Regulation of Transcription Initiation
Cell Function

Proteins

mRNA Translation Posttranslational Protein 

Concentration Efficiency Modification Stability

Transcription Transcription mRNA mRNA mRNA

Initiation Elongation Editing Transport Stability
Eukaryotes only Eukaryotes only

   
Key Components in Control of Transcription Initiation

1)  Regulatory sequences associated with genes. 
(cis­acting)

2)   Proteins that bind to the regulatory sequences.
(trans­acting) 

   
 Francois Jacob Jacques Monod

   
 Genes involved in lactose metabolism

GENE PROTEIN FUNCTION

lacZ β­galactosidase degrade lactose

lacY lactose permease pump lactose

lacA thiogalactoside  ?
transacetylase

“Enzyme Induction”: 
β­galactosidase is induced in the presence of 
lactose, not glucose.
   
 The Specificity of Induction

       INDUCER  SUBSTRATE FOR
FOR LAC OPERON? β ­GALACTOSIDASE?

• Lactose yes yes

• IPTG yes no
• X­gal no yes (blue product)

   
 Initial observation that led to the Jacob­Monod Model

RESULTS:

* All three enzymes respond identically to all 
inducers.

* There is little correlation between good inducers 
and good substrates.

CONCLUSION:

An additional protein acts as a receptor for the inducer, 
which is different from the lactose­digesting enzymes.
   
Mutations in lacI Cause Constitutive Expression of lac Operon

E. coli Medium Colony Color

Wild­type  X­gal+lactose blue

Wild­type X­gal+glucose white
Rare Mutants X­gal+glucose blue

Constitutive mutants

lacI lac repressor
Importance: first gene shown to be involved in the regulation of enzymes.
   
 The Jacob and Monod  Model

Based on the model, 
what would be the predicted 
phenotypes of operator mutants 
   
(Oc) and promoter mutants?
 Oc is Cis­Acting and Dominant over O+ 

   
 lacI+ is Trans­Acting and Dominant over lacI­ 

   
DNaseI Footprinting

   
 Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

   
 Lac­Operon Transcription­Control Region

   
 β and β’ polymerize NTPs
α  interacts with regulatory proteins
σ 70   determines the initiation site
β, β’, α, α. core polymerase 
β, β’, α, α, σ 70 holoenzyme

   
• Lac repressor inhibits transcription by blocking access of RNA polymerase to the 
lac promoter. 
• cAMP­CAP activates transcription by increasing affinity of RNA polymerase for 
the lac promoter.  
• Cooperative binding of cAMP­CAP and RNA polymerase to the lac control 
region.
   
Negative and Positive Transcriptional Control of the lac Operon

   
Usage of Different Sigma Factors in Gene Regulation

   
Gene activation through
phosphorylation of 
enhancer­binding proteins

   
   
 Eukaryotic Gene Control: General Approaches

• Determining mode of regulation: mRNA amount, protein amount, protein 
activity
– Northern blot; immunoblot; and functional assay

• Determining mode of regulation: transcription versus RNA stability
– Nascent­chain analysis (nuclear run­on assay); transfection; transcription 
inhibitor assays.

• Mapping of transcription initiation site.
– Primer extension; RNase protection; S1 Nuclease protection; RACE

• Mapping transcription­control sequences
– Linker scanning mutagenesis

• Isolating site­specific DNA­binding transcription factors
– Biochemical; genetic approaches
   
 Nascent­Chain (Run­On) Assay

   
 Differential mRNA Synthesis in Liver

   
Primer Extension

   
Linker Scanning Mutagenesis to Identify Transcription­Control Elements

   
    Comparison of Cis­Acting Promoter Elements 
in (a) Unicellular and (b) Multicellular Eukaryotes

   
 Boundary or Insulator Elements 
can Prevent Enhancer Interactions with Inappropriate Promoters

   
Biochemical Techniques for Identifying Transcription Factors

– Chromatography (e.g  sequence­specific DNA affinity 
chromatography)

– DNaseI footprinting or electrophoretic mobility shift assay (EMSA)

– In vitro transcription assay

– Determination of partial amino acid sequence

– Isolation of the cDNA clone

– In vivo transfection assay
   
 Additional Methods for Identifying Partners in Protein­DNA Interactions

Yeast One­Hybrid:

Classic Genetic Screens:

PCR­Mediated Selection for Specific DNA Binding Sites:

   
Purification of Transcription Factors by DNA Affinity Chromatography

   
 In Vitro Transcription Activation by SP1

   
 In Vivo Assay for Transcription Factor Activity

What is the general caveat of over­expression?
   
What are the alternatives?
Modular Structure of Eukaryotic Transcription Activators

   
Yeast Two­Hybrid Screen: 
 A Common Approach for Identifying Protein­Protein Interactions

   
The RNA Polymerase II Transcription Machinery

   
 Initiation by Pol II Requires General Transcription Factors

   
Stepwise Assembly 
of a Transcription
Initiation Complex

   
 Yeast RNA Pol II­Dependent Transcription Machinery

   
 Eukaryotic RNA Polymerases

*     Three eukaryotic polymerases catalyze formation of different RNAs.

Polymerase I Pre­ribosomal RNA (28S, 5.8S, 18S)
Polymerase II All messenger RNAs; small nuclear RNAs (splicing)
Polymerase III tRNAs; 5S rRNA; small RNAs

*     CTD of the largest subunit of RNA polymerase II.

Tyr­Ser­Pro­Thr­Ser­Pro­Ser (x26­52)

   
The C­terminal Domain 
(CTD) of RNA polymerase II 
Coordinates Transcription 
and Pre­mRNA Processing

   
Model for Cooperative Assembly of an Activated Transcription­Initiation Complex

   
Identification of Tissue­ and 
Gene­Specific Subunits of the 
General Transcription Apparatus

ovarian­specific TAF105

TBP­related factors (TRFs)

   
 SUMMARY
Prokaryotic Transcription Initiation

• Promoter strength depends on ­10 and ­35 sequences.
• Repressors interferes with binding of RNA polymerase.  Activator cAMP­CAP 
facilitates polymerase binding.
• Multiple mechanisms of gene regulation in response to various environmental cues.

Eukaryotic Transcription Initiation
• Promoters (TATA box, initiator, or DPE) determine the transcription 
initiation site. Cis­acting control regions in eukaryotic genes can be promoter­
proximal elements, enhancers, silencers, and insulators.
• Transcription factors bind to promoter­proximal elements and enhancers. 
RNA polymerase II requires several general transcription factors (GTF) to 
locate the initiation site.  Site­specific activators can facilitate RNA 
polymerase function by interactions with the co­activators.
• Gene regulation in multicellular organisms are mainly designed for the 
growth and developmental needs.