana fue inferior a este estudio. En comparación con el estudio de
Velazquez C. 1997, demostró la actividad antibacteriana del extracto hexánico de Tiquilia canescens sobre E. coli por
el método de difusión en placa, con halos de inhibición de 40.6 mm a una concentración de 7.5 mg/mL, la actividad
antibacteriana fue mayor a esta investigación.
 TABLA N° 11. Pruebas de múltiples rangos para
TABLA N° 10. Análisis de la varianza (ANOVA)
tamaño de halo de E. coli por concentración de
para tamaño de halo de E. coli por
extracto etanólico al 70% de Heliotropium
concentración de extracto etanólico al 70%.
arborescens.

GRÁFICO N° 3. Comparación del tamaño de halo en E. coli. por el extracto etanólico al 70%.
T a m a ñ o h a lo E . c o li (m m )

50

40

30

20

10

0
Amikacina 100 50 25 12.5 6.25

Concentracion extracto etanolico

TABLA N° 12. Resultados de los diámetros de los halos de inhibición del extracto acuoso y
etanólico al 70% de las hojas de Heliotropium arborescens L. frente a Klebsiella pneumoniae.

Según la Escala de Duraffourd

TABLA N° 13. Análisis de la varianza (ANOVA) para tamaño de halo de K.

pneumoniae por concentración de extracto etanólico al 70%.
TABLA N° 14. Pruebas de múltiples rangos para tamaño de halo de K. pneumoniae
por concentración de extracto etanólico al 70% de Heliotropium arborescens.

GRÁFICO N° 4. Comparación del tamaño de halo en K. pneumoniae por el

extracto etanólico al 70%.
T a m a ñ o h a lo K . p n e u m o n ia e (m m )

40

30

20

10

0
Amikacina 100 50 25 12.5 6.25

Concentracion extracto etanolico

TABLA N° 15. Resultados de los diámetros de los halos de inhibición del extracto acuoso
y etanólico al 70% de las hojas de Heliotropium arborescens L. frente a Proteus mirabilis.

Según la Escala de Duraffourd

TABLA N° 16. Análisis de la varianza (ANOVA) para tamaño de halo de P. mirabilis

por concentración de extracto etanólico al 70%.
TABLA N° 17. Pruebas de múltiples rangos para tamaño de halo de P. mirabilis por
concentración de extracto etanólico al 70% de Heliotropium arborescens.

GRÁFICO N° 5. Comparación del tamaño de halo en P. mirabilis por el extracto

etanólico al 70%.
T a m a ñ o h a lo P . m ir a b ilis (m m )

40

30

20

10

0
Amikacina 100 50 25 12.5 6.25

Concentracion extracto etanolico

TABLA N° 18. Resultados de los diámetros de los halos de inhibición del extracto acuoso y
etanólico al 70% de las hojas de Heliotropium arborescens L. frente a P. aeruginosa.

Según la Escala de Duraffourd

Peña N. 2007 determinó la actividad antibacteriana de C. collococca por el método de la técnica de difusión en agar,
empleando un extracto acuoso frente a cepas de P. aeruginosa ATCC 27853, el cual presentó actividad
antibacteriana a una concentración de 5 mg con halo de inhibición de 10 mm.
Leos C. 2010 evaluó la actividad antibacteriana de los extractos metanólicos de H. amplexicaule, C. moreolosana y B.
officinalis frente a P. aeruginosa por el método de difusión en placa, los cuales no presentaron actividad a una
concentración de 40 mg/mL colocando 10 μL del extracto. Al igual que Peña N. 2007 determinó la actividad
antibacteriana de C. collococca, empleando un extracto hidroalcohólico frente a cepas de P. aeruginosa ATCC 27853,
el cual no presentó actividad antibacteriana. En comparación con el estudio de Azuero A. 2015 determinó que con
el extracto metanólico de Borajo officinalis tuvo una actividad antibacteriana contra P. aeruginosa un halo de
inhibición de 6.7 mm a una concentración de 40 mg/mL, la actividad antibacteriana fue inferior a este estudio.
TABLA N° 19. Análisis de la varianza (ANOVA) para TABLA N° 20. Pruebas de múltiples rangos para
tamaño de halo de P. aeruginosa por concentración tamaño de halo de P. aeruginosa por
de extracto etanólico al 70%. concentración de extracto etanólico al 70% de
Heliotropium arborescens.

GRÁFICO N° 6. Comparación del tamaño de halo en P. aeruginosa por el extracto

etanólico al 70%.
T a m a ñ o h a lo P . a e r u g in o s a (m m )

40

30

20

10

0
Amikacina 100 50 25 12.5 6.25

Concentracion extracto etanolico

4.3 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI)
TABLA N° 21. Resultados de la presencia o ausencia de turbidez de S. aureus frente al
extracto etanólico al 70% de las hojas de Heliotropium arborescens L.
  Concentración Caldo Concentr Inóculo Resultados Observacionales
Tubo del extracto Tripticasa ación bacteriano S. S. E. coli   K. P.  P.
s etanólico al Soya final (μL) aureus  pneumo pneumo mirabili aeruginosa
70% (mg/mL) (mL) (mg/mL) niae  niae s 

1 100 1 50 100 - - - - - -
2 50 1 25 100 - - - - - -
3 25 1 12.5 100 - - - - - -
4 12.5 1 6.25 100 - + - + + +
5 6.25 1 3.12 100 + + + + + +
6 3.12 1 1.56 100 + + + + + +
7 1.56 1 0.78 100 + + + + + +
8 Control (+) 1 --- 100 + + + + + +
9 Según
Control (-)
la IMET-ESSALUD, 1
2007 --- --- - - - - - -

Pérez L. 2005 Evaluó la CMI por la técnica de microdilución en placa de los extractos metanólicos de Cordia
boissieri y Heliotropium angiospermum frente a cepas de S. aureus y S. pneumoniae, demostrando que solo el
extracto metanólico de C. boissieri presentó una CMI de 0.25 mg/mL sobre S. aureus y probando que solo el
extracto de H. angiospermum presentó una CMI de 0.125 mg/mL.

Velazquez C. 1997 Determinó la concentración mínima inhibitoria del extracto hexánico de Tiquilia canescens
por el método de difusión en placa, con una CMI para S. aureus de 3 mg/mL y para E. coli de 3 mg/mL.
 4.4 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA BACTERICIDA (CMB)

TABLA N° 22. Resultados de la presencia o ausencia de crecimiento de S. aureus, S.

pneumoniae, E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis y Pseudomona aeruginosa frente al
extracto etanólico al 70% de las hojas de Heliotropium arborescens L.
  Concentrac Inóculo Resultados Observacionales
Placa ión bacterian S. aureus S. E. coli K. P. mirabilis P.
(mg/mL) o (μL) pneumo pneumo aeruginosa
Niae niae
  50 100 - - - - - -
  25 100 - + - + + -
  12.5 100 + + - + + +
1
6.25 100 + + + + + +
3.12 100 + + + + + +
1.56 100 + + + + + +
0.78 100 + + + + + +
Control 100 + + + + + +
positivo

Leyenda:
• (-): Ausencia de crecimiento
• (+): Presencia de crecimiento
 4.5 DETERMINACIÓN DE LA SENSIBILIDAD DE LAS BACTERIAS AISLADAS FRENTE A LOS EXTRACTOS ACUOSO Y
ETANÓLICO AL 70%

TABLA N° 23. Resultados de la susceptibilidad de las bacterias Gram positivas y Gram negativas
frente a los extractos acuoso y etanólico al 70%.

Peña N. 2007 Evaluó la susceptibilidad bacteriana del extracto acuoso e hidroalcohólico de C. collococca sobre Staphylococcus aureus,
Escherichia coli y Pseudomona aeruginosa mediante ensayos de inhibición de crecimiento in vitro, según una modificación de la técnica
de Kirby-Bauer, donde el extracto acuoso presentó actividad antibacteriana frente a S. aureus y P. aeruginosa con halos de inhibición de 9
y 10 mm a una concentración de 5 mg, mientras que el extracto hidroalcohólico no presentó actividad antibacteriana,
4.6 DETERMINACIÓN DEL ENSAYO DE CITOTOXICIDAD EN Artemia salina.

4.6.1 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA (CL50).

TABLA N° 24. Recuento de nauplios de Artemia salina muertos en el extracto

acuoso.
TABLA N° 27. Recuento de nauplios de Artemia salina muertos en el extracto
etanólico al 70%.
 CONCLUSIONES

Se evaluó que solo el extracto etanólico al 70% presentó actividad antibacteriana frente a
Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli,
Proteus mirabilis y Pseudomona aeruginosa. Asimismo los extractos acuoso y etanólico al
70% no son citotóxicos sobre Artemia salina.

Se obtuvo un porcentaje de humedad de 6.91% y un porcentaje de extracción de 6.66% y

12.86% de los extractos acuoso y etanólico al 70%, respectivamente. En el análisis
fitoquímico cualitativo, el extracto acuoso presentó poca cantidad cantidad de compuestos
fenólicos, alcaloides, flavonoides, azúcares reductores y el extracto etanólico al 70%
presentó abundante cantidad de compuestos fenólicos, alcaloides, lactonas, flavonoides,
taninos y azúcares reductores

Se hizo la susceptibilidad bacteriana con los extractos acuoso y etanólico al 70% de las hojas
de Heliotropium arborescens L., donde se obtuvo que el extracto acuoso no formo halos de
inhibición frente a las cepas de (S. aureus, S. pneumoniae, E. coli, K, pneumoniae, P. mirabilis
y P. aeruginosa), mientras que el extracto etanólico al 70% presentó halos de inhibición
frente a todas las cepas en estudio, siendo la cepa más sensible S. aureus con un halo de
inhibición promedio de 20.33mm a una concentración de 100mg/mL y la cepa menos
sensible fue S. pneumoniae con un halo de inhibición promedio de 13.33mm a una
concentración de 100mg/mL, colocando 50μL del extracto. Respecto a los medicamentos
patrón, los resultados obtenidos de los extractos no son comparables con los antibióticos,
sin embargo se comprueba la actividad antibacteriana del extracto.
La concentración mínima inhibitoria del extracto etanólico al 70% fue de 6.25mg/mL para
S. aureus, 12.5mg/mL para S. pneumoniae, 6.25mg/mL para E. coli, 12.5mg/mL para K.
pneumoniae, 12.5mg/mL para P. mirabilis y 12.5 mg/mL para P. aeruginosa.

La concentración mínima bactericida del extracto etanólico al 70% fue 25mg/mL para S.
aureus, 50mg/mL para S. pneumoniae, 12.5mg/mL para E. coli, 50mg/mL para K.
pneumoniae, 50mg/mL para P. mirabilis y 25mg/mL para Pseudomona aeruginosa.

Se realizó la actividad antibacteriana de los extractos acuoso y etanólico al 70% de las

hojas de Heliotropium arborescens L., frente a las bacterias aisladas Gram positivas
(Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae) y bacterias aisladas Gram negativas
(Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Proteus mirabilis y Pseudomona aeruginosa),
siendo el extracto etanólico al 70%, más efectivo frente a las cepas aisladas.

La concentración letal media (CL50) del extracto acuoso y etanólico al 70% de las hojas de
Heliotropium arborescens L., fue de 2090.1ppm y 1131.75ppm respectivamente,
considerados como no tóxicos sobre Artemia salina.
 SUGERENCIAS

A LA AUTORIDAD UNIVERSITARIA
• Implementar un laboratorio de Farmacología Experimental exclusivamente para el desarrollo de trabajos de
investigación de plantas medicinales.
• Adquirir equipos e instrumentos de medición para la determinación de los parámetros establecidos en los
modelos experimentales.
• Implementar una biblioteca virtual con acceso gratuito a las revistas científicas internacionales y nacionales.

A LOS DOCENTES:
• Fomentar el estudio y la investigación de plantas medicinales.
• Elaborar un registro de plantas medicinales que posean potenciales acciones terapeúticas que sirvan de guía
para el estudiante para su posterior estudio e investigación.
• Realizar prácticas y pasantías sobre modelos experimentales en diferentes instituciones públicas y privadas.

A LOS ESTUDIANTES:
• Realizar el análisis fitoquímico cuantitativo, para caracterizar, cuantificar y aislar los metabolitos secundarios del
extracto etanólico al 70 % de las hojas de Heliotropium arborescens L. “Hierba del alacrán” con el fin de conocer
el mecanismo de acción de los principios activos responsables de la actividad antibacteriana.
• Hacer estudios sobre la actividad antiinflamatoria, analgésica, antipirética de Heliotropium arborescens L.
“Hierba del alacrán”.
• Efectuar la actividad antimicótica y toxicidad de los extractos etanólicos y etéreos de las hojas del Heliotropium
arborescens L.
• Desarrollar formulaciones diseñadas con el extracto etanólico al 70 % de las hojas de Heliotropium arborescens
L. “Hierba del alacrán”, en estudios clínicos posteriores para saber su utilidad en el tratamiento de las infecciones
producidas por Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,
Proteus mirabilis y Pseudomona aeruginosa.
GR
AC
IAS