MEDIOS DE FIJACION

Fijadores fisicos
• Puede ser por en una congelación muy rápida del
tejido, en la aplicación de calor o microondas.
• Se utilizan cuando el tipo de muestra lo requiere,
cuando los fijadores químicos alteran la
estructuras que queremos observar, o cuando
necesitamos una fijación muy rápida.
• La congelación rápida es un buen método de
preservación de las caraterísticas moleculares y es
conveniente que sea rápida puesto que así se
impide la formación de grandes cristales de hielo
que nos destrozarían la estructura del tejido
Fijadores fisicos
• La criodesecación o lifilizacion.-Parte de
tejido previamente congelado, pero
posteriormente se realiza una sublimación
del hielo, es decir, el agua pasa de estado
sólido a gaseoso sin pasar por estado
líquido
• La criosustitución también parte de tejido
congelado pero en este caso se produce
una sustitución lenta del hielo por una
solución fijadora
Fijadores quimicos
Utilizan soluciones acuosas compuestas
por moléculas fijadoras que establecen
puentes entre las moléculas celulares,
manteniéndolas en sus lugares originales e
impidiendo su degradación
Hay dos métodos de fijación con fijadores
líquidos: inmersión y perfusión.
INMERSION
• Las piezas de tejido no deberían superar los 0.5 cm de
espesor para que el fijador alcance el interior de la
pieza antes de que ésta comience a deteriorarse. Esto
depende de la velocidad de penetración del fijador y
de las características del tejido, por ejemplo, si tiene
cavidades por donde penetre la solución fijadora.
• El volumen recomendado de fijador debe ser 20 veces
superior al volumen de la pieza.
• La osmolaridad entre tejido y solución fijadora deben
estar equilibradas.
• El pH del fijador debe ser próximo al fisiológico
• El tiempo de fijación depende de cada tipo de fijador,
pero generalmente existe un tiempo máximo para cada
uno de ellos que no debe ser excedido.
Perfusión
• Por este procedimiento la solución fijadora se
introduce a través del sistema circulatorio mediante el
cual accede a todas las células del tejido gracias a la
red de capilares
• Mediante este método se puede fijar un animal
completo introduciendo la solución fijadora a través
del ventrículo cardiaco, con lo que el fijador llegará a
todas las células irriegadas por la sangre bombeada
por dicho ventrículo
• Antes de introducir el fijador en el sistema de vasos
sanguíneos hay eliminar previamente la sangre con
una solución de lavado oxigenada, de otra manera su
interacción con el fijador produce trombos
CLASIFICACION
Los fijadores se clasifican en dos grandes grupos:
a) Oxidantes: el tetraóxido de osmio (ácido
ósmico), el bicromato de potasio, ácido crómico,
bicloruro de mercurio o “sublimado corrosivo”,
ácido pícrico, ácido acético.
b) Reductores: el formaldehído, el
glutaraldehído, el alcohol etílico, el alcohol
metílico.
 CUALIDADES QUE DEBE
TENER UN BUEN FIJADOR
 Actuar con rapidez, matando y fijando a las células antes que
aparezcan los fenómenos post-mortem (autólisis, desintegración,
etc.).
 Poseer alto poder de penetración para asegurar la fijación correcta
hasta en las capas profundas de la pieza a fijar
 Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban
in vivo
 Permitir el empleo de los procedimientos necesarios para su
observación ulterior (cortes, coloración, etc.)
 Impedir la desaparición de los elementos solubles durante la
fijación o después de ella
 No provocar o impedir la producción de estructuras artificiales
 No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos quebradizos
 APLICACIÓN DE LOS
FIJADORES
 La acción oxidante o reductora de los fijadores le confieren a
las células ciertas condiciones que posibilitan una mejor
aplicación de las sustancias colorantes, por ejemplo:
 El alcohol etílico absoluto conserva el glucógeno
 El bicloruro de mercurio provoca que las anilinas coloreen de
manera más brillante a las fibras colágenas,
 El bicromato de potasio facilita la coloración de las
mitocondrias, el ácido acético permite una mejor tinción de
los núcleos
 El cloruro de calcio conserva e insolubiliza parcialmente a los
lípidos.
ALCOHOL ETILICO (CH3-CH2-OH
• Fija por deshidratación y se usa entre el 70 y 90 %
• Es un buen elemento para preservar moléculas,
como ciertas enzimas, propiedades antigénicas,
glucógeno, pigmentos y para las extensiones
citológicas
• Debido a que deshidrata, a la vez que fija, se
puede usar también como un conservante de las
muestras
• Tiene inconvenientes como el endurecimiento y la
retracción de los tejidos
• Carece de efecto mordiente
ACIDO ACETICO (CH3COOH)
• Su proceso de fijación consiste en cambiar el
estado coloidal de las proteínas
• Se utiliza a una concentración que varía entre
el 1 y el 5 %
• Es el fijador ideal para ácidos nucleicos y
nucleoproteínas
• Como inconvenientes cabe destacar la
destrucción de las mitocondrias y mala
fijación de membranas y citoplasma.
• Se suele usar en combinación con otros
fijadores
Ácido pícrico(C6H2OH(NO2)3 )
• La fijación la produce porque sales del tipo
picrato coagulan con las proteínas de los tejidos.
• Se suele usar el 2 % de una solución saturada de
ácido pícrico.
• Preserva bien la estructura celular, no produce
retracciones cuando el tiempo de fijación es
óptimo, preserva bien glucógeno y lípidos
• Es un buen fijador para tinciones generales
puesto que favorece la unión de los colorantes
• Hay que eliminarlo completamente antes de
proceder a la inclusión en ceras como la parafina
• Se suele usar combinado con otros fijadores.
 FORMALDEHIDO(CH2=O)
Altamente volátil y muy inflamable
Se obtiene por oxidación catalítica del alcohol
metílico
Las disoluciones acuosas al ≈ 40 % se conocen
con el nombre de formol, que es un líquido
incoloro de olor penetrante y sofocante
estas disoluciones pueden contener alcohol
metílico como estabilizante.
Otros nombres: Formalina, aldehído fórmico,
óxido de metileno, metanaldehído, oxometano,
formol
FORMALDEHIDO(CH2=O)
 Fue descrito por primera vez en 1859 por el químico ruso
Aleksandr Butlerov (1828–86),2 donde lo llama
"Dioxymethylen" (methylene dioxide)por un error en su
fórmula (C4H4O4). No fue hasta 1869 que August Wilhelm
von Hofmann lo identificó correctamente.
 El formaldehído se disuelve en agua (400 L gas /L de agua a
20 °C). La disolución se degrada lentamente bajo formación
de paraformaldehído, el polímero del formaldehído. También
puede formarse el trímero cíclico.
 La oxidación del formaldehído da ácido fórmico y en una
segunda etapa agua y dióxido de carbono.
 Actúa mediante la formación de puentes entre las moléculas
tisulares.
VENTAJAS DEL FORMOL
Tiene un solo componente (formaldehído) y por
ello la fijación única
La imagen microscópica que produce es el
“estándar de oro”, reconocida por todos los
patólogos.
El formol es quizá el único fijador cuyo
mecanismo es conocido en detalle
Es muy barato y abundante
La mayoría de los métodos de tinción se crearon
para tejidos fijados con formol
 DESVENTAJAS DEL
FORMOL
 El cancerígeno con un nivel de toxicidad muy alto
 Es un proceso muy lento y en tres etapas: penetración
(muy rápida) que detiene la autolisis, la unión covalente
que es 12 veces más lenta que la penetración, y el
cruzamiento o “cross-linking” que es 4 veces más lento
que la formación de la unión covalente
 El cruzamiento (“cross-linking”) completo requiere un
mínimo de 48 horas de fijación afectando el tiempo de
finalización
 Afecta la recuperación del ADN, mARN y la eficacia de
las pruebas moleculares y genéticas
 La neutralización siempre es incompleta
 El reciclaje aumenta la exposición
GLUTARALDEHIDO
 Forma puentes entre las moléculas de los tejidos
 Se usa a una proporción de entre el 0,5 y el 3 %
 Tiene una alta capacidad para preservar la estructura
celular, por lo que es el fijador de referencia para
observación de ultraestructuras celulares con el
microscopio electrónico
 Se usa en soluciones tamponadas isotónicas
 Se usa tambien como desinfectante de equipos medicos
y como un agente de endurecimiento en el revelado de
los rayos X y en la industria del cuero se usa como
agente curtidor y es un componente de líquidos de
embalsamamiento.
Tetróxido de osmio
Se emplea al 1 % en soluciones tamponadas.
Es buen fijador de la ultraestructura de la célula
por lo que se emplea habitualmente para las
observaciones con el microscopio electrónico
Es un buen fijador para grasas y membranas
celulares
Por su fuerte carácter oxidante no se usa para
tinciones convencionales, excepto para las
impregnaciones argénticas como el método de
Golgi.
Mezclas fijadoras
Solución de Bouin
Solución de Carnoy
Glutaraldehido-tetraoxido de osmio
Liquido de Zenker
Liquido de Clarke
Liquido de Helly
Liquido de Karnovsky
Liquido de Lewitzky
Liquido FAA
Solución de Bouin
 Está formado por ácido pícrico, formaldehído y ácido
acético glacial
 Muy utilizado en histología embriológica y para
órganos genitales
 Se recomienda cuando se desea colorear con cualquier
técnica tricrómica para la diferenciación de tejido
muscular y conectivo
 Las muestras se deben lavar con etanol a 70º
 Hay que tener cuidado con el tiempo de fijación, que no
debe exceder de 48 h en el caso de fijaciones por
inmersión
 No está recomendado para el riñón ni para el estudio de
mitocondrias
Solucion de Carnoy
Es un buen fijador para el glucógeno, para los
hidratos de carbono simples y para las proteínas
fibrosas
Es bueno para visualizar los ácidos nucleicos,
aunque no la morfología nuclear, y para los
grumos de Nissl del sistema nervioso
Está formado por etanol absoluto 60 %,
cloroformo 30 % y ácido acético glacial 10 %.
Tiende a destruir micobacterias.
 Líquido de Zenker
se la puede emplear para la preservación de
componentes ricos en sangre y para la realización de
métodos tricrómicos y coloración de miofilamentos
En el momento de usar de debe agregar 5 ml de ácido
acético glacial por cada 95 ml de la solución stock.
Esta compuesto por 12.5 g de Cloruro de mercurio;
6.3 gr de Dicromato de potasio; 2.5 gr de Sulfato de
sodio y 250 ml de agua destilada
OTRAS MEZCLAS UTILES
 Líquido de Karnovsky: se utiliza especialmente para la
fijación de muestras destinadas al estudio con
microscopio electrónico. Es una mezcla de
formaldehido, glutaraldehido y cacodilato de sodio
 Líquido de Helly: Util para médula ósea, tejido
hematopoyéticos y estudios de discos intercalares. En el
momento de usar de debe agregar 5 ml de formol puro
por cada 95 ml de solución stock
 Líquido de Lillie o B-5: Util para la fijación de médula
ósea, nódulos linfáticos y otros tejidos hematopoyéticos.
En el momento de usar se debe agregar 5 ml de formol
puro por cada 50 ml de solución stock.. Formado por
cloruro de mercurio, acetato de sodio y agua destilada
 OTRAS MEZCLAS UTILES
 Líquido FAA: utilizada por los botánicos para la fijación
de muestras vegetales. La concentración de alcohol es
mayor debido a que los vegetales presentan gran cantidad
de carbohidratos en su composición macromolecular
(celulosa y hemicelulosa). Esta compuesto por : Etanol al
50% 67 ml; Acido acético glacial 17 ml; Formaldehído
puro 16 ml
 Líquido Anatech Ltd. o Formol-zinc: Esta mezcla no
tamponada es un excelente fijador para
inmunohistoquímica. La solución tamponada se prepara
agregando 1.6 gr de cloruro de zinc a 1000 ml de Formol-
PBS pH 7,2. Contiene 100 ml de Formaldehído ,4.5 gr de
cloruro de sodio, 1.6 gr de sulfato de Zn y 900 ml de agua
destilada