VOD

Rutinn prce v mikrobiologick laboratoi je asto podceovna. Nejene nejsou respektovny specifick nroky pi vybavovn mikrobiologickho pracovit, ale dochz i k tomu, e vedouc pracovnci nejsou dostaten vykoleni a nejsou dodrovny pedepsan zsady bezpenosti prce. Tato fakta pak vedou k cel ad nedostatk, kter mohou sniovat serioznost vsledk. Pi prci s patogennmi mikroorganismy me dojt i k potencionlnmu zdravotnmu riziku. Z tchto dvod je nutn klst vysok poadavky na dodrovn pracovn kzn a pracovnho du a dit se nsledujcmi pravidly bezpenosti prce.

PRAVIDLA PRCE V MIKROBIOLOGICK LABORATOI : 1. Vstup do mikrobiologick laboratoe je dovolen pouze osobm, kter tam pracuj. Svrchn odv je nutn ped vstupem do laboratoe odloit do sknk na chodb a pevlknout se do istho laboratornho plt. Pracovn pl je uren vhradn k prci v mikrobiologick laboratoi a nen dovoleno ho pouvat mimo pedem uren prostory. 2. V laboratoi nen dovoleno jst, pt a kouit. 3. Je nutn zvenou mrou dodrovat bezpenost prce a hygienu, nebo se pracuje s podmnn pathogennmi a pathogennmi mikroorganismy. Po ukonen prce se mus ruce dkladn umt mdlem, pop. vydezinfikovat 0,1% roztokem Ajatinu. 4. Pracovn stl se mus ped i po prci vydezinfikovat 0,1% roztokem Ajatinu nebo jinm innm dezinfeknm prostedkem (70% ethanol). Bhem prce nesm bt na pracovnm stole nesteriln pedmty a je nutn udrovat maximln podek. Prostory a ovzdu v laboratoi je teba desinfikovat UV zenm. Provd se v nonch hodinch po odchodu pracovnk z pracovit a po dkladnm mechanickm oeten, omyt a chemick desinfekci. 5. Kad raz a zrann je nutno ihned hlsit asistentovi. I nejmen odrky mus bt peliv vydezinfikovny a oeteny, nebo hroz infekce rny.

Strana1

6. Dostane-li se pi prci infekn materil do st, je nutno sta dkladn vyplchnout a vykloktat 1% roztokem KMnO4 nebo zednm Lugolovm roztokem. 7. Dostane-li se infekn materil do oka , mus se oko ihned vyplchnout borovou vodou. 8. Kontaminovanou pokoku nebo pedmt (pracovn stl, odv) je nutn ihned ott 0,1% roztokem Ajatinu. 9. Po ukonen pokus ped likvidac a mytm ndob mus bt mikrobiln kultury ve zkumavkch, Petriho miskch a ostatnch kultivanch ndobch usmrceny autoklvovnm nejmn 30. minut pi 121oC. V dnm ppad se nesm kultury bez pedelho usmrcen vylvat do vodovodn vlevky nebo jinho odpadu. 10. Rozbit sklo se odkld pouze do uren ndoby. Je-li zneitno mikrobiln kulturou mus se nejdve vydezinfikovat ponoenm do dezinfeknho prostedku za pouit pinzety nebo klet. Stepy se nikdy nesmj sbrat rukou. 11. Ped odchodem z laboratoe je nutno uklidit pracovn stl i pomocn prostory, uloit potebn kultury do chladniky, oistit objektivy mikroskopu a uschovat jej na pslun msto, zkontrolovat, zda jsou uzaveny plynov a vodovodn kohoutky a vypnuty vechny elektrick spotebie krom nepetrit pracujcch termostat, tepaek a chladniek.

Strana2

1.

PRINCIPY MIKROBIOLOGICK PRCE Prce v mikrobiologick laboratoi se mus stejn tak jako v laboratoi chemick

dit pravidly Sprvn laboratorn praxe (SLP). Tato skutenost je obzvlt dleit v dnen dob zavedenm mezinrodnch norem ISO a norem platnch v EU. Mikrobiologick prce mus vdy vychzet z vdom, e: a) v prosted kolem ns se vyskytuje velk mnostv mikroorganism, kter mohou zneistit a tm pln znehodnotit pouvan mikrobiln kultury nebo ivn pdy nebo pln zkreslit vsledky mikrobiologickch analz, b) e nkter z pouvanch kultur nebo koloni, je vyrostly pi rozboru potravinskch surovin jsou podmnn patogenn nebo dokonce patogenn, take bychom neopatrnou prac s nimi mohli ohrozit sv zdrav i zdrav svch spolupracovnk. Zkladnm poadavkem pi vech mikrobiologickch postupech je to tzv. aseptick prce, spovajc v tom, e zabrauje rozptlen bunk z kultur do prosted a vniknut mikroorganism z prosted do kultur do prosted a vniknut mikroorganism z prosted do kultur nebo ivnch pd, co by vedlo k rychlmu pomnoen tchto cizch mikroorganism. Proto je nutno pracovat se sterilnmi pomckami a pokud mono ve sterilnm tj. vydezinfikovanm prosted, a to co nejrychleji, teba i na kor objemov nebo hmotnost pesnosti. Je teba mt na pamti, e pracujeme s ivmi objekty, kter potebuj uritou dobu k pomnoen, avak velmi rychle strnou a pomrn snadno podlhaj genetickm zmnm. Vechny tyto skutenosti kladou velk nroky na plnovn pokus a organizaci prce, udrovn kultur v ivm stavu, jejich kontrolu z hlediska istoty a stability genetickch i fyziologickch vlastnost. Vtina pouvanch postup vyaduje uritou zrunost a zkuenost, a proto je teba je opakovat nkolikrt ne se doshne danho vsledku. Ovem i pi uspokojivm vsledku je vhodn pokus opakovat, aby se zjistilo, e pvodn vsledek nebyl dosaen nhodn.

Strana3

V kadm vzkumu jsou velmi dleit kontroln pokusy, a to jak pozitivn kontrola, kter nm ukazuje, jak m pslun reakce probhat a zda pouit ivn pdy, inidla i pracovn postup jsou sprvn, tak i negativn kontrola, kter je mez, podle n hodnotme pozitivn reakci. Nkdy lze pro negativn kontrolu pout nezaokovanou ivnou pdu, avak pesnj a v nkterch ppadech nezbytn je provst cel postup s mikroorganismem, kter poskytuje negativn reakci. Jeliko pracujeme s ivm materilem, kter pomrn snadno podlh zmnm, a u v dsledku strnut, genetickch zmn a jejich selekce nebo zneitn cizmi mikroorganismy, musme pi neuspokojivm vsledku pozitivn kontroly hledat pinu nejen v chybn pipravench pdch nebo inidlech, v chybn kultivaci nebo pracovnm postupu, ale tak ve vlastnostech pouitho kmene. Z tchto dvod tak kontrolujeme identitu a istotu vech pouvanch kultur, a to jak makroskopicky, tak i mikroskopicky a pomoc biochemickch test. O istot a souasn i homogenit kultury se pesvdujeme pouitm nkter z isolanch metod a testovnm jednotlivch koloni. Pitom je nutn, aby kad student provdl vechny pokusy sm a zskal jistotu, e pslunou metodiku dobe zvldl, nikoliv tedy aby si preparty a jin sten vsledky vymoval s kolegy. 1.1 protokol Mikrobiologick prce je asov velmi nron, vzhledem k tomu, e ji v pprav pokus je nutn vysterilovat vechny potebn pomcky vetn ivnch pd a fermentanch medi, asov zdlouhav me bt i oivovn a testovn pouitch mikroorganism spojen s jejich kultivac. Jeliko mikrobiln buky pouvan v pokusu mus bt vtinou uritho st (8h, 24h, 48h), je teba vnovat velkou pozornost pesnmu naplnovn prbhu cel prce vetn ppravnch prac, nasazen pokusu a jeho dal zpracovn. Bhem laborato plnuj pracovn program a ppravu pomcek vyuujc, take studenti vas dostvaj vhodn materil a pomcky. Pi plnovn pokusu si experimenttor mus dobe uvdomit el a cl pokusu a vechna skal, kter by mohla zkreslit vyhodnocen. Mus se seznmit se souasnm stavem problematiky prostudovnm literatury, zskat a otestovat biologick materil, vyzkouet si vhodnost a pesnost potebnch analytickch metod. Teprve pot me pistoupit k podrobnmu rozpisu pokusu vetn ppravnch prac a naplnovat ve Strana4 Plnovn mikrobiologick prce, jej organizace, veden

podle jednotlivch dn. Pi plnovn prce je vdy nutn potat s uritou rezervou ivnch pd a sterilnch pomcek, aby rozbit nebo rozlit jedin ndoby nezabrnilo v spnm pokraovn prce. Jestlie zanme pracovat na nov problematice, plnujeme prvn pokus pomrn jednoduch, nebo pi nm bychom mli pedevm zjistit, zda cel pokus lze naimi prostedky spn zvldnout. Teprve pot, kdy metodika pokusu je dobe propracovna, lze plnovat komplikovan pokus, sledujc rzn varianty a sledujc seriovou prci, je je vdy ekonomitj ne individuln stanoven. Pi vech pokusech nesmme zapomnat na vhodn kontroly a na dostaten opakovn pokus, pokud je to mon, tak na jejich statistick vyhodnocen. O pokusu a vech analysch, kter jsou provdny vedeme strun, ale pehledn protokol, kde vedle elu a cle prce je uveden rozpis pokusu, pouit materil a jeho pvod (u mikroorganism se vedle nzvu druhu uvd tak oznaen kmene a jeho zdroj), st kultury, medium na nm byl mikroorganismus pstovn, zpsob kultivace (povrchov, submerzn, za tepn, nebo staticky atd.), sloen a postup ppravy roztok, inidel, a pd, daje o kultivanch podmnkch (teplota, pH, doba) i prbh pokus vetn ppadnch drobnch zvad, abnormalit a jinch podrobnost. U kadho protokolu mus bt uvedeno datum, je-li to nutn i hodina proveden danho men. Kad pokus je vyhodnocen graficky nebo tabulkou, u mikroskopickch prac i obrzkem. Na zvr je ukonen diskus vsledk a zvrem, kter hodnot dosaen vsledky i pouit metody a ppadn uvd nmty pro ovovac a roziujc pokusy. Cel protokol mus bt veden tak, e popsan pokus me bt kdykoli kmkoli pesn zopakovn. Souasn dobe zapsan pokus by ml experimenttorovi umonit zjistit, kde eventueln dolo k chyb pi realizaci plnu (nap. chybn navka, chyba v pprav pdy apod.). Z tohoto dvodu jsou pro experimenttora dleit protokoly z nezdaench nebo nedokonench pokus. 1.2 Zskvn mikrobilnch kultur Kad mikrobiologick pracovit, a u jde o pracovit pedagogick, vzkumn, analytick nebo technologick, m obyejn men pracovn sbrku mikroorganism, v n udruje pouvan ppadn i srovnvac kmeny. Krom toho existuj vt sbrky mikroorganism, kter jsou organizovny z hlediska prmyslovch, zemdlskch, zdravotnickch nebo vdeckch poteb, mikroorganism a zaslaj je na objednvku adatel. Protoe udrovn a kontrola Strana5

istoty eventueln stabilita vlastnost mikrobilnch kultur jsou pomrn nkladn, tuj sbrky za kad dodan kmen urit poplatek. Nejvt sbrkou mikroorganism v esk republice je sbrka mikroorganism v Brn (zkratka CCM Czech Collection of Microorganisms), kter dov obsahuje nkolik tisc kmen bakteri a stovek kmen plsn. Ron rozesl adu z nich do tuzemska i zahrani. Tmto zpsobem sbrka zskv i urit prostedky pro objednvn kmen ze zahraninch sbrek. Z potravinskho hlediska je dleit sbrka mlnch kultur mlkrenskho prmyslu, umstn ve vzkumnm a vvojovm zvod v Praze 6, kter udruje kolem 800 mikrobilnch kmen, vtinou bakteri. 1.3 Zazen, pstrojov vybaven a pracovn pomcky na mikrobiologickm pracoviti Jak ji bylo uvedeno, prce v mikrobiologick laboratoi se v mnoha aspektech znan li od prce v bn chemick laboratoi. Tyto rozdly vyplvaj hlavn z toho, e mikrobiolog pracuje s ivmi organismy a jejich poadavkm mus poddit nejen metodiku, ale i vybaven laboratoe. V mikrobiologick laboratoi proto pouvme nkter mn bn pomcky. Laboratorn nbytek mus vyhovovat charakteru prce v mikrobiologick laboratoi a poadavkm ast desinfekce. Pstroje uren pro mikrobiologick pracovit slou vhradn pro provdn mikrobiologickch rozbor : Mikroskop Pat do zkladnho vybaven kad mokrobiologick laboratoe. Tm, e umouje studovat pedmty pouhm okem neviditeln, stv se nezbytnou pomckou pi studiu morfologie mikroorganism. Podrobn viz mikrobiologick metody. Chladnika Slou k uchovvn vzork urench k rozboru, sterilnch kultivanch medi v kultivanch ndobch, nebo kultur mikroorganism. Chladnika by mla spolehliv udrovat teplotu v rozmez 1-4oC a nemla by bt uvna k jinm ne ve uvedenmm elm. Je t vhodn pokud kultury mikroorganism a ist kultivan media jsou uchovvny odlen, ve dvou odlench chladnikch. Mrazc box - Pstroj se pouv k uchovvn lyofilizovanch kultur mikroorganism (-20oC), skladovn nkterch antibiotik (sloky specilnch medi), Strana6

enzym (restrikn enzymy), mikrobilnch, zsobnch kultur v glycerolu (-80oC) a nkterch chemikli. Okovac box - Okovn provdme v okovacch boxech (tzv. laminrn box nebo flow-box). Tato zazen jsou vybavena filtry, kter umouj sterilaci vzduchu, je laminrn proud uvnit zazen, a tm je zajitno steriln prosted uvnit okovacho boxu. Pracovnk me do vnitnho prostoru vsunovat pouze ruce, jinak je od vnitn, steriln sti zazen oddlen sklem. Toto sklo nejen zabrauje kontaminaci je by mohla pijt zven, souasn vak chrn pracovnka nap. ped ppadnm vdechnutm mikroorganism s nimi pracuje. Laminrn box je vybaven pvodem plynu, vody, elektiny ml by bt vybaven i germicidn zivkou. Inkubtory - Tato zazen se pouvaj pro kultivaci mikroorganism pi konkrtnch teplotch odpovdajcch optimln teplot rstu, v ppad rozbor pi teplotch danch pslunou normou. Tato zazen jsou vybavena termostaty, u nich je mon teplotu regulovat. Nejvhodnj jsou inkubtory vodn, mn pak inkubtoey teplovzdun, kter neudr nastavenou teplotu pi krtkodobch vpadcch elektrick energie. Vodn lze Pedevm slou k provdn pasterizace vzork pro stanoven sporulujcch mikroorganism, ve zvltnch ppadech k rozvaovn ztuhlch kultivanch medi nebo novch medi, kter obsahuj sloky, je nen mono sterilovat v autoklvu. Homogeniztor- Toto zazen se pouv pi pprav vzork s jinou ne tekutou konzistenc, pro rozmlnn vzork tuh konzistence ped jejich okovnm ppadn zeovnm. V zsad existuj dva typy homogeniztor, rotan a peristaltick. Rotan homogeniztor mus bt vybaven sklennmi nebo kovovmi uzavratelnmi ndobkami, kter snesou sterilaci. Soust poeristaltickho homogeniztoru jsou steriln sky, v nich je vzorek homogenizovn ve zeovacm roztoku. Obecn plat, e velikost sku by mla bt dvojnsobn oproti objemu vzorku. Pouit homogeniztoru je upraveno SN ISO 6887 (56 0102). Vvva Pouv se pro membrnovou filtraci. Nejvhodnj je olejov, pokud ta nen k dispozici, lze pout i vodn. UV lampa Toto zazen se obecn pouv k rznm elm. K vyhodnocovn fluorescence se uvaj UV lampy o vlnov dlce 360 nm. Pi mutanch pokusech, kdy jsou suspenze mikroorganism ozaovny po uritou dobu

Strana7

UV svtlem z urit vzdlenosti. Vsledkem je zskn istch kmen s odlinm genotypem a fenotypem. UV (germicidn) lampa se pouv ke sterilaci kontaminovanho prosted, nebo obecn prostor a ploch mikrobiologickho pracovit, kde se pracuje s mikroorganismy, a k likvidaci aerosol. Tento zpsob sterilace prosted se uv v noci, v ppad neptomnosti pracovnk. Nejvy innosti je dosaeno pi 200-280 nm, optimum je 260 nm. Komern vyrbn germicidn lampy emituj UV zen o vlnov dlce 253,7 nm a nelze je zamovat s UV lampami uvanmi k vyhodnocovn fluorescence (360nm). Vhy Pro vt navky se pouvaj vhy s pesnost minimln 0,1 g a monost navky do 200 g. Na navky ni ne 2 g se pouvaj analytick vhy s citlivost 0,1 mg a navkou do 10 g. pH metr slou ke stanoven pH kultivanch medi a roztok. Vhodn jsou pH metry schopn mit s pesnost 0,1 pH jednotky. Odstedivka je pstroj, kter pat k zkladnmu vybaven mikrobiologick laboratoe, pestoe vtina metod mikrobiologickho rozboru toto zazen nevyaduje. Je urena k separaci suspendovanch stic hmoty v kapalin, nebo oddlen mikrobilnch bunk od kultivanho media. Odstedivka je v souasnosti t hodn vyuvna u metod molekulrn biologie (isolace plasmidov, chromosomln DNA). Tepaka je pstroj pouvan pro kultivaci mikroorganism, pi inkubaci nkterch roztok a suspenz, pprav vzork urench k rozboru. Pohyb je horizontln, krouiv, a u vtiny tepaek lze regulovat rychlost i polomr otek. V souasn dob se vyrb i termostatovan modely (vodn i se vzdunou atmosferou) s monost regulace teploty. Nkter uzaven pstroje jsou vybaveny i umlm osvtlenm. Laboratorn sklo Mikrobiologick sklo se li od chemickho nejen tvarem ndob, ale i jakost. Zkladnm poadavkem je odolnost vi vysokm teplotm, kterch se pouv pi horkovzdun sterilaci. Sklo slouc k dle trvajcmu uskladovn ivnch pd m bt I. hydrolytick tdy, tzn. vod dokonale odoln sklo, u kterho nedochz k vyluhovn chemikli do media bhem skladovn. Kultivan ndoby Mikrobiologick zkumavky - maj na rozdl od chemickch silnj stny a rovn okraje. Uvaj se pro tekut, ztuen i tuh pdy pi kultivaci, udrovn kultur a Strana8

biochemickch testech. Zkumavky uzavrme ztkami z obyejn nebo buniit vaty, druh je mnohem levnj, a proto j dvme pednost. Ztky mus zasahovat dvma tetinami sv dlky dovnit zkumavky a mus bt dostaten pevn, aby zabrnily pstupu kontaminujc mikroflory. Pli tvrd ztky jsou vak bhem sterilace nebo vvoje plynu vytlaovny. Postup vroby ztek je znzornn na obr. 1. Msto vatovch ztek se t pouvaj hlinkov uzvry, nebo patentn kovov ztky. Vedle sklennch zkumavek se pouvaj i umlohmotn zkumavky na jedno pouit, kter vrobce dodv ji steriln v zatavench polyethylenovch scch. Tyto zkumavky vak nejsou odoln vi vysokm teplotm. Jejich pouit je vhodn, protoe et as a energii obzvlt v servisnch mikrobiologickch laboratoch, kde se provd velk mnostv rozbor denn. Baky pouvaj se vtinou knick (Erlenmayerovy) nebo obyejn varn. Ztkujeme je podobn jako zkumavky. Pouvaj se hlavn k pprav ivnch pd a kultivace v tekutch pdch. Dve se asto pouvaly speciln kultivan baky se zabrouenou sklennou epikou na ochranu vatov ztky ped zvlhnutm (obr. xxx) a poppad jet s oko-vacm tubusem (obr. xxx). Pro zskn vtho povrchu substrtu se pouvaly Fernbachovy baky (s tubusem a bez tubusu) a Houleovy baky apod. (obr. xxx). Misky pouvaj se pro ztuen pdy nebo sklkov kultury. Nejbnj jsou Petriho misky o prmru 50 mm, 90 mm, 100 mm. Misky s dlenm dnem jsou vhodn pro souasn pouit rznch substrt a pro spolen pstovn aerob a anaerob. Vedle sklennch misek se stejn jako v ppad zkumavek pouvaj misky z uml hmoty na jedno pouit, kter vrobce dodv ji steriln v zatavench polyethylenovch scch. Plynovky Pro sledovn vvoje plynu (nap. zkvaovn cukru kvasinkami) se pouvaj Durhamovy plynovky (obr. xxx), co jsou mal zkumavky vkldan dnem vzhru do bakteriologickch zkumavek. Mikroskopick sklka K pprav prepart pouvme podlon sklka velikosti cca 76 mm x 26 mm a kryc sklka velikosti 20 x 20 mm o tlouce 0,16 nebo 0,17 mm. ist sklka uchovvme v Petriho miskch, pouit je nutn vkldat ihned do kyselho alkoholu (ethanol + 3% HCl) nebo do 95% ethanolu, aby nezaschla a neslepila se. Nov podlon a kryc sklka dvme na nkolik hodin do alkoholu s 3%HCl, oplachujeme nejdve vodovodn, pot destilovanou vodou, osume filtranm paprem a vyletme suchm hadkem. Strana9

Pouit sklka shromaujeme v kyselm alkoholu, tuk odstraujeme xylenem nebo chromsrovou kyselinou. Po nkolikerm oplchnut je vkldme na nkolik hodin do 50% alkoholu. Dal postup je stejn jako u novch. istotu sklek zkoume kapkou destilovan vody, kter mus tvoit souvisl film. Podlon sklka K pprav visutch kapek a vlhkch komrek pouvme podlon sklka s kruhovou prohloubeninou uprosted. Vlhk komrky jsou vhodn k pmmu pozorovn vzniku pseudomycelia u kvasinkovch mikroorganism. Thomova nebo Brkerova komrka Slou k potn mikroorganism. Pipety - Pro pipetovn roztok nebo sterilnch kultivanch medi pouvme stejn jako v chemick laboratoi dlen pipety. Nov sklenn pipety vkldme do oxidan smsi (chromsrov kyselin), aby se zbavily mastnoty. Po vyjmut ze smsi je pipety nutn dn omt vodou. Pro odmovn medi obsahujcch mikroorganismy se podle SLP (sprvn laboratorn praxe), jej pravidla jsou zavedena do novch norem pro prci v mikrobiologick laboratoi, se nesm pouvat pipetovn sty. Z tohoto dvodu se pro dvkovn a odmovn rznch objem pouvaj steriln odmrn vlce, nebo v ppad malch objem mikropipety s vymovatelnmi sterilnmi pikami na jedno pouit, kter jsou vyrobeny z uml hmoty. Tyto piky jsou bu vrobcem dodvny nesteriln nebo ve specilnch krabikch ji steriln. Nesteriln piky lze sterilovat autoklvovnm, nikoli suchm teplem v hor-kovzdunm steriltoru. Ndobky na barviva a jin kapaliny Jde o bn indiktorov lahviky s kaptky. Pro alkoholick vzorky se doporuuje kaptka uzavt gumikou, aby barviva nemnila vysychnm koncentraci. Pro imerzn olej a xylen pouvme lahviky se ztkami s tyinkou. Pouit sklenn ndob (i s kulturou) je nutn nejdve autoklvovat (1/2 hodiny pi petlaku 0,1 Mpa), potom jet za horka obsah ndob vylt a mt obvyklm zpsobem. Polyethylenov ndob na jedno pouit se i s obsahem vkld do specilnch pytl z uml hmoty, kter jsou odoln vi vysokm teplotm v autoklvu. Cel pytel i s obsahem se po zautoklvovn odn do pedem vyhrazenho odpadu. Preparan a okovac pomcky Pro okovn a ppravu prepart pouvme okovac jehly chromniklov, zdka platinov (obr. xxx), o prmru oka cca 2 mm. Pro rkovn je vhodn oko odchlit asi o 30o od pmho smru. Dle se pouvaj tvrd ocelov preparan jehly (obr. xx), tyinky, pinzety, lancety (obr.x),

Strana10

skalpely. Pasteurova pipeta (obr. xx) je do kapilry vytaen trubika, uzaven na irm konci vatou. Sterilizan zazen Autoklv Jedn se o speciln zazen, v nm pi zahvn dochz ke vzniku zvenho tlaku pry, a tak k peht vnitnho prostoru na vy teplotu ne 100oC. Vtinou se uv tlak 0,1 Mpa, ktermu odpovd teplota 121oC. Autoklv mus bt vybaven regulanm zazenm pro regulaci teploty i doby sterilace. Bn slou pro mikrobiologick ely, k bezpen sterilaci vtiny kultivanch medi a roztok, nkterch umlohmotnch pomcek (kyvety, piky, mikrozkumavky atd.) a k likvidaci jakhokoli infikovanho nebo kontaminovanho materilu. Pro sterilaci istch medi a pomcek by ml bt uren jin autoklv ne je uvn pro likvidaci. Autoklvy se nepouvaj ke sterilaci sklennho ndob. Pouit Papinova hrnce je nevhodn, vzhledem k tomu, e v tlakovm hrnci lze doshnout petlaku pouze 0,05 MPa, co odpovd teplot 112oC. V dnen dob jsou autoklvy vybaveny tak, e lze nastavit i reim sterilace v proudc pe pi teplot maximln 100oC. Tento zpsob se pouv pro frakcionovanou sterilaci ltek choulostivch na teplotu a medi, kter tyto ltky obsahuj. Toto vybaven nahrazuje tzv. Kochv parn hrnec. Horkovzdun steriliztor Existuje mnoho typ horkovzdunch steriliztor, kter udruj teplotu 160-180oC po dobu 1 a 3 hodin (ponaje dobou, kdy teplota doshla 160oC). Krom teploty lze regulovat vtinou i dobu sterilace a registrovat teplotu. Horkovzdun steriliztory se vhradn pouvaj ke sterilaci laboratornho skla a nkterch pomcek. Sterilizan filtry Pouvaj se pro sterilaci irch kapalin, kter nesnej zahvn. Je to bu asbestocelulosov filtr (tzv.Seitzv filtr), nebo nyn astji membrnov filtr, kter m velikost pr 0,1-0,2 , ppadn 0,3-0,5 m. Pro laboratorn mikrobiln filtraci se tak pouvaj sklenn sintrov kelmky nebo nue (nap. kelmek G5). 1.4 Popis mikroskopu Mikroskop se skld z mechanick a optick sti : 1.4.1 Mechanick st mikroskopu Strana11

Mechanickou st tvo stativ (noha mikroskopu), tubus a stolek. Noha mikroskopu je spojena s nosiem kloubem, kter umouje tubus naklnt. Na nosii jsou dle umstny 2 rouby makrometrick a mikrometrick. Tyto rouby umouj hrub a jemn posuv tubusu ve smru optick osy mikroskopu, a tm plynul zaostovn pozorovanho objektu. Tubus udruje optick systmy mikroskopu (okulr, objektiv) v konstantn vzdlenosti. Na spodnm konci tubusu je umstn objektiv a shora je zasunut okulr. Vzdlenost mezi hornm a dolnm okrajem tubusu je mechanick dlka tubusu. Tato dlka bv obvykle 160 mm nebo 170 mm. Optick dlka tubusu, co je vzdlenost ohnisek okulru a objektivu, se mn podle pouitch okulr a objektiv. Okulry se vymuj prostm vyjmutm a zasunutm, bez dalho upevovn. Pro rychlou vmnu objektiv slou tzv. revolverov mni, umstn na tubusu. Vmna se provd otenm nosnho kotoue, ve kterm jsou jednotliv objektivy naroubovny. Prepart, kter se pokld na stolek mikroskopu se pichycuje provmi svorkami nebo kovm vodiem prepartu. Stolky bez kovho vodie jsou obyejn otiv a krom toho posuvn. 1.4.2 Optick st mikroskopu Optick st se skld ze dvou soustav oek, je vytv obraz pedmtu (objektiv, okulr) a z osvtlovacho zazen. Objektiv vytv obraz objektu reln, pevrcen a zvten. Tento obraz je zvten okulrem tak, aby detaily zobrazen objektivem bylo mono pozorovat okem. To jak detaily je objektiv schopen rozliit, je dno hodnotou jeho tzv. numerick apertury A : Kde A = n . sin n = index lomu prosted mezi eln okou objektivu a prepartu sin = polovina otvorovho hlu objektivu (tj. hlu mezi optickou osou a krajnmi paprsky vchzejcmi do objektivu). Na numerick apertue A a vlnov dlce pouitho svtla zvis rozliovac schopnost objektivu a : a = /A a = nejmen rozmr struktury, kter lze rozliit (rozliovac schopnost mikroskopu) = vlnov dlka pouitho svtla Pi konstantn vlnov dlce pro bl svtlo (500-550 nm) lze doshnout maximln rozliovac schopnost tm, e pouijeme objektiv s vysokou numerickou aperturou. Toto sloje na na objektivu vyraeno pod slem udvajcm linern zvten. Protoe otvorov hel me mt pouze hodnoty ni ne 180o , maximln dosaiteln hodnota sin je kolem 0,95. Index lomu vzduchu je piblin roven 1.

Strana12

V tomto ppad me numerick apertura nabvat pouze hodnot od 0 1. Vych hodnot lze doshnout zmnou prosted mezi prepartem a objektivem. Mluvme o tzv. imerznch objektivech, z nich nejpouvanj jsou olejov imerze, kde mezi prepart a eln oku objektivu kpneme cedrov olej, kter m index lomu piblin stejn jako sklo (n=1,33). Znamen to, e paprsky prochzej opticky homogennm prostedm, nelmou se a vstupuje jich do objektivu vce ne u ostatnch tzv. suchch objektiv. Nejlep imerzn objektivy maj n = 1,3 1,4. Rozliovac schopnost svtelnho mikroskopu dosahuje hodnot kolem 210-7m. Celkov zvten mikroskopu vypoteme, nsobmeli zvten objektivu zvtenm okulru. Toto celkov zvten je nutn stanovit pedem, aby nedolo k pekroen uitenho zvten . To je omezeno numerickou aperturou tak, e dosahuje jejho 500 1000 nsobku. Z toho vyplv, e e u objektivu s A 0,65 me bt celkov zvten mikroskopu 325 a 650 nsobn. Vt zvten je bezvznman, a proto je nazvme przdnm. Nedv dn dal detaily. Osvtlovac zazen se skld ze zrctka a kondenzoru, jen je na spodu opaten irisovou clonnkou. Zrctko m jednu stranu plochou a druhou vypouklou. Ploch zrctko se nastavuje pi pouit objektiv s malm zvtenm (do 45), u vech ostatnch je nutno pracovat s vydutm zrctkem. Kondenzor je optick soustava oek s velkou aperturou A= 1,2-1,4, jejm kolem je soustedit ir svazek svtelnch paprsk odraench zrctkem na pozorovan prepart. Irisovou clonkou kondenzoru je mon regulovat mru osvtlen prepartu a tm souasn mnit numerickou aperturu kondenzoru. Kondenzor je umstn pod mikroskopickm stolkem a je posunovateln ve svislm smru. Jako zdroje svtla pouvme elektrick lampy pro mikroskopovn, u novjch mikroskop je svtlo umstn pmo v noze stativu. 1.4.3 Zkladn postup pi mikroskopovn

1. Mikroskop se dr vdy za stativ. 2. Do revolverovho mnie se naroubuje objektiv od nejslabho do nejsilnjho po smru hodinovch ruiek. Do tubusu se vsune okulr stedn sly (10). Zrctko se nastav tak, aby cel zorn pole bylo osvtleno. 3. Prepart se umst na mikroskopick stolek tak, aby leel v optick ose mikroskopu. 4. Otenm makrometrickho roubu se pomalu sniuje objektiv ke krycmu sklku a ze strany se pozuruje vzdlenost, aby objektiv nenarazil do sklka a nepokodila se

Strana13

eln oka. Osvtlen se uprav pomoc zrctka, clony a svislho posuvu kondenzoru. 5. Makroroubem se tubus pomalu zdvih tak dlouho, dokud se hledan obraz neobjev v zornm poli. Doost se mikrometrickm roubem a prepart se nastav do stedu zornho pole. U monookulrnho typu mikroskopu se prepart pozoruje levm okem a prav se nech oteven. 6. Po prohldnut prepartu malm zvtenm se objektiv vymn za silnj pomoc revolverovho mnie. Barevn preparty se pozoruj pi oteven clonce. 7. Pi mikroskopovn s imerznm objektivem se kpne kapka cedrovho oleje na eln stranu oky kondensoru, kter se pedem sni. 8. Na stolek se vlo prepart a kondensor se pomalu zdvih a olej spoj oku s podlonm sklkem. Sthne se clonka kondenzoru, pot se kpne kapka cedrovho oleje na fixovan prepart nebo kryc sklko a objektiv se pomalu sniuje, a se eln oka pono do oleje. 9. Tubus se dle pomalu zved, aby nedolo k peruen spojen oky s olejem a pozuruje se, kdy se v zornm poli kmitne obraz objektu. Pot se tubus opatrn sniuje, a se obraz znovu objev. Mikrometrickm roubem se obraz zaost a uprav se osvtlen. 1.4.4 Pe o mikroskop

1. Mikroskop m bt uloen tak, aby byl chrnn ped prachem, vpary kyselin a pmm slunenm svtlem. 2. Horn konec tubusu nesm zstat oteven, aby prach nevnikl do mikroskopu a neusadil se na vnitn stran mikroskopu a zadn oce. Do tubusu se proto vkld okulr nebo speciln kryc destika. 3. ocky se nejlpe ist lnnm pltnkem ovlhenm xylenem nebo benzenem a ihned se osu. U modernch mikroskop vrobce dodv speciln roztoky pro itn oek. Objektivy se nikdy nesm rozroubovvat, jeliko by se poruilo pesn nastaven a centrace oek. U okulru meme naopak ob oky rozroubovat. 4. Mechanick sti se nejlpe ist k. 5. Po del dob pouvn je nutn pedat mikroskop odborn kontrole. 1.4.5 Fzov kontrastn mikroskopie Strana14

Tento zpsob mikroskopovn je zvlt vhodn pro studium struktury ivch bunk. Je zaloen na rozdlnm chovn svtla pi prchodu zbarvenm, ili sten absorbujcm objektem, nebo nezbarvenm, zcela transparentnm objektem. V prvm ppad dochz k stenmu absorbovn urit vlnov dlky prochzejcho svtla. Dochz pitom ke zmn amplitudy svtelnho vlnn, kter nae oko zachyt jako zmnu barvy (Obr. XXX). Vsledn vlna vznik interferenc pvodn vlny a vlny po difrakci, kter je posunuta oproti pvodn o 180o. V ppad zcela transparentnho objektu se amplituda nemn, ale vzhledem k rznm refraktivnm vlastnostem objektu bude prochzejc vlna bu zpodna nebo v pedstihu proti pvodn vln, tzn. bude mezi nimi fzov posun (Obr. XXZ). U transparentnch objekt je difrakc vznikl vlna posunuta oproti pvodn o rzn hel. Pro slab lmav objekty, asto sledovan v mikroskopu, je fzov posun 90o, tj. 1/4 dlky vlny. Pouitm optickho zazen je rozdl ve fzi mezi pvodn svtelnou vlnou a vlnou po difrakci zven z asi 90o na 180o, take se ob vlny pi interferenci co nejvce ru. Nastane obdobn situace jako na obr. XXX, tzn. jako by svteln vlna prola barevnm objektem. Lidsk oko a fotografick materil bude tento zcela transparentn materil vnmat jako by sten absorboval svtlo. Vtina ivch bunk je ve svtelnm mikroskopu tm transparentn. Rzn sti bunk a organely se li indexem lomu a tloukou. Tyto rozdly jsou fzovm kontrastem pevedeny na zmny intenzity svtla, piem nekles rozliovac schopnost ani kvalita obrazu. iv bakterie se pi fzov kontrastn mikroskopii jev jako zbarven. U kvasinek a plsn jsou patrn jednotliv sti bunk.

Praktick proveden : 1. Vym normln objektivy za fzov a kondenzor za kondenzor s fzovmi clonami. 2. Fzov kondenzor nastav na normln osvtlen ve svtelnm poli, tj. bez fzov destiky (oznaeno na okraji mnie fzovch destiek jako 0). 3. Zaosti prepart pi znan zen clon kondenzoru a nulov poloze mnie destiek. 4. Otevi pln irisovou clonku kondenzoru a mniem nastav pslunou fzovou destiku (nap. pro 10x zvtujc objektiv destiku . 10, apod.). Vym okulr za pomocn mikroskop a zaosti na fzovou destiku, kter je v zornm poli zobrazena

Strana15

jako prstenec. Mimo to je v zornm poli vidt prstenit clona kondenztoru, kter jasn z. 5. Centranm zazenm pod kondenztorem, tj. dvma kli zasunutmi do pslunch otvor mnie pohybuj tak, aby obrazy obou prstenc byly koncentrick. Svtlo prochzejc prstenitou clonou kondenzoru nesm prosvtat na okraji fzov destiky objektivu. 6. Nasa okulr a pozoruj fzov kontrastn objekt. Poznmka: Objekt pozorujeme ve lutozelenm svtle, kter dostaneme pouitm filtru, jen je soust vybaven fzovho kontrastu.

Strana16

2.

KULTIVACE MIKROORGANISM Abychom udreli mikroorganismy v ivotnm stavu, musme je pravideln

pomnoovat, tj. kultivovat za optimlnch podmnek s nsledujcm uchovnm za takovch podmnek, kdy strnou a tud i odumraj co nejpomaleji (viz kap. ).Pomnoovn mikroorganism je nutn tak pro zskn vtho mnostv jejich bunn hmoty potebn k biotechnologickm elm (pak hovome o propagaci mikroorganism) nebo pro mikrobiologick, biochemick i genetick studie. Pro kultivaci potebujeme vhodn steriln ivn pdy v kultivanch ndobch, okovac pomcky, inkubtor (tj. termostat) nebo temperovan box a nkdy jet zazen pro regulaci pstupu vzduchu ke kulturm. 2.1 ivn pdy ivn pdy neboli media, pouvan pro kultivaci mikroorganism mus vyhovovat vem nrokm pslunho mikroorganismu na vivu , na pH, osmotick tlak a dal fyziklnchemick podmnky. Zkladn vlastnosti vech ivch pd jsou: 1. 2. Dostatek vody, nebo ivotn pochody probhaj jen ve vodnm prosted. Ptomnost potebnch ivin ve vhodnch koncentracch ,a to : a) zdroje energie (u fototrofnch je nahraen svtlem, u heterotrofnch organism je stejn se zdrojem uhlku), b) zdroje uhlku (cukry, blkoviny, organick kyseleny nebo alkoholy, pro autotrofn bakterie CO2), c) zdroje dusku (NH4+, NO3-, aminokyseliny, blkoviny a jejich sten hydrolyzty, jako jsou proteosy a peptony; jen pomrn malm skupinm mikroorganism sta jako zdroj dusku plynn N2), d) ostatn biogenn prvky a prvky oligogenn,nejastji ve form anorganickch sol. Nkter ivn pdy obsahuj jet specifick faktory, nap. nadbytek SO4- pro bakterie redukujc srany, rstov faktory (vitamny, aminokyseliny) nutn pro auxotrofn mikroorganismy aj. Strana17

Jako ivn pdy slou nkter prodn ltky (nap. mlko, pltky mrkve nebo brambor). U tzv. umlch pd, kam pat i sladina a bujon, jsou zdrojem vitamn a aminokyselin vtaky prodnch ltek. Jako zdroj vitamn slou hlavn sladov vtaek, vluh ze sladovch klk, kvasnin autolyzt, zahutn mec vody z vroby kukuinho krobu, masov vtaek apod. Zdrojem aminokyselin je hlavn hydrolyzt kaseinu. U tzv. syntetickch pd je pesn udno chemick sloen, take pouv istch vitamn, aminokyselin a stopovch prvk atd. K rozpoutn vech sloek syntetickch pd se pouv destilovan voda. Podle konzistence rozdlujeme pdy na tekut (mlko,masopeptonov bujon, sladina), ztuen agarem nebo elatinou a tuh (mrkev,brambor). Podle elu rozliujeme pdy veobecn, na nich se rozmnouj velk skupiny mikroorganism (masopeptonov bujon pro bakterie, sladina pro kvasinky a plsn), selektivn, zvhodujc rst urit skupiny mikroorganism, nebo diagnostick pdy, na nich roste jen velmi uzk skupina mikroorganism. 2.1.1 Pprava ivnch pd K pprav ivnch pd z prodnho materilu se pouv vtinou vodovodn voda, kter vak nesm bt tvrd a nesm obsahovat vt mnostv eleza a chlorid. Tak siln chlorovn je na zvadu. K pprav syntetickch a specilnch ivnch pd pouvme destilovanou vodu, pro analytick stanoven vitamn a aminokyselin pomoc mikroorganism nutno pout redestilovanou nebo deionizovanou vodu. ivn pda se pipravuje rozputnm jejich soust ve vod za ppadnho zaht a neustlho mchn. Pak se uprav pH, pda se zfiltruje, rozpln do vhodnch ndob (bank nebo zkumavek) a ihned steriluje. Pro ztuen pd se ped sterilac pidv pslun mnostv agaru. Komern dodvan tzv.suen ivn pdy (nap. od firmy Oxoid) maj ji upraven pH a jsou z hlediska ppravy velmi jednoduch. PH ivnch pd se upravuje pomoc 1n NaOH nebo 1n H2SO4. Pdy pipraven z p-rodnch materil maj reakci obyejn kyselou. Pro bakterie je nutno upravit pH 7,07,3, kdeto kvasinky a plsn vyaduj kyselou reakci (pH 4,56,0). Sterilac pd klesne jejich pH o 0,1 0,3. Filtrace pd se provd skldanm filtrem, u siln vyvlokovanch pd se msto filtranho papru pouije vrstva obyejn vaty. Prvn podl filtrtu se vrt na filtr.

Strana18

Ztuovn ivnch pd se nejastji provd pomoc agaru v mnostv 1,5-3,0%. Agar je polysacharid, zskan z moskch as. Rozvaen agaru v pd se provd na vodn lzni nebo v autoklvu. Bod tn agarovch pd je 96C, bod tuhnut 37-42C. Pprava jednotlivch pd je uvedena v seznamu ivnch pd na konci tohoto skripta.

2.1.2

Rozlvn pd a jejich uchovvn

Tekut nebo ztekucen ivn pdy plnme ihned po pprav do sterilnch bank nebo zkumavek, opatench vatovmi ztkami nebo patentnmi uzvry. Pro plnn zkumavek pouvme nlevek uzavench tlakou na napojen hadice (obr. ), u neztuench pd meme pout tak byrety. Pi rozlvn se nesm pdou potsnit okraje ndob ani ztky, nebo by zde dolo k pomnoen mikroorganism ze vzduchu a k jejich prorstn ztkou do ndoby. Pdy mus bt sterilovny ihned po jejich rozlit. ikm agary se pepravuj tak, e se zkumavky napln roztavenou pdou asi do 1/3 objemu, vysterilizuj a pak nechaj ztuhnout v ikm poloze (nejlpe openyo lec tyinku nebo pipetu). Horn okraj ikmho agaru se nesm dotkat ztky zkumavky (obr. ).Seikmen se provd krtce ped pouitm, nebo ikm agar rychle vysych. Lit desek (ploten) do Petriho misek se provd asepticky a po sterilaci pd. Agarovou pdu v bace nebo ve zkumavce roztavme na vrouc vodn lzni nebo v autoklvu, okraj ndoby oehneme a ndobku oteveme tak, e ztku uchopme dlan a malkem lev ruky nebo mezi malkem prstenkem lev ruky, je je obrcena dlan vzhru, pak znovu oehneme hrdlo ndoby, palcem a ukazovkem lev ruky ponkud nadzdvihneme vko steriln Petriho misky, vlijeme takov mnostv pdy, aby vznikla vrstva 34 mm vysok (tj. 1520 ml pdy na Petriho misku o prmru 10 cm), vko ihned piklopme a nalvme dal desky. Ztku ndobky bhem lit desek nepokldme. Okraje a vka misek nesm bt potsnny rozlvanou pdou. Po ukonen rozlvn hrdlo ndobky i vnitn st ztky, kterou drme stle v ruce, oehneme a ndobu uzaveme. Rozlvn provdme na vydezinfikovanm stole blzko plamene. Bubliny na povrchu pdy odstranme jet v tekutm stavu pmm plamenem kahanu. Desky nechme ztuhnout ve vodorovn poloze. Po utuhnut je obyejn inkubujeme 23 dny v obrcen poloze (zaven agar) pi teplot, je bude pouvna

Strana19

pro kultivaci mikroorganism. Tm dojde k vhodnmu pedsuen pdy, je je nutn pro povrchov okovn. Krom toho se bhem tto inkubace tak projev ppadn kontaminace desek tvorbou zetelnch koloni, take tyto nevhodn desky mohou bt vyazeny a neznehodnot dal prci. Pro rychl pedsuen desek pouvme surnu o teplot 5070C; doba suen otevench misek, poloench dnem vzhru, je pak 530 minut, tj. do vytvoen nepravidelnch hran na povrchu desky. Pi pouvn misek z uml hmoty nesm teplota pi suen peshnout 60C, nebo by dolo k mknut misek a jejich deformaci. 1) Sterilace pd ivn pdy se steriluj nejastji autoklvovnm pi petlaku 0,10,15 MPa. Sterilan doba je zvisl na objemu a viskozit pdy (20 min. pro zkumavky, 30 min. a 1 hod pro objemy 3 litr). 2) Uchovvn ivnch pd ivn pda se uchovvaj na temnm, bezpranm, suchm a pokud mono chladnm mst. Pro dlouhodob uchovvn se doporuuje chladnika o 5-6C. 2.2 Sterilace ndob, ivnch pd a ostatnch pomcek Kad mikrobiologick prce vyaduje steriln pomcky, tj. pomcky prost vech ivch mikroorganism. Vkon, kterm materil nebo pedmty zbavujeme ivch mikroorganism, nazvme sterilac. Sterilace spov bu v usmrcen ptomnch mikroorganism nebo v jejich odstrann. 2.2.1 Fyzikln prostedky sterilace Z fyziklnch prostedk se v mikrobiologick laboratoi nejastji pouv tepeln sterilace, je se provd nkolika zpsoby. Volba zpsobu zvis na materilu, kter sterilizujeme. 1) Sterilace oehvnm Se pouv pro hrdla zkumavek bank, pro okovn tubusu ndob a sklenn tyinky k jejich uzavrn, pro okovac a preparan jehly, pinzety, podlon skla a jin kovov nebo sklenn pedmty. Strana20

Okovac jehly oehujeme v oxidanm plameni kahanu (viz obr.v kap. ), a to po cel dlce jehly a do hnut drtku a krtce oehneme i tu st drku, kter bude pi okovn zasahovat do kultivan ndoby. Oehujeme tsn ped okovnm a jehlu pak zchlazujeme na nezaokovan pd, ve steriln vod nebo na okraji kultury. Po pouit nutno jehlu ihned znovu oehnout, abychom mikroorganismy z kultury nezneistily prosted laboratoe. U chromniklov jehly vypalujeme zbytky kultury v redukn sti plamene, aby se nerozptlily po o-kol (dleit hlavn pi rozokovn kultur pod parafnovm olejem!) a pak teprve jehlu oehujeme v oxidanm plameni. Redukn plamen nememe pout pro platinov jehly (vznik kehkho karbidu platiny!). 2) Sterilace suchm teplem v horkovzdunm steriliztoru Tato sterilace se pouv pro przdn kultivan ndoby (tj. zkumavky nebo baky uzaven vatovmi ztkami nebo patentnmi uzvry, sklenn Petriho misky zabalen do papr nebo v kovovch pouzdrech), pipety, vatov filtry, paprov, sklenn nebo kovov pomcky, je vesms sterilizujeme zabalen do papru. Such teplo m ni sterilan inky ne teplo vlhk, a proto je nutno pout pomrn vysokch teplot, tj.160oC180C po dobu dvou hodin (pot se od dosaen sterilanch teploty). Tato vysok teplota by ji pokodila ivn pdy, gumov rukavice, tkaniny apod. Sterilovan pedmty vkldme do chladnho steriliztoru, piem steriltor nesm bt pedmty peplnn, aby se nebrnilo cirkulaci vzduchu a pronikn tepla. Paprov obaly nebo vatov ztky se nesmj dotkat stn steriliztoru, aby nedolo k zuhelnn. Po ukonen sterilace nechme zaven steriliztor pomalu vychladnout a teprve chladn steriln pedmty z nj vyjmme. Parafn a parafnov olej sterilujeme suchm teplem pi 150C po dobu 1 hodiny ve sterilnch bakch uzavench vatovmi ztkami. 3) Sterilace vlhkm teplem Sterilace vlhkm teplem se pouv pro ivn pdy, vodu a roztoky pidvan do kultur mikroorganism, dle pro tkaniny, gumov hadice, pro likvidaci nepotebnch kultur apod. Nejpouvanj je sterilace tlakovou parou. Pouv se petlaku 0,10,15

Strana21

MPa, co odpovd teplot 121128C (viz tab. ). K tto sterilaci se pouvaj tlakov ndoby, tzv. autoklvy, kter jsou vytpny plynem, elektinou nebo tlakovou parou. Kad autoklv mus bt opaten manometrem, pojistnm ventilem, vpustnm kohoutem pro pru a vodoznak. Podle bezpenostnch pedpis mus bt autoklvy v pravidelnch intervalech podrobeny tlakov zkouce. Rozliujeme autoklvy jednoplov (obr. ), u nich je vyvje pry spojen otvory se sterilanm prostorem, a dvouplov (obr. ), kde pru z vyvjee pepoutme pomoc ventilu do sterilanho prostoru. Dnes se vtinou vyrbj elektrick autoklvy s automatickou regulac, u nich se pouze nastav zvolen sterilan program.

4)

Frakcionovan (peruovan) sterilace Sterilace proudc parou pouv teploty 99o100C, kter vak neme usmrtit

bakteriln spory. Proto je mono pouvat tuto sterilaci pouze u ivnch pd, v nich bakteriln spory po 24 h uchovvn pi laboratorn teplot vykl a pemn se v rozmnoujc se vegetativn buky, je se dalm zahtm proudc parou usmrt. Pro jistotu postup opakujeme jet tet den, u nkterch pd jet i tvrt den. Jednotliv zhevy trvaj 2030 min a cel postup se pro to nazv frakcionovan (peruovan) sterilace. Pro asovou nronost a ne vdy 100%n innost se pouv tto sterilace pouze u pd, kter by byly tlakovou sterilac pokozeny. 5) Tyndalizace Pro ivn pdy a roztoky, kter nesnej zahvn na 100C, pouvme tzv. tyndalizaci, co je zahvn na teplotu 57C po dobu 1 h, opakovan osmkrt v 24 hodinovch intervalech, bhem nich jsou roztoky uchovvny pi laboratorn teplot. Tento postup nen pli inn, nebo neusmrcuje termofiln bakterie, a proto je v posledn dob u irch roztok nahrazovn filtrac. 6) Sterilace ultrafialovm zenm Sterilace UV svtlem se pouv k usmrcen mikroorganism ve vzduchu a na povrchu pracovnch ploch (v okovacch boxech a laboratoch). Pouvme tzv. germicidn lampy, kter vydvaj zen o vlnov dlce 240280 nm. Lampy jsou zapnuty pes noc nebo ped zapoetm prce. Pi obsluze UV svtla je nutn si chrnit zrak. 7) Sterilace filtrac Strana22

Tento zpsob sterilace se pouv pro plyny a dle pro ir kapaliny, kter by byly zahvnm pokozeny. Pro sterilaci vzduchu pouvme vatov filtry (sklenn nebo kovov trubice naplnn vzdunm filtrem nebo skelnou vatou a sterilovan suchm teplem). Nejjednodum vzdunm filtrem je vatov ztka kultivanch ndob. Pro sterilaci irch kapalin, kter nesnej zahvn, se pouv filtrace pes asbesto-celulosov vrstvy (tzv. Seitzv filtr viz. obr. ) nebo pes membrnov fitltry. Tyto filtry se steriluj v autoklvu. 2.2.2 Sterilace chemickmi prostedky Chemick prostedky se pouvaj v mikrobiologick laboratoi nejastji pro sterilaci (ppadn dezinfekci) povrchu pedmt a pracovnch ploch, dle do ndob pro ukldn pouitch pipet a k rychl likvidaci zbytk kultur, nap. nhodn rozlitch na pracovn ploe. Vzcnji se pouvaj ke sterilaci roztok barviv a jinch ltek, je nemohou bt sterilovny tepeln ani filtrac, a pro konzervaci kultur ped jejich chemickm zpracovnm. Nejpouvanj prostedky pro povrchovou sterilaci jsou:povrchov aktivn prostedky, jako nap. Ajatin (10%n roztok dimethyllaurylbenzylamoniumchloridu nebo bromidu), pouvan ve zedn 1 : 100 a 1 : 200. Jsou to bezbarv. nejedovat, nekorozivn sloueniny povahy kationtovch povrchov aktivnch ltek, a proto se jej innost sniuje v ptomnosti aniontovch povrchov aktivnch ltek, tj.mdel a pracch prostedk.Dal povrchov aktivn ltkou je Persteril (cca 40%n roztok peroctov kyseliny). Pouv se ve zedn 1 : 80.Je vel-mi inn i na kvasinky a plsn, ale i pomrn zedn je siln korozivn. Ethanol m pomrn mal dezinfekn inek. Nejinnj je v koncentraci 50- 70%. Formaldehyd se pouv pro usmrcen mikrobilnch kultur ped jejich dalm zpracovnm. Pro zastaven rozmnoovn se pidv 0,1ml 40%nho formaldehydu do 10 ml kultury. Chemick prostedky se pouvaj k zastaven rstu rychle se rozrstajcch koloni na Petriho misce. Dosahuje se toho vloenm krystalku KmnO4 do stedu kolonie. Podobnho inku se doshne kapkou 10%nho roztoku AgNO3, kter je vak inn hlavn pro bakterie. Pro zastaven innosti kvasinek a plsn v kulturch ped jejich chemickou analzou se pouv allylisothiokyanatan v mnostv 12 kapky/10 ml kultury.

Strana23

2.3

Okovn mikroorganism Pi pstovn nebo-li kultivaci mikroorganism je zapoteb penst do steriln

ivn pdy iv buky danho druhu, co se oznauje jako okovn (inokulace) a penesen buky se nazvaj inokulum. Je samozejm, e pi kultivaci mikroorganism musme postupovat psn asepticky, tzn. e do kultury ani do pouvan pdy nesm vniknout dn ciz mikroorganismy ze vzduchu nebo z pracovnch pomcek. Aseptick prce vyaduje adu zvltnch opaten i znanou zrunost. Hlavn zsady aseptick prce jsou : 1. Pracovat v co nejistm prosted,tj.v mstnosti,kde se nev prach,nen prvan a je dokonal istota. 2. Ruce si omt ped prac mdlem a ott dezinfeknm prostedkem. 3. Povrch pracovn plochy ped prac vydezinfikovat, pracovat blzko plamene a plamen jet ped prac nkolikrt prothnout pracovnm prostorem. 4. Pracovat sice opatrn, ale co nejrychleji. 5. Hrdla ndob i ztky ped a po prci oehnout plamenem. 6. Ztky nikdy nepokldat, ale dret je bhem cel prce dlan a malkem, malkem a prostednkem ap. prav ruky. Pi pipetovn je vhodn dret ztky mezi ukazovkem a prostednkem (dla je obrcen vzhru) nebo malkem a dlan lev ruky. Nikdy se nedotkat rukou nebo jinm nesterilnm pedmtem t sti ztky, je se zasunuje do kultivan ndoby. 7. Ndoby s kulturou nebo steriln roztoky nechvat oteven jen po skuten nezbytnou dobu a oteven dret hrdlem blzko plamene v siln naklonn (tm vodorovn)poloze. 2.3.1 Okovn kultury ve zkumavce na ikm agar Uchop zkumavku s kulturou a zkumavku s nezaokovanm ikmm agarem paraleln do lev ruky obrcen dlan vzhru tak, abys ml nezakryt povrch ikmho agaru a aby zkumavky byly tm vodorovn. Do prav ruky vezmi okovac kliku a oehni ji pomalm protahovnm oxidan st plamene (viz obr.22). Pak oehni okraje zkumavky, sejmi pomoc dlan a malku, malku a prstenku prav ruky ztky ze zkumavek (obr.14), znovu oehni okraje zkumavek, ochla kliku na nezaokovan pd, naber mal mnostv kultury a lehkm klikatm pohybem, vychzejcm ze Strana24

zpst, je penes na cel povrch ikmho agaru. Potom opt oehni okraje zkumavek a doln st jejich ztek, zaztkuj zkumavky, oehni okovac kliku a ulo ve do stojnku. Po zaokovn nebo radji jet ped nm ozna novou kulturu ttkem, nalepenm na hoej st zkumavky (asi 1cm od okraje zkumavky) tak, aby nezakryl agar a pi oehvn nebyl oplen. Na ttku uve nzev, ppadn slo mikroorganismu, zkratku pouit pdy a datum okovn. Po dosaen urit zrunosti je mono souasn okovat na dva nov agary (viz obr.14). 2.3.2 Okovn ze zkumavky do zkumavky tekut nebo ztekucen ivn pdy Zachovvme stejn postup jako pi okovn na ikm agar (kap.3.1) jen s tm rozdlem, e buky uvolujeme do pdy otrnm kliky o stnu pod hladinou kapaliny a pak dobe rozmchme poklepem zkumavky o dla nebo vlivm pohybem mezi dlanmi. Ztekucen ivn pda mus bt ped okovnm vytemperovno ve vodn lzni na vhodnou teplotu (30C u elatiny, 42C u agaru) a po zaokovn bu ihned rozlita do Petriho misky (nutno ped tm oehnout okraj zkumavky!) nebo ihned zchlazena ve svisl poloze pod tekouc vodou. 2.3.3 Okovn z Petriho misky do zkumavek a naopak Zkumavku drme v lev ruce ohnutm ukazovkem. Okovac kliku, umstnou v prav ruce oehneme plamenem, pak oehneme okraj zkumavky, malkem a dlan prav ruky vyjmeme jej ztku, okraj zkumavky znovu oehneme, palcem a prostednkem lev ruky nadzdvihneme vko Petriho misky (obr.15), nabereme kulturu, zaveme misku a kulturu peneseme znmm zpsobem do zkumavky. Pak oehneme okraj zkumavky i vnitn konec ztky, zkumavku zaztkujeme, oehneme okovac klikou a ozname zkumavku ttkem. Pro okovn ze zkumavky na Petriho misku je postup obdobn. V tomto ppad je vhodn pout okovac jehlu s okem odchlenm cca 30 stup od pmho smru, aby se mohlo okovat celou plochou oka. U plsn se doporuuje okovat misky ze spodu, piem se dr spodek misky dnem vzhru. Tm se zabrn rozpren spor po cel ploe desky

Strana25

Zaokovanou misku oznaujeme tukou na sklo, nebo paprov ttek by se v dsledku rozdln tepeln roztanosti skla a papru pi penosu do termostatu nebo z termostatu do lednice odlepil. 2.3.4 Okovn vpichem Vpichu do ztuen pdy pouvme pro pstovn anaerobnch nebo mikroaerofilnch mikroorganism, pro sledovn nrok na kyslk, typu ztekucen elatiny apod. Vpich se provd rovnou okovac jehlou (tj. bez koncov kliky) do svislho agaru nebo elatiny. Postup je podobn jako pi ntru na ikm agar (kap.3.1). Jeliko je teba se vyhnout tvorb krter v pd, mus se rovn jehla thnout dovnit i ven stejnou stopou. Proto je vhodn dret okovanou zkumavku ve vodorovn poloze (nebo ve svisl poloze dnem vzhru) a ruce oprat lokty o stl. Vpich m zasahovat asi 0.5 cm nad dno zkumavky. 2.3.5 Okovn pomoc pipety Pi pevdn vtho objemu tekutho inokula pouvme steriln pipety. Pipetu vyjmeme z obalu a tsn ped pouitm, a to vdy blzko plamene a rukou nebo jinmi nesterilnmi pedmty se j dotkme pouze na hoejm konci, kter nebude zasahovat do kultivan ndoby. Po vyjmut pipety z obalu vyjmeme z ndob s kulturou a s nezaokovanou pdou dlan a malkem, malkem a prstenkem lev ruky ztky (ndoby pidrujeme dlan a malkem prav ruky, v n je pipeta). Pipetujeme-li ze zkumavek, je lpe si zkumavku po vyjmut jejich ztek pendat do lev ruky a pi pipetovn je naklnt hrdlem k plameni. Pipetujeme co nejrychleji a pouitou pipetu odlome do vlce s dezinfeknm prostedkem. Pak oehneme hrdla ndobek i doln st ztek a ndoby rychle uzaveme. Inokulum rozmchme v pd krouivm pohybem. Pro zatenky je vhodnj pracovat ve dvojici, z ni jeden pracuje s pipe-tou, druh otevr ndoby za pslunho oehvn.. 2.4 Inkubace Po zaokovn pdy musme nechat mikroorganismy rst pi jejich optimln teplot, co je pro kvasinky vtinou 26-30C (rody Rhodotorula, Sporobolomyces a

Strana26

Nadsonia maj optimln teplotu 18-20C, pro plsn 20-28C, pro mezofiln bakterie 30-37C, psychrofiln 20C a termofiln 50-55C. Agarov desky kultivujeme pevrcen, tj.s vkem na podloce (tzv. zaven agar), abychom se vyhnuli stkn zkondenzovanch par s vka na kulturu. Pi teplotch nad 37C je nutno misky vkldat do vlhkch komrek, aby pdy nevyschly. Vlhk komrka je uzaven ndoba, na jejm dn je kdinka s vodou. Bhem inkubace je nutno zajistit vhodn podmnky, pokud jde o pstup vzduchu. Pi optimlnch podmnkch je doba potebn pro dostaten nrst kultury (tzv. inkuban doba) rzn (u bakteri a kvasinek 24-48 hodin, u plsn 2-5 dn). K dosaen maximln rstov rychlosti (tj.log-fze rstu viz pdy u bakteri teba 1,5-2,5 h., u kvasinek 3-5 h. Mikroorganismy se znan li svmi nroky na ptomnost nebo neptomnost kyslku, k emu musme pihlet, chceme-li urit organismus udret v dobrm stavu. Pi kultivaci v malch objemech se vtinou pstup kyslku reguluje tvarem ndoby a velikost styn plochy mezi povrchem pdy a vzduchem. Tak nap. aerobn organismy (plsn,nkter bakterie a kvasinky) pstujeme na ntrech (desky, ikm agary), nebo v nzkch vrstvch kapalin. Anaerobn nebo mikroaerobn organismy okujeme vpichem nebo rozmchnm do svislch agar nebo do vysokch vrstev kapaliny o malm povrchu, ppadn jet snenm oxidoreduknho potencilu ivnho prosted pidnm redukujcch ltek jako je thioglykolt sodn, kyselina askorbov, siiitan, thiosran, pyrosiiitan apod. Pro aerobn kultivaci ve vtch objemech a pi kultivaci psn anaerobnch mikroorganism vak toto uspodn nesta. 2.4.1 Aerobn kultivace ve vtm objemu Pro rychl pomnoen aerobnch mikroorganism v tekut pd je teba sycen kyslkem, a to bu tepnm na automatickch tepakch (zpsobuje souasn lep rozptyl bunk a spor) nebo aerac. Aerace spov v pivdn stlaenho vzduchu trubkou ke dnu ndoby a jeho protlaen porzn destikou. Pro vet objemy se pouvaj Kluyverovy vtrac ndoby nebo sklenn nerezov fermentory s aeranm mchacm systmem. U mench fermentor se pro aeraci pouv tak turbinov mchadlo, kter nasv vzduch tsn nad hladinou fermentan kapaliny a rozmchv ho do tto kapaliny. Nen-li po ruce stlaen vzduch, sta u malch kultivanch ndob ) je od zaokovn bunk do nov

Strana27

odsvat z prostoru nad kapalinou vzduch pomoc vvvy a trubic sahajc ke dnu nasvat vnj vzduch do kapaliny. Vzduch pivdn do kultury nutno vdy sterilizovat, co se dj vatovmi nebo porznmi filtry (viz ) nebo prohnnm vzduchu plynovou promvakou s roztokem germicidnho prostedku. Za germicidn roztok vkldme jet dal promvaku se steriln vodou jako pojistku. Pi tomto zpsobu se vzduch souasn syt vodou, take nenastvaj objemov ztrty kultury. Pi aeraci dochz krom sycen kyslkem tak k odvdn tkch metabolickch zplodin, kter by ve vych koncentracch brzdily rozvoj mikroorganism. Mme-li zjistit mnostv vznikajcch tkavch ltek, je teba ndobku vzduchotsn uzavt a vypuzen vzduch vst karborafinovm nebo jinm uzvrem, kde se tkav ltky zachycuj. 2.4.2 Anaerobn kultivace Anaerobn mikroorganismy jsou organismy schopn rstu za neptomnosti kyslku, tj. v anoxickch podmnkch. V zvislosti na stupni tolerance vi molekulrnmu kyslku je mono klasifikovat z tohoto hlediska anaerobn mikroorganismy na nsledujc skupiny : a) Striktn anaerobn mikroorganismy vyaduj dokonalou absenci kyslku v prosted. Vt koncentrace O2 ne 0,5% na n psob toxicky a odumraj. b) Obligtn anaerobn mikroorganismy nemaj schopnost tolerovat vy koncentraci kyslku ne 2-3%. c) Aerotolerantn mikroorganismy maj schopnost tolerovat malou koncentraci kyslku. d) Fakultativn anaerobn mikroorganismy mohou rst v aerobnch i anaerobnch podmnkch. e) Mikroaerofiln mikroorganismy nerostou dobe za ptomnosti vzdunho kyslku pi normlnm tlaku. f) Obligtn aerobn mikroorganismy vyaduj jako konen akceptor elektron kyslk pro jejich metabolismus. 2.4.2.1 Pprava anoxickho prosted

Strana28

Anaerobnch podmnek doshneme vypuzenm kyslku z pdy varem a zabrnnm dalho pstupu vzduchu ke kultue nebo vzduchotsnm uzavenm ndoby s kulturou a odstrannm kyslku fyziklnmi nebo chemickmi metodami, dle vakuem, vmnnou vzduchu v kultinanm zazen za inertn atmosfru, vysokou vrstvou agaru, pdavkem reduknch inidel do mdia aj. 1) kultue U vech tchto metod pdu ve zkumavce nejdve zahvme 20 min. ve vrouc vodn lzni, pak ochladme na danou teplotu (u agarovch pd na 42C, u ostatnch na 30C), zaokujeme, ihned pevrstvme pdu sterilnm rozehtm agarem nebo parafnem nebo sterilnm parafnovm olejem a ochladme ve svisl poloze na vodn lzni. Okujeme-li sporotvorn bakterie, nen teba vyvaenou pdu ped zaokovnm zchlazovat, ale zchlazujeme ji po ukonen celho postupu. Uveden metody se pouvaj pro udrovn sbrkovch kmen nkterch anaerobnch bakteri (hlavn pro rod Clostridium). Agarov nebo parafnov ztka se pouv tak pi kva-litativnm zjiovn ptomnosti anaerobnch sporotvornch bakteri produkujc plyn. 2) Vzduchotsn uzaven ndob a odstrann kyslku Tento zpsob je pracovn i vybavenm ponkud nronj ne pedchoz, avak m tak mnohem ir upoteben. Umouje nap. tak anaerobn kultivaci na deskch pi kvantitativnm stanovovn anaerob a pi jejich izolaci. Kyslk me bt odstrann nkolika zpsoby. K fyziklnm metodm odstrann kyslku pat odsvn vzduchu nebo jeho nahrazen inertnm plynem, nejastji duskem. Chemick metody pouvaj snadno oxidovatelnch ltek, kter velmi rychle spotebuj ptomn kyslk. Nejastji se pouv zalkalizovan roztok pyrogallolu. K odstrann O2 z 1dm3 je zapoteb 7 g pyrogallolu a 50 ml 20%nho KOH. asto se pouv kombinace fyziklnch a chemickch metod, kdy se ppadn zbyl stopy kyslku odstran alkalickm roztokem pyrogallolu. Zeovn a dal manipulace se provd ve speciln okovac skni (obr. ), kter m otvory pro ruce uzaven neprodynmi gumovmi rukavicemi a je zazena na vmnu vzduchu v jejm prostoru oxidem uhliitm nebo vodkem. Pro vysterilizovn celho prostoru je zde instalovno UV svtlo. Strana29 Odstrann kyslku vyvenm a omezen dalho pstupu vzduchu ke

Dkaz,e jsme doshly trvalho odstrann kyslku, provdme roztoky oxidoreduktanch indiktor (nap. nsk mode, methylenov mode, 2,6dichlorfenolindofenolu nebo resazurinu) odbarvench reduknm inidlem (hydrosiiitanem, askorbovou kyselinou ap.), kter umisujeme do prostoru zbavenho kyslku a nechme tam bhem cel anaerobn kultivace. 3) Kultivace za ptomnosti aerobnho mikroorganismu Rouxova metoda U tto metody, po ztuhnut prv vrstvy mdia, se provede naokovn anaerobnho mikroorganismu. Pak se tato vrstva pelije novou vrstvou agaru a po jeho ztuhnut se povrch tto druh vrstvy naokuje kulturou aerobnho mikroba. Pouv se Bacillus subtilis. Metoda tzv.Fotnerovy plotny Princip metody spov v tom, e do Petriho misky s nzkm okrajem se naokuje na dosti vysokou vrstvu agarovho mdia na jednu polovinu kultura striktn aerobnho mikroorganismu (pvodn Serratia marcescens) a na zbvajc plochu anaerobn mikroorganismus. Po naokovn se miska peklop dnem vzhru bez vka na steriln sklo a okraje se dokonale utsn plastelnou. Bhem kultivace aerobn Serratia marcescens vytvo svou metabolickou innost anoxick prosted a umon tak pozdj rst anaerobnho mikroorganismu. 4) Kultivace v anaerobnm hrnci Jedno z prvch zazen tohoto typu navrhl Nowy. Je to sklenn vlcovit ndoba se zabrouenm okrajem a s vkem, kde je zabudovna ppojka, kter slou na evakuaci nebo na pipoutn inertnho plynu. Tyto pstroje obsahuj smsi chemikli, je po ovlhen poskytuj plynn vodk, kter v ptomnosti katalyztoru (Pt nebo Pd) reaguje se vzdunm kyslkem. Cv.2.1 Poteby : Kombinace fyziklnch a chemickch prostedk Kultury aerobnch a anaerobnch mikroorganism, ivn pdy ve ), -400 ml, zkumavka nebo kyveta dlky maximln 90% prmru

zkumavkch nebo na Petriho miskch, vakuov exsiktor nebo Nowyho zvon(obr. nzk kdinka 250-

Strana30

kdinky, prkov pyrogallol, nasycen roztok Na2CO3, vvva nebo tlakov ndoba s N2, srie promvaek, zkumavka s odbarvenm oxidoreduknm indiktorem. Proveden : 1. Zaokuj pdy ve zkumavkch a v Petriho miskch danmi mikroorganismy a ulo do exiktoru nebo Nowyho zvonu (Petriho misky jsou opt dnem vzhru!). Souasn tam ulo kdinku s cca 4g pyrogallolu, do n je umstna zkumavka naplnn roztokem Na2CO3 (pozor, aby se zkumavka nepevrtila!) a dle zkumavka s odbarvevm redox indiktorem. 2. Uzavi exiktor a odsaj z nho vzduch, a tlak v exiktoru klesne na nkolik mm Hg. Pak uzavi kohout, opatrnm naklnnm exiktoru pevra zkumavku s Na2CO3 do kdinky s pyrogallolem a exiktor dej do termostatu o optimln teplot pro zaokovan mikroorganismy. V ppad,e pouv dusk k vytsnn vzduchu z exiktoru, promvej dusk z bomby prchodem alespo dvma promvakami naplnnmi erstvm pyrogallolem se 40%nm louhem. Peitn dusk pivdj pomoc gumov hadiky a ke dnu exiktoru, v nm jsou umstny zaokovan pdy a vechny pedmty jako u postupu s odsvnm, a druhm kohoutem odvdj vzduch a pebyten dusk z hoej sti (obr. ). Asi po 10 min. prchodu N2 uzavi nejdve kohoutek pivdjc N2 do exiktoru, pak ihned tak kohoutek pro odvod plynu z exiktoru a uzavi ventily bomby. Opatrnm naklnnm pak pevra zkumavku s Na2CO3 do pyrogallolu a dle postupuj, jak uvedeno ve. 3. Po inkubaci otevi oba kohouty, pak uvolni vko Nowyho zvonu a prohldni narostl kultury a zmikroskopuj je. 2.5 Uchovvn a oivovn mikrobilnch kultur Pro bnou potebu uchovvme mikroorganismy na ikmch agarech, bakterie na MPA (pda ), kvasinky a plsn na SA(pda . ), kter ukldme ve stojncch na tmavch, chladnch a bezpranch mstech, nejlpe v chladnikch pi 4C a 6C. U anaerobnch nebo mikroaerobnch bakteri pouvme msto ikmho agaru vpichu do souvisl vrstvy agarov pdy ve zkumavce. Agarovm pdm dvme vtinou pednost ped kapalnmi, nebo jedovat zplodiny metabolismu difunduj do agaru, kdeto v kapalnm prosted jsou neustle ve styku s bukami. Pesto vak je nutn

Strana31

agarov kultury po 2-6 mscch peokovvat, nebo pi vysychn pdy dochz k odumrn mikroorganism. Trvanlivost kultur na agarovch pdch se prodlou, jestlie se jejich ztky zalij parafnem nebo pokryj hlinkovou foli. Podstatnjho prodlouen trvanlivosti (1-2 roky) se doshne pelitm kultury, narostl na ikmm agaru, sterilnm parafnovm olejem tak, aby olej o 1 cm pevyoval hoej okraj agaru. Nkter druhy mikroorganism (nap.octov bakterie a nkter mln bakterie) vjimen rychle odumraj, a proto je musme peokovvat v tdennch intervalech na specilnch pdch. Pi dlouhodobm uchovvn mikroorganism je teba obas mnit ivnou pdu co do sloen i konzistence, aby nedolo k selekci nedoucch typ. Uchovvme vdy mlad kultury, kter jet nedoshly maximlnho nrstu, a ped pouitm je nkolikrt peokujeme do vhodn tekut pdy a kultivujeme vdy 24 hod. za optimlnch podmnek. Jestlie takto pipraven kultura nespluje dan poadavky vlastnosti (nap.pomal rst, slab tvorba kyselin apod.), pokusme se j zskat z tto kultury izolac, doplnnou testovnm fyziologickch vlastnost, vhodn buky. Kultury s prakticky neomezenou trvanlivost zskme mraenm suspenze bunk a jejich sublimac vody ve vysokm vakuu (tzv.lyofilizace). Suspenze bunk nebo spor v ochran-n kapalin bohat na blkoviny (bujon, krevn srum, mln syrovtka apod.) se penese do sterilnch ampulek, zmraz se v lyofilizanm pstroji na 30 a 80C a vysu za vysokho vakua (10-100 mHg). Pi zachovn vakua se ampulky zatav. Bhem lyofilizace dochz k odumen uritho podlu bunk, avak pevajc buky si ponechaj vechny vlastnosti po adu let. Ped pouitm je lyofilizovan buky nutno oivit pasovnm v tekut ivn pd za optimlnch podmnek. Jednodum postupem je uchovvn mikroorganism v uzavench ndobkch ve zmraenm stavu v prosted tekutho dusku (tj.-150o a 200C). Nevhodou vak je, e tekut dusk je nutno pravideln doplovat. Pro kvasinky a plsn se osvdilo uchovvn suspenze bunk ve sterilnm silikagelu. Suspenze v ochrannm roztoku (nejastji v odstednm mlce) se za chlazen ledem vlije na steriln silikagel, kde dojde k rychlmu vysuen bunk. ivotnost tchto bunk je nkolik let. Podrobnj postup viz.Brockman a de Serres,Neurospora Newletter 1,8 (1962). Pi oivovn lyofilizovanch kultur bakteri se za aseptickch podmnek oteve zataven ampulka. K vysuen kultue se pid cca 0,3 ml vhodnho tekutho media Strana32

steriln pipetou a promch. Paprov ttek s oznaenm kultury se vlo na pevnou ivnou pdu a suspenze v ampulce peneste do tuhho media. Inkubujeme pi optimlnch podmnkch. U lyofilizovanch kultur hub se po oteven ampule pidv cca 0,3 ml steriln destilovan vody a ponechme stt 15-20 min stt. Pak peneseme suspenzi i s paprovm ttkem na vhodnou ivnou pdu. Inkubujeme nkolik dn pi optimln teplot. U pskov kultury se psek z ampulky steriln nasype na ivnou pdu. Inkubujeme nkolik dn pi optimln teplot. Veker zbytky pvodn ampule vlote do dezinfeknho roztoku nebo klvujte.

2.6

Prce s bakteriofgem Pi prci s bakteriofge, a u jde o transdukci nebo ppravu lysogennch kmen

bakteri, mutagenesi fg, jejich ken a nebo studium jejich vlastnost, potebujeme suspenzi fgovch partikul, kterou nejsnze zskme z fzovch lyzt mladch bujonovch kultur citlivch bakterilnch kmen. Polzi, kter trv 2-3 hodiny u virulentnch fg a kolem 5 hodin u mrnch (temperovanch) fg, vysrme nkolika kapkami chloroformu zbytky bakterilnch bunk a odstedme je pomalou centrifugac. Aby dolo k dobr lzi, je zapoteb, aby bakteriln kultura byla v potku logaritmick fze rstu (nejvhodnj je inkubace bakterilnho inokula 2,5h za provzduovn pi 37C) a aby sloen media bylo vhodn pro adsorpci pidanch fgovch stic na bakteriln buky. Obzvlt dleit je koncentrace elektrolyt, jej optimum je rzn pro rzn fgy. Pro lyzty virulentnch fg bv pomr koncentrace pidanch fgovch stic ke koncentraci bakteri 10:1,u mrnch fg 200:1. Kontroln otzky ke kap. 2 KULTIVACE MIKROORGANISM 1. Co slou nejastji jako zdroj energie v ivnch pdch heterotrofnch organism? 2. Kter znte prodn zdroje vitamn pouvan pro ppravu ivnch pd? 3. Jak zdroje dusku jsou v ivnch pdch? 4. Jak znte typy ivnch pd? 5. Kter ltky se pouvaj pro ztuen ivnch pd a jak maj pednosti a nedostatky?

Strana33

6. Jak pH vyaduj pro rst bakterie, kvasinky a plsn? 7. Jak upravujeme pH pd a) tekutch, b) agarovch, c) elatinovch? 8. Jak sterilujeme ivn pdy? 9. Steriluj se ivn pdy ped rozlitm nebo po rozlit do kultivanch ndob? 10. Je po sterilaci innj vlhk nebo such teplo? 11. Jak se steriluje ndob, gumov hadice, tkaniny a pro, 12. Co je to peruovan sterilace a na em je zaloena? 13. Meme pout peruovanou sterilaci pro sterilaci fyziologickho roztoku nebo vody? Vysvtlete! 14. Jak jsou nevhody tyndalizace a m ji nahraujeme? 15. Jak jsou sterilan teploty a doby pi a) such b) vlhk sterilaci? 16. Jak znte netepeln sterilan prostedky? 17. Kdy meme pout sterilaci ultrafialovm svtlem? 18. Kdy byste pouil(a) Ajatin, Persteril, formaldehyd, ethanol? 19. Jak postupujeme pi aseptick prci? 20. Jak kultivan teploty a doby byste volil(a) pro kvasinky, plsn, bakterie? 21. Jak zjiujeme dostaten psun kyslku pro aerobn a fakultativn anaerobn mikroorganismy pi jejich kultivaci? 22. Jak je nejjednodu postup pro zajitn anaerobnch podmnek pi kultivaci? 23. Kter znte chemick metody pro zajitn anaerobnch podmnek? 24. Jak postupujeme pi dlouhodobm uchovvn mikrobilnch kultur? 25. Jak doshneme pomnoen fg (tj. fgovch partikul) a m je konzervujeme?

Strana34

3.

MORFOLOGIE A CYTOLOGIE MIKROORGANISM Morfologick a cytologick znaky mikroorganism zjiujeme pi identifikaci

mikrobilnch rod a druh, pi kontrole istoty kultury, ppadn tak pi posouzen fyziologickho stavu bunk v kultue. Morfologick znaky dlme na makroskopick, kter jsou patrn ji pouhm okem a tkaj se zpsobu rstu mikroorganismu v ivnch pdch, a na mikroskopick znaky, kter meme pozorovat svtelnm nebo elektronickm mikroskopem, ppadn i lupou. Cytologick znaky, tj.vnitn strukturu jednotlivch bunk, meme pozorovat pouze svtelnm nebo elektronickm mikroskopem a asto si pomhme jet speciln preparac pozorovanho materilu, tj.rznmi typy fixace, barven, stnovn, pokovovn apod. 3.1 Makroskopick morfologick znaky mikroorganism I kdy jsou makroskopick morfologick znaky siln ovlivnny pouitou ivnou pdou a stm kultury, pinej nm mimodn cenn informace o povaze mikroorganismu a o istot kultury. Jen v nkterch ppadech jsou tyto znaky tak dleitm vodtkem pi iden-tifikaci rod nebo dokonce druh mikroorganism (nap. u nkterch plsn, u zbarvench nebo barvivo redukujcch rod bakteri ppadn kvasinek). Mezi makroskopick morfologick znaky nle charakter rstu : Strana35

a) po kultivaci mikroorganismu v tekut pd b) po kultivaci ntru na ikmm agaru c) po kultivaci jednotlivch bunk na agarov pd v Petriho misce d) po kultivaci suspenze bunk nebo spor v jednom mst agarov nebo elatinov pdy (tzv. obrovsk kolonie) e) po kultivaci svislch agar zaokovanch vpichem Jako zkladn ivn pdy se pro sledovn makroskopickch znak bakteri pouv masopeptonov bujon (pda ), ppadn ztuen agarem (pda ) nebo elatinou (pda ), u kvasinek se pouv sladina (pda ), ppadn ztuen agarem (pda ) nebo elatinou (pda ), pro plsn je vhodn rovn sladina nebo sladinov agar, dle Sabouraudv agar (p-da ) a pro rody Aspergillus a Penicillium nejastji syntetick pda podle Czapka-Doxe, ztuen agarem (pda kontrolou pozorovan kultury(viz. kap). ). Sledovn makroskopickch morfologickch znak m bt vdy doplnno mikroskopickou

3.1.1

Charakter rstu v tekut pd Mikroorganismy rostou pi statick, tj. klidov kultivaci v tekut pd nejastji

ve form difusnho zkalu (nap. nkter bakterie tvoc drobn tyinky nebo koky) nebo ve for-m hrubch vznejcch se vloek (nap. bakteriln rod Staphylococcus a nkter druhy rodu Bacillus) i sedliny, je v konench fzch rstu pomrn lp na dn ndoby (nap. bakteriln rod Laktobacillus a vtina kvasinek). ada mikroorganism vak za tchto podmnek roste na povrchu tekut ivn pdy. Tak nap. plsn tvo koovit, na povrchu voln vlknit nebo sametov povlak, kdeto oxidativn typy kvasinek tvo blou suchou a siln zvrsnnou blanku zvanou ks, kter vzln po stnch ndoby a snadno se rozpad. Po del kultivaci se ks propad ve form hrubch volnch vloek a tvo se nov. Tak nkter kmeny druh rodu Bacillus a aerobnch rod Pseudomonas a Acetobacter tvo na povrchu tekutch pd blan-ky podobn ksu kvasinek, avak vtinou jemnj. Vjimkou je Acetobacter aceti subsp. xylium, kter tvo silnou koovitou blnu. Povrchov nrst v kapalnm prosted je zpsoben pomrn patnou smivost bunk nebo mycelia a vznikl vrstva je na povrchu kapaliny udrovna silou povrchovho napt tto kapaliny. Pidaj-li se do tekut ivn pdy ltky sni-ujc povrchov napt (tzv. povrchov aktivn ltky neboli Strana36

tenzidy), dojde k ponoen tchto blanek. Jestlie se pouij neionogenn povrchov aktivn ltky, kter neinhibuj rozmnoovn mikroorganism (nap. Tween 80), ji ped zaokovn kultury, rostou blankotvorn mikroorganismy difusn v prosted a na povrchu tekut pdy se nevytvo. Rst v povrchovch blanch na tekut ivn pd se asto vyskytuje jen u nkterch kmen uritch druh mikroorganism (nap. u kvasinkovho rodu Hansenula nebo dokonce i Saccharomyces a u bakterilnho rodu Bacillus), kdeto u jinch druh pevld (nap. u kvasinkovho rodu Pichia). Je spojen tak s morfologi koloni na agarovch pdch, tj. s tvorbou drsnch a zvrsnnch koloni (viz. kap. ) se zmnou metabolismu v oxidativn typ na kor fermentativnho a se zmnou morfologie bunk a sloen povrchovch vrstev bunn stny, a tm i imunologickch vlastnost oproti kmenm s rstem difusnm nebo ve form sedliny. Nkter sedlinotvorn kvasinky tvo po del inkubaci (1-4 tdny) v sacharidovm prosted na jeho povrchu vlhkou kaovitou vrstvu, nazvanou mzdra, nkter tvo za tchto podmnek pouze kaovit prstenec podl stn ndoby. Tento druhotn povrchov rst je vsledkem vyerpn sacharidovch ivin ethanolovm kvaenm a nastupujcho aerobnho vyuvn naprodukovanho ethanolu. 3.1.2 Charakter rstu na ikmm agaru Pro sledovn charakteru rstu na ikmm agaru pouvme pedsuen agar (alespo 24 h pi 37C), aby kondenzan voda nerozplvala buky do souvisl vrstvy po celm agaru. Na povrchu ikmho agaru okujeme mikroorganismy k tomuto elu nejlpe pomoc okovac jehly bez kliky, pomoc n vedeme rovnou ru od spodnho okraje povrchu agaru k hoejmu okraji. Po inkubaci pi optimln teplot po dobu 2448 h u bakteri a 2-3 dny u kvasinek zjiujeme : a) rychlost rstu b) tvar ntru (rovn, pln, bodov, rozplvav, ostnit, konkovit, stromekovit (viz. obr. ) c) prez ntru (ploch, vyven) d) povrch ntru (hladk leskl, hladk bez lesku, drsn, zvrsnn, such, vlhk) e) konzistence ntru (kaovit, slizovit, moun, koovit) f) barvu ntru (krmov, kdov bl, citrnov lut, okrov, rumlkov erven atd.) Strana37

g) barvivo uvolovan do prosted,ppadn jeho fluorescenci U plsn pozorujeme nrst v jednodennch intervalech ponaje druhm dnem inkubace a zjiujeme : a) rychlost rstu b) charakter rstu (voln, kompaktn, koovit) c) povrch nrstu (sametov, mechovit, krtce nebo dlouze vlknit, svazkovit, provazcovit, chomkovit) d) barvu mycelia e) barvu sporov vrstvy f) barvu rubu ntru g) barvivo vyluovan do ivn pdy h) ptomnost kapiek transpirovan kapaliny na povrchu nrstu a jejich barvu i) vni kultury Vechny tyto znaky jsou dleit pi identifikaci jednotlivch druh nebo sekc rozshlch rod plsn.

3.1.3.

Kolonie vyrostl z jednotlivch bunk Typick tzv. jednobukov kolonie zskme rozetenm suspenze obsahujc 30-

100 bunk (viz kap

) na pedsuenou agarovou pdu v Petriho misce a inkubac za

optimln teploty po dobu 1-2 dn u bakteri, 2-3 dn u kvasinek a 2-5 dn u plsn. Vyhodnocovn morfologie tchto koloni je u plsn prakticky stejn jako u ntru na ikmm agaru (viz kap.3.1.2). U bakteri a kvasinek se zjiuje (obr.. ) : a) tvar koloni (bodov, kruhov, konkovit, nepravideln, vlknit), b) povrch koloni (hladk, hladk s jednotlivmi papilami, drsn, zvrsnn, radiln nebo koncentricky rhovan, such, vlhk), c) prez (relif) kolonie (ploch, vyven rovn nebo s vyvenm i propadlm stedem), d) okraj kolonie (rovn, vlnit, vroubkovan, cpat, lalonat, vlknit), e) konzistence kolonie (kaovit, slizovit, moun, koovit), f) barva kolonie a jejho rubu, Strana38

g) barvivo uvolovan do prosted, Vzhled kolonie je siln ovlivnn stm kultury i kultivanmi podmnkami. Mlad kolonie jsou vdy hlad s rovnjmi okraji a teprve pozdji se me objevit rhovn, zdrsnn a rzn nerovnosti. Urit druh bakteri nebo kvasinek se me vyskytovat v nkolika morfologickch typech, z nich nejdleitj jsou : M (mukoidn), majc vlhk slizovit velmi leskl kolonie, tvoen opouzdenmi bukami (viz kap. ), S (z angl.smooth = hladk), tvoc hladk kolonie s rovnm okrajem a mrnm leskem nebo bez lesku , buky netvo pouzdra, R (z angl.rough = drsn), tvoc drsn a siln zvrsnn, such, pomrn nzk kolonie, kter se vtinou iroce rozrstaj a maj nerovn okraje; obvykle se vyskytuje nkolik Rtyp, kter se li vkou kolonie a hrubost jejho zvrsnn. Zmny M-S-R nastvaj v dsledku mutace a nsledujc selekce. Pi izolaci mikroorganism z infeknho materilu zskvme vtinou M-kmeny, u nich se vak po nkolikerm pasovn na umlch pdch selektuj S-kmeny. Z tchto S-kultur meme vtinou jen velmi obtn zskat opt M-formu. Sloen ivn pdy siln ovlivuje fenotypov vyjden M, S a R genotyp. Nap. vysok koncentrace (15-20%) zkvasitelnch sacharid podporuj tvorbu slizu u M-typ a tak S-typy zde tvo hladk pomrn leskl kolonie, nebo siln kvaen potlauje fenotypov vyjden nkterch drsnch gen. Jet vraznj inky maj tenzidy (viz kap. ), kter vedou k tvorb hladkch a asto i lesklch koloni i u R-typ. Jak ji bylo eeno (kap. ), je vskyt drsnch koloni spojen s povrchovm rstem ), se zmnou sloen bunn stny a asto i v tekutm prosted, a dle s tvorbou etzk bunk u bakteri a pseudomycelia nebo pravho mycelia u kvasinek (viz kap. zintenzivnnm aerobnho metabolismu na kor kvasnch schopnost. Z bakteri se Rtypy nejastji vyskytuj u rodu Bacillus. Z kvasinek u oxidativnch rod Pichia,Hansenula,Candida,Sporobolomyces, a tch rod, kter tvo pechod mezi kvasinkami a plsnmi (Endomyces,Eremothecium,Trichosporum). Vzcnji se R-typy tak vyskytuj u typicky kvasnch druh kvasinek jako je nap. Saccharomyces cerevisiae. 3.1.4 Obrovsk kolonie

Strana39

Charakter rstu v obrovskch kolonich se sleduje u kvasinek a plsn. U kvasinek se vy vrstva sladinovho agaru (pda ) zaokuje v jednom mst (nejlpe ve stedu) kapkou suspenze mladch bunk ve fyziologickm roztoku (o koncentraci 107-109 bunk/ml), je se sem penese okovac klikou. Inkubuje se za optimlnch podmnek a pozoruje v jednoden-nch intervalech po dobu 14 dn. Vyhodnocen je obdobn jako u jednobukovch koloni (kap ), navc se zde vak mohou vyskytovat rzn sektory, vznikl v dsledku genetick nejednotnosti suspenze nebo mutac vzniklch v prbhu rstu, ppadn i v dsledku sporulace bhem kultivace. Vznik a pomnoen nkterch typ mutant se projevuje jako drobn papily na povrchu kolonie, kter jsou v nkterch ppadech tak hust, e pipomnaj drsn typ koloni. U plsn pipravujeme obrovsk kolonie penesenm spor do stedu sladinovho nebo Czapek-Doxova agaru v Petriho misce. asto se spory okuj na tyto pdy do t bod odpovdajcch vrcholm rovnostrannho trojhelnka vzdlench asi 3 cm od kraje misky (obr ). K okovn se pouije okovac klika, jej okrajem se dotkneme agarov pdy. Aby se spory pi okovn nerozptlily po cel ivn pd, je vhodn okovat desky zespoda, pi em je Petriho miska dnem vzhru. Obrovsk kolonie se vyhodnocuj po kultivaci pi optimln teplot po dobu 2-5 dn (ppadn i dle), postupuje se pi tom stejn jako pi vyhodnocovn rstu plsn na ikmm agaru (kap ).

3.1.5

Rst podl vpichu do agarov pdy Typ rstu podl vpichu do svisl vrstvy agarov pdy uruje nejen morfologick

znaky, ale i nroky mikroorganismu na kyslk. Aerobn mikroorganismy rostou v hoej sti vpichu, anaerobn ve spodn sti a fakultativn anaerobn po cel dlce vpichu. Rst podl vpichu se sleduje pouze u bakteri. Pouv se masopeptonov agar(pda ) a jako inokulum slou 24 h bujonov kultura. Postup okovn vpichem je uveden v kap . Rst se vyhodnocuje v jednodennch intervalech pi inkubaci za ) : spojit, bodov (okovit), kartovit, konkovit optimln teplot ( vtinou 30-37C). U fakultativn anaerobnch bakteri rozliujeme tyto typy rstu ( obr. (rhizoidn).

Strana40

3.2

Mikroskopick mikroorganism

morfologick

cytologick

znaky

Dleitmi mikroskopickmi morfologickmi znaky jsou tvar, velikost a uspodn bunk, zpsob rozmnoovn a ptomnost zvltnch orgn. Mikroskopick hodnocen doplujeme vdy makroskopickm posouzenm kultury. 3.2.1 Typy mikroskopickch prepart Mikroskopick hodnocen provdme nejastji v mikroskopickm prepartu.U nkterch plsn a vzcnji u kvasinek jsou pro mikroskopovn vhodn jet tzv. sklkov kultury nebo kultury na celofnu ( viz kap ). Pozorujeme-li suspenzi ivch nebarevnch bunk na podlonm sklku, hovome o nativnm prepartu. Pro diferenciovan vybarven uritch sloek buky nebo k rozlien ivch a mrtvch bunk (viz mikroskopie kvasinek ) pipravujeme vitln barven prepart. U bakteri se nejastji pouv prepart barven po fixaci, nebo bakteriln buky jsou vtinou bezbarv a jejich tvar i struktura jsou bez barven ve svtelnm mikroskopu mlo zeteln. 3.2.2 Fixace prepartu elem fixace je usmrcen bunk, nebo mrtv buky pijmaj snze barvivo, a dle pilnut bunk k podlonmu sklku, aby nebyly barvcm roztokem nebo pi oplachovn odplaveny. Bakterie fixujeme nejastji plamenem, kvasinky a plsn vtinou chemikliemi, (nap. ethanolem, acetonem), nebo plamenem se ji znan mn jejich tvar. Fixace kvasinek a plsn se provd pouze pi specilnch typech barven a jej postup bv uvdn spolu s p-slunm barvcm postupem. Fixace plamenem. Odmatn podlon sklko prothneme plamenem, asepticky na n peneseme suspenzi bakteri, rozeteme na plochu cca 2 cm2 a nechme vyschnout na vzduchu. Pak sklko ntrem vzhru tikrt prothneme nesvtivm plamenem kahanu a po vychladnut barvme. Vyetujeme-li kulturu z tekutho cukernatho prosted, je nejlpe zskat buky odstednm a suspendovat je vod nebo

Strana41

ve fyziologickm roztoku, nebo sacharidy v plameni karamelizuj a znesnaduj pak barven a mikroskopovn. 3.2.3 Barven mikroorganism Pro barven mikroorganismu se nejastji pouvaj zedn vodn roztoky organickch barviv. Jde obvykle o sole, jejich barevn sloka je kationtem (tzv.bzick barviva) nebo aniontem (tzv. kysel barviva). Pro barven bakteri nebo jdra eukaryotnch mikroorganism se vtinou pouvaj bzick barviva (nap. krystalov a gencinov viole, methylenov mod, safranin, zsadit fuchsin, vesuvin a malachitov zele). Kysel barviva (nap. kyselina pikrov, eosin), se pouvaj pouze pro vybarven cytoplazmy eukaryotnch mikroorganism. Intenzitu vybarven zsaditmi barvivy zvyuje zsadit reakce prosted, u kyselch barviv kysel reakce. Pi barven se uplatuj jak fyzikln procesy (difuze, adsorpce), tak procesy chemick. Nkter chemick sloueniny (nap. fenol, anilin, chromov kyselina, tanin) zpsobuj sytj vybarven objekt a jejich aplikace se oznauj jako moen. inek vtiny moidel spov v tom, e maj vt afinitu k buce i k barvivu, ne je afinita mezi bukou a barvivem, take hraj lohu jakhosi prostednka. Podle elu barven rozliujeme : 1) Jednoduch barven, kter slou k dobrmu rozlien tvaru bunk. 2) Diferencian barven, je slou k rozlien jednotlivch morfologickch tvar (nap. jdra, spor, bunn stny) nebo chemickch sloek bunk (volutinov zrna, glykogen, krob, tukov kapiky. 3) Diagnostick barven, je slou jako pomcka pi identifikaci mikroorganism. Nejpouvanj je Gramovo barven a acidorezistenn barven.

Cv.3.1 Poteby : Proveden :

Aseptick postup pi pprav mikroskopickho prepartu Podlon sklka, okovac jehla, kryc sklka, zkumavka s kulturou.

1. Oehni podlon sklko a polo je na filtran papr blzko plamene. 2. Do lev ruky uchop zkumavku, do prav okovac jehlu a vysterilizuj jehlu a ztku v pla-meni (obr. ). Malkem a dlan vyjmi ztku ze zkumavky a po ochlazen Strana42

kliky na pd naber mal mnostv kultury. Znovu oehni okraj zkumavky i vatovou ztku a uzavi zku-mavku. Pak penes buky s kliky doprosted podlonho skla a okovac jehlu oehni v plameni. U kultury s povrchu agarov pdy se lehce dotkni ochlazenou klikou kolonie nebo ntru, abys penesl mal mnostv bunk (asi jako pendlkov hlavika), rozmchej buky s kliky jejm krouivm pohybem v kapce vodovodn vody nebo fyziologickho roztoku na podlonm skle a pak jehlu oehni. 3. Pi pprav nativnho prepartu pikryj suspenzi bunk na podlonm skle istm krycm sklkem tak, aby v prepartu nebyly vzduchov bublinky. Sklko nepikldej najednou celou plochou, ale nejdve jednou hranou. K manipulaci s krycm sklkem pouij pinzetu nebo ber kryc sklko za hrany. Pebytenou kapalinu odsaj filtranm paprem, ale nepi-tlauj, aby nedolo k pokozen bunk. Nativn prepart je nutno ihned mikroskopovat, ne-bo ve vyschlm prepart jsou buky nezeteln. Jde li o fixovan prepart, nech suspenzi zaschnout na vzduchu nebo vysoko nad plamenem a pak postupuj podle fixanho pedpisu. 3.2.4 Svteln mikroskopie bakteri

U bakteri zjiujeme : 1. Tvar a velikost bunk (koky nebo tyinky, u tyinek t jejich dlku, charakter konc a p-padn zakiven), 2. uspodn bunk (jednotliv, v etzcch, ve shlucch nebo balcch), 3. ptomnost a charakter vlken (vtven, nevtven), 4. ptomnost spor, jejich tvar, velikost (roziuje i neroziuje buku) a umstn (centrln, terminln, subterminln i excentrick), 5. ptomnost pouzder. Vechny tyto znaky zjiujeme v barevnch prepartech. Ptomnost bok zjiujeme obyejn nepmo, tj. z pohybu bunk v nativnm prepartu. Pm zjitn tvaru, potu a uspodn bik je mon pomoc elektronovho mikroskopu (viz kap ). Mikroskopicky hodnotme morfologick znaky makroskopick znaky (viz kap ). Cv.3.2 Poteby : Jednoduch barven bakteri po fixaci a jeho hodnocen Bakteriln kultura, roztok krystalov violeti (roztok . ) nebo karbol-

fuchsin (roztok . ), imerzn olej, podlon skla, okovac jehla. Strana43

Proveden : 1. Na odmatn oehnut podlon sklko asepticky (viz kap ) nanes kapku vyetovanho materilu a rozeti na co nejvt plochu. Vyetujeme-li kulturu z tuh pdy, penes oeh-nutou a ochlazenou okovac jehlou mal mnostv bunk do kapky vody na podlon plochu. Pak ihned kliku oehni. 2. Ntr nech zaschnout na vzduchu nebo vysoko nad plamenem (sklo nesm plit pi poloen na hbet ruky) .Pak uchop sklo pinzetou a tikrt je pomalu prothni oxidan st plamene kahanu tak, aby ntr byl nahoe. 3. Po vychladnut sklka pokryj ntr bu roztokem krystalov violeti (Gramem I) na 1520 vtein nebo karbolfuksinem na 30 vtein. 4. Oplchni sklko slabm proudem vody, pi em sklko je tm ve svisl poloze a voda dopad nikoliv na ntr, nbr na msto nad nm. Osu sklko piloenm papru a dosu vysoko nad plamenem. Na usuen ntr kpni imerzn olej a mikroskopuj (bez krycho sklka!) za pouit imerznho objektivu (zvten 10 x 100). 5. Pomoc mkk tuky zakresli do protokolu nejastji se vyskytujc buky a jejich uspodn. Zjisti tak ptomnost spor (jev se jako nezbarven tlska uvnit bunk nebo jako nezbarven vlcovit tvary s tmavm obrysem), jejich tvar, pomr ky k dlce a umstn v buce. Poznvej tak, zda jsou spory ir ne vegetativn buky i nikoliv. 6. Zorn pole znzorni kruhem o prmru 10 cm a ve stejnm pomru zvti tak zakreslen tvary. Strun popi veker mikroskopick morfologick znaky. V protokolu uve st kultury, ivnou pdu, mikroskopick zvten a makroskopick znaky mikroskopovan kultury. Poznmka : Prepart nesm bt pli hust a nesm obsahovat shluky bunk v dsledku jejich pat-nho rozmchn. Jednotliv buky nebo jejich etzky mus bt od sebe dostaten vzdlen, aby byl zeteln jejich tvar a velikost.

3.2.5

Nativn prepart pro dkaz pohybu bunk Bakteriln buky, kter maj na svm povrchu biky, jsou schopny aktivnho

pohybu, kter je pmoar, viv, krouiv nebo nepravideln a je zpsoben rotac Strana44

bik. Tento pohyb je nutno rozliovat od pasivnho pohybu zpsobenho bu proudem kapaliny nebo kinetickou energi molekul kapaliny, je narej na bakteriln buky a zpsobuj jej kmitav pohyb, (tzv. Brownv pohyb). Aktivn pohyb bakteri ustv po usmrcen bunk dezinfeknm prostedkem, m jej meme snadno rozliit od pasivnho pohybu. Pohyb bunk nutno sledovat u malch, intenzivn se rozmnoujcch bunk z kapaln pdy a je nutno se vyhnout tepn nebo jinmu neetrnmu zsahu, nebo biky se velmi snadno lmou. Aktivn pohyb pozorujeme v nativnm prepartu nebo v tzv. visut kapce, tj. v kapice kultury na krycm sklku, je je obklopeno na prohlube ve zvltnm podlonm skle (Kochova komrka) nebo na sklenn prstenec pilepen kanadskm balzmem na podlon sklo (Bttcherova komrka, viz obr. ). Cv.3.3 Poteby : Dkaz pohybu bunk 18 hodin star kultura Bacillus subtilis, podlon sklo nebo Kochova

komrka (ppadn Bttcherova komrka (obr. ), kryc sklko, vazelna, stteek, dezinfekn roztok (0,5% n roztok Ajatinu), pipeta. Proveden : A. Na podlonm skle : 1. Na odmatn oehnut podlon sklo asepticky penes kapku bujonov kultury, pekryj opatrn krycm sklkem (nepitiskuj!) a mikroskopuj zvtenm 1060. Pozoruj, zda se buky pohybuj a popi charakter pohybu. 2. Ze strany krycho sklka pidej pipetou kapku dezinfeknho prostedku a zjisti, zda pohyb ustv. Poznmka : V ppad, e chce pohyb bunk pozorovat imerz, je nutno pebytenou kapalinu prepartu opatrn odst ze strany pomoc filtranho papru a kryc sklko pilepit k pod-lonmu sklu jeho ormovnm vazelnou. Pak na kryc sklko kpni imerzn olej a pozoruj zvtenm 10100 a 20100. B. Visut kapka : 1. Na kryc sklko penes asepticky kapku mlad bujonov kultury a peklop kryc sklko kapkou dol na prohlube Kochovy nebo Bttcherovy komrky (obr. ), je m okraj prohlubn naten vazelnou, a pitiskni. Pozoruj zvtenm 1060 nebo

Strana45

kpni na kryc sklko imerzn olej a pozoruj zvtenm 10100 a 20100. Zjisti, zda se buky pohybuj aktivnm pohybem. 2. Paraleln piprav visutou kapku stejnm zpsobem jen s tm rozdlem, e do kapky kultury na krycm sklku pid kapku dezinfeknho prostedku, a pozoruj, zda se buky jet pohybuj. Poznmka : Pozor na promknut sklka imerznm objektivem! 3.2.6 Negativn barven bakteri Jestlie mme mit velikost bakterilnch bunk, nememe je fixovat ani barvit, nebo tyto zsahy velikost bunk mn. V tomto ppad barvme pozad, od nho se svtl buky jasn odrej. Pouvme zednou tu, roztok nigrosinu nebo roztok konsk erven. Dleit je, aby buky byly dostaten zedn a nevytvoily shluky a aby vytvoily na podlonm skle tenk rovnomrn film, kter nen pli tmav. Cv.3.4 Poteby : Negativn barven bakteri Kultura bakteri v tekutm ivnm prosted, Dornerv roztok nigrosinu (

roztok . ), 2,5%n vodn roztok konsk erven, 1%n roztok HCl, roztok krystalov violeti (roztok ), podlon skla, imerzn olej, okovac jehla. Proveden : A: 1. Aseptickm zpsobem (viz kap. ) penes 2-3 kliky mikrobiln suspenze z tekut pdy na dkladn odmatn podlon sklo, pidej kliku nigrosinovho roztoku nebo co nejmen mnostv erstv pefiltrovan tue, dkladn rozmchej a rozeti na co nejvt plochu, pokud mono po celm podlonm skle. K tomuto elu me pout tak druhho podlonho skla, kter se pilo v hlu cca 45 k prvnmu sklu (obr. ) a zvolna se po nm thne (ppadn i nkolikrt) ve smru tupho hlu. Toto pomocn sklo se ihned oehne. 2. Prepart na prvnm podlonm skle nech oschnout na vzduchu. Nefixuj! Ntr na podlonm skle se m pouhmu oku jevit jako tmav ed. Pli svtl prepart je mlo kontrastn, pli tmav vbec nepropout svtlo a po vyschnut na vzduchu se v barvivu objevuj svtl trhliny. Proto se doporuuje pi pouit pomocnho Strana46

podlonho skla jeho postupnm vtm pitlaovnm plynule mnit vrstvu barviva a pi mikroskopovn najt jeho nejvhodnj koncentraci. Vtinou je zapoteb ppravu prepartu nkolikrt opakovat, ne se doshne vhodn koncentrace barviva. 3. Pozoruj olejovou imerz zvtenm 10100 a zakresli. Buky jsou svtl na edm a namodralm pozad. 4. Piprav na dalm podlonm skle jet prepart fixovan plamenem a barven krystalovou violet (viz kap. s prepartem barvenm nativn. B: 1. Ke krat stran dobe odmatnho podlonho skla kpni roztok konsk erven a rozmchej do n 2-3 kliky asepticky odebran bujnov kultury bakteri. 2. Druh dobe odmatn podlon sklo pilo ke kapce v hlu cca 45 ( obr. ) a zvolna je thni po prvnm skle ve smru tupho hlu, take barvivo se hrne ped pohybujcm se sklem po cel ploe prvnho skla, na n vytvo souvisl povlak. Pak druh sklo oehni a prvn s negativn obarvenm prepartem nech na vzduchu oschnout. Nezahvej! 3. Such prepart oplchni 1%n HCl a ihned kapalinu ockni ,ale neoplachuj. Po usuen na vzduchu mikroskopuj s olejovou imerz (zvten 10100) a srovnej s prepartem fixovanm teplem a barvenm krystalovou violet (viz kap. ). 3.2.7 Barven spor rod Bacillus a Clostridium Spory rodu Bacillus a Clostridium se velmi tko barv i po fixaci, co je zpsobeno jejich silnm, patn prostupnm obalem. Pi jednoduchm barven po fixaci plamenem(viz kap. ) zstanou proto nezbarveny a vybarv se pouze jejich obal (tzv. negativn barven spor). Obarv-li se vak spory po pedchozm moen nebo za tepla pomoc silnch barviv, tko se odbarvuj kyselinami (tzv. acidorezistence) nebo jinmi sloueninami. Pro zjitn tvorby spor jsou vhodn 2-3 dny star kultury na tuhch pdch, nebo v mladch intenzivn rostoucch kulturch se spory netvo. Uvdme Mllerovu metodu barven spor. Cv.3.5 Barven spor rod Bacillus a Clostridium ), mikroskopuj s olejovou imerz a srovnej

Strana47

Poteby :

2-3 dny star kultura Bacillus subtilis na masopeptonovm agaru, 5%n ), methylenov mod (roztok . ), 5%n

kyselina chromov, karbofuchsin(roztok . kyselina srov. Proveden :

1. Piprav aseptick ntr na podlonm skle, usu a fixuj plamenem. 2. Mo kyselinou chromovou 10 min, oplchni vodou, pokryj ntr karbofuchsinem a zahvej nad mrnm plamenem 2 min (potno od vstupu par). Barvivo nesm na prepartu vyschnout. 3. Po zchladnut oplchni vodou, odbarvuj kyselinou srovou 10-20 s a oplchni vodou, osu a mikroskopuj s imerz. Poznmky : 1. Spory aktinomicet se barv stejn dobe jako vegetativn buky, take je od vlken vegetativnch bunk meme rozpoznat pouze z jejich kulovitho nebo tyinkovitho tvaru. 2. Nkter kmeny sporotvornch bakteri ztratily v dsledku mutace nkter z gen, nutnch pro sporulaci, schopnost tvoit spory, co in znan pote pi identifikaci tchto bakteri. 3.2.8 Gramovo barven Barven podle Grama je jednou z nejdleitjch diagnostickch metod pi urovn rod a druh bakteri. V podstat jde o barven fixovanho prepartu a nsledujc moen bunk jodovm roztokem, m vznik komplex barvivo-jodbunn sloky. Tento komplex lze z bunk nkterch rod nebo druh mikroorganism vyplavit ethanolem nebo acetonem, take se buky odbarvuj a pslun druhy jsou oznaovny jako gramnegativn (G-) na rozdl od tch, jejich buky si ponechvaj zbarven i po psoben tchto rozpoutdel a jsou oznaovny jako grampozitivn (G+). Stm kultury se vtinou grampozitivnost ztrc, a proto pouvme 24 h star kultury. Buky nkterch druh mikroorganism jsou vak i v mlad kultue nkdy G+ a nkdy G- a jsou proto oznaovny jako gramlabiln (G). Podstata rozdlnho chovn G+ a G- mikroorganism pi Gramov barven nebyly dosud s konenou platnost vysvtlena. Pravdpodobn se zde nejvce uplatuj rozdly ve sloen bunn stny obou skupin bakteri. Gramovo barven m nkolik Strana48

modifikac, z nich nejrychlej a proto nejastji pouvan je modifikace Nowyho, kterou uvdme. Cv. 3.6 Poteby : Barven podle Grama 24 hodin star kultury sledovanch bakteri a kontrolnch mikroorbanism

(Mi-crococcus roseus jako G+ a Serratia marcescens jako G-), Gram I, tj. roztok violeti (roztok .), Lugolv jodov roztok (roztok . ), aceton, roztok safraninu (roztok . ), nesteriln pipeta 10 ml. Proveden : 1. 2. 3. 4. 5. Na jedno podlon sklko piprav doprosted ntr zkouen kultury a po stranch ntr kontrolnch G+ a G- kultur, usu a fixuj plamenem. Barvi 1520 vtein erstv pefiltrovanm roztokem krystalov violeti, slij pebyten barvivo, ale neoplachuj vodou. Pekryj Lugolovm roztokem na 1520 vtein, kapalinu slij. Oplchni rychle acetonem (pokud prepart pout barvivo, maximln vak 15 vtein), oplchni vodou a odckni. Dobarvuj safraninem 1 minutu, oplchni vodou, usu a mikroskopuj s imerz. G+ druhy jsou zbarveny fialov, G- erven. Poznmky: 1. Gramovo barven vyaduje pesnou prci, nepli hust prepart, kter se bhem krtkho psoben barviva me probarvit a pomoc acetonu pak okamit odbarvit. Vtinou se Gramovo barven zda a po nkolikerm opakovn. Z tchto dvod je nutn souasn s ne-znmou kulturou barvit vdy tak buky kontrolnch G+ a Gbakteri. Nejastj chyby pi barven jsou : a) hust prepart, b) suen prepartu za tepla (tj.uvaen bunk), c) pli dlouh odbarvovn acetonem. 2. U jednotlivch jednobukovch koloni meme Gramovu reakci zjistit pomoc rychlho testu s KOH, zaloenho na rozdlnm sloen bunn stny u G+ a Gbakteri. Postup kontrolnho testu jednobukovch koloni :

Strana49

Na podlon sklo kpni 3%n roztok KOH a do nho pomoc steriln kliky rozmchej st bakteriln kolonie. Pi pomalm odtahovn kliky smrem vzhru pozoruj,zda se v prbhu 1 sekundy tvo viskzn hmota thnouc se ve form nitky =G-. U G + druh bakteri se tato viskzn hmota netvo, nebo siln peptido-glykanov vrstva jejich bunn stny je k inkm louh odoln. Tento test ovem nememe pouvat pi kontrole istoty kultury ze ikmho agaru nebo z tekut pdy a pi testovn istoty koloni slizotvornch bakteri (viz kap. ). 3.2.9 Pprava trvalch prepart bakteri V nkterch ppadech je vhodn uchovat si obarven prepart bakteri jako srovnvac nebo dokumentan materil. V tchto ppadech odstranme po mikroskopick prohldce prepartu imerzn olej oplchnutm xylenem a vysume na vzduchu. Pak na ntr kpneme kanadsk balzm, pikryjeme odmatnm krycm sklkem a jemn pitiskneme, aby balzm vyplnil cel prostor mezi podlonm a krycm sklkem. Tento tlak prsty mus trvat 2-3 min. Prepart nechme vyschnou na temnm mst (nejlpe v zsuvce) asi dva tdny a pak sekrbeme pebytek zaschlho balzmu kolem okraj krycho sklka a prepart uchovvme v su-chu a temnu. Tento postup je vhodn pro barven preparty pipraven podle kap. . 3.2.10 Svteln mikroskopie kvasinek Pi mikroskopovn kvasinek sledujeme pedevm morfologii bunk, tj. jejich tvar (kulovit, vejit, elipsoidn, obdlnkovit, trojhelnkovit, vlcovit, apikultn) a velikost, zpsob vegetativnho rozmnoovn, tj. dlen, puen (polrn, bipolrn, multilaterln) nebo puen na irok zkladn. Dle zjiujeme ptomnost pseudomycelia nebo pravho myclia s blastosporami, typ spjen (izogamn, heterogamn), tvorbu askospor, jejich tvar, poet a u-spodn v asku, tvorbu balistospor, teliospor, sporidi nebo chlamydospor. Vechny tyto znaky maj prvoad vznam pi urovn rod kvasinek. V nkterch ppadech meme z tvaru a velikosti bunk usuzovat i na fyziologick vlastnosti. Fyziologick stav bunk v kul-tue je vak patrnj z mikroskopickho sledovn struktury bunnho obsahu a z mnostv uritch chemickch sloek cytoplazmy, nap.glykogenu a tuku. Strana50

Pi sledovn tvaru a struktury bunk kvasinek pipravujeme obyejn nativn prepart (kap. ) ve vod nebo ve fyziologickm roztoku (roztok . ). V tomto prepartu je patrn bunn stna, protoplasma, vakuoly. Bunn jdro m stejn index lomu jako cytoplasma, a proto je zeteln a po specilnm barven (viz kap. ). V pucch bukch je jdro zeteln v nativnm mikroskopovanm prepartu pomoc fzovho kontrastu. Cytoplasma mladch bu-nk je obvykle homogenn bez zeteln struktury. Pi strnut bunk se v n objev drobn zrnka, je se zvtuj a vytvej prstenec uprosted buky. Pozdji vznik v mst prstence blna vakuoly. Vakuola se stm roste, a me vyplovat celou buku. Souasn s mikroskopickm sledovnm morfologie danho kmene kvasinek sledujeme i makroskopick morfologick znaky (viz kap. ), kter zjiujeme ve sladin (pda . ) a na sladinovm agaru (pda . ), ppadn t na sladinov elatin (pda . ). Cv.3.7 Poteby : sklko a kryc sklko, okovac jehla. Proveden : 1. Piprav asepticky nativn prepart kvasinek na podlon sklko podobn jako u bakteri (viz kap. ), a pozoruj jej pi zvten 1045 nebo 1060. 2. Zjisti tvar bunk a jejich vnitn strukturu, zpsob vegetativnho rozmnoovn, ptomnost pseudomycelia nebo mycelia, blastospor a balistospor. 3. Poznvej tak charakter rstu na tuh pd i v tekutm prosted (pro jeho hodnocen viz kap. ). 4. Povimni si spojitosti tvaru bunk s charakterem ntru i se zpsobem rstu v kapalin :kmeny s velmi prothlmi bukami (nap. rod Pichia, nkte pslunci rodu Hansenula a nkter R mutanty rodu Saccharomyces) maj drsn a zvrsnn povrch koloni a v kapalin rostou ve form ksu, tj. zvrsnn such blanky na jejm povrchu, kdeto krtce ovln buky tvo hladk kolonie a sedlinu v kapalin. Poznmky : 1. Je-li prepart zakalen, pidej ze strany kapku asi 5%nho KOH nebo 1%n HCl a pebytenou kapalinu na druh stran odsaj. Lpe se vak osvduje pidat louh nebo kyselinu pmo ke kapce kultury na podlon sklo ped pokrytm krycm sklkem. Je-li v prepart mnoho pokozench bunk, me to bt zpsobeno : Strana51 Nativn prepart kvasinek 2448 h kultury kvasinek na sladin nebo sladinovm agaru, podlon

a) plinm pitlaenm krycho skla k podlonmu, nap. pi vysvn pebyten kapaliny. Z bunk zstvaj jen przdn bunn stny a protoplasma je form zrnek rozptlena v kapalin; b) jehla nebyla dn ochlazena;protoplasma vjkovit vyhezv z bunk. 2. Balistospory, tj. spory odmrovan ze zvltnch stopeek (sterigmat) a tvoen jen u t rod kvasinek (Sporobolomyces, Bullera a Spiridiobolus) se v nativnm prepartu ze svch stopeek velmi snadno uvoluj a tyto stopky jsou dosti tko odliiteln od normlnch vbk mycelia. 3. Bezpen lze balistospory zjistit ze zrcadlovho obrazu koloni, kter se vytvo na vku Petriho misky nad zaokovanou deskou sladinovho agaru po inkubaci 4-10 dn pi 1620 C. Nkte autoi doporuuj na vko Petriho misky nakapat ped inkubac sladinov agar, take se msto vrstvy spor objev pmo zrcadlov kolonie. 3.2.10.1 Sledovn tvorby pseudomycelia, mycelia a blastospor kvasinek ve sklkov kultue

Tvorba psedomycelia, tj. zakrcovanch vlken tvoench prothlmi bukami, a pravho mycelia je charakteristick pro nkter rody kvasinek (Candida, Endomycopsis, Trichosporon, atd.), ale i pro nkter drsn, tj. R mutanty rod, je pseudomycelium obyejn netvo (nap. Saccharomyces). Vvoj pseudomycelia je podporovn ptomnost vzdunho kyslku, neptomnost zkvasitelnch cukr v ivn pd, ptomnost krobu a nkterch duskatch slouenin, nap. asparaginu apod. Vem tmto podmnkm vyhovuje bramborov agar ( pda . ). Pro diagnostick ely je dleit tvar a uspodn blastospor, tj. svazk bunk pucch z pseudomycelia nebo mycelia. Blastospory se vyskytuj v chomcch, peslenech nebo v nepravidelnch vtvch. Jeliko se svazky blastospor v nativnm prepartu v jednotliv buky, je vhodn sledovat jejich uspodn pmo v sklkovch kulturch na bramborovm agaru. Cv.3.8 Poteby : Sledovn tvorby pseudomycelia, mycelia a blastospor kvasinek kultura sledovanch kvasinek (Candida utilis, Saccharomyces cerevisiae

apod.), steriln Petriho miska, podlon skla, steriln voda, podloky pod sklka, tj. sklenn tyinky zahnut do tvaru U ,sklenn tyinka, bramborov agar (pda . ), kovov pinzeta.

Strana52

Proveden : 1. Vysterilizuj podloku v plameni a vlo (pomoc oehnut pinzety) do Petriho misky. 2. Na vysterilovan podlon sklo, penes kapku roztaven pdy a rozeti pomoc pomoc oehnut tyinky do tenk vrstvy (0,51 mm). Pak vlo sklko na podloku. 3. Piprav dkou suspenzi kultury ve steriln vod a jednm okem udlej na ztuhl pd na sklku nkolik teek. Na dno Petriho misky vlij nkolik ml steriln vody. 4. Inkubuj misku se zaokovanm podlonm sklem pi 28C a kad den pozoruj pouhm okem, zda se vytvej na povrchu agaru kolonie s vbky pseudomycelia. 5. V pozitivnm ppad, vtinou po 4-5 dnech, vyjmi sklkovou kulturu z Petriho misky, pozoruj mikroskopem (bez piloen krycho sklka) a zakresli do protokolu charakter pseudomycelia a blastospor. Poznmka : Msto roztrn pdy po sklku se doporuuje ponoit sklko pomoc oehnut pinzety do roztaven pdy v Petriho misce. V tomto ppad je teba agar se spodn strany sklka ped mikroskopovnm oistit, nejlpe pomoc buniit vaty. 3.2.10.2 Sledovn askospor kvasinek

Askospory se tvo u nkterch rod kvasinek (nap. Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Pichia, Nadsonia atd.). Vznikaj v diploidn nebo polyploidn buce (viz kap. ), je se tm pemuje v askus a jsou vsledkem pohlavnho rozmnoovn charakterizovanho spjenm dvou haploidnch bunk (viz kap. ). Pro tvorbu askospor je nezbytn aerobn metabolismus, take se tyto spory vtinou tvo pouze za neptomnosti zkvasitelnch cukr (nap. ve starch kulturch na sladinovm agaru, na specilnch pdch obsahujc octan draseln jako zdroj uhlku pda . ). Pouze rody, u nich se nevyskytuje hexosov represe dchn (nap. Schizosaccharomyces a Kluyveromyces) sporuluj i v ptomnosti sacharid. Nkter rody kvasinek sporuluj dobe na pdch s vluhy z rznch druh zeleniny (pda . ) nebo na pd Gorodkov (pda . ). Obyejn je nutno pout nkolika sporulanch pd, abychom mohli tvrdit, e studovan kmen nesporuluje. Bli o spoulanch pdch, vhodnch pro rzn rody kvasinek (viz van der Walt v Lodder J. (ed.): The Yasts.Ataxonomic Study, North-Holland, Amsterodam, 1970). Dleitm poadavkem sporulace je dobr fyziologick stav bunk, a proto je nutno diploidn buky tsn ped sporulac kultivovat 48 h na bohat ivn pd, nap. Strana53

na presporulanm agaru (pda . ). U nkterch kmen je doporuovno pasovn na hroznovm motu nebo jinch ovocnch vch. Prmyslov pouvan pivovarsk a drorensk kmeny kvasinek vtinou sporuluj jen vzcn a tvo obyejn jen 1-2 spory v asku, pestoe charakteristick poet spor pro dokonal askus rodu Saccharomyces je pprava diploidnch kmen z heterotalickch haploidnch kmen S. cerevisiae i dal postup pi sporulaci tchto kmen je popsn v kap. . Spory kvasinek sledujeme v nativnm prepartu, nebo jejich siln stna je dobe patrn. Jejich cytoplasma lme svtlo ponkud silnji ne cytoplasma bunk,take se v mikro-skopu jev ponkud svtlej. Dleitmi diagnostickmi znaky jsou tvar asku, poet v asku (1, 1-4, 8, vc ne 8) a jejich uspodn, tvar spor a charakter jejich povrchu. Cv.3.9 Poteby : Sledovn askospor 3 dny star kultura diploidnho kmene S.cerevisiae na desce sporulanho

agaru, 2-3 msce star kultura tohoto kmene na ikmm agaru nebo 6 dn star kultura diploidnho kmene Schizosaccharomyces pombe na desce 4%nho sladinovho agaru, podlon sklka, kryc ka, okovac jehla. Proveden : 1. Z dodan kultury piprav nativn prepart do kapky vody a ihned mikroskopuj zvtenm 1045 nebo 1060. 2. Zjisti tvar ask, poet a uspodn spor v asku, jejich tvar (kulovit, vejit, ledvinovit, kloboukovit, jehlovit, nepravideln, hranat) a povrch (hladk, rhovan, bradavit) a zakresli do protokolu. Poznmka : Tvar asku a uspodn spor v nich je zvisl tak na tvaru pvodn diploidn buky: velmi prothl buky maj spory uspodny linern, kdeto vejit a krtk buky maj 4 spory v asku, jen m prez tm kosotvercov. 3.2.10.3 Rozliovn ivch a mrtvch kvasinek vitlnm barvenm

Pro zjitn procenta mrtvch bunk v pekaskm drod, pivovarskch kvasnicch nebo bhem technologickho procesu se pouv barven bunk Strana54

methylenovou mod nebo jinm netoxickm barvivem. Pi tomto postupu se vybarv pouze mrtv buky a iv buky zstanou nezbarveny. Methylenov mod sama psob slab toxicky na kvasinky, zvlt v p-tomnosti kyslku, a proto je nutno zbarven prepart ihned mikroskopovat. Velmi dleit je dodren danho pH barvcho roztoku. Pro kontrolu vybarven mrtvch bunk pipravujeme vedle vitln barvenho prepartu tak prepart barven po fixaci plamenem. Cv.3.10 Rozlien ivch a mrtvch kvasinek

24 h star kultura ze sladiny, podlon a kryc sklo, roztok methylenov Poteby : mode v pufru o pH 4,6 (roztok . ). Proveden : 1. Do stedu jedn poloviny podlonho skla penes kapku kultury, rozeti ji na vt plochu a nech vysuit na vzduchu nebo nad mrnm plamenem. 2. Such ntr prothni plamenem, abys usmrtil buky, ale nepokodil pli jejich tvar a strukturu. 3. Na fixovan ntr kpni roztok methylenov mode, druhou kapku barviva penes do stedu druh poloviny podlonho skla a rozmchej do n oko kultury. 4. Pikryj ob kapky krycm sklem a pomoc zvten 1045 pozoruj rozdl ve zbarven bunk v obou prepartech. Mrtv buky se barv mode. 5. Spotej zbarven i nezbarven buky asi ve 20 zornch polch vitlnho prepartu a poet mrtvch bunk vyjdi v % celkovho potu bunk. Poznmky : 1. Msto methylenov mode mono pout t 0,037mM roztok nilsk mode. 2. Mrtv buky je mono zjistit tak fluorescenn mikroskopi za pouit akridinov orane (pouv se roztok 1 : 5000 smchan s M/15 fosftovm pufrem o pH 6,0 v pomru 1 dl barviva : 4 dlm pufru). Poruen plazma mrtvch bunk z intenzivn erven oproti matn zelen fluorescenci plazmy neporuench bunk. Buky lut a oranov ji odumraj (zpravidla nejsou ji schopny rozmnoovn). Bunn stny vech bunk z erven, take pi rozosten dostvaj iv buky erven ndech. Vakuoly bvaj erven nebo tmav. Pi tomto postupu je nutn dostaten pebytek barvcho roztoku, jinak rozlien pokozench bunk nen mon.

Strana55

3.3 hlediska

Mikroskopick vlknit houby vznamn z potravinskho

Houby v irm pojet (tj. houby a organismy houbovho charakteru) nle celkem do t rznch (PROTOZOA, CHROMISTA a FUNGI). Houby v um slova smyslu (tj. vlastn houby oddlen Eumycota), vznamn z potravinskho nebo hygienickho hlediska pro lovka, nle do jedin e FUNGI. Nade : PROKARYOTA Nade : EUKARYOTA : e Amalia e PLANTAE e FUNGI e PROTOZOA e CROMISTA (Cavalier-Smith, 1986) Ze systematickho pohledu se do skupiny Fungi tradin zaazuj zygomycety (pododdlen Zygomycotina), houby veckovtrus (pododdlen Ascomycotina), houby konidiln (pododdlen Deuteromycotina) a houby stopkovtrus (pododdlen Basidiomycotina). Do e hub pat jak mikroskopick houby, tak i houby makroskopick. Aplikovan mykologie a mikrobiologie asto zjednoduuje botanick systm a mikroskopick houby dl na kvasinky a mikroskopick vlknit houby. Pro mikroskopick vlknit houby astji pouv se termn PLSN. Tento nzev byl zaveden v 19.stolet botanikem J.S.Preslem. Jde o esk ekvivalent anglickho slova moulds i nmeckho Schimmelpilze. e : Oddlen : HOUBY (Fungi) VLASTN HOUBY (Eumycota) VECKOVTRUS HOUBY (Ascomycotina) KONIDILN HOUBY (Deuteromycotina) STOPKOVTRUS HOUBY (Basidiomycotina) 3.3.1 ivn pdy pro izolaci mikroskopickch hub z potravin

Pododdlen : ZYGOMYCETY (Zygomycotina)

Strana56

Osvdenou ivnou pdou irokho pouit je agar s pdnm vluhem a benglskou erven obohacen streptomycinem (pda . ). Tato pda potlauje rst nkterch bakteri a omezuje ponkud rst samotnch hub, take je lze lpe izolovat. Pouit agaru s pdnm vluhem pro izolaci hub rozsevovou a zeovac metodou se doporuuje kombinovat jet s dalmi ivnmi pdami jako je : Bramboromrkvov agar, sladinov agar, kukuin agar, Sabouradv agar a CzapekDoxv agar. Do vech tchto pd se pidv streptomycin (cca 3 mg/l). Rovn lze pout komern vyrbn DRBC agar s chloramfenikolem nebo O.G.Y.E agar s oxytetracyklinem. Pro potravinsk vyeten na ptomnost plsn ve vzorku se podle ISO/N pouvaj pdy obsahujc kvasnin vtaek, glukosu a antibiotikum (chloramfenikol nebo oxytetracyklin) pro potlaen rstu bakteri. Pro izolaci xerofilnch hub z potravin lze pout adu ivnch medi s omezenou dostupnost vody, nap. ivnou pdu s glycerolem a dichloranem vyrbnou t komern jako DG18. 3.3.2 Metody determinace Na izolanch pdch je mon po mikroskopickm pozorovn vtinu sporulujcch hub urit do rod, vjmen i do druh. Pro pesnou druhovou diagnostiku se pouvaj identifikan pdy. Diagnostika nadruh rovni vak nepat mezi rutinn prce a vyaduje uritou zkuenost a znalost. V diagnostice mikroskopickch vlknitch hub se uplatuj ti zkladn typy metod : 1) 2) 3) Morfologick, fyziologick, biochemick.

Morfologick znaky maj primrn vznam pro identifikaci. Znaky fyziologick a biochemick maj pouze doplujc charakter. Mezi fyziologick znaky pat nap. schopnost rstu pi vy teplot (37oC), schopnost vyuvat rzn zdroje dusku nebo schopnost rstu na ivnch pdch s omezenou dostupnost vody. Z biochemickch znak maj vznam sekundrn metabolity, pedevm mykotoxiny. Metody molekulrn biologie zatm nejsou pro bnou identifikaci pouvan, dochz vak k jejich boulivmu rozvoji.

Strana57

Zskan poznatky molekulrn taxonomie jsou zatm kus, materilov i asov nkladn, a proto nedostupn pro adu pracovi. Ale ani morfologick metody, kter jsou nejdostupnj, neumouj v ad ppad jednoznanou druhovou identifikaci, protoe morfologick znaky nejsou zcela oste vymezeny. 3.2.3 1) Preparty mikroskopickch vlknitch hub Pprava mikroskopickch prepart Mikroskopick morfologick znaky vlknitch hub se pozoruj v nativnm prepartu. Jako pozorovac medium se vtinou doporuuje voda. U konidilnch a veckovtrusnch hub lze tak pout laktofenol nebo samotnou kyselinu mlnou obarvenou nap. methylenovou mod. Zskme polotrval preparty, jejich trvanlivost lze prodlouit ormovnm krycho skla nitrocelulosovm lakem nebo nap. sms kalafuny a velho vosku v pomru 7:2. Nkte autoi pouvaj pro ppravu trvalch prepart komern dostupn zalvac media na bzi polyvinylalkoholu. Pprava trvalch prepart zygomycet se nedoporuuje, nebo pi jejich tvorb dochz k deformaci spor a k tvorb rznch artefakt. V tomto ppad je pozorovac medium voda nebo 4% roztok gencinov violeti ve vod. 2) Pprava sklkovch kultur Sklkov kultury jsou pro pozorovn a diagnostice vlknitch hub asto vyuvny. Jejich vhodou je, e nedochz pi jejich pouit k poruen vnitnch struktur hub, take lze velmi dobe sledovat konidiogenezi a umstnn spor na hyfch. Cv.3.11 Poteby : Pprava sklkov kultury mikroskopick vlknit houby steriln podlon a kryc sklko, steriln agarov pda, steriln voda,

suspenze spor vlknit houby, okovac jehla, steriln Petriho miska, mal sklenn zahnut trubika, Proveden : 1. 2. 3. 4. Na steriln podlon sklo kpneme rozehtou agarovou pdu a lehkm naklnnm rozlijeme kapku po povrchu. Na ztuhlou agarovou vrstvu naokujeme suspenzi spor. Sklko umstnme do steriln Petriho misky na steriln kousek zahnut sklenn trubiky. Pidme na dno misky nkolik kapek steriln vody a inkubujeme. Strana58

5.

Po nkolika dnech pozorujeme pmo vyrostlou mikrokulturu na podlonm sklku pod mikroskopem.

Poznmka : Velmi dobr informace poskytuje i kultura narostl mezi podlonm a krycm sklem. 3.3.5 Promovn mikromorfologickch struktur vlknitch hub Pro men velikosti bunk, spor, ky hyf apod. pouvme okulrov mikrometrick mtko, kter vkldme mezi onici asbrnou oku okulru. Dlka stupnice okulrovho mtka je libovoln a je rozdlena na 100 dlk. Kalibraci okulrovho mtka je nutno provst pro kad objektiv, okulr i pro mikroskop s danou dlkou tubusu. Cv.3.12 A) Poteby : Proveden : 1. 2. Ob mtka nastavme tak, e se jejich potky stupnic shoduj. Pozorujeme, kter dal dlky (co nejvzdlenj) opt splvaj. Men mikromorfologickch struktur Kalibrace okulrovho mikrometru Podlon sklo s vyrytou stupnic (2 mm dlen na 200 dlk), okulrov

mikrometrick mtko.

Pklad : Nech 55. dlek mikrometrickho mtka se shoduje s 36. dlkem objektivnho mtka. Pak vypoteme pomoc trojlenky : 55 dlk m.m. x dlek m.m. 36 dlk obj.m. 2 000 m/200 d.o.m.

55x = 362 000/200 x = = 6,54 m B) Poteby : Proveden : 1. 2. 3. Pipravit nativn prepart kvasinek (cvin mikroorganismus). Pro diagnostick ely zmme dlku a klu nejmen a nejvt dospl buky. Vsledek uvdme ve varianm rozpt, nap. (3-5)m (5-7)m. Vlastn men 48 h star kultura kvasinek na sladin

Strana59

Poznmka : Men znan usnadn pouit promtacho mikroskopu. Pak odpad pouit okulrovho mikrometrickho mtka, kter je nahraeno kancelskm mtkem.. 3.3.6 Pododdlen Zygomycotina Hyfy mycelia jsou vtinou nepehrdkovan, pehrdky oddluj pouze rozmnoovac struktury nebo jsou vytvoeny ve starch hyfch. U mnoha zstupc dochz vak k tvorb pehrtek i v mladch kulturch. Bunn stny jsou tvoeny vtinou chitinem a chitosanem. Nepohlavn rozmnoovn se uskuteuje pomoc endogennch sporangiospor, kter se tvo uvnit sporangi. U nkterch zstupc dochz v hyfch k tvorb tlustostnnch chlamydospor. Sporangia jsou vtinou kulovit, u nkterch zstupc uvnit se steriln kolumelou. Po rozpadu stny sporangia zstv na bzi sporangia tzv. lmeek. Sporangia mohou bt mnohosporov i jednosporov pipomnajc konidie. Nkte zstupci vytvej vlcovit merosporangia. U nkterch rod vyrstaj sporangiofory ve svazcch ze zvltnch dlouhch lahounovitch hyf stolon, kter tvo v mstech dotyku se substrtem rhizoidy tvary podobn konkm. Pohlavn rozmnoovn je charakterizovno splvnm dvou gametangi, kter jsou od mycelia oddlena pehrdkou a jsou nesena rozenm koncem hyfy suspenzorem. Po splynut gametangi vznik diploidn zygospora v zygosporangiu. 3.3.6.1 1a) 1b) 2a) Kl k uren nejastjch rod Zygomycet kontaminujc potraviny

Sporangiospory se tvo v merosporangich, kter pokrvaj rozen konec SYNCEPHALASTRUM viz 2 Sporangiospory se tvo v kulovitch nebo hrukovitch sporangich Sporangia a sporangiofory obvykle tmav pigmentovan, sporangiofory vtinou

sporangioforu s kolumelou

nevtven, asto se vyskytuj ve skupin. Velikost sporangi se pohybuje mezi 50-360 m. Spory jsou asto rhovan RHIZOPUS

Strana60

2b)

Sporangia a sporangiofory nejsou pigmentovan nebo jen slab zbarven, viz 3

sporangiofory asto bohat vtven. Sporangia nikdy nepesahuj 100 m v prmru. Spory nejsou rhovan 3a) sporangia dosahuj a 80 m 3b) Hrukovit sporangia se zetelnou apofysou, 10-40 m v prmru (koncov ABSIDIA Sporangia kulovit bez apofysy, vtinou vt ne 40 m v prmru MUCOR 3.3.7 Pododdlen Ascomycotina a Deuteromycotina Pododdlen Ascomycotina zahrnuje veckovtrus houby (Meiosporick houby), v jejich ivotnm cyklu se vyskytuje pohlavn stadium, tzv. TELEOMORFA. Pododlen Deuteromycotina je taxonomicky pomocn pododdlen. Zahrnuje houby, kter znme pouze ve stadiu ANAFORY, tj. chyb jim pohlavn rozmnoovn. Tyto houby se tak oznauj jako konidiln nebo mitosporick houby. Dve byly oznaovny Fungi imperfecti. Cel ivotn cyklus veckovtrus houby zahrnuje jak pohlavn, tak i nepohlavn stadium rozmnoovn. Houba prochzejc obma stadii se nazv HOLOMORFA. Hyfy mycelia jsou pehrdkovan, podstatnou slokou bunnch stn je chitin a polyglutany. Nepohlavn rozmnoovn se uskuteuje nejastji pomoc nejrznjch typ spor, tak dlenm a fragmentac stlky. Z hlediska morfologickho mohou mt spory rozlin tvar, velikost a barvu. Mohou bt jedno i vcebunn a mohou vznikat jednotliv, ale i v menm i vtm potu. Nejastji vznikaj spory endogenn. Exogenn mohou vznikat na specializovanch hyfch, oznaovanch jako konidiofory. Spory takto vznikl nazvme konidie. Existuj dva zkladn typy vzniku konidi (konidiogenese) : 1. Thalick nebo arthrick konidiogenese Thalick (arthrick) typ je charakterizovn vznikem konidi z pedem vytvoen existujc buky - hyfy, kter se obvykle rozdl pehrdkami a rozpadne se na jednobunn sti. 2. Blastick konidiogenese Blastick typ je charakterizovn vznikem konidi vypuenm z konidiogenn buky. Z konidi vznikajcch blastickm zpsobem jsou nejznmj :

Strana61

a) b) c)

Porospory, vznikaj vyheznutm z pru a nslednm vytvoenm bunn stny. Fialospory, vznikaji v tzv. fialidch, co jsou lahvicovit buky s stm v apikln sti, z n se postupn uvoluj konidie. Anelospory, pi jejich vzniku je pepka oddlujc nov vzniklou konidii protrhvna nsledn vznikajc konidi. Zbytky protrench stn vytvej lmeky u st konidiogenn buky, zvan anelida. Pohlavn rozmnoovn je charakterizovno kontaktem a splynutm obsah dvou

morfologicky diferencovanch gametangi. Pak dochz k plazmogamii a ke vzniku tzv. askogennch hyf. Tyto hyfy pedstavuj dikaryotickou fzi a jejich vskyt je omezen na vnitn prostor plodnice. Koncov buky askogennch hyf se pemuj na askus (vecko). V asku dochz ke karyogamii a nsledn meioze a mitoze. Vsledkem je vznik askospor. Plodnice (askoma, askokarp) je tvoena haploidnmi hyfami, kter uzavraj askogenn hyfy a vecka. Z hlediska systematiky je dleit vvoj plodnice a jej morfologick tvar. Nejastjm typem plodnice u potravinsky vznamnch hub je kleistothecium a perithecium. Kleistothecium je vestrann uzaven plodnice, kter se otvr rozpadem nebo rozputnm stny. Vecka jsou uvnit neuspodna. Perithecium je kulovit a hrukovit plodnice s zkm kanlkovm stm (ostiolem). Vecka jsou v n uspodna. 3.3.7.1 1a) 1b) 2a) 2b) 3a) 3b) Kl k uren nejastjch rod Deuteromycotina kontaminujcch potraviny Konidie vznikaj v pyknid synnematech PHOMA viz 2 Konidie nevznikaj v pyknid, alena hyfch, konidioforech, sporodochich nebo Konidie se tvo na specilnch konidiogennch bukch (fialidch, anelidch) v etzcch nebo kulovitch shlucch (bazipetlnm zpsobem) Konidie se netvo na specilnch konidiogennchbukch, ale akropetln (bazifugln) nebo rozpadem plodnch hyf nebo jednotliv Konidie v suchch etzcch (snadno rozpadavch) Konidie v slizovitch kulovitch shlucch viz 4 viz 9 viz 13

Strana62

4a)

Konidie jsou vtinou dvoubunn, vznikaj z vlknitch konidiogennch bunk, vce i mn ikmo umstnn, uspodan jako v klasu. Kolonie narovl TRICHOTHECIUM

4b) 5a)

Konidie vdy jednobunn, vznikajc v lahvicovitch konidiogennch bukch v rovnch etzcch. Kolonie rznch barev viz 5 Konidie omezenho rstu, ervenohnd. Konidie se tvo po tyech rozpadem vlcovit bradavit plodn hyfy. Konidie jsou zprvu kostkovitho tvaru, pozdji se zaobluj (subglobozn tvar). Xerofiln WALLEMIA viz 6 ASPERGILLUS viz 7

5b) 6a) 6b) 7a) 7b) 8a) 8b) 9a) 9b)

Kolonie obvykle nejsou omezenho rstu (vyjma xerofiln druhy rodu Aspergillus). Konidie se netvo dlenm plodn hyfy Konidiofory jsou na konci typicky rozen Konidie nejsou apikln rozen

Konidiogenn buky anelidick. Konidie se irokou uatou baz Konidiogenn buky fialidick. Konidie bez irok uat baze. Kolonie lut a hnd. Fialidy s dlouhm krkem Fialidy dlouh, idlovitho tvaru, polyfialidy chyb jsou fialidy redukovny PAECILOMYCES Kolonie asto do zelena (u nkterch druh blav). Fialidy s krtkm krkem ACREMONIUM viz 10 Trichoderma Fialidy vce i mn lahvicovitho tvaru a/nebo jsou ptomny polyfialidy nebo

10a) Kolonie obvykle zelen (kdy rostou na svtle)

10b) Kolonie blav, lut, purpurov fialov, narovl, hnd nebo ernav 11a) Kolonie bl, lutav rov, purpurov, nkdy zelenav. Pehrdkovan konidie tvaru bannu obvykle ptomny FUSARIUM 11b) Kolonie ern, nkdy rov. Konidie nejsou septovan viz 12 12a) Fialidy jednotliv nebo v chudch peslenech lahvicovho tvaru se zetelnm lmekem nebo jsou fialidy redukovny. Konidiofory nejsou zeteln (vrazn vytvoen) PHIALOPHORA nebo LECYTHOPHORA 12b) Fialidy v hustch koncovch svazcch, iroce kyjovit, nejir ve vrcholov sti. Bez npadnho lmeku. Konidiofory jasn diferencovan, se stopkou 13a) Kolonie rostou velmi rychle, pokrvaj celou Petriho misku o 9 cm za nkolik mlo dn. dce vlknit Strana63 CHRYSONILIA

13b) Kolonie nejsou oranov a nepokrvaj bhem nkolika dn celou Petriho misku o 9 cm 14a) Konidie pouze arthrick 14b) Konidie jak arthrick, tak blastick nebo jen blastick 15b) Konidie se netvo po tyech viz 14 GEOTRICHUM viz 15 viz 16

15a) Konidie se tvo po tyech dlenm vlcovitho plodnho vlkna 16a) Konidiogenn struktury se skldaj jak z arthrokonidi, tak z blastickch konidi (podobn jako Trichosporon u kvasinek a tlustostnn hnd arthrokonidim podobn hyfov u Aureobasidium) MONILIELLA 16b) Konidiogenn struktury se skldaj pouze z blastickch konidi 17a) Blastick konidie vznikaj synchronn na hyfch nebo zvtench bukch i vtvch vtvch viz 18 viz 19 17b) Blastick konidie se netvo synchronn na hyf nebo na zvtench bukch i 18a) Konidie vznikaj na zoubcch terminln zduelch konidiogennch bunk. Konidiofory vzpmen, na konci stromekovit vtven. Kolonie dce vlknit, edohnd BOTRYTIS 18b) Konidie vznikaj na vlknech nebo na zcela zduelch vtvch. Kolonie pipomnaj kvasinky, smetanov lut a svtle hnd, rovooranov nebo ernozelen 19a) Konidie se tvo jednotliv na mlo patrnch konidioforech, v hroznech viditelnch jako ern body (sporodochia) EPICOCCUM 19b) Konidie se tvo jednotliv nebo v etzcch, konidiofory zeteln,neshlukuj se 20a) Konidie jsou v etzcch, maj hladkou stnu. Kolonie obvykle zprvu krmov zelen, pozdji tmavnou nebo zelenohndho odstnu septovan, ale jen s pnmi septy 21b) Konidie jak s pnmi, tak podlnmi septy (zovit) zobkem falench etzcch Strana64 MONILIELLA viz 21 20b) Konidie v etzcch nebo jednotliv, obvykle bradavit. Kolonie zelenoernho 21a) Konidie spe tenkostnn, vtinou jednobunn. Bazln konidie asto CLADOSPORIUM viz 22

AUR

22a) Mlad konidie zaoblen na bzi, zral konidie v etzcch a/nebo jsou opaten ALTERNARIA 22b) Mlad konidie zapiatl na bzi, zral konidie jednotliv nebo v krtkch ULOCLADIUM

3.3.7.2 1a) 1b) 2a) 2b) 3a) 3b) 4a) 4b) 5a) 5b)

Kl k uren nejastjch rod Ascomycotina kontaminujcch potraviny

Askomata se zetelnou vyvinutou stopkou. Stopka je tvoena jednoduchou hyfou. Anamorfou je Basipetospora MONASCUS viz 2 Ascomata bez zeteln stny.Anamorfa je Paecilomyces BYSSOCHLAMYS Ascomata maj stnu. Anamorfa je Aspergillus nebo Penicillium Anamorfa je Penicillium, askomata se zetelnm obalem, lut nkdy pechzejc do naervenal barvy vcevrstevnou stnou Aspergillus nidulans Stna askomatu nen obklopena vrstvou Hlle cells skupiny Aspergillus glaucus Anamorfa je ze skupiny Aspergillus fumigatus TALAROMYCES viz 4 Anamorfa je Aspergillus, askomata s Hlle cells nebo s jedno- a s Stna askomatu obklopen silnostnnmi Hlle cells. Anamorfa je ze skupiny EMERICELLA viz 5 Ascomata bez stopky. Anamorfa je Penicillium, Paecilomyces nebo Aspergillus

Askomata lut, stna seskld z jedn vrstvy zplotlch bunk. Anamorfa je ze EUROTIUM omata bl a krmov, stna se skld z nkolika vrstev zplotlch bunk. NEOSARTORYA

3.3.8

Pododdlen Bazidiomycotina Karyogamie i meiosa probh v buce zvan bazidie, haploidn bazidiospory se

tvo exogenn na sterigmatech. Toto pododdlen se dl na dv tdy : 1. 2. Heterobazidiomycetes Homobazidiomycetes Do prv z tchto td pat tzv. bazidiomycetn kvasinky (kap.3.2.10). Jin mikroskopick houby vznamn z potravinskho hlediska do tohoto pododdlen azeny nejsou. Z tohoto dvodu toto pododdlen nebude ble morfologicky probran. 3.3.9 krtSlovnk hlavnch pojm myceliln poltek se seskupenmi, pomrn kmi konidiofory Strana65

ACERVULUS

AKROPETLN ANAMORFA cyklu ANELIDA anelospoe, na ANELOSPORA APOFYSA (ec apophyo = vyrstm) ARTHROSPORA (ec.rthron = len) existujc sti ASKOGENN HYFA konASKOKARP ASKOMA ASKOSPORA ASKUS (ec.asks = vecko) karyoBLASTOSPORA BAZIFUGLN (lat.fugio = prchm) st nejstar FIALIDA blastick koFIALOSPORA FUNGI IMPERFECTI konidilnch GAMETANGIUM s druhou gametanHOLOMORFA z anamorfy a telemorfy) HYFA (ec.hphe = bunn vlkno) gi vznik zygospora. nidie je nejmlad BAZIPETLN (lat.peto = smuji)

vvoj nastv na vrcholu (= BAZIFUGLN) fze nepohlavnho rozmnoovn v ivotnm konidiogenn buka, dvajc vznik jejm st jsou prstncovit zbytky bunnch stn konidie vznikl vypuenm z anelidy rozen nejhoej st sporangioforu spora vznikajc z ji pedem vytvoen,

buky hyfy, kter se rozdl pehrdkami a rozpadne se na jednotliv dikarystick hyfa veckovtrusnch hub, jej plodnice veckovtrusnch hub plodnice veckovtrusnch hub (= ASKOKARP) spora vznikl reduknm dlenm ve vecku buka veckovtrusch hub, v n dochz ke puenm vznikl buka nebo konidie akropetln vvoj nastv na vrcholu, apikln vvoj nastv od zkladu, tj.apikln st je obvykle lahvicovit buka produkujc konidie vznikl vypuenm z fialidy nedokonal houby star oznaen rozen konec hyfy, vznikl po dotyku hyfou a oddlen od matesk buky pepkou. Po splynut dvou cel ivotn cyklus houby (skld se vlkno mycelia hud (= Deuteromycotina) gamii a nsledn i asov oddlen meiozi

cov buka se pemn ve vecko

Strana66

CHLAMYDOSPORA (ec.chlamys = svrchn odv) vznikaKARYOGAMIE KLEISTOTHECIUM otevrajc zasatj.pouze KONIDIE KONIDIOFOR KONIDIOGENESE KONIDIOGENN BUKA KONIDIOMA tvorb KOREMIE (=SYNNEMA) MEIOSPORICK HOUBA telemorfickou uspodanmi METULA MITOSPORICK HOUBA anamorfickou OSTIOLUM PERITHECIUM PLAZMOGAMIE PLODNICE POROSPORA PYKNIDA (ec.pykns = uzaven) RHIZOIDY (ec.rhiza = koen) koeny vych rostlin Strana67 fz) MYCELIUM (ec.mkos = houba) fz) MEROSPORANGIUM v ad konidi KOLUMELA (lat.columella = sloupek) hujc do sporangia KONIDILN HOUBY

silnostnn nepohlavn spora hub

jc v hyfch tak, e se obsah zahust a obal tlustou blanou. Je urena k peit, nikoliv k rozmnoovn. splvn dvou bunnch jader uzaven plodnice vechovtrusch hub se rozpadem nebo rozruenm stny polokulovit a kuelovit st sporangioforu houby rozmnoujc se pouze nepohlavn, nepohlav vznikl spora houby specializovan hyfa nesouc konidie zpsob vzniku konidi buka, ve kter vznik konidie tvar podobn plodnici, ve kterm dochz ke svazek navzjem slepench konidiofor houba rozmnoujc se pohlavn (= vlcovit sporangium se sporami buka na konidioforu nesouc fialidy houba rozmnoujc se nepohlavn (= vegetativn forma hub, soubor houbovch hyf st askokarpu askokarp vtinou lahvicovitho tvaru cytoplazmatick fze (splvn cytoplazmy) obal uzavrajc askogenn hyfy a vecka blasticky vznikl spora lahvicovit konidioma vlkna vyrstajcz mycelia a pipomnajc

anamorficky (= Deuteromycotina)

SPORANGIOFOR SPORANGIOSPORA SPORANGIOLA SPORANGIUM (ec.angeion = ndrka) SPORODOCHIUM palisdovit substrtem SUSPENZOR SYNNEMA (=koremie) TELEMORFA cyklu VECKO XEROFILN aktivitou ZYGOSPORA (ec.zygn = jamo)

specializovan hyfa nesouc sporangium spora vznikajc endogenn ve sporangiu sporangium s malm potem spor tvar obsahujc spory loisko, podukovit tvar hyf s hust uspodanmi konidiofory dlouh hyfa tvoc pi styku se rhizoidy rozenina hyfy nesouc zygosporangium svazek navzjem spletench konidiofor fze pohlavnho rozmnoovn v ivotnm = askus rozmnoujc se v prosted s nzkou vodn tlustostnn spora vznikl po kopulaci

STOLON(ec.stolnes = koenovit vbky)

Kontroln otzky ke kap. 3. MORFOLOGIE A CYTOLOGIE MIKROORGANISM 1. Kter znte makroskopick znaky? 2. Co je to ks a jak meme jeho tvorbu potlait? 3. Jak je rozdl mezi ksem a mzdrou? 4. Co zjiujeme pi makroskopickm vyhodnocovn rstu na ikmm agaru 5. u bakteri 6. u plsn 7. Existuje njak vztah mezi charakterem rstu na tuhm a tekutm prosted? 8. Co jsou obrovsk kolonie? 9. Jak znte typy mikroskopickch prepart? 10. Co je to fixace a pro se provd? 11. Kter barviva se pouvaj v mikroskopii mikroorganism, a jak typy barven prepart znte? 12. Kter morfologick znaky meme zjistit pi svtelnm mikroskopii a na em je zaloen jejich prkaz? Strana68

13. Kdy pouvme negativn barven bakteri? 14. Jak zjistte tvorbu spor u a)bakteri b)kvasinek c)plsn? 15. Jak zjistte pohyb mikroorganism? 16. Na em je zaloeno Gramovo barven a k emu je pouvme? 17. Na em je zaloeno mikroskopick zjitn ivch a mrtvch bunk v pekaskm drod? 18. Jak lenme oddlen Eumycota 19. Vyjmenujte charakteristick znaky zygomycet 20. Vyjmenujte charakteristick znaky askomycet 21. Vyjmenujte charakteristick znaky deuteromycet 22. Kter z basidiomycet maj vznam v potravinsk technologii?

Strana69

4.

SLEDOVN VLIVU VNJCH PODMNEK NA MIKROORGANISMY Rst a metabolismus mikroorganism je zvisl na podmnkch ivotnho

prosted. Psoben faktor ivotnho prosted se d rozdlit na nsledujc skupiny: 1) fyzikln faktory (teplota, tlak, UV zen, zen), 2) chemick faktory (zdroje C, zdroje N a ostatn iviny, ptomnost antimikrobilnch ltek ), 3) biologick faktory (vliv ostatnch mikroorganism). Kad mikroorganismus vyaduje sv specifick optimln vnj podmnky. Mikroorganismy ve srovnn s vymi organismy jsou obecn odolnj k nepznivm ivotnm podmnkm a maj velikou adaptan schopnost regulovat svj metabolismus k promnlivm podmnkm ivotnho prosted. V praxi se vyuv rzn citlivosti mikroorganism ke shora uvedenm faktorm k zen aktivity mikroorganism danm smrem : Bu k potlaen rstu nedoucch mikroorganism nebo naopak k vbru odolnch druh, kter lze pout v prmyslov praxi. 4.1 Vliv teploty na mikroorganismy Teplota vnjho prosted je nejvznamnjm faktorem, kter ovlivuje rst a rozmnoovn mikroorganism. Teploty, kter umouj rst mikroorganism jsou od 0oC do 85-90 oC , i kdy jsou popsan jet vy teploty, pi kterch nkter druhy bakteri rostou a ij. Hodnotme-li zvislost rstu na teplot, uruje ti zkladn teploty : minimln, tj. nejni teplota, pi kter se mikroorganismus jet rozmnouje mitelnou rychlost, optimln, pi kter dosahuje nejvy rstov rychlosti (max), maximln, tj. nejvy teplota pi kter jet dochz k dlen buky. Optimln teploty pro jednotliv fyziologick pochody v buce (tvorba enzym, sporulace, transport ivin) se li i pro jeden druh. inek teploty je rovn ovlivnn velikost kultivan ndoby, koncentrac bunk, obsahem vody v ivnm substrtu a pH. Obvykle se stanovuje optimln teplota rstu a smrtc teplota, mn asto teplotn rozmez rstu.

Strana70

Cv.4.1. Poteby :

Vliv teploty na rst mikroorganism Kultury Serratia marcescens, Bacillus stearothermophilus, Saccharomyces

cerevisiae, 8 zkumavek s naikmenou ivnou pdou (pda .XZ), 4 zkumavky se sladinkovm agarem (pda . XY) nebo OGYE agarem ( pda . XZ). Proveden : 1. Zaokuj pomoc kliky 4 zkumavky se ivnou pdou kulturou S. marcescens 2. Dal 4 zkumavky kulturou B. stearothermophilus a 4 zkumavky se sladinkovou pdou kulturou S. cerevisiae. 3. Dej po jedn zkumavce kad naokovan kultury inkubovat do teploty 4oC, 25oC, 37oC a 55 oC. Pi kultivaci 55 oC je nutno dt zkumavky do tzv. vlhk komrky, co je sklenn vana, ve kter je umstna ndobka s vodou a kter je uzaven sklennou deskou. Aby deska dobe pilhala, je nutn kraje vany pott tukem na zbrusy. 4. Za 48 a 72 hodin inkubace pozoruj intensitu nrstu, porovnej ji. 5. Vsledky zapi do tabulky. Intenzitu rstu ozna nsledovn: dn nrst = 0, slab nrst = +, silnj nrst = ++, maximln nrst = +++. 6. U S. marcescens sleduj tak barvu vyrostlch koloni. 4.1.1 Stanoven smrtc teploty Smrtc (letln) teplota je nejni teplota, kter bhem urit doby usmrcuje mikroorganismus za pesn definovanch podmnek. Tuto teplotu stanovuje zsadn v tekutch kulturch. Smrtc teplota se pro jednotliv mikroorganismy li a je ovlivnn koncentrac bunk, fyziologickm stavem kultury (st), sloenm media a pH. Obvykle se smrtc teplotou rozum teplota, kter za 10 minut usmrt vechny buky v suspenzi. Z technologickho hlediska m vt vznam stanoven smrtc doby, kter udv nejkratmdobu potebnou k usmrcen mikroorganism za dan teploty a definovanch podmnek. Vztah mezi letln teplotou a dobou potebnou k usmrcen

Strana71

mikroorganismu lze vyjdit letalitn kivkou, kter m mimodn vznam obzvlt v konzervrenskm prmyslu. Velk vtina mikroorganism pat mezi mezofiln (optimum rstu mezi 25oC a 40oC), kter jsou usmrcovny teplotami kolem 60oC, psobcmi 10 a 15 minut. Pro usmrcen thermofilnch mikroorganism (optimum rstu mezi 45oC a 65oC) je nutn uvat vych teplot (vce ne 80oC). Spory vtiny bakteri jsou znan thermorezistentn a bvaj usmrceny teplotou a 120oC a vce, psobc po dobu alespo 15 minut (sterilisace autoklvem). Spory kvasinek a plsn jsou mnohem mn odoln, vetinou je usmrcuj teploty mezi 60oC-70oC. Pi pasterisaci jsou obvykl teploty mezi 63oC-72oC od 15 sekund pi horn teplot a po dobu 30 minut pro doln hranici. Odolnost mikroorganism k teplot ovlivuje obsah vody v prosted i v bukch, pH prosted a ptomnost nkterch ltek (lipidy, blkoviny, sacharidy) ve vy koncentraci. Cv.4.2 Poteby : Orientan stanoven smrtc teploty kvasinek, plsn a bakteri kultura mikroorganism v tekut pd, 2 desky pslun agarov pdy,

vhodn pro testovan mikroorganismus, teplomr, pipeta 2 ml, 8 sterilnch zkumavek, termostatovan vodn lze, termostat. Proveden: 1. Pracovn skupiny nastav postupn vodn lze na teploty: 45oC, 50oC, 55oC, 60oC, 65oC, 70oC, 75oC. 2. Do 7 zkumavek napipetuj 2 ml kultury testovanho mikroorganismu a ozna je 1 a 7. 3. Dno Petriho misek s agarovou pdou rozdl fixem na 8 dl a ozna 1 a 8. 4. Z pvodn suspenze bunk naokuj klikou (velmi pesn) na dl oznaen osmikou, kter bude slouit jako kontrola. 5. Na dobu 11 minut vlo zkumavky do jednotlivch teplot vodn lzn, jedna minuta se pidv na vytemperovn kultury na teplotu vodn lzn. 6. Zkumavky po 11 minutch rychle ochla pod tekouc vodou a postupn naokuj klikou z kad zkumavky na jeden dl agarov pdy oznaen stejnm slem. 7. Dej zaokovan Petriho misky inkubovat do termostatu pi teplot vhodn pro testovan mikroorganismus na dobu potebnou k jeho rstu.

Strana72

8. Odeti nejni teplotu, pi kter ji buky mikroorganismu nevyrostly, kter se rovn smrtc teplot. Pi odetn nrstu berte v vahu monost vzdun kontaminace zpsoben opakovanm otevrnm misek. Cv.4.3 Poteby : Stanoven letalitn kivky u sporotvornch bakteri Narostl tekut kultura Bacillus megaterium, olejov lze, ivn pda

.XY, 20 kus sklennch ampulek obsahu 25 ml, steriln piky objemu 1 ml (modr), pipetman nastaven na 1 ml, 12 zkumavek s ivnou pdou, ochrann tt, pilnk na sklo.

Proveden : 1. 2. Stanov mikroskopicky v barevnm fixovanm prepartu (kap. ) relativn poet spor vzhledem k potu bunk. Vzrostlou kulturu nae asepticky MPB 104, m doshne koncentrace bunk asi 104 v 1 ml. K inaktivaci vegetativnch bunk zahej na 10 min na vodn lzni tepl 90oC. Po ochlazen tto suspenze napipeuj 1 ml na misku a pelij MPA ochlazenm na 45oC a dobe rozmchej. Po inkubaci pi 37oC spotej narostl kolonie. Jejich poet odpovd potu ivch spor v pvodn edn suspenzi. 3. Noem na sklo asepticky odstra horn st sklenn ampulky a injekn stkakou penes do n 1 ml edn suspenze. Napl tak vech 20 ampulek. Ampulky ihned zatav! 4. Vytemperuj olejovou lze na 110oC, vlo do n 8 ampulek, kter jsou absolutn such. Pracuj na vnj stran s nasazenm ochranm ttem, nebo ampulky asto praskaj. Po 10, 15, 20, 25 a 30 min postupn vythni 2 ampulky a rychle ochla vodou. Jednu ampulku dej kultivovat pi 37oC neotevenou, druhou vdy otevi asepticky pilnkem, obsah penes do Petriho misky a pelej MPA zchlazenm na 45oC a dobe rozmchej. Po ztuhnut dej inkubovat jako prv ampulka. 5. Stejn pracuj pi teplot 115oC, a to po 5, 10, 15 min a pi teplot 120oC po 2, 3 a 5 min. 6. Po 24 a 48 h kultivace pozoruj rst mikroorganism na Petriho miskch i v ampulkch. Vzrostl ozna (+), nevzrostl () a zanes do tabulky, vynes v grafu

Strana73

posledn pozitivn a prvn negativn zjitn pi kad teplot a prolo tmito body pmku na semilogaritmickm papru, m zsk letalitn kivku. Poznmky : 1. as. 2. Pro sledovn vlivu substrtu na odolnost spor ze suspenzi bunk namsto do MPB do 2% NaCl, 10% roztoku sacharosy a podobn. Porovnej zskan kivky. 3. Podrobn se dote o latalitnch kivkch, jejich konstrukci a pouit v knize V.Kyzlink : Zklady konzervace potravin, Praha, 1980. 4.2 Vliv pH prosted na rst mikroorganism Rst mikroorganism je vznamn ovlivovn koncentrac vodkovch iont v pro-sted. Vtina bakteri roste v neutrlnm nebo slab alkalickm prosted. Pro kvasinky je optimln kysel prosted (pH 4,85,5). Optimln pH pro vtinu plsn je pobl neutrlnch hodnot, ale obecn se plsn rozmnouj ve velmi irokm rozmez pH, tj. od 1,2 a po 11,0. V mnoha ppadech mikroorganismy samy ovlivuj pH prosted pomoc svho metabolismu, nap. kyselinotvorn bakterie, plsn i kvasinky sniuj pH prosted. Pi hodnotch pH vzdlench od optima, kles odolnost mikroorganismu k teplot. Cv.4.4 Poteby : Sledovn vlivu pH prosted na rst mikroorganism erstv kultury Escherichia coli a Saccharomyces cerevisiae, 12 sterilnch K pesnmu stanoven se uv nejmn 5 paralelnch ampulek pro kadou teplotu a

zkumavek, bujon, sladina, zsobn sada roztok pufr : roztok A Na2HPO4.2 H2O (35,6 g/1000 ml), roztok B kyselina citronov (21,06 monohydrtu/1000 ml). Pufry o potebnm pH zskme nsledujcm ednm : pufr (pH) 3.0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 Proveden : roztok A (ml) 4,1 7,7 10,3 12,6 16,5 19,4 roztok B (ml) 15,9 12,3 9,7 7,4 3,5 0,6

Strana74

1. Ze zsobnch roztok A a B namchej pufry o uvedenm pH. Do 6 zkumavek napipetuj 5 ml bujonu a do dalch 5 ml sladiny a od kadho pufru napipetuj vdy 5 ml a pidej do obou typ pd. Takto pipraven zkumavky uzavi kovovm uzvrem a vysteriluj v autoklvu. 2. Po zchladnut obsahu zkumavek po sterilaci, zaokuj zkumavky s bujonem bakteri E. coli a zkumavky se sladinou kvasinkou S. cerevisiae. 3. Bakterije inkubuj pi 37oC 24 hodin a kvasinky pi 25oC 48 hodin. 4. Odeti nrst mikroorganism ve zkumavkch a zanes do tabulky . dn nrst = 0, intensitu vyhodno potem +. Rovn je mon zmit optickou denzitu pi 650 nm na spektrofotometru. 4.3 Vliv osmotickho tlaku na rst mikroorganism Mikroorganismy rostou nejlpe v prosted, kter m stejn nebo jen o mlo ni osmotick tlak, ne jejich cytoplasma. Je-li prosted siln hypotonick, dochz k plasmoptze, tj. procesu vyrovnvn osmotickho tlaku buky a prosted, do buky pes cytoplasmatickou membrnu vstupuje voda. Buka bobtn a jejmu prasknut brn pouze siln bunn stna. V hypertonickm prosted nastv naopak odvodnn bunk, tj. plasmolza, je se u G- bunk projevuje odtrenm cytoplasmatick membrny od bunn stny. Zrove se sniuje metabolick aktivita bunk, co se vyuv v konzervrenskm prmyslu. Nkter potraviny (maso, ryby) se nasoluj 6 a 30% NaCl, jin (demy, marmeldy, kandovan ovoce) se konzervuj pdavkem sacharosy a do 80%. Jsou vak tak mikroorganismy, kter jsou schopn rst pi vysokm osmotickm tlaku, osmofiln organismy, nebo vysok koncentraci soli, halofiln organismy. Tzv. osmotolerantn kvasinky rostou i v ptomnosti 60% sacharosy, nkter halofiln bakterie potebuj ke svmu rstu koncentrace NaCl od 5 20%, jin tzv. extrmn halofily do 30%. Cv.4.5 Poteby : Vliv osmotickho tlaku na rst mikroorganism Steriln roztoky 30% NaCl, 60% roztok sacharosy, bujonov kultura

Escherichia coli nebo Staphylococcus aureus, Saccharomyces cerevisiae nebo Zygosaccharomyces, 10 sterilnch zkumavek, pipety dlen 1 ml a 10 ml, masopeptonov bujon (pda .XY) a sladina (pda .XY). Proveden: Strana75

1. Piprav 5 zkumavek po 6 ml bujonu obsahujcho postupn 0, 5, 19, 25% NaCl. Podobn piprav 5 zkumavek po 6 ml sladiny obsahujc postupn 0, 10, 20, 30 a 40% sacharosy. 2. Zkumavky s bujonem zaokuj 0,5 ml kultury E. coli a dej inkubovat 24 hodin pi 37oC. 3. Zkumavky se sladinou zaokuj 0,5 ml kultury S. cerevisiae a dej inkubovat pi 25oC na 2448 hodin. 4. Odeti, ve kterch zkumavkch mikroorganismy rostou a zapi do tabulky. Zjisti nejni koncentraci NaCl a sacharosy, kter zabrnila mikroorganismm v rstu. 4.4 Vliv ultrafialovho svtla na mikroorganismy Zen pichz na zemsk povrch ze slunce a ostatnch mimozemskch zdroj a rovn vznik na zemi z rznch umlch zdroj. Zen maj rznou vlnovou dlku a energii, m krat je vlnov dlka zen, tm vy m energii. Rentgenov zen (X paprsky) a gama zen pat mezi ionizujc zen. Toto zen ionizuje vodu a vytv vysoce aktivn voln radikly, kter maj destruktivn inek na DNA. inek zen je zvisl na st bunk, sloen media a na teplot. Ultrafialov svtlo (UV) svtlo vlnov dlky 240300 nm m mutagenn a letln inky na mikroorganismy. Nejinnj je UV svtlo o vlnov dlce 265 nm, kter pokozuje DNA tvorbou pyrimidinovch dimer. UV svtlo tak vyvolv tvorbu toxickch peroxid a ozonu. Vy dvky buky usmrcuj (letln inek), pi nich dvkch buky pevaj, zvyuje se vak poet mutac. Normln sklo UV zen pohlcuje a chrn tak mikroorganismy ped jeho inky. Ptomnost karotenoidnch barviv v bukch nkterch kvasinek, bakteri a na povrchu plsovch spor zvyuje odolnost tchto mikroorganism proti UV svtlu, obzvlt proti UV sloce slunenho zen. Cv.4.5 Poteby : Proveden : 1. Do ztekucen agarov pdy, ochlazen na 45oC, pidej 1 ml kultury E. coli a rozlej do Petriho misek. Strana76 Vliv ultrafialovho svtla na mikroorganismy UV lampa, 3 steriln Petriho misky, ivn pda .XY, steriln alobalov

masky, tekut kultura Escherichia coli.

2. Piprav UV lampu tak, abys mohl ozaovat Petriho misky ze vzdlenosti 30 cm a nech ji 5 minut nahavit. 3. Na povrch agarov pdy polo steriln pinzetou steriln alobalovou masku a oza prvn misku 1 minutu, druhou misku 3 minuty a tet misku 10 minut. 4. Inkubuj pi 37oC a za 24 h odeti nrst na jednotlivch miskch. Na ploe agarovch desek chrnnch alobalovmi maskami bakterie narostou, na ozench plochch dochz k sten nebo pln inhibici rstu bakteri. Zapi vsledek do tabulky : doba ozen intensita rstu a sestroj graf. 4.5 Bakteriostatick psoben nkterch barviv Nkter organick barviva maj bakteriostatick inek na grampozitivn bakterie i v koncentracch, kdy gramnegativn bakterie jet rostou. Tohoto jevu se vyuv pro ppravu selektivnch pd uvanch, nap. pi stanoven koliformnch bakteri. Obvykle se pidv krystalov nebo gencianov viole, malachitov zele, methylenov mod, trypaflavin aj. Cv.4.6 Poteby : Bakteriostatick psoben roztoku krystalov violeti 1% vodn roztok krystalov violeti (nezamovat s roztokem oznaenm

Gram I), bujonov kultury Bacillus subtilis, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli a Micrococcus luteus, 4 steriln zkumavky, steriln destilovan voda, steriln pipeta 10 ml, 4 steriln pipety 1 ml, 4 steriln Petriho misky, 4 zkumavky s 18 ml MPA (pda .XY). Proveden : 1. Nae roztok krystalov violeti postupn asepticky 10, 100, a 1000. 2. Rozehej 4 zkumavky s MPA ve vodn lzni. Do prv pidej 1 ml neednho barviva, do druh zkumavky 1 ml 10 ednho, do tet zkumavky 1 ml barviva 100 ednho a do posledn pidej 1 ml barviva 1000 naednho. Rozmchej a vylej do 4 sterilnch Petriho misek. 3. Po ztuhnut rozdl fixem dno misek na tvrtiny, a na kadou z nich naokuj rkovnm vechny 4 shora uveden kmeny bakteri. 4. Dej inkubovat pi 37oC na 24 hodin. Odeti rst bakteri a vsledky zapi do tabulky, srovnej rst gramnegativnch bakteri s rstem bakteri grampozitivnch. 4.6 Citlivost mikroorganism k antimikrobilnm ltkm Strana77

V souasnosti je znm cel ada chemickch ltek, jak anorganickho, tak organickho pvodu, kter psob toxicky na mikroorganismy. Jsou oznaovny jako antimikrobiln ltky a mohou se vyuvat jako desinfekn prostedky, lky (nap. antibiotika, sulfonamidy) nebo potravinsk konzervan prostedky. Podle jejich inku na mikroorganismy je dlme na mikrobistatick, kter pouze zastavuj rst a rozmnoovn a na ltky mikrobicidn, kter psob na buky letln. inek antimikrobilnch ltek zvis na jejich koncentraci. Velmi nzk koncentrace naopak stimuluj ivotn pochody v buce. inn koncentrace jednotlivch ltek s antimikrobilnm inkem zvis na druhu pouit ltky i na mikroorganismu, na kter ltky psob. Cv.4.7 Poteby : Stanoven innosti konzervanch prostedk difuzn metodou 2 steriln Petriho misky, steriln korkovrt o prmru 8 mm, 2 baky po 100

ml sladinovho agaru, steriln voda, steriln sklenn perly, dobe osporovan kultura plsn na ikmm agaru, steriln Erlenmayerovy baky, steriln pipety (1 ml), konzervan prostedky. Proveden : 1. Piprav steriln roztoky konzervanch inidel ve steriln destilovan vod v tchto koncentracch : Benzoan sodn: 0,5; 1,0; 1,5; 10,0 %. Kyselina mraven: 4,0; 6,0; 8,0; 10,0 %. Kyselina sorbov: 0,25; 0,50; 0,75; 1,00 %. 2. Spory plsn smyj pdavkem 35 ml steriln vody do steriln baky s perlami, protepej a pomoc Thomovy nebo Brkerovy komrky zjisti poet spor v 1 ml suspenze a nae tak, aby vsledn koncentrace spor v 1 ml suspenze byla 105. 3. Piprav 3 misky se sladinovm agarem, po jeho ztuhnut a vysuen napipetuj na kadou misku 0,2 ml suspenze spor, rozeti rovnomrn po celm agaru a nech zaschnout. Potom vyzni sterilnm korkovrtem v kad misce 5 otvor a dbej, aby byly dostaten vzdleny od kraje misky a od sebe navzjem. Otvory na dn misky osluj. 4. Do kad jamky napipetuj asepticky postupn 0,2 ml ednch konzervanch inidel. Do pt jamky napipetuj pro kontrolu 0,2 ml steriln destilovan vody, pouit k edn konzervanch inidel. 5. Inkubuj pi 28oC 4872 hodin a sleduj nrst plsn. Strana78

6.

Zm ku mezikru vzniklch inhibinch zn a zapi vsledky do tabulky. Fenolov koeficient mikrobicidnch ltek innost mikrobicidnch prostedk lze vyjdit tzv. fenolovm koeficientem,

4.6.1

kter udv, kolikrt je testovan ltka innj ne fenol. Metoda je pouiteln pro vechny ve vod rozpustn nebo s vodou msiteln ltky. Fenolov koeficient je podl nejvyho zedn zkouen ltky a nejvyho edn fenolu, kter usmrt testovan mikroorganismus. Obvykle se vol doba psoben ltky 10 minut a teplota 20 oC. Jako testovac mikroorganismy se vtinou pouvaj Staphylococcus aureus, Salmonella typhi a tak nkter sporotvorn bakterie. Fenolov koeficient stanovujeme bu podle pvodn metody Rideal-Walkerovy, kde se mikroorganismy okuj ze zednch desinfeknch prostedk do ivnho media, nebo metodou podle Patoky, kter pouv nosie testovacch mikroorganism, nap. sklenn perly, kter brn penosu malch mnostv desinfeknch prostedk do ivnho media. Cv.4.8 Poteby : Stanoven fenolovho koeficientu mikrobicidnch ltek suspenzn Rideal -Walkerovou metodou 24 h star bujonov kultura Staphylococcus aureus, 0,5 % roztok fenolu, 0,5 % roztok Septonexu, 14 sterilnch zkumavek, 14 zkumavek s MPB (pda .XY), steriln destilovan voda, dlen pipety 1 ml a 20 ml.

Proveden : 1. Napipetuj do 6 zkumavek postupn 4, 5, 6, 7, 8 a 9 ml steriln destilovan vody. Do kad zkumavky pidej 1 ml roztoku fenolu a dobe promchej. Takto byl roztok zedn 5, 6, 7, 8, 9 a 10. 2. Zkumavky ozna a z kad odpipetuj tolik, aby v n zstalo jen 5 ml. Postupuj od zkumavky edn 10 ke zkumavce edn 5, abys mohl pout jedin pipety. Do 7. zkumavky napipetuj 5 ml steriln destilovan vody a ozna ji jako kontrolu. 3. Roztok Septonexu ze nejprve 50 steriln destilovanou vodou. Do 6 zkumavek napipetuj postupn 5,0 ml; 3,35 ml; 2,5 ml; 2,0 ml; 1,0 ml a 0,5 ml. Dopl steriln

Strana79

destilovanou vodou do 5 ml. Tak byl roztok zedn postupn 50, 75, 100, 250 a 500. 4. Zkumavky s fenolem, Septonexem a kontroln vytemperuj na 20 oC; v intervalu 30s pidvej do kad zkumavky po 0,5 ml bujonov kultury Staphylococus aureus. Kadou zkumavku protepej a inkubuj 10 min, a pak z n vyokuj jedno oko klikou do zkumavky s MPB stejn oznaen. 5. Naokovan zkumavky s MPB dej inkubovat pi 37oC na 24 hodin nebo vce. 6. Odeti a ozna zkumavky, ve kterch bakterie vyrostly (jsou zakalen), a zjisti nejvy zedn Septonexu a fenolu, kter zabrnilo vzrstu kultury bakteri. Jejich podl se rovn fenolovmu koeficientu pro Septonex. Cv.4.9 Poteby : Stanoven fenolovho koeficientu mikrobicidnch ltek metodou se sklennmi perlami Bujonov kultura Staphylococcus aureus, 14 sterilnch Petriho misek, 13 s MPB zkumavek (pda .XY), steriln destilovan voda, pinzeta, sklenn perly matov 7 mm, pipety dlen, 0,5 % roztok fenolu a 0,5 % roztok Septonexu, steriln filtran papr. Proveden : 1. Sklenn perly vysteriluj v horkovzdunm steriliztoru. Ve zkumavce pevrstvi perly bujonovou kulturou Staphylococcus aureus. Ulo do tmy pi teplot 20 oC na 2 hodiny. 2. Vysu perly na sterilnm filtranm papru v exsiktoru. Takto pipraven perly ulo do steriln Petriho misky, kde vydr nkolik dn. 3. Do 6 Petriho misek piprav roztoky fenolu ve steriln destilovan vod (vdy 30 ml na misku) edn postupn 5, 6, 7, 8, 9 a 10. Podobn piprav roztoky Septonexu edn 50, 75, 100, 125, 250 a 1000. Do 13. Petriho misky dej 30 ml steriln destilovan vody, kter bude jako kontrola. Nvod k edn viz bod 1 a 2 minul lohy. 4. Steriln pinzetou penes po 3 perlch do kad Petriho misky, kde je ponechej 4 minuty. Pak penes pinzetou perly do steriln destilovan vody pipraven v dal Petriho misce, oplchni a vho vdy 3 perly do 1 zkumavky s MPB. Toto prove postupn se vemi koncentracemi fenolu a Septonexu a s kontrolou tak, abys

Strana80

dodrel pesn interval inkubace 4 minuty. Steriln destilovanou vodu na oplachovn vymuj pro kad edn. 5. Zkumavky inkubuj 24 hodin pi 37 oC. 6. Dal postup je stejn jako u pedchoz metody. 4.6.2 Citlivost mikroorganism k antibiotikm V roce 1928 Alexander Fleming objevil antibiotick psoben plsn Penicillium na stafylokoky. Pozdji definovan inn ltka penicilin inhiboval rst grampozitivnch bakteri. Dal antibiotikum streptomycin, kter bylo inn i proti gramnegativnm bakterim objevil v roce 1940 Selman A. Waksman ve filtrtu kultury aktinomycet. Od t doby bylo isolovno a charakterisovno nkolik tisc antibiotik produkovanch bakteriemi, plsnmi a vymi houbami. Pouze mal st z nich se vak vyrb prmyslov (asi 100 druh) a pouv se v humnn i veterinrn medicin. Antibiotika se vzjemn li svou chemickou strukturou, spektrem innosti a mechanismem inku na mikroorganismy. Antibiotika se ad mezi tzv. chemotherapeutick prostedky. Korektn pouit tchto ltek pedpokld isolaci pathogenu (bakterie vyvolvajc onemocnn) a otestovn jeho citlivosti na vhodn antibiotika. Diskov difusn metoda je standardnm postupem. Na povrch Petriho misky s vhodnou ivnou pdou se rovnomrn naokuje testovan mikroorganismus. Paprov disky naputn znmmi koncentracemi rznch antibiotik se pilo na povrch agaru.. Bhem nsledn inkubace antibiotika difunduj z papru do agaru a jejich koncentrace ve smru os okraje disku postupn slbne. inn antibiotikum vytvo kolem disku przranou znu bez nrstu bunk. Koncentrace antibiotika na okraji zny pedstavuje minimln inhibin koncentraci (MIC). Pro vyhodnocen se udv prmr zny v mm. Jeliko rychlost difuse hodn zvis na typu pdy uv se v klinick mikrobiologii Mller-Hintonv agar, kter umouje dobrou difusi a srovnn vsledk mezi jednotlivmi laboratoemi.

Cv.4.10

Zjitn citlivosti mikroorganism k antibiotikm Strana81

Poteby :

2 steriln Petriho misky, Mller-Hintonv agar (pda .Xy), bujonov

kultury testovanch mikroorganism (nejlpe vyrostl pes noc), testovac disky s antibiotiky, steriln sklenn zahnut tyinka (hokejka). Proveden : 1. Na povrch Mller-Hintonova agaru v Petriho miskch, zbavenho nadbyten vlhkosti (60 oC, 1015 minut), pipetuj 0,10,2 bujonov kultury testovanho mikroorganismu, rozeti sklennou hokejkou a nech zaschnout. 2. 3. Steriln pinzetou pilo na povrch pdy standardn testovac disky s antibiotiky (zpravidla 6 disk na 1 misku). Inkubuj 2436 h pi 37oC a sleduj tvorbu zn kolem disk. Prom jejich velikost a zapi do tabulky. Poznmky : 1. 2. Velikost zny 5-10 mm odpovd citlivmu mikroorganismu. Velikost zny 12 a vce mm velmi citlivmu mikroorganismu. Do pdy je mono pidat 1 ml 0,5% vodnho roztoku TTC (trifenyl tetrazolium chlorid) pro zvraznn inhibin zny; rst se projev ervenm zabarvenm (redukovan forma TTC). Kontroln otzky ke kap. 4 - SLEDOVN VLIVU VNJCH PODMNEK NA
MIKROORGANISMY

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13.

Co je minimln, optimln a maximln teplota pro rst mikroorganism ? Definujte smrtc teplotu. Pro stanovujeme letalitn kivku ? Jak je optimln pH pro rst kvasinek, bakteri a plsn ? Jak ovlivuje zmna pH odolnost mikroorganism vi teplot ? Definujte plasmolysu a plasmoptyzu. Co jsou halofiln bakterie a osmotolerantn kvasinky ? Jak je nejinnj vlnov dlka UV svtla ? Pro musme pi ozaovn UV svtlem odstranit vko sklenn Petriho misky ? Kter bakterie jsou citlivj vi barvivm ? G+ nebo G- bakterie ? M rozdl v citlivosti bakteri vi barvivm njak praktick vznam ? Jmenujte alespo 5 antibiotik, jejich mikrobilnho producenta, chemick sloen a spektrum innosti. Co vyjaduje fenolov koeficient ?

Strana82

Tabulka YX Velikosti inhibinch zn pro rzn antibiotika Oznaen antibiotikum disku AM vce ampicilinapro testy mnostv 10 g prmr inhibin zny (mm) rezistentn citliv 13 a mn 17 a

G- bakteri a enterokok AM ampicilina pro testy stafylokok a mikrob citlivch 10 g vce na penicilin G B vce bacitracin 10 j 100 g

28 a mn

29

8 a mn 19 a mn

13 23

a a

CB carbenicilin pro testy vce Proteus a Escherichi coli CB carbenicilin pro testy vce Pseudomonas aeruginosa C vce E vce K vce ME vce P vce P vce PB vce S vce chloramfenikol erythromycin kanamycin methicilinb penicilin G pro testy stafylokokc penicilin G pro testy ostatnch bakteri polymyxin Be streptomycin

100 g

13 a mn

17

30 g 15 g 30 g 5 g 10 j 10 j 300 j 10 g

12 a mn 13 a mn 13 a mn 9 a mn 20 a mn 11 a mn 8 a mn 11 a mn

18 18 18 14 21 22 12 15

a a a a a a a a

Strana83

ST vce T vce SXT vce

a

sulfonamidy tetracyklin trimethyloprim-sulfomethoxazol

300 g 30 g 23 g

12 a mn 14 a mn 10 a mn

17 19 16

a a a

disk s ampicilinem se uv pro testovn citlivosti jak na ampicilin, tak na betacilin disk s methicilinem se uv pro testovn penicilinasa resistentnch penicilin c disk s penicilinem G se uv pro testovn penicilinasa citlivch penicilin, vyjma ampicilinu a carbenicilinu e polymyxin B a colistinmaj slabou difuzi do agaru, pesnost uren je men ne u ostatnch antibiotik
b

5.

IZOLACE MIKROORGANISM Izolac rozumme zskvn ist kultury uritho mikroorganismu z mikrobiln

smsi. Pouvme j: 1. k zskn istch kultur z prodnho materilu, 2. k istn infikovanch kultur, 3. k zskn bunk vhodnch vlastnost z dan kultury uritho mikroorganismu Princip izolace spov v dostatenm zedn mikrobiln smsi ve vhodn pd takovm zpsobem, aby kolonie, kter vzniknou rozmnoovnm, vyrostly z jedn buky. Pi metodch makroskopicky kontrolovatelnch sledujeme vyvjejc se kolonie na Petriho mikch pouhm okem a jejich istotu zjiujeme mikroskopicky a po jejich dostatenm nrstu. Metody mikroskopicky kontrolovateln dovoluj sledovn celho izolanho postupu pomoc mikroskopu a sktaj zruku, e narostl kolonie vznikla skuten z jedn buky. Podle elu prce volme i metody. Pi zskvn novch kultur nejdve dan mikroorganismus pomnome za souasnho potlaen ostatn mikroflory vhodn volenmi podmnkami (tzv. nahromaovac kultury) a rovn bhem izolace se sname o optimln rozvoj danho mikroorganismu za minimlnho rozvoje provzejc mikroflory (pomoc selektivn pdy, pH, teploty apod.). Pro vlastn izolaci pouvme vtinou metody makroskopicky kontrolovateln. Tak pi itn infikovanch kultur pouvme nejdve fyzikln a chemick metody, je doplujeme izolac makroskopicky kontrolovatelnou. Pi selekci vodnch kmen, kdy jde o Strana84

zskvn bunk uritch vlastnost z kultury, je je sice druhov jednotn, ale fyziologicky nen homogenn, pouvme nkdy metody mikroskopicky kontrolovateln, doplnn sledovnm danch fyziologickch vlastnost. Velmi asto se vak pouvaj i zde metody makroskopicky kontrolovateln, u nich jsou kultivan podmnky voleny tak, aby hledan fyziologick rozdly byly pokud mono snadno rozliiteln (viz kap. ). ada izolanch metod je pouvna v genetickch pracch pro zjiovn rznch typ mutant (viz kap. ). Mikroskopicky kontrolovateln metody se pouvaj pi tetrdov analze a pi izolaci zygot. 5.1 Nahromaovac kultury Pi zskvn uritho mikrobilnho druhu z jeho prodnho zdroje nebo pi peiovn siln kontaminovanch kultur musme bhem kultivace zvhodnit dan mikroorganismus a vechny ostatn mikroorganismy, kter jsou zpravidla v silnm nadbytku, co nejvce potlait nebo dokonce usmrtit. Teprve po tto nahromaovac kultivaci meme s spchem pout nkterou z izolanch metod (viz kap. ), kterou meme kombinovat jet s pouitm indiktor uritch fyziologickch vlastnost (nap. zjiovn tvorby kyselin dle barvy, pH, indiktoru v ivn pd, tmavnut koloni v dsledku reakce vznikajcho H2S s ptomnm Fe2+, vznik hemolysy na krevnm agaru, tpen lipid nebo blkovin, projevujc se zonami kolem koloni vyrostlch na pslunch pdch apod. spnost nahromaovacch kultivac je podmnna znalost fyziologickch vlastnost nejen danho mikrobilnho druhu, ala i vtiny doprovzejcch mikroorganism. Nejvhodnjm zdrojem mikroorganism pi zskvn novch kultur je zemdlsk nebo lesn pda, bahno a rybnin voda, co jsou prodn rezervory nejen aktinimycet, ale i vtiny ostatnch bakteri, kvasinek a plsn. U kvasinek jsou velmi vhodnm zdrojem jet kvtn nektary a trvic trakt opylujcho hmyzu a dle pezrl plody peckovho a bobulovho ovoce, u plsn jet vzduch rznch lokalit, plesniv potraviny a potravinsk suroviny (nap. chlb, ovoce, koenov zelenina). Speciln zdroje meme pout tak pro nkter men skupiny bakteri (nap. nepasterovan mlko pro zskn Streptoccocus lactis, ementlsk sr pro zskvn propionovch bakteri, erstv feklie pro zskn koliformnch bakteri (tj. Escherichia coli a Enterobacker aerogenes) a enterokok (tj. hlavn Streptococcus faecalis),zkysan vno Strana85

pro zskn octovch bakteri, kysan zel pro zskn nkterch mlnch bakteri apod.). Vhoda specilnch zdroj spov v tom, e dan mikroorganismus zde pevld a prvodn mikroflora je omezena jen na nkolik druh, kdeto v obdlan pd je ptomna velmi irok paleta druh a dan mikroorganismus se nemus vdy zskat. Po nahromaovac kultue mus vdy nsledovat izolan metoda, nejastji rkovnm na utuhl agar (viz kap. ). Jestlie tuto izolaci provdme na selektivnm agaru, potlaujcm rozvoj doprovodnch organism, musme zskanou jet znova peistit na neselektivnm agaru, abychom se pesvdili, e neobsahuje jednotliv buky doprovodn mikroflory, je by se pi pstovn za neselektivnch podmnek mohly pehldnout. Pslunost zskan ist kultury k danmu druhu zjistme na zklad morfologickch a biochemickch identifikanch tabulek nebo kl (viz kap. ). Jako pklad uvdme nahromadn a zskn tchto nejdleitjch skupin mikroorganism : 1. Pslunky rodu Bacillus zskme tm, e vzorek kultivujeme 3 dny v MPB (pda . ) ve zkumavce pi 30C a pak vyhvme kulturu 3 min na vrouc vodn lzni, m u-smrtme vegetativn formy vech ptomnch bakteri i vechny zrodky kvasinek a plsn. Z tto povaen kultury izolujeme jednotliv druhy rodu Bacillus na MPA(pda . ). 2. Pslunky rodu Clostridium zskme tm, e vzorek (nap. obdlan pdy, rozemlet neoitn brambor apod.) kultivujeme ve zkumavce s MPB (pda . ) s pdavkem 5% glukosy za anaerobnch podmnek (nap. vyvaenm O2 a pelitm sterilnm parafnovm olejem) 3 dny pi 30C a pak pokraujeme obdobn jako u rodu Bacillus, ale s tm rozdlem, e kultivujeme anaerobn (viz kap. ) na pd obsahujc sacharidy, nap. bramborov agar (tj. pda . ) nebo na agarov pd s 1% peptonu a 5% glukosy. 3. Mln bakterie z rodu Lactobacillus,Streptococcus,Pediococcus a Leuconostoc pomnoujeme na bohat tekut sacharidov pd (pda . ) s pdavkem 0,02% azidu sodnho (pidv se a po sterilaci pdy!), kter potla rozvoj vech aerobnch a fakultativn anaerobnch mikroorganism. Msto pdy . meme pout tak roztok obsahujc 1,5% peptonu, 0,45% masovho vtaku, 0,75% glukosy, 0,75% NaCl a 0,02% azidu sodnho. Po inkubaci nahromaovac kultury pi optimln teplot pro dan druh izolujeme mln bakterie metodou Strana86

lit desek (kap.

) na agarov pd .

s p-davkem 2% sterilnho CaCO3,

rozmchanho do pdy. Po utuhnut desku pelijeme jet asi 1 mm silnou vrstvikou tto pdy, abychom zajistili mikroaerofiln podmnky. Pro mln bakterie jsou charakteristick jasn zny kolem koloni v dsledku pemny CaCO3 v rozpustn laktt vpenat, dle neptomnost katalzy, grampozitivn reakce, neptomnost spor. Vhodnm zdrojem nkterch mlnch bakteri jsou vedle mlnch vrobk tak sladov klky, str z stn dutiny, stdka ze stedn sti vtho bochnku chleba, rzn traviny apod. Steptoctococcus faecalis meme zskat rkovnm suspenze fekli na pdu obsahujc 1% enzymov natrvenho kaseinu, 0,5% suchho kvasninho autolyztu, 0,5% KH2PO4, 1% glukosy, 0,02% azidu sodnho a 1,5% agaru a inkubac pi 37C. 4. Bn gramnegativn bakterie pomnoujeme v MPB (pda . ) s pdavkem nkterch barviv (nap. 0,02% krystalov violeti) nebo aniontovch povchov aktivnch ltek (na p. 0,01% dodecyl sulftu sodnho nebo 0,15% luovch sol), je potlauj rozvoj grampozitivnch bakteri. Pak nsleduje izolace rkovnm (viz. kap. ) na MPA (pda . ). Pro zskn Escherichia coli nebo Enterobacter aerogenes rkujeme izolan metodou pmo ze suspenze erstvch fekli na selektivn diagnostick agar, nap. Levinv (pda . ) nebo Endv (pda . ). Po 48 h inkubace pi 37C E.coli tvo tmav ploch kolonie, asto s kovovm leskem, kdeto E. aerogenes tvo vt vypoukl kolonie s tmavm, ppadn ervenm stedem a irokm blm okrajem. Pslunky rodu Pseudomonas zskme z povrchu zkaenho masa uchovvanho v chladnice, z ryb, z kaench vajek apod. Vzorek masa nebo vajec m bt tepn ve fosftovm pufru o pH 7,0 s pdavkem 0,02% krystalov violeti 24 h pi 20C. Odtud rkujeme izolan metodou na agar s MgCl2 a K2SO4 (zkladn pda . ) nebo tyto soli podporuj tvorbu fluoreskujcho barviva u pslunk rodu Pseudomonas.Selektivity doshneme pdavkem (na 1000ml pdy): 44,9 mg (tj. 75 000 jednotek) penicilinu G k potlaen G+ bakteri, 45 mg novobiocinu k potlaen G- bakteri a 75 mg cykloheximidu k potlaen kvasinek a plsn. Tato antibiotika se rozpust ve 3 ml ethanolu a naed se 50 ml steriln vody a pidaj se ke steriln pd. Selektivity pro rod Pseudomonas nebo dokonce pro druh Ps. aeruginosa lze doshnout tak kombinacemi antibiotik uvedenmi u pdy . . Charakteristickmi znaky rodu Pseudomonas jsou : pohyblivost pomoc polrnho

Strana87

biku, nezkvaovn cukr, ptomnost lipas, proteinas, cytochromidas (viz kap. ). 5. Bakteriln kontaminaci z pekaskho nebo krmnho drod nebo z plsovch fermentac (nap. pi vrob penicilinu, citronov, fumarov nebo itakonov kyseliny) i z jinho materilu, kde pevldaj plsn, izolujeme tak, e rozvoj kvasinek a plsn potlame pdavkem cykloheximidu v mnostv 1 mg/ml ivn pdy. Cyhloheximid je termostabiln, take se me pidvat do ivn pdy ped jej sterilac. 6. Kvasinky a plsn meme izolovat od bakteri na SA (pda ) okyselenm po sterilaci na pH 4,04,2, nebo rst vtiny bakteri je pi tomto pH inhibovn. V ptomnosti acidotolerantnch bakteri, nebo nesn-li dan druh kvasinek nebo plsn tak kysel prosted, inhibujeme rozvoj bakteri sms antibiotik (nap. 100 g chloramfenikolu, 30 g streptomycinu a 100g tetracyklinu/ml mrn okyselenho ivnho agaru). Vhodnou pdou pro izolaci plsn je tak kompletn agar (pda . ) s pdavkem uvedench antibiotik nebo Sabouraudv agar ( pda . ). Nejbohatm zdrojem kvasinek a plsn je obdlan pda, avak plsn meme zskat tak ze vzduchu (sta exponovat na rznch mstech 1020 min oteven Petriho misky se SA nebo KM, a z plesnivjcho materilu (ovoce,chlb), kvasinky pak z vinnch hrozn, z povrchu zralho peckovho ovoce, z kvtnch nektar, z pdy vinic, teovch nebo vestkovch sad apod. 7. Pomalu rostouc plsn meme od rychle rostoucch izolovat na chudch ivnch pdch (nap. jen 2%n agar ve vodovodn vod nebo 2% n sladina ztuen 2% agaru) nebo rst sten potlame pdavkem 0,01% benglsk erven. Jednotliv velmi nzk kolonie pak peokujeme na sladinov nebo kompletn agar (pdy a ).

5.2

Zkladn izolan techniky Zkladn izolan techniky rozdlujeme podle zpsobu kontroly :

5.2.1

Makroskopicky kontrolovateln metody Strana88

Tyto metody dlme takto : 1. Izolace litm desek spov v rozmchvn mikrobiln smsi do roztaven ivn pdy a v postupnm zeovn do dalch pd, z nich lijeme desky. Pouvme ji vtinou pro kvasinky (pouit pda je sladinov elatina) a pro bakterie (masopeptonov agar). Obsahuje-li smsn kultura vedle kvasinek jet bakterie, hustou suspenzi kvasinek peneseme do Raulinova roztoku (roztok . ) a nechme stt 24 h pi laboratorn teplot, m dojde k usmrcen vtiny bakteri. Vhodnj vak je pidat do elatinov pdy sms antibiotik, je potlauje rozvoj prakticky vech bakteri.(viz kap. ). Cv.5.1 Poteby : Izolace kvasinek litm desek 3 zkumavky se sladinovou elatinou (pda . ), 3 steriln Petriho misky, ), smsn

steriln zkumavky, steriln voda, teplomr, ikm sladinov agary(pda . kultura kvasinek. Proveden :

1. Okovac jehlou penes oko ze vzorku (je-li sms v kapaln pd, rozmchej nejdve pdu mrnm krouenm) do zkumavky se steriln vodou. Promchej dkladn potepem i rotac mezi dlanmi. Penes okem kapku z takto vznikl suspenze do prvn zkumavky a rozehtou pdou, vytemperovanou na 30C, a opt dkladn promchej. Pak penes jedno oko z tto suspenze do dal zkumavky s pdou (II), promchej a penes dal oko z poslednho zedn (II) do tet zkumavky s pdou a opt dkladn promchej. 2. Zaokovanou pdu ze zkumavek rozlij asepticky do Petriho misek (nezapome na oehnut okraje zkumavky ped rozlitm!), roztrej rotanm i pmoarm pohybem stejnomrn po cel misce a nech ztuhnout ve vodorovn poloze. 3. Fixem ozna misky I, II, III a datem a inkubuj pi laboratornch teplot, a vyrostou dosti velk, dobe izolovan kolonie. 4. Zjisti makroskopicky (ppadn lupou) ptomnost dvou typ koloni. Z jedn dobe izolovan kolonie kadho typu piprav nativn mikroskopick preparty a zjisti, zda kad obsahuje jen buky jednoho druhu. V kladnm ppad odpchni zbytek ist kolonie a penes na pdu . . Inkubuj pi 28C. V zpornm ppad prove zkouku s jinmi koloniemi. Nenajde-li dnou istou kolonii, prove izolaci znovu. Strana89

5. Po 24 48 h inkubaci zkontroluj mikroskopicky (tj. v nativnm prepartu) istotu obou kultur na ikmch agarech. Poznmka : Stejn postup meme pout i pi izolaci bakteri. Jako ivn pda slou MPA(pda . ) vytemperovan na 45C, kultivaci provdme 1-2 dny pi 30-37C a pro mikroskopickou kontrolu jednotlivch koloni pipravujeme fixovan prepart barven podle Grama (viz kap. . ), kter pozorujeme zvtenm 10100(s imerznm olejem). 2. Izolace roztrem je modifikac pedchoz metody. Spov ve eovn suspenze bunk ve steriln vod nebo fyziologickm roztoku, pipetovn 0,1 ml zedn suspenze na utuhlou pedsuenou agarovou pdu a roztrn pomoc zahnut sklenn tyinky po celm povrchu desky a do plnho vsknut. Pouv se hlavn pro kvasinky a plsn, nebo ji meme kombinovat s pmm potnm bunk Thomovou komrkou (viz kap ) a naednm tak, aby na desce vyrostlo 10 200 koloni. Cv.5.2 Izolace roztrem )

Poteby : Smsn suspenze kvasinek, 3 desky pedsuenho SA(pda .

v Petriho miskch, 5 sterilnch zkumavek, steriln voda(cca100ml), Thomova nebo Brkerova komrka, podlon a kryc skla, sklenn tyinka, ethanol, steriln pipeta 10 ml, steriln pipety 1ml, dva ikm SA. Proveden : 1. Pedsu desky SA pi 60o-70C , a se na jejich povrchu vytvo vyven hrany. 2. Pomoc Thomovy nebo Brkerovy potac komrky zjisti koncentraci bunk v suspenzi (viz kap. ) 3. Piprav si pln postupnho destkovho a stovkovho zeovn tto suspenze do 10 ml steriln vody (tj. 1 ml + 9 ml H2O, 0,1 ml + 9,9 ml H2O apod.) tak, aby v poslednch tech zkumavkch byly koncentrace bunk (12 )104/ml, (1 2)103/ml a 100200/ml (viz obr. . ). Podle tohoto plnu si piprav zkumavky a pslunmi objemy steriln vody. 4. Ze suspenzi asepticky podle zeovacho plnu tak, e pro kad zedn pouije novou steriln pipetu. Pipetu pouvanou pro ppravu zedn D (obr. ), avak pouij souasn pro vyokovn suspenze C na misku I (obr. . ) atd. Pouit pipety

Strana90

ihned odkldej do vlce s dezinfeknm roztokem. Pi kadm zeovn a tsn ped pipetovnm suspenzi dkladn promchej. 5. Suspenze na agarovch deskch I, II, III ihned dkladn rozeti (do sucha) pmoarm a krouivm pohybem steriln sklenn tyinky, zahnut do tvaru hokejky. Pi roztrn otej misku levou rukou proti smru hodinovch ruiek, m doshne rozeten suspenze po celm povrchu desky. Vko misky pidruj naklonn nad miskou pomoc lev ruky tak, aby se nedotkalo sklenn tyinky pouvan pi roztrn. 6. Inkubuj pevrcen desky (zaven agar) pi 28C 2-3 dny. Zjisti poet vyrostlch koloni a srovnej s vsledkem pmho potn bunk. Pak zjisti makroskopicky ptomnost dvou typ koloni. Z dobe izolovanch koloni kadho typu piprav nativn prepart a mikroskopovnm zjisti, zda kad kolonie obsahuje pouze jeden typ bunk. V kladnm ppad peokuj zbytek te kolonie na ikm SA a inkubuj jej 2 dny pi 28C. Tot prove s druhm typem koloni. ikm agary ozna ttkem s datem okovn, jmnem a oznaenm kultury. 7. Mikroskopicky, tj. v nativnm prepartu, zkontroluj istotu obou vyizolovanch kultur na ikmch agarech. Poznmka : Sklennou tyinku nejastji sterilujeme ponoenm do ethanolu a pak oehnutm, po nm nsleduje ochlazen na vnitn stran vka sklenn Petriho misky nebo nad povrchem agaru pooteven umlohmotn Petriho misky. 3. Izolace rkovnm na desky zle v postupnm rkovn a tm zeovn mikrobiln smsi pomoc okovac jehly na agarovou desku. Je to nejuniverzlnj metoda, pouiteln pro bakterie, kvasinky, plsn i pro smsi tchto skupin, jestlie pouijeme vhodnou pdu, ppadn uritou skupinu mikroorganism jet potlame vhodnm antibiotikem nebo pH (viz kap. ). Izolace doshneme jen tehdy, jestlie pouijeme velmi mal mnostv dobe rozmchan suspenze bunk (ve steriln vod nebo kapaln ivn pd). U plsn doshneme dobr rozptlen spor vtinou pouze v roztoku neionogenn povrchov aktivn ltky (nap.0,2% roztok Tweenu). Cv.5.3 Izolace rkovnm desky

Strana91

Poteby : Deska MPA (pda . ) v Petriho miskch, Gramovy barvc roztoky (roztoky ), aceton, 2 ikm MPA, sms bakteri v MPB. Proveden : 1. Sterilnm okem naber mal mnostv rozmchan mikrobiln suspenze, odklop ponkud vko Petriho misky a thni mnohonsobn okem po povrchu ztuhl pdy v pruhu irokm asi 2 cm a dlouhm asi 3 cm.Vysterilizuj oko v plameni, ochla na nezaokovanm mst agaru a bez nabrn dal kultury roztrej konec pruhu v hlu asi 120. Tento postup opakuj po celm povrchu misky a ppadn posledn pruh ukoni. (obr. ). 2. Ozna misku datem a slem a inkubuj v pevrcen poloze 24-48 h pi optimln teplot (pro vtinu bakteri 37C). 3. Pouhm okem zjisti ptomnost rznch typ koloni. Z dobe izolovan (tj. osamocen a pravideln) kolonie kadho typu z nejvtho zedn piprav prepart fixovan plamenem a obarven podle Grama (viz. kap. ) a jeho mikroskopovnm pi zvten 10100 (s imerznm olejem! ) zjisti, zda pslun kolonie obsahuje jen jeden druh bakteri. V kladnm ppad peokuj zbytek te kolonie na ikm agar a inkubuj 24 h pi optimln teplot. V negativnm ppad, (tj. po pezkouen vech koloni stejnho typu) opakuj izolaci na novou desku MPA. Stejn postup opakuj u dalch typ koloni. 4. Po inkubaci zkontroluj istotu kultur na ikmch agarech makroskopicky i mikroskopicky (po Gramov barven). Poznmka : Tato metoda je vhodn tak pro izolaci kvasinek a plsn za pouit SA (pda . ), kompletnho agaru (pda . ) a u plsn jet Sabouraudova agaru (pda . ) nebo Czapek-Doxova agaru (pda . ). Kultivan teplota je 22o-30C, doba 2-4 dny. Pro potlaen rstu bakteri zde meme pout tak pdavek antibiotik (viz kap. ). 4. Izolace rozmchnm do vysok vrstvy agaru (metoda Burriho) se pouvala pro anaerobn mikroorganismy. Po vzrstu koloni valeek pdy z kultivan trubiky asepticky vytlame, mechanicky rozdlme a ist kolonie (mikroskopicky zkontrolovan) peneseme do vhodnch pd. Dnes vak izolujeme anaerobn mikroorganismy obvyklmi postupy a kultivujeme desky za anaerobnch podmnek (viz kap. ) Strana92

5.2.2

Mikroskopicky kontrolovateln metody Tyto metody spovaj ve zedn mikrobiln smsi do ivn pdy, kter se

nanese na kryc sklko, upraven do komrky. Pomoc mikroskopu se pak zjist nebo vyizoluj osamocen buky, kter se potom inkubuj do vzniku kolonie. Nejpouvanj metody jsou: 1. Lindnerova kapikov metoda,pouvan v kvasnm prmyslu pro kvasinky.Kvasinky se zeuj do sladiny,je se sterilnm perem pen v podob kapiek na steriln kryc sklko.Pomoc mikroskopu se vybraj ty kapiky,je obsahuj pouze jednu buku. Cv.5.4 Poteby : Lindnerova kapikov metoda Nkolik zkumavek s istou steriln sladinou (pda . ), steriln voda ve

zkumavkch, psac pero s nsadkou, komrka (Bttcherova, Kochova), steriln pipeta (1ml), vazelna, steriln prouky filtranho papru, pinzeta, mlad peditn kultura kvasinek, zkumavky se steriln sladinou, 96%n ethanol, sklenn tyinka. Proveden : 1. Do jedn zkumavky se steriln vodou penes oehnutm okem 2-4 kapky kvasinkov suspenze a dkladn promchej. 3 kapky takto vznikl suspenze penes do zkumavky s istou sladinou a dobe promchej. 2. Piprav zkusmou komrku : Oti sklo na pracovn ploe 96%nm ethanolem a oehni, oehni komrku a polo na ni dno vy steriln Petriho misky, oehnutou tyinkou penes na dno komrky kapku steriln vody a okraje komrky poti vazelnou. Kryc sklko pozi po jedn stran vazelnou a strej prstem a vrstva vazelny je velmi slab. Prothni sklko 3 x plamenem, nech zchladnout blzko plamene a polo pes komrku, mastnou stranou vzhru. Sterilnm psacm perem nanes rychle a lehce 2536 teek zedn suspenze kvasinek do tverce do stedu krycho sklka. Kapiky maj bt maximln jako pendlkov hlaviky. Sklko peklop ihned na komrku (obr. ). 3. Prohldni pod mikroskopem (pozor na proraen sklka objektivem pi zaostovn!). Nejdve pouij zvten 1010, pak 1045. Zorn pole m obshnout celou kapiku. Zaosti na horn okraj a su tubus opatrn dol, a

Strana93

zaost na spodn okraj, kde bvaj nahromadny buky i rzn zrnka. Prohldni ve vech vkch a zjisti, kolik bunk je prmrn v kapice. 4. 5. Ze suspenzi bunk ve sladin jet tolikrt, kolik je bunk v kapice a piprav stejnm zpsobem komrku k izolaci. Prohldni vechny kapiky popsanm zpsobem a zakresli do plnku polohu kapiek s jednou bukou a bez neistot ze sladiny nebo z pera. Je nutno zskat alespo 5 kapiek s jednou bukou, nebo vechny vyizolovan buky za danch podmnek nevypu. 6. Inkubuj pi 20C. Kontroluj mikroskopicky po nkolika hodinch a pak kad pt den. Za 3-4 dny se kapiky zakal rozrostlmi svazky bunk (nenech pestrnout!). 7. Oehnutou pinzetou vyjmi jeden prouek sterilnho filtranho papru z misky, levou rukou nadzdvihni kryc sklko s komrky (ale neobracej kapikami vzhru !), pikou filtranho papru vysaj vyhldnutou kapiku s rozrostlou koloni a vho paprek asepticky do pipraven sladiny. Sklko s kapikami ihned zase pendej na komrku a pitiskni. Zjisti mikroskopicky,zda jsi odpchl sprvnou kapiku a pokrauj stejnm zpsobem s dalmi kapikami a sladinou. 8. Inkubuj vechny sladiny 48 h pi 26C. Pak zjisti mikroskopicky istotu kultury (v nativnm prepartu). Poznmka: Msto sterilnho filtranho paprku mono pro odpchnut vhodn pout platinov preparan jehly, oehnut a ochlazen ve sladinov elatin. Kvasinky ulp na elatin, odkud se rozmchaj do steriln sladiny. 2. Izolace pomoc mikromanipultoru, kter nyn vytlauje Lindnerovu metodu, je nezbytn pi genetick analze kvasinek a jinch askomycet. dk suspenze bunk se nanese na tenkou vrstvu agaru na krycm sklku, kter se peklop na zvltn komrku, a pomoc jehly mikromanipultoru se jednotliv buky penesou na vhodn msto tohoto agaru. Vrstva manipulanho agaru se pak inkubuje na desce ivnho agaru do vzniku koloni. 3. Izolace pomoc monoskopickho izoltoru spov v rozprosten dk suspenze kvasinkovch bunk nebo spor plsn na ivn agar v Petriho misce a objektivem 10 zvtujcm, kter m nasazem izoltor, se najde osamocen buka. Zaostovacm roubem se trubika izoltoru spust a na dno misky, m se vykroj Strana94

vleek agaru se sporou. Tlakem sterilnho vzduchu (pes vatov filtr !) se tento vleek pevede do steriln ivn pdy. Podrobn popis viz Nesek a spol., Preslia 26,105 (1954). Cv.5.5 Izolace bunk nebo spor pomoc mikromanipultoru

Popis : Mikromanipultor je zazen, kter umouje sebrat pomoc kapilrn tyinky nebo trubiky uritou buku nebo sporu a penst ji do vzdlenosti a 30 mm za souasn mikroskopick kontroly. Protoe meme pi mikromanipulovn pout jen objektivy 10 nebo 20 zvtujc, mohou bt pomoc mikromanipultoru izolovny pouze buky nebo spory kvasinek a plsn. Nejastji se pouvaj klouzav mikromanipultory (viz obr. ), i kdy jsou znmy i pneumatick (nap. francouzsk).

Postup pi mikromanipulovn: 1. Piprav si nkolik mikromanipulanch jehel tm, e v plameni mikrokahanu, na jeho konci je nasazena injekn jehla, roztav konce dvou tyinek o takovm prmru, aby mohly bt upevnny v drku jehly mikromanipultoru (7 v obr. ), pak tyinky vysu z plamene a spoj je roztavenmi konci na vteinu v hlu 120o140 a prudkm tahen je od sebe odtrhni. Vznikl sklenn vlas zkra nkami na 1-2 mm u kad tyinky. Tlouka vlasu m bt asi dvoj- a trojnsobek velikosti objektu, kter bude mikromanipulovat, a jeho konec mus bt ve ne horn okraj tyinky pi jejm vodorovnm uloen (viz obr.). 2. Oti ethanolem sklennou desku stolu, oehni ji a piprav na n steriln kryc sklka velikosti 2525 mm a 2550 mm a pikryj je polovinami sterilnch Petriho misek. 3. Na tato sklka napipetuj mikromanipulan agar (pda . 35) tak, aby se vytvoila rovn vrstva tlouky asi 1 mm. Po jejm utuhnut odzni a odstra pomoc sterilnho noe asi dvoumilimetrov okraje tak, aby agarov vrstva byla u, ne je ka mikromanipulan komrky (obr. ). Podl del strany agarov vrstvy nanes zkou ru zedn suspenze bunk nebo ask, je bude mikromanipilovat. Suspenze vak nesm bt pmo na hran agaru, aby nestekla na kryc sklko. Po vsknut suspenze peklop sklko na steriln mikromanipulan komrku (obr. ), jej horn hrany jsou lehce poteny vazelnou, aby k n kryc sklko dobe pilnulo. Agar na krycm sklku je orientovn dol (zaven agar) a nesm se dotkat stn

Strana95

komrky. Komrka se steriluje oplchnutm neednm ethanolem s nsledujcm oplchnutm steriln vodou. 4. Vysterilizuj mikromanipulan jehlu ponoenm do ethanolu, dobe ji ockni a nasa do drku jehly (7 v obr. ). Opatrnm posouvnm pohybliv sti ( 3 v obr. ) pomoc ruky (3a) umsti jehlu do stedu zornho pole mikroskopu (pozoruj zvtenm 1010) a pomoc hrubho svislho posuvu (roub 4 v obr. ) a klouzavho pohybu rukou zaosti na vlasovou piku jehly. Potom opatrn sni jehlu pomoc roubu 4 tak, aby nevadila zasunut komrky. Pi mikromanipulovn ji pohybuj jehlou pouze ve svislm smru a vechny ostatn pohyby provdj pomoc kovho stolku mikroskopu. 5. Zasu komrku do zornho pole mikroskopu a zaosti na nanesenou suspenzi. Pak si najdi prav, lev i horn okraj agarov vrstvy a souadnice jejich polohy, zjitn na kovm stolku, nanes do plnku. Stejnm zpsobem zjisti a zaznamenej i horn okraj ntru suspenze. 6. Zvtenm 1010 vyhledej v nanesen suspenzi vhodn objekt (buku, sporu, natrven askus apod.), kter je osamocen, umsti jej do stedu zornho pole, zaosti zvtenm 10(ok.)20(obj.) a opatrnm zvednm jehly pomoc roub 4 a 5 v obr. se jej jehlou ze strany dotkni a seber jej s agaru jemnm klouzavm pohybem. Pak jehlu stejnm zpsobem sni (asi 1 mm pod agarovou vrstvu) a pomoc kovho stolku nastav msto, kam chce objekt penst. Mus to bt alespo 8 mm od okraje ntru a alespo 2 mm od okraj agaru a od dalch zmikromanipulovanch objekt. Pomoc roub 4 a 5 (obr. ) opatrn zdvihni jehlu tm k povrchu agaru (pozoruj v mikroskopu, aby se jehla nezabodla do agaru!) a lehkm poklepem na roub 5 objekt sho na agar za souasn mikroskopick kontroly. Do plnku zapi nynj souadnice polohy zmikromanipulovanho objektu. Pak jehlu opatrn sni asi 1mm pod agarovou vrstvu a posuvem kovho stolku a opatrnm zaostovnm znovu najdi (pi zvten 1010) nanesenou suspenzi a vyhledej dal vhodn objekt. 7. Po ukonen mikromanipulace opatrn sni jehlu, vysu komrku, odklop kryc sklko s agarem a pomoc sterilnho noe sejmi agarovou vrstvu se sklka a penes ji na ivn agar v Petriho misce, nap. kompletn agar (pda . pomoc preparan jehly k dalmu pomnoen a uchovn. Poznmky : ). Inkubuj 2-3 dny pi optimln teplot. Pak peokuj vyrostl kolonie pomoc sterilnch prtek nebo

Strana96

1. Mikromanipultor mus bt umstn na konzole ve zdi nebo na tkm laboratornm stole, aby nepodlhal zchvvm. 2. Kluzn plochy mikromanipultoru se potraj jemnou vrstvou smsi specilnch vazeln, jejich pomr se vol podle plochy prosted tak, aby pohyb nebyl pli lehk ani pli obtn. Tyto plochy nutno chrnit ped prachem a korozivnm prostedm, aby nedochzelo k drhnut bhem pohybu. 3. Mikromanipulan komrku si me pipravit nalepenm vhodnch skel na bn podlon sklo, pouvan pro ppravu prepart. 4. Kapilrn mikromanipulan jehla nesm bt pli dlouh, aby nevibrovala. 5. Centrovanou mikromanipulan jehlu me ponechat v mikromanipultoru a vysterilizovat ji ped prac pokapnm ethanolem, kter stk do podloen mistiky. Mikromanipulan postup vyaduje nkolikadennho zcviku, ne se doshne bn rychlosti.Pi pomal prci mikromanipulan agar vysych a stv se lepkavm, co ztuje sbrn pomoc jehly. 6. Jestlie vybran objekt nememe sebrat s agaru, meme jej pomoc mikromanipulan jehly posunovat po povrchu agaru. Posun se provd pomoc kovho stolku mikroskopu a mus bt neustle kontrolovn mikroskopem. Kontroln otzky ke kap. 5 - IZOLACE MIKROORGANISM 1. Co rozumme izolac mikroorganism a kdy ji provdme? 2. Kdy pipravujeme pomnoovac kultury a jak je jejich princip? 3. Jak zn prodn zdroje kvasinek,mlnch bakteri,koliformnch bakteri,octovch bakteri,pslunk rodu Pseudomonas,akcynomicet? 4. Jak zsk pslunky rodu Bacillus nebo Clostridium? Jak mono zvhodnit rst kvasinek a plsn proti bakterim,bakteri proti kvasinkm a plsnm? 5. Uve principy nejdleitjch makroskopicky kontrolovanch izolanch metod. Jmenuj alespo tyi znaky,kter pouije pro rozlien koloni pi izolanch metodch. 6. Kter zn mikroskopicky kontrolovan izolan metody?

Strana97

6.

ZJIOVN POTU MIKROBILNCH BUNK V PROSTED

V mikrobiologii jsme asto postaveni ped kol stanovit poet mikrobilnch

bunk v uritm prosted. Tak je tomu nap. pi kontrole biotechnologickch proces, pi hledn optimlnch rstovch podmnek pro urit kmen mikroorganism, pi analytickm stanoven vitamin, aminokyselin nebo stopovch mnostv jinch slouenin pomoc mikroorganism, pi sledovn innosti dezinfeknch nebo konzervanch prostedk nebo pi zjiovn mikroorganism v potravinskch surovinch i v hotovch vrobcch na provoznm zazen, ve vzduchu, ve vod apod. V potravinstv je stanoven potu mikrob velmi dleit, nebo ns informuje o kvalit surovin i hotovch vrobk a o jejich drnosti. Sledovnm potu mikroorganism, ppadn i jejich druh, se meme tak pesvdit o vhodnosti technologickch postup v potravinskm prmyslu, o bezpenosti sterilanch zkrok a konen o sanitanch a hygienickch podmnkch na danm seku vroby nebo distribuce.

Strana98

Zjitn mnostv mikroorganism je rovn nutn pi nkterch biochemickch a genetickch pracech, pro n jsou mikroorganismy velmi asto voleny, nebo maj adu pednost ped ostatnmi organismy. Pro stanoven mnostv mikrobilnch bunk v rznch prostedch byla vypracovna ada metod, take pro kad el je mono zvolit metodu nejlpe vyhovujc. 6.1 PEHLED METOD ZJIOVN POTU MIKROBILNCH BUNK Pro zjiovn potu mikrobilnch bunk v uritm prosted se pouv jednak pm nebo nepm potn bunk, jednak stanoven bunn hmoty ptomnch mikroorganism, jednak metody sledujc intenzitu biochemick innosti ptomnch mikrob. Nejpesnj a nejcitlivj jsou metody zjiujc poet bunk. Pouvaj se pedevm pi rozboru potravin, kontrole kvasnch technologickch proces a pi kontrole hygienickch a sanitanch podmnek potravinskch zvod nebo distribuce potravin. Metody stanovujc hmotu biomasy pouvme pouze v kulturch mikroorganism,a to pedevm pi bilancovn kvasnch proces, pi biochemickch pracech apod. Sledovn innosti ptomnch mikroorganism se pouv pro rychl posouzen mikrobiologick istoty potravin.

6.1.1 1.

Potn bunk Pm mikroskopick potn bunk v rzn upravench prepartech Tyto metody meme pout pouze tam, kde hustota mikroorganism je aspo

106 bunk/ml, u bakteri asto teprve a od 107 bunk/ml (tj. v mikrobilnch kulturch, zkvasech apod.). Pednost tchto metod je pomrn rychl zskvn vsledk, nevhodou je, e u bakteri nelze rozliit iv a mrtv buky. Pm mikroskopick potn se provd : a) V potacch komrkch (Thomov, Brkerov apod., viz kap. 7.2.1.1), kter maj uritou hloubku (0,02 0,1 mm, viz obr.43) a dno rozdleno na tvereky o znm velikosti, take potme buky ve znmm objemu. Pouv se pro kvasinky, bakterie a spory plsn. Jeliko pracujeme s nativnm prepartem, je teba u bakteri

Strana99

pout mikroskopie ve fzovm kontrastu (viz kap.2.4.5.2), aby byly buky dostaten zeteln. b) Ve fixovanm ntru na podlonm sklku (viz kap.7.2.1.2): Znm objem kapaliny (vtinou 0,01 ml) rozprosteme na plochu 1 cm2 a po vysuen, fixaci a barven zjiujeme poet bunk v jednotlivch zornch polch, jeliko velikost zmm (pomoc objektivovho mikrometru). mrou pak vypotme mnostv zrodk v jednotce objemu pvodn suspenze. Pouv se pro susspenze bakteri. 2. Elektronick potn bunk je zaloeno na nasvn pesn definovanho objemu elektrolytu, v nm jsou rozptlen buky, velmi malm otvorem do elektricky nevodiv (sklenn) trubice. Pi prchodu jednotlivch bunk otvorem dochz ke zmn vodivosti, co se pstrojem registruje jako impuls. Pstroje byly pvodn vyvinuty pro potn krvinek, ale velmi dobe se uplatuj i pi potn kvasninch bunk v suspenzi, v ppad, e buky jsou od sebe oddlen (netvo shluky nebo etzky). U nkterch pstroj (nap. Celloscopu) je mono zjistit i etnost rznch velikostnch skupin bunk zapojenm diskrimintoru, take potme buky pesahujc uritou velikostn mez. 3. Nefelometrick stanoven potu mikroorganism spov ve zjitn potu bunk v ir kapalin na zklad intenzity svtla odraenho od jednotlivch bunk (viz obr ). Metoda je velmi rychl a citliv. Umouje zjitn potu bunk ponaje koncentrac 105 bakteri/ml do koncentrace 107 bakteri/ml. Nejvhodnj je pro krtk tyinky nebo koky, pi delch tyinkch nebo etzcch me dojt k ne-pravidelnostem. Touto metodou zjiujeme celkov poet bunk na zklad kalibran kivky zhotoven pomoc pmho mikroskopickho potn bunk. 4. Kultivan stanoven potu mikrob spov na principu penen mikroorganism na vhodnou pdu, kde jsou schopny rozmnoovn. Zjiuje se tedy poet ivch bunk, nebo kriteriem ivotnosti mikrobiln buky je schopnost autoreprodukce, tedy schopnost syntzy bunnho materilu a schopnost bunnho dlen. Tchto metod lze pout pro prakticky libovoln hustou suspenzi mikroorganism a ve smsch je asto mono rozliit jednotliv skupiny nebo rody. Nevhodou je del doba potebn k zskn vsledk Strana100

(minimln 24 hod.) a u sms rznch mikroorganism fakt, e dostvme vtinou ponkud ni vsledky, ne odpovd skutenosti, nebo nememe zaruit vhodn kultivan podmnky vem ptomnm mikroorganismm. Ke kultivanm metodm pat : a) Stanoven nejpravdpodobnjho potu mikroorganism (MPN z angl. most propable number), spovajc v seriovm destkovm zeovn vzorku a ve zjitn, ve kterch zednch ji dolo k vymizen mikroorganism, take nenastal po inkubaci v tekut pd rst. Kad zedn se vyokovv paraleln do 3 nebo 5 kultivanch ndobek s ivnou pdou a vsledek se vyhodnocuje dle tabulek sestavench na zklad statistickch vpot. Metoda nedv pli pesn vsledky, avak umouje i rozbor tuhch nebo nefiltrovatelnch vzork s nzkm obsahem mikroorganism (<10 zrodk/g). b) Deskov ili plotnov metoda, zaloen na zjitn potu koloni vyrostlch na ztuench pdch za pedpokladu, e kad kolonie vznikla z jedn buky. Tato metoda je nejrozenj, nebo umouje zjitn potu ivch bunk mikrob jak v kapalnch nebo v tuhch ltkch, tak i na povrchu pedmt, ve vzduchu apod. Pouvme ji pro zjitn pevajcch bunk pi dezinfeknch nebo sterilanch zkrocch, v genetickch studich pi sledovn letlnch ink pouitch mutagen apod., ale pedevm pi mikrobiologickch rozborech potravin a potravinskch surovin vetn vody, pi sledovn mikrobiologick istoty provoznho zazen a vzduchu v potravinskm prmyslu atd. Pi tchto potravinskch rozborech meme pomoc deskovch metod zjistit celkov poet ptomnch mikroorganism nebo poet bunk urit skupiny mikroorganism, co je umonno pouitm selektivnch pd, na nich se mohou rozmnoovat pouze ty druhy mikroorganism, je chceme stanovit. U vzork s pomrn nzkm potem mikrob zpracovvme vt mnostv vzorku filtran metody, u vzork o znanm mikrobilnm zneitn pouvme vhodnho zedn. Zkladnm postupem deskov metody je pipetovn uritho objemu pipraven suspenze na Petriho misku a jeho pelit rozehtou ivnou pdou, nebo roztrn suspenze po povrchu utuhl pdy a zjiovn potu koloni po inkubaci pi optimln teplot. Proto se vsledek v posledn dob udv jako poet kolonietvornch jednotek (angl.zkratka c.f.u.= conoly forming unit), co zahrnuje i fakt, e nkter kolonie nevznikly z jedin buky (nap.u slizotvornch bakteri nebo plsn) a e pi zjiovn tzv. celkovho potu mezofilnch bakteri nevyhovuje pouit ivn agar vem ptomnm Strana101

druhm bakteri, take poet koloni je ni ne skuten poet bunk rznch druh. 6.1.2 Stanoven bunn hmoty mikroorganism Mnostv bunn hmoty mikroorganism zjiujeme pmmi nebo nepmmi metodami. K pmm metodm pat vkov stanoven suiny bunk a dle stanoven obsahu jednotlivch sloek protoplasmy, kter se v bukch vyskytuj v pomrn stl koncentraci (nap. dusk, nukleov kyseliny apod.). Nepm metody (nap. stanoven objemu bunn hmoty, stanoven intenzity zkalu bunn suspenze) vyhodnocujememna zklad kalibran kivky, pipraven pomoc nkter z pmch metod. Mnostv bunn hmoty nemus bt v pmm pomru k potu bunk, nebo v rznch rstovch fzch kultury mohou buky dosahovat rzn velikosti. 1. Pm metody rstov bilance mikroorganism na uritch substrtech (tj.pi zjiovn vtnosti biomasy) nebo pi bilannm hodnocen kvasnch proces, je bvaj doprovzeny syntzou bunn hmoty. Nkdy se tato metoda pouv ke zjiovn mnostv bunn hmoty v biochemickch pokusech. Metoda spov v suen promytch bunk pi 95-105oC do konstantn vhy. b) Stanoven obsahu dusku v bunn hmot. Pi tto metod mineralizujeme bunnou hmotu spalovnm v prosted koncentrovan kyseliny srov a stanovme vznikl amonn ionty. Tato metoda se me pout jen u dobe promytch bunk, zbavench zbytk kultivanho prosted. Pouv se hlavn pi bilancovn produkce biomasy v bio-technologich a nkdy tak v biochemickch pracech. Nsobme-li zjitn obsah dusku faktorem 6,25 dostvme piblin obsah blkovin. c) Stanoven obsahu blkovin v promyt bunn hmot. Blkoviny se v tto metod stanovuj vtinou biuretovou reakc nebo Lowryho metodou (viz B.Krlov,J.K a P.Rauch: Laborato z biochemie, skripta VChT,1983). Pouv se hlavn pi stanoven enzymovch aktivit bunn hmoty a pi jinch biochemickch pracech. 2. Nepm metody Strana102

a) Vkov stanoven bunn suiny. Toto stanoven je nezbytn pi provdn

a) Turbidimetrick stanoven bunn hmoty je mnohem rychlej a citlivj ne pm metody a mnohem pesnj ne dal metoda. b) Volumetrick metoda Nevhodou obou tchto nepmch metod je, e se mus pipravovat kalibran kivka pro kad kmen mikroorganismu, a proto se pouvaj pouze pro seriov stanoven provdn u jednoho kmene. 6.1.3 Zjitn piblinho mnostv mikroorganism na zklad jejich biochemick innosti Do tto skupiny pat ada metod pouvanch pro zjitn hygienickho stavu a drnosti (a tedy i kvality) potravin a potravinskch surovin. Vtinou se zjiuje sumrn aktivita vech ptomnch druh bakteri, kter je mrn potu ptomnch bunk. Vyjden vsledku potem ptomnch bakterilnch bunk je vak piblin, nebo jednotliv buky se li intenzitou sledovan reakce a tak jednotliv buky uritho druhu se mohou v tomto ohledu znan liit. Krom tto celkov aktivity meme zjistit tak aktivitu jednotlivch bakterilnch skupin (nap.koliformnch bakteri, salmonel apod.). Vhodou tchto metod je pomrn jednoduchost proveden a pedevm to, e vsledek zskme velmi brzy (10 min a 4 h). Nkter z tchto metod se pouvaj ji destky let (nap.titran zjitn produkce kyselin v mlce, sledovn redukn aktivity bakteri ptomnch v mlce pomoc resazurinu nebo methylenov mode). Zskan hodnoty jsou ukazateli kvality potraviny a nejsou zde obvykle pevdny v piblin poty bakteri. (Bli o proveden viz nap. SN 570530 Metody zkouen mlka a mlnch vrobk.) Z novjch metod je teba uvst : 1. Radiometrick metody, u nich se nejastji zjiuje tvorba
14

CO2 ze znaenho uhlkatho substrtu.

Nejastji se pouvaj v klinick diagnostice, nebo pi pouit antiser proti jednotlivm patogenm umouj urit tyto patogeny. V potravinstv se nejastji pouvaj tyto metody pro rozbor zmraench potravin a potravinskch surovin. Tato analza byla automatizovna (nap.pstroj Bactec, vyrbn firmou Johnston Laboratories, USA). Vsledek se zsk za 46h. (viz nap.Journal of Food Science,40,223,1977).

Strana103

2.

Men elektrick vodivosti, kter je zaloeno na faktu, e v dsledku metabolimu bakteri stoup elektrick

vodivost kultivanch roztok. Proto se bhem kultivacesleduje prchod slabho elektrickho proudu tekutou ivnou pdou, zaokovanou vzorkem. Zjistiteln zmna vodivosti se objev, kdy koncentrace bakterilnch bunk doshne 106 v ml.Z doby, za kterou se toho doshne, se pomoc kalibran kivky zjist poten koncentrace mikroorganism. Kalibran kivky pro jednotliv typy vzork (nap.mraen zelenina, mlko, syrov maso apod.) se konstruuj za pouit kultivanho stanioven potu bakteri v pslunch vzorcch. Stanoven bylo pln zautomatizovno za pouit vpoetn techniky (nap.pstroj firmy Malthus Instruments, Perth, Skotsko, analyzuje 120 vzork souasn). Vsledky se udvaj jak graficky, tak i numericky. Metoda je vhodn pro koncentrace 102-106 bakterilnch bunk/g vzorku (u vych koncentrac je mon provdt zedn). Doba inkubace je 5-9 h. Dojde-li ke zmn vodivosti za dobu krat ne 5 h, m vzorek pli vysok obsah bakteri, a proto z hygienickho hlediska nevyhovuje. Vodivostn metodu meme pot tak pi hodnocen startovacch kultur v mlkrenskm prmyslu. Inkuban doba je pak 2-4 h a zle tak na pouitm zedn. Plsn se chovaj opan ne bakterie, tzn., e sniuj vodivost. Pi stanoven bakteri vak jejich bn ptomnost nevad. 3. Limulus test, tj. pouit lyztu amoebocyt krabu Limulus polyphemus, kter je pipravovn americkou firmou Difco (Detroit), je zaloen na tom, e endotoxin ptomn ve stn gramnegativnch stevnch bakteri koaguluje tento lyzt za tvorby gelu nebo vloek. Pozitivn reakci po 1 h inkubace pi 37oC d 5102 bakterilnch bunk/ml. Metoda je tedy velmi rychl a umouje zjiovn koliformnch bakteri v syrovm mlce, mletm mase, uzeninch apod. Nap.v chlazenm mletm mase m bt negativn 0,1 ml za zedn 1:1000. 4. Chemoluminiscenn metody jsou citliv metody zaloen na stanoven porfyrin nebo ATP mikrobilnch bunk. Pi stanoven porfyrin pomoc luminolu (tj. 5-amino-2,3-dihydro-1,4aminoftaltu) v p-tomnosti H2O2 je nutno odstranit ruiv inek kovovch iont. Pi stanoven mikrobiln ATP je nutno nejdve odstranit ATP analyzovan potraviny nebo potravinsk suroviny, pak uvolnit ATP z ptomnch mikrobilnch bunk a stanovit ji Strana104

pomoc enzymovho systmu luciferin-luciferasa. Holandsk firma Lumac vyvinula inidla pro tyto jednotliv kroky i pstroj pro zjitn pslun luminiscence. Pouv se pro zjitn bakteri v mase (nejni zjistiteln mez je 105 bakterilnch bunk/g), kvasinek v ovocnch vch (kombinuje se s odstednm kvasinkovch bunk) ap. Podrobnji viz nap. Food Technology,33,63 (1979) nebo Fleischwirtschaft,60,266 (1980). Abychom dostali sprvn obraz o skuten kvalit mikrob v okamiku odebrn vzorku, sname se omezit co nejvce dal pomnoen mikoorganism ve vzorku. Dosahujeme toho u kultivanch metod ochlazenm vzorku na 5-6oC nebo jeho rychlm zpracovnm, u ostatnch metod meme mikroorganismy usmrtit, nejastji pdavkem formaldehydu (0,2 ml na 10 ml vzorku).

6.2 6.2.1 Cv.6.1 Popis :

JEDNOTLIV METODY STANOVEN POTU MIKROORGANISM Mikroskopick potn bunk Stanoven potu bunk potac komrkou Potac komrka je v podstat siln podlon sklko, je m ve stedn

sti ni, pesn vybrouen polko (obr.42), kter po pikryt krycm sklkem tvo komrku o pesn hloubce (nap. 0,1 mm u Thomovy komrky). Dno komrky je rozdleno tvercovou st na tvereky a obdlnky o znmch dlkch stran (obr.43). Po stranch vybrouenho pole jsou zezy ve tvaru kanlk, kam petk pebyten kapalina (obr.42). Poteby : sklka. Proveden : 1. Kulturu dkladn promchej a pak steriln pipetou penes kapiku do stedu potac komrky. 2. Piklop krycm sklkem tak aby nevznikly vzduchov bubliny a dobe pitiskni. Ponech chvli ve vodorovn poloze (na preparanm stolku mikroskopu), aby buky klesly ke dnu. Potac komrka Thoma nebo Brker, erstv kasnin kultura v tekutm mediu, steriln dlen pipety (1 ml, 5 ml), steriln fyziologick roztok (roztok .1), kryc

Strana105

3. Zvtenm 1010 prohldni komrku, je-li v jednom tvereku o stran 1/20 mm maximln 5 bunk kvasinek. V zpornm ppad prove pslun zedn tak, e odpipetuje urit mnostv suspenze do zkumavky a pid vypoten mnostv sterilnho fyziologickho roztoku a piprav znovu komrku s ednou kulturou. 4. Zjisti opt zvtenm1010, zda je zedn dostaten, a pak pi zvten 450 spotej buky asi ve 120 tverecch (tj. pouze ve tverecch, souvisejcch spolu svmi rohy) po celm poli komrky. Z bunk lecch na arch potej vdy jen ty, kter le na dvou zvolench stranch, puc buky potej jako jednu, matesk a dcein buky (i jet spojen) jako dv. 5. Celkovou sumu dl potem potanch tverek, m dostane prmrn poet bunk v jednom tvereku. 6. Vypoti mnostv bunk v 1 ml pvodn suspenze (prmrn poet bunk v 1 tvereku dlen objemem, kter je vymezen tverekem a hloubkou komrky, nsoben pouitm zednm). Poznmky : 1. Bakterie mono potat obdobnm zpsobem pi zvten 4515, avak za pouit fzovho konstrastu (viz kap.2.4.5.2). Nkdy bvaj pro bakterie pouvny komrky o hloubce 0,02 mm (nap. Petroff-Hansenova komrka), u nich lze pout vtho zvten. I v tomto ppad je vak teba pout fzov kontrast, nebo nebarven bakterie jsou patn zeteln. 2. Pro piblin rozlien mrtvch a ivch bunk kvasinek je mono pout vitln barven (viz kap. 4.2.6.5), i kdy za skuten dkaz ivotnosti mikrobiln buky je nutno povaovat jej schopnost autoreprodukce, a tedy tvorby kolonie. 3. Pro rozlien cizch tj. kontaminujcch kvasinek v droskch provozech doporuuje Kunz a Klaushofer (Applied Mocrobiology,9,469 (1961) vybarven bunk provoznho kmene antiserem oznaenm fluoresceinem a pozorovn za pouit fluorescenn techniky ve fzovm kontrastu. Buky provoznho kmene jsou pak zelen, kdeto kontaminujc kvasinky jsou jasn erven. Obdobn fluorescenn metody pro potn bunk kvasinkov kontaminace v pivovarstv vypracoval Campbell a Brudzinski (Journal of the Instutute of Brewing,72,56 (1966)) a Richards aaa Cowland (J.Inst.of Brewing,73,552 (1967)). Cv.6.2 Stanoven potu bunk ve fixovanm obarvenm prepartu

Strana106

Poteby :

Kultura Escheria coli v tekutm mediu, podlon sklka, ablonka

s narsovanou plochou 1 cm2, roztok krystalov violeti (roztok .2), steriln mikropipeta, objetivov mtko. Proveden : 1. Pipetuj 0,01 ml dobe rozmchanho vzorku na odmatn podlon sklko, rozeti na ploe 1 cm2 (podlo si pod sklko milimetrov papr jako ablonku), usu v pesn vodorovn poloze a fixuj plamenem. 2. Obarvi krystalovou violet (15-20 s), oplchni vodou a usu. 3. Zjisti imerznm objetivem poet bunk v 10 a 15 zornch polch a vypotej prmr. 4. Uri velikost zornho pole objetivovm mikrometrem. 5. Vypotej celkov poet mikrob v 1 ml, kter se rovn CH3_CH_COOH HS_CH2_CH_COOH

H2S

NH2

NH2

kde a Z1 v Z2 Poznmka :

je prmrn poet mikrob v jednom poli, je plocha prepartu (100 mm2) je pouit objem vzorku je plocha zornho pole v mm2 (0,01 ml)

Je-li prepart pli hust, prove zedn sterilnm fyziologickm roztokem. Pro potn bakteri ve fixovanm prepartu je vhodn pout okulr s mkou, kter umouje potat buky pouze uprosted zornho pole. Tm se odstran pote, zpsoben neostrost okraj zornho pole. Mku mono nakreslit leptacm nebo obyejnm inkoustem na upraven kryc sklko, kter vkldme mezo onici a sbrnou okou okulru. Velikost tvereku nakreslen mky stanovujeme objetivovm mtkem. 6.2.2 Nefelometrick stanoven potu bunk Nefelometrie je zaloena na rozptylu svtla drobnmi stekami suspendovanm v kapalin, tj. na tzv. Tyndallov efektu. Zakalen kapalina m toti schopnost vychlit st svtla, kter ji ozauje, z jeho pvodnho smru a rozptlit jej tak do vech smr (obr.X4). Zpsob rozptylu svtla je rzn pro rzn vlnov dlky svtla a proto

Strana107

pouvme monochromatick svtlo (viz obr.X4), a zvis tak na optickch vlastnostech kapaliny i suspendovanch steek a na velikosti a tvaru tchto steek. Je-li velikost suspendovanch stic men ne vlnov dlka pouitho svtla, zkal se vbec neobjev. V uritm rozmez koncentrac suspendovanch stic stejn velikosti plat mezi intenzitou rozptlenho svtla a koncentrac suspendovanch stic vztah : Is/Io = Kc, kde Is intenzita svtla odraenho v uritm hlu, Io intenzita dopadajcho svtelnho paprsku, K konstanta, kterou mono stanovit promenm suspenze o znm koncentraci, c koncentrace stic (v naem ppad poet bunk v 1 ml). Pi vych koncentracch suspendovanch stic dochz k absorpci svtla v kapalin, take men by neposkytlo sprvn vsledky. Pi stanoven potu bunk si pipravme suspenzi mikroorganism v destilovan vod pefiltrovan pes sintrov sklo (kelmek S-4) nebo v ir pd. Pmm mikroskopickm potnm zjistme jej koncentraci a nefelometrickm promenm jejich nkolika zedn stanovme kalibran kivku, kter v pouiteln oblasti mus mt tvar pmky. Jej pomoc pak stanovujeme nefelometricky poet bunk tho mikroorganismu v suspenzch v destilovan vod nebo v ir pd. Meen je teba provdt za konstantn teploty. Aby se kyveta dopadajcm svtlem neohla, vkldme ji bhem men do vodn komory, kterou proud voda o konstatn teplot. Cv.6.3 Poteby : Nefelometrick stanoven potu bunk Kultura E.coli v irm MPB, potac komrka, mikroskop s fzovm

kontrastem, nefelometr s kyvetami, zkumavky, pipety, pda MPB pefiltrovan sklennm filtrem S-4. Proveden : 1. Zjisti pmou mikroskopickou metodou (kap.7.2.1.1) pomoc fzovho kontrastu poet bunk v 1 ml kultury. 2. Pomoc irho (tj.pefiltrovanho sklennm filtrem) bujonu piprav nkolik edn kultury tak, aby bylo v prvm edn 1107 bunk/ml a v poslednm zedn 1104bunk/ml.

Strana108

3. Zm jednotliv zedn na nefelometru (za pouit filtru odpovdajcho barvou barv pouitho bujonu a za chlazen komory protkajc vodou). 4. Ze zskanch hodnot sestav kalibran kivku : Na osu X nanes koncentrace bunk podle mikroskopickho men, na osu Y hodnoty nefelometrickch ten. Zskan body propoj pmkou. 5. Prom jednotliv vzorky a z kalibran kivky zjisti odpovdajc koncentrace bunk. Jsou-li vzorky pli koncentrovan, prove edn filtrovanm bujonem. Poznmky : 1. Absorpce svtla je ovlivnna mj.tloukou vrstvy kapaliny (tj.velikost nefelometrick kyvety): m je vrstva men, tm lze mit vy koncentrace bunk, take nen teba edit vzorek, avak je nutn pro kadou tlouku stanovit novou kivku. 2. U zkumavkovch kultur je mon zjiovat poet bunk bhem rstu pmo v tchto zkumavkch po jejich dkladnm protepn. Mus bt pouito pesn stejn irokch zkumavek (kyvet) jak pro kultivaci, tak i pi sestrojovn kalibranch kivek. 3. Nefelometrick stanoven se pouv tak pro kvantitativn sledovn rstu bakteri pi mikrobiologickm stanoven nkterch vitamin (nap.thiaminu). Kalibran kivka se pak sestrojuje promenm kultur narostlch za znmch koncentrac sledovanho vitanimu. 6.2.3 1. Kultivan stanoven potu bunk Stanoven nejpravdpodobnjho potu mikroorganism (MPN) Tato metoda je vhodn pro rozbor potravin a potravinskch surovin s nzkm obsahem mikroorganism (<10/g), nebo meme vyokovat 10-100 g vzorku do desetinsobnho objemu tekut ivn pdy. Dal vhodou je, e se kvantitativnch vsledk doshne bez pouit agaru, kter se v dsledku stle vyho zneiovn mo stv nedostatkovm zbom. Nevhodou je ni pesnost ne u deskovch kultivanch metod. Nejastji se zjitn MPN pouv pi stanoven koliformnch bakteri jako indiktor feklnho zneitn a ukazatele hygienickho stavu potraviny. V tomto ppad se pouvaj selektivn media (nap.pda P-X2) zabraujc rozmnoovn grampozitivnch bakteri a umoujc identifikovat rst koliformnch bakteri na zklad biochemickch text (tvorba plyn z laktosy). Pro celkov poet Strana109

mezofilnch bakteri se pouv masopeptonov bujon (pda .X) a inkubace 483 h pi 32oC1oC. Do paralelnch zkumavek se vyokovvaj takov ti za sebou jdouc destkov zedn, u nich v nejvtm zedn je alespo jedna zkumavka po kultivaci bez nrustu (tj.negativn) a u mench zedj dochz k nrstu alespo v podlu zkumavek U vzork s neznmm potem mikroorganism se pipravuje vce edn a pro vyhodnocen se pouije nejvt zedn, je m jet vechny pozitivn kultury a dal dv zedn. Cv.6.4 Poteby : a 1 ml. Proveden : 1. Zaokuj 3 zkumavky pdy po 1 ml vzorku zednho 1:10, 3 zkumavky po 1 ml vzorku zednho 1:100, 3 zkumavky po 1 ml vzorku zednho 1:1000 a 3 zkumavky po 0,1 ml vzorku zednho 1:1000. 3 zkumavky pdy nech nezaokovan jako kontroly. Tabulka 2 Nejpravdpodobnj poet mikroorganism (MPN) v 1 g vzorku a limity za 95%n pravdpodobnosti pi pouit t paralelnch kultur Poet pozitivnch kultur MPN Limity MPN 0,1 g 0,01 g 0,001 g /g doln horn 0 0 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 0 0 1 0 0 1 1 2 0 0 1 1 2 2 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 2 Strana110 <3 3 3 4 7 7 11 11 9 14 15 20 21 28 23 39 64 . 0,5 <0,5 <0,5 1 1 3 3 1 3 3 7 4 10 4 7 15 . 9 13 20 21 23 36 36 36 37 44 89 47 150 120 130 380 Stanoven MPN vzorek mlka, 15 zkumavek s 10 ml pdy P-X2 a s Durhamovmi

plynovkami, steriln zkumavky, steriln fyziologick roztok, steriln dlen pipety 10 ml

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

1 1 1 2 2 2 3 3 3 3

0 1 2 0 1 2 0 1 2 3

43 75 120 93 150 210 240 460 1100 >2400

7 14 30 15 30 35 36 71 150 .

210 230 380 380 440 470 1300 2400 4800 .

2. Inkubuj vechny zkumavky 48 h pi 37oC a po inkubaci zjisti vznik zkalu a tvorbu plynu v jednotlivch zkumavkch vech zedn i kontroly. (Vechny kontroln zkumavky mus bt negativn). 3. Zapi poet pozitivnch zkumavek (zkal+plyn) z kadho zedn (nap.3,3,1,0) a na zklad zskanho kdu (v naem pkladu 3,1,0) zjisti podle tabulky .2 hodnotu MPN. V naem ppad 4310 bunk/ml, jeliko nejvt vyhodnocen inokulum bylo zedno 1:100. Kdybychom pouili kd 3,3,1, dostali bychom 460 bunk/ml. Za pesnj nutno povaovat vsledek 430 bunk/ml, nebo byl zskn na principu pouit nejvyho zedn obsahujcho vechny pozitivn kultury. 4. Zjisti, zda nalezen vsledek odpovd norm jakosti pro mlkrensky oeten mlko (SN 570599), je povoluje ve spotebitelskm balen v dob pevzet do trn st nejve 500 koliformnch mikrob v 1 ml. Poznmky : 1. Jestlie se vdalm edn objev neoekvan pozitivn kultura, pit se k sousednmu nimu edn. Nap. vsledek 3,1,0,1 m kd 3,1,1. 2. Jestlie nememe bezpen rozliit pozitivn a negativn kultury (nap. pi analze nerozpustnch potravin, tvocch v kultue zkal, nebo potravin mncch barvu pH indiktoru kultury) peneseme oko kultur na ivn agar nebo do zkumavky pdy pro MPN a inkubujeme 24 h pi pslun teplot. 3. Zjitn MPN pi stanoven koliformnch bakteri bylo pouito jako pklad, jeliko podle SN se tato skupina zjiuje v mlce za pouit selektivnch agar. 2. Deskov (plotnov) kultivan metody potn bunk Deskov metoda umouje zjitn potu ivch bunk v nejirm rozmez jejich koncentrac a na nejrznjm materilu. Za pouit vhodnch selektivnch pd umouje tak rozlien jednotlivch skupin rod mikroorganism. Z tchto dvod je

Strana111

nejpouvanj metodou pi mikrobiologickch rozborech potravin a potravinskch surovin, vody, vzduchu a pi sledovn istoty obal, provoznho zazen aj. Pro zsady kultivace mikroorganism a zpsob zpracovn vsledk pi mikrobiologickm zkouen potravinskch vrobk plat norma SN 560082 a obdobnou platnost maj i normy pro zpsob odbru vzork pro mikrobiologick zkouen potravinskch vrobk (SN 560080) a pro ppravu vzork k mikrobiologickmu zkouen potravinskch vrobk (SN 560081) uvdjc tak postup zeovn vzork, nebo poet koloni, vyrostlch na agarov pd v Petriho misce prmru kolrm 10 cm mus btv rozmez 30-300 u celkovho potu bakteri nebo kvasinek a v rozmez 15-150 pi zjiovn urit skupiny mikroorganism (nap.koliformnch bakteri) a v rozmez 5-50 pi stanoven plsn. Vy hodnoty koloni, ne je horn mez, dvaj ni vsledky, ne je skutenost, nebo se zde uplatuje ji antagonismus mezi bukami rznch druh z dvodu mal vzdlenosti tchto bunk v pd, pi mench potech koloni, ne je spodn mez, je vsledek zaten znanou chybou z dvodu nerovnomrnho rozptlen bunk a nhodnosti jejich penosu na pdu. Kvantitativn vyhodnocen ptomnosti plsn je vdy zateno velkou chybou jednak pro jejich tvorbu vlken, jejich rozpad v men seky, schopn tvoit samostatn kolonie, zvis na intenzit tepn vzorku, jednak pro hydrofobn povahu povrchu jejich spor, kter proto asto tvo shluky. Ni vsledky, ne je skutenost, dvaj bakterie tvoc slizovit obaly, spojujc vdy nkolik bunk, take kolonie nevznikaj z jednotlivch bunk. Abychom doshli poadovanho potu koloni na Petriho misce, musme vtinou vzorek edit postupnm destkovm zpsobem (viz kap. pd (kap. ). Roztrov metod dvme pednost, jeliko umouje lep rozptlen bunk ne pelivov metoda a nehroz u n nebezpe usmrcen bunk pli teplm agarem. Je nezbytn u psn aerobnch mikroorganism (nap. plsn). Jej nevhodou je nutnost malho inokula (0,1-0,3 ml oproti a 2 ml u hloukovho okovn). Roztrov metoda m proti pedchoz metod vhodu v tvorb zetelnjch koloni a lep reprodukovatelnosti vsledk. Dv tak ponkud vy vsledky ne zalvn do pevnch pd. Je nezbytn pro stanoven kvasinek a plsn (pouit pda je sladinov agar s pH upravenm po sterilaci na 3,8-4,0 a kultivace 2-5 dn pi 25-30oC) pro psn aerobn povahu plsn a nkterch kvasinek. Nevhodou roztrov metody je Strana112 ) a z kadho zedn pak okujeme dv misky, a to bu zalvnm pomoc roztaven agarov pdy (viz kap. ) nebo roztrem na povrch pedsuench agarovch

irok rozrstnnkterch bakteri (nap. Bacillus cereus var.mycoides, Proteus vulgaris), kter v krtk dob pokryj konkovitmi vbky svch koloni znanou st povrchu desky a znemon rozvoj i spotn ostatnch koloni. Z tchto dvod se nkdy doporuuje vloit do stedu ponajcch mykoidnch koloni mal krystalek manganistanu nebo se inkubuje pi suboptimln teplot. Bhem prce je u kultivan metody teba dodrovat psn aseptick podmnky, zvlt je-li povno nkolikansobn zedn, nebo kontaminace ze vzduchu nebo nesterilnho nin by mohla zpsobit pln zkreslen vsledk. Poet vyrostlch koloni zjiujeme po inkubaci pi optimln teplot po dobu 24-72 h (podle druhu zjiovanch mikroorganism viz kap.). Podle uveden normy (SN 560082) musme z vsledku dvou paralelnch misek za zedn poskytujcho vyhovujc poet koloni (tj.nap.30-300 u celkovho potu bakteri nebo kvasinek) vypotat aritmetick prmr a zaokrouhlit jej pi potu nim ne 100 na nejbli nsobek pti, pi potu vym ne 100, nekoncho na 5, na nejbli nsobekdeseti, a u koncho na 5 na nejbli nsobek dvaceti (tedy 125 se zaokrouhluje na 120 a 135 na 140). Tento vsledek pepoteme na 1 g nebo 1 ml pvodnho vzorku a vyjdme slem 1,0-9,910n. Jestlie poadovanmu rozmez potu koloni na miskch vyhovuj dv po sob jdouc zedn, vypote se podle uveden normy poet mikroorganism v 1 g (nebo 1 ml) vzorku pro kad zedn zvl a neli-li se zskan hodnoty vce ne dvakrt, je konen vsledek jejich prmr. V opanm ppad se pokld za konen vsledek ni z obou hodnot. Jestlie i pi nejmenm pouitm zedn vyroste na obou miskch pouze ni poet koloni, ne je poadovan mez, je nutno podle citovan normy uvst, e poet mikroorganism v 1 g (ml) je ni ne

, kde M je doln mez poadovanho potu koloni (tj. 30 pro celkov poet bakteri nebo kvasinek, 15 pro zjiovn jednotlivch skupin mikroorganism, 5 pro plsn) S je pouit zedn, In je velikost inokula.

Strana113

Cv.6.5 Poteby :

Zalvn do pevnch pd Vzorek mlka, 6 zkumavek s MPA (pda .X), 6 sterilnch Petriho misek, 3

steriln dlen pipety (1 ml), 2 zkumavky sterilnho fyziologickho roztoku (roztok .1) nebo steriln vodovodn vody (po 9 ml), vlec s dezinfeknm prostedkem pro odkldn pouitch pipet. Proveden : 1. Steriln 1 ml pipetou odeber asepticky (viz kap.3.3.5) 1 ml dobe promchanho vzorku a penes do zkumavky s 9 ml sterilnho fyziologickho roztoku (I) a dobe promchej. 2. Novou steriln pipetou penes 1 ml prvnho zedn do misky oznaen I a 1 ml dozkumavky oznaen II a ve zkumavce dobe promchej. 3. Dal steriln pipetou penes 1 ml druhho zedn do misky oznaen II a 0,1 ml tohoto zedn do misky oznaen III. 4. Pelij kadou misku cca 15 ml rozehtho ivnho agaru, vytemperovanho ve vodn lzni na 45o0,5oC a dobe promchej. Ped vylvnmagaru nezapome oehnout okraj zkumavky! 5. Inkubuj misky (zaven agar!) 24-48 h. Vzhledem k ptomnosti mlnch streptokok, jejich optimln teplota je pomrnnzk, inkubuje se pi 30oC. U ostatnch potravin je inkuban teplota pro mezofiln bakterie 37oC. 6. Spotej jednotliv kolonie na miskch a pepoti vsledek na 1 ml pvodnho vzorku podle normy SN 570082. Uve, zda mlko vyhovuje norm jakosti pro mlkrensky oeten mlko (SN 570599), je pro spotebitelsk balen v dob pevzet do trn st povoluje nejve 5,0105celkovho potu mikrob/ml. Poznmky : 1. ivn pda pouvan k pelvn suspenz na miskch nesm mt vt teplotu ne 45,5oC, jinak dojde k usmrcen bunk a dostaneme zkreslen vsledky. Proto temperujeme rozehtou agarovou pdu minimln 5 minut (pi objemu pdy do 100 ml, u vtch objem patin dle) za obasnho mchn ve vodn lzni; avak i teplota 45oC zpsobuje u nkterch mikrobilnch bunk teplotn ok, jen me pokodit jejich schopnost rozmnoovn, take metoda zalvn do pevnch pd dv vdy ni vsledky ne roztr na povrch pevnch pd (kap. v protokolu nutno uvst, kterou metodou byl vzorek analyzovn. ). Proto je

Strana114

2. Pro potn koloni na Petriho miskch byly zkonstruovny rzn pstroje. Plnoautomaticky vyhodnocuj misky pomoc samoinnch pota (viz kap.2.1). Nkter z nich pracuj pomoc laseru. Cel postup analzy metodou zalvn do agarovch pd byl zautomatizovn. Cv.6.6 Poteby : Roztr na povrchu pevnch pd Vzorek mlka, 6 zkumavek s MPA (pda .X), 6 sterilnch Petriho misek, 3

steriln dlen pipety (1 ml), 2 zkumavky sterilnho fyziologickho roztoku (roztok .1) nebo steriln vodovodn vody (po 9 ml), vlec s dezinfeknm prostedkem pro odkldn pouitch pipet, sklenn tyinka zahnut ve tvaru hokejky, ppadn rovn sklenn tyinka, kdinka s ethanolem. Proveden : 1. Piprav asepticky 2 desky ivnho agaru v Petriho miskch a pedsu je pi teplot 50oC po dobu 30 min nebo pi 60o-70oC krat dobu bez vzniku nepravidelnch hran na jejich povrchu. Pozor na pesuen, je by vedlo k zabrnn rozmnoovn mikroorganism! Pi pedsouen jsou misky oteven a dnem vzhru (zaven agar) a podobn jsou poloena i jejich vka. 2. Steriln pipetou penes 1 ml vzorku do prvn zkumavky s fyziologickm roztokem a dobe promchej. 3. Dal steriln pipetou penes 0,1 ml na povrch prvn desky ivn pdy (I) a 1 ml do dal zkumavkys fyziologickm roztokem. Dobe promchej a novou steriln pipetou penes 0,1 ml na druhou desku ivn pdy (II). 4. Sklennou tyinku pono do poloviny jej dlky do 96%nho ethanolu, pak ethanol odckni, oehni tyinku a ochla ji o vnitn plochu vka sklenn Petriho misky s pdou nebo o nezaokovan agar v ppad umlohmotn misky a vzorek dkladn rozeti po povrchu agaru pmoarm i krouivm pohybem, a se vechna kapalina vskne (viz kap. ). 5. Inkubuj zaven agar 24-48 h pi 30oC. 6. Spotej vyrostl kolonie a vsledek zpracuj podle poadavku normy SN 560082 a zjisti, zda vzorek odpovd norm jakosti (viz kap.7.2.3.2.1) Poznmka : Automatick lit desek pro tento postup umouje ada zazen, nap. firmy New Brunswick Scientific, USA, kter vyrb tak automatick potae koloni. Automatick povrchov okovn na pedsuen desky umouje nap.pstroj, kter Strana115

pomoc mikropipety nan vzorek na rotujc misku s agarem. Okovn zan od stedu misky a v dsledku pomalho pmoarho pohybu pipety k okraji misky probh po spirle. 3. Rozlien jednotlivch skupin mikroorganism Jednou z vhod deskov kultivan metody je monost rozlien jednotlivch skupin mikroorganism pouitm rznch selektivnch pd nebo kultivanch podmnek. Pro celkov poet mezofilnch bakteri pouvme MPA (pda . ) a inkubujeme pi 37oC. Pro kvasinky a plsn pouvme sladinov agar o pH 3,8-4,0, okujeme roztrem (kap. ) a inkubujeme pi 25--30oC 2 a 5 dn. Selektivn pdy pro rozlien mench skupin mikroorganism spovaj bu na pouit slouenin, inhibujcch rozmnoovn doprovzejc mikroflory, kter je nkdy ve znanm pebytku nad zjiovanou skupinou mikroorganism, nebo za pouit zdroj uhlku nebo dusku, kter jsou vyuvny pouze sledovanou skupinou mikrob, take doprovzejc mikroflora neme tvoit kolonie. Prvn ppad je hojnj a je pouvn pro adu skupin mikroorganism. Jako inhibitory slou nap. nkter barviva (pi zjiovn koliformnch bakteri nebo samonel), azid sodn (pi stanoven enterokok), chlorid sodn (pi stanoven stafylokok), kyselina jodoctov (pi stanoven kvasinkov kontaminace v pekaskm drod) apod. Na druhm zpsobu (tj. na rznch asimilanch schopnostech mikroorganism) je zaloena metoda stanoven kvasinkov kontaminace drod podle SN. Protoe inhibice rstu doprovodn mikroflory nen v nkterch ppadech pln, vyuv se k odlien jednotlivch skupin jet dalch fyziologickch rozdl, nap.: a) Zkvaovn rznch cukr zjiovan pdavkem acidometrickch indiktor do pdy. b) Ptomnosti katalasy, zjiovan pelitm koloni na Petriho misce 3%nm roztokem H2O2 a pozorovnm vzniku bublinek kyslku (k rozlien mlnch bakteri, kter katalasu nemaj). c) Tvorby sirovodku zjiovan z tvorby ernho FeS, tpen rznch slouenin apod. Nejastji je v potravinch a v potravinskch surovinch stanovovna skupina koliformnch bakteri, jakoto indiktor feklnho zneitn, a proto ukazatel hygienickch podmnek pi vrob a distribuci. V nkterch ppadech je dleit tak obsah sporotvornch bakteri, pedevm termofilnch. Strana116

. 3a. Stanoven koliformnch bakteri Jako koliformn bakterie oznaujeme gramnegativn tyinky z eledi

Enterobacteriaceae, zkvaujc laktosu pi 37oC do 48 h za souasn tvorby kyselin a plynu. Maj podobn morfologick a fyziologick vlastnosti jako Escherichia coli a krom tohoto druhu sem nle pslunci rodu Enterobacter, ale podobn se chovaj i nkte pslunci podmnn pathogennho rodu Citrobacter, pathogennho rodu Klebsiella i podrodu Arizona, kter byl vytpen z rodu Salmonella. Koliformn bakterie netvo spory a v dsledku hexosov represe dchn maj na sacharidovch pdch negativn cytochromoxidasov test. Jejch ptomnost v potravin naznauje, e stejnm zpsobem by se do potraviny mohly dostat tak velmi nebezpen stevn pathogeny, vyluovan s vkaly, pedevm pslunci rodu Salmonella a Shigella. Dve byla skupina koliformnch bakteri oznaovna jako skupina Coli-aerogenes podle nejvce zastoupench druh (Escherichia coli, Enterobacter aerogenes). Selektivn diagnostick agarov pdy pro stanoven koliformnch bakteri jsou vtinou zaloeny na schopnosti tto skupiny zkvaovat laktosu za tvorby kyselin, co se projev zmnou barvy ptomnho acidimetrickho indiktoru, a na potlaen innosti a rstu ptomnch grampozitivnch bakteri uritm barvivem. Pouze u Endovy pdy (pda .XY) je msto kyseliny zjiovn acetaldehyd vznikajc z laktosy a vc ptomn siiitan, take se objev zbarven ptomnho fuchsinu. Protoe fuchsin je siln kancerogenn, je nyn nejastji pouvanou pdou Levinv agar (pda .XX), kter obsaaahuje barviva eosin a methylenovou mod. Escherichia coli, kter je typickm indiktorem feklnho zneitn, na n tvo tmav kolonie, kter mohou, ale nemus mt zelenav kovov lesk a nkdy maj zk svtl okraj, kdeto druh Enterobacter aerogenes, kter je typickm pdnm mikroorganismem, tvo kolonie se irokm blm okrajem a malm tmavm stedem. V souasn dob je u ns komern vyrbn modifikovan suen Levinv agar, kter msto methylenov mode obsahuje bromkresolpurpur. Koliformn bakterie jsou na nm lutoerven oproti modrofialovm kolonim bakteri, kter nezkauj laktosu. Na Endov agaru (pda .XY) tvo kolonie E.coli tmav karmnov erven, asto se zelenm leskem a nkdy s zkm svtlm okrajem. Enterobacter aerogenes tvo vt kolonie ponkud svtlejho karmnovho odstnu a s blm okrajem. Oba rody tvo tmav karmnov zny v pd kolem koloni (nezaokovan Endova pda je jen slab narovl). Na agaru s trypaflavinem a s bromthymolovou mod (pda .YY), pouvanm v mlkrenskm prmyslu, tvo Strana117

koliformn bakterie lut a oranov kolonie (kulovit vypukl) se lutmi znami v modr zkladn pd. U Levinova a Endova agaru se okuje na utuhlou pedsuenou pdu, aby bylo mono dobe rozliit charakter koloni a zn kolem nich, take se pouv roztrov metoda (kap. pout i zalvn do pevn pdy (kap. ) nebo filtran metoda (kap. ). U pdy s trypaflavinem, kde nelze rozliit E.coli od ostatnch koliformnch bakteri, meme ). Tato pda vak dv ni vsledky, nebo inhibuje i rst nkterch kmen koliformnch bakteri. Pro usnadnn tchto biochemickch test se v zahrani prodvaj speciln testovac soubory, nap. trubika rozdlen pn na adu oddlen s rznmi pdami a reagenciemi, je spolen zaokuj jedinm prothnutm okovacho drtku (viz kap. ). Urit usnadnn prce pin tak mikrotesty Entero I a Entero II. Jsou to plastikov destiky s osmi adami dvancti jamek naplnnch specilnmi pdami pro proveden dvancti rznch biochemickch test u 8 izolt stevnch bakteri. Tyto mikrotesty umouj rozliit 30 nejbnjch druh stevnch bakteri vetn nkterch pathogen (nap. Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Arizona a nkolik typ rodu Shigella). Cv.6.7 Poteby : Stanoven koliformnch bakteri vzorek mlka, 4 desky pedsuenho Endova nebo Levinova agaru (pdy

.XY a XX), steriln dlen pipety 10 ml a 1 ml, steriln fyziologick roztok (roztok .1), sklenn tyinka ve tvaru hokejky, ethanol. Proveden : 1. Na pedsuen desky asepticky pipetuj po 0,1 ml neednho vzorku a edn 1:10 (dv desky pro kad zedn) a rozeti do sucha (kap. ). 2. Inkubuj zaven agary 48 h pi 37oC, spotej kolonie charakteristick pro koliformn bakterie a vsledek vypotej podle princip uvedench v SN 560082. Kvantitativn se mohou vyhodnotit pouze misky obsahujc 15-150 koloni. 3. Zapi, zda analyzovan vzorek odpovd norm jakosti mlkrensky oetenho mlka (SN 570599), tj. maximln 5,0102 koliformnch bakteri/ml v dob pevzet do trn st. Poznmky : 1. Jako potvrzujc test pro koliformn bakterie je doporuovn cytochromoxidasov test (viz SN 030521 pro mikrobiologick rozbor pitn vody), kter je rozli od gramnegativnch psn aerobnch bakteri (nap.od pslunk rodu Pseudomonas).

Strana118

2. Protoe vechny koliformn bakterie nemaj stejnou hodnotu pi vyhodnocovn hygienickch podmnek (nap.rod Enterobacter se vyskytuje hojn tak v zemdlsk pd a Citrobacter je podmnn patogenn), provdj se nkdy tak s typickmi zstupci koloni z diagnostick pdy doplkov biochemick testy po kultivaci ve zkumavkch specilnch pd. Nejastji jde o sledovn tvorby indolu, acetoinu, sirovodku, siln produkce kyselin z glukosy (test na methylerve), tpen elatiny, rst na citrtu jako jedinm zdroji uhlku (viz tab..3). Tabulka .3 Biochemick testy koliformnch bakteri a pbuznch rod Biochemick test E.coli Enterobacter Citrobacter Arizona Klebsiella Produkce indolu Produkce acetoinu Produkce H2S tpen elatiny Vyuvn citrtu Test s methylerven + + + + D D + + d = rzn u rznch kmen + + D + + + D d d D

D = rzn u rznch druh 3b.

Zjiovn sporotvornch bakteri Zjiovn sporotvornch bakteri, tj. pslunk rod Bacillus, Clostridium a

Desulfotomaculum, je dleit hlavn z hlediska konzervrensk technologie. V teplem sterilovanch nekyselch konzervch (tj. o pH vym ne 4,0) nesm pevat spory mezofilnch druh tchto rod, nebo stejnm zpsobem by dolo k pevn spor nebezpenho druhu Clostridium botulinum. Mezofiln sporotvorn anaeroby slou tedy jako indiktorov mikroorganismy. Spory termofilnch sporotvornch bakteri vtinou tepeln sterilan reim nekyselch konzerv pevaj a mohou bt pinou kaen tchto konzerv pi jejich uchovvn pi teplotch 30oC a ve, kdy me dojt k pomnoen tchto termofil. Ztchto dvod nesmj konzervrensk suroviny a pdavn ltky (cukr, krob, koen, mouka apod.) obsaahovat pli velk mnostv spor tchto druh (ppustn je maximln 150 spor/10 g vzorku). Ptomnost sporotvornch bakteri zjiujeme vtinou po odstrann vegetativnch bu-nk zahvnm na vodn lzni (u mezofil vtinou 30 min pi 80oC, ppadn 8 min pi 88o-90oC, u termofil 30 min na vrouc vodn lzni) a rychlm zchlazen vodou. Spory nkterch druh (nap. Bac.stearothermophilus a nkterch klostridi) bez tohoto

Strana119

tepelnho oku velmi tko kl, take by v potravinskch surovinch unikly stanoven. Ptomnost pslunk rodu Clostridium tvocch plyn, a to mezofilnch i termofilnch, zjiujeme po teplotnm oku vtinou pouze kvalitativn, tj. z vvinu plynu pod agarovou nebo parafinovou ztkou v pd obsaahujc sacharidy (nap.jtrov bujon viz pda .YY), kdeto mezofiln i termofiln pslunky rodu Bacillus a termofiln Desulfomaculum nigrificans vyhodnocujeme kvantitativn. Cv.6.8 Poteby : Zjiovn sporotvornch bakteri vzorek koen nebo cukru, steriln Erlenmeyerva baka obsahu 150 ml se

znakou na 100 ml, 4 steriln Petriho misky, steriln dlen pipeta 1 ml, steriln parafin nebo MPA (pda .5), 3 zkumavky peptosiiitanovho agaru s proukem eleza (pda .??) pro stanoven Clostridium nigrificans, steriln voda, 3 zkumavky jtrovho hujonu (pda .15), 4 zkumavky peptonglukosovho agaru s bromkresolpurpurem (pda .yx). Proveden : 1. Do zven Erlenmeyerovy baky penes asepticky 1-2 g mletho nebo asi 10 g nemletho koen nebo 10 g cukru a znovu zva (pesnost na 0,02 g). 2. Pelij 40 ml steriln vody, tepej po dobu 5 min a pak vyhvej na vodn lzni o teplot 88oC po dobu 8 min. Ochla pod vodovodem a dopl steriln vodou po znaku (100 ml). 3. Po usazen kousk koen pipetuj 1 ml a 0,1 ml do Petriho misek. Po 1 ml napipetuj do zkumavek s peptonsiiitanovm mediem, vyhvanm ped tm 20 min na vrouc lzni (pro vypuzen kyslku), dobe rozmchej a nech ztuhnout pod vodovodem ve svisl poloze. Do zkumavek jtrovho bujonu, je byly ped tm vyhvny 30 min na vrouc lzni pro odstrann rozputnho kyslku napipetuj (ke dnu zkumavky) po 2 ml suspenze a bujon v kad zkumavce pevrstvi cca 5 ml tuhnoucho MPA nebo 1 ml sterilnho parafinu a ochla pod tekouc vodou. Vzorky v Petriho miskch pelij rozehtm peptonglukosovm agarem a dobe promchej. 4. Inkubuj misky pi 37oC, zkumavky pi 55oC (ve vlhk komrce!) 1-2 dny. 5. Ozna tukou na sklo a spotej kolonie aerobnch mezofilnch sporotvornch bakteri na Petriho miskch, a to zvl kyselinotvorn (tj. tvoc lut zny kolem koloni) a ostatn, tj. nemnc modrofislovou barvu pdy. 6. Misky dej inkubovat na 24 h do 55oC (vlhk komrka!). Spotej ern kolonie anaerobnho termofilnho Cl.nigrificans ve zkumavkch, ppadn dej zkumavky

Strana120

jet znova inkubovat na 55oC. Zjisti poet zkumavek jtrovho bujonu, v nich je zeteln vvoj plynu. 7. Zjisti, kolik koloni pibylo na miskch i ve zkumavkch po inkubaci pi 55oC. U misek opt rozli kyselinotvorn od ostatnch. 8. Vechny vsledky pepotej na 10 g pvodnho vzorku. U plynotvornch anaerob sm bt pozitivn maximln dv zkumavky. 4. Pi Filtran metoda stanoven potu mikroorganism mikrobiologickm rozboru kapalin s pomrn nzkm obsahem

mikroorganism (nap. pitn voda) je teba zpracovat vt objemy vzorku, abychom doshli smrodatnch vsledk. K tomu elu pouvme stanoven MPN (viz kap. ), nebo filtran metodu. Filtran metoda je pesnj, avak lze ji pout pouze u naprosto irch vzork. Princip tto metody spov ve filtraci vzorku sterilnm membrnovm filtrem, schopnm zachytit mikrobiln buky. Nsledn penesen tohoto filtru na desku ivn pdy a inkubaci za optimln teploty pro vytvoen jednotlivch koloni. Tto metody se pouv pro rozbor pitn vody, sacharosy (pipravuje se 5-10%n roztok ve steriln vod), kuchysk soli a jinch rozpustnch ltek nebo pro rozbor kapalin, obsahujcch sloueniny, inhibujc rst zjiovanch mikroorganism (nap. pro hypertonick roztoky jako jsou sirupy nebo pro npoje obsahujc chemick konzervan prostedky). Tato metoda vak neme bt pouita pro rozbory suspenz nebo homogent vzork ucpvajc pry membrny. Tekutina obsahujc mal mnostv suspendovanch stic me bt nejdve filtrovna pes steriln filtr o prmru pr 4m a pak pes filtr zachycujc zjiovan mikroorganismy, pi em se kultivuj oba filtry za shodnch podmnek (monost adsorpce bunk na prvm filtru). Filtruje-li se hypertonick roztok nebo roztok obsahujc antimikrobiln ltky, mus se po skonen filtrace filtr dkladn promt steriln destilovanou vodou nebo zeovacm roztokem. Pro zjiovn bakteri se pouvaj membrnov filtry o prmru pr 0,3 m. Nkter membrnov filtry maj barevnou tvercovou mku (tzv.rastrovn) pro usnadnn potn koloni po inkubaci (viz obr.XXX). Ped pouitm se membrny vyva v destilovan vod, kter se 3 vymuje, aby se zbavily zbytk rozpoutdel. Pro stanoven koloformnch bakteri se mohou pout ji tyto vyvaen filtry, nebo pevajc bakteriln spory nemohou na selektivnch pdch dt vznik kolonim. Pro

Strana121

ostatn stanoven sterilujeme membrnov filtry v 0,1%n peptonov vod frakcionovan v proudc pe v jednodennch intervalech po dobu 20 min (viz kap. ). Cv.6.9 Poteby : Stanoven potu mikroorganism filtran metodou ve vod vyvaen membrnov filtry, steriln filtran nlevka, steriln

pipeta 25 ml, odsvaka, pinzeta bez vroubk, pedsuen desky Levinova agaru (pda .XX), steriln Petriho miska, steriln destilovan voda, vzorek pitn vody nebo npoje. Proveden : 1. Pomoc oehnut a ochlazen hladk pinzety uchop vyvaen membrnov filtr. Prohldni jej, zda nen mechanicky pokozen, a vlo jej (lesklou stranou nahoru) na filtran destiku steriln filtran nlevky. Nlevku sestav a nasa na odsvaku. Ve provdj co nejrychleji, a to ve sterilnm prostoru (nap.blzko plamene). 2. Steriln pipetou penes do nlevky asepticky 100 ml vzorku a pikryj ji ihned vkem steriln Petriho misky. 3. Pomoc vvvy odsaj vzorek, malm mnostvm steriln vody oplchni vnitn stny nlevky do vky, kam sahal vzorek a znovu odsaj. Filtrace mus bt skonena ihned, jakmile je povrch filtru such, aby se filtrem neprosval vzduch mstnosti ppadn zneitn mikroorganismy. 4. Ihned po filtraci vyjmi membrnov filtr asepticky z pstroje, polo na pslunou pedsuenou ivnou pdu (opt lesklou stranou vzhru) a dobe pitiskni. Inkubuj 48 h pi 37oC. iviny bhem inkubace difunduj na povrch filtru, na kterm vyrostou kolonie bakteri. 5. Spotej typick kolonie koliformnch bakteri a pepoti na 1 litr nebo 100 g pvodnho vzorku. Poznmky : 1. Pro zamezen kontaminace filtran membrny mikroorganismy ze vzduchu bhem odsvn vzorku vyrbj nkter zahranin firmy filtran nlevku s vkem, kter se po napipetovn filtrovanho vzorku upevn na nlevku. Na vku je trubika vyplnn steriln vatou, kter slou jako filtr vzduchu, pichzejcho pi odsvn nlevky. 2. Vyrbj se tak celulosov podloky obsahujc suchou ivnou pdu (pro koliformn bakterie, pro celkov poet bakteri, pro kvasinky a plsn), kter se pouze ovlh steriln vodou a na n se polo membrnov filtr po proveden filtrace. Steriln podloky jsou vtinou v balcch spolu se sterilnm membrnovm filtrem. Strana122

3. Pro usnadnn rozboru vody v ternu se vyrb tak zazen pracujc naaa principu injekn stkaky, do n se nasaje zkouman voda. Po nasazen sterilnho membrnovho filtru se voda protla tmto filtrem a filtr se pak inkubuje na ivn agarov pd nebo na podloce s pdou. 4. Msto odsvn nebo petlaku (viz pozn.3) se pro filtraci me pout tak odsteovn. K romuto elu se vyrb speciln nerezov prstenec, do nho se nasazuje membrnov filtr s kovovou filtran podlokou. Horn strana prstence se naroubuje na ndabku s filtrovanou kapalinou, spodn strana na ndobku, do kter bude filtrovan kapalina prochzet pi odsteovn. 5. Stanoven potu mikroorganism v ltkch tuh konzistence Pi rozboru ltek tuh konzistence je teba vzorek po naven rozmlnit na jemnou dr neboli homogenizovat. U ltek mk konzistence (jtrov patika, unka s vejci apod.) sta nkdy dkladn tepat vzorek se sterilnmi sklennmi perlami a steriln vodou v zabrouen prachovnici. U ostatnch ltek roztrme vzorek se sterilnm kemennm pskem a steriln vodou v tec misce nebo jej homogenizujeme se steriln vodou ve vrtulovm homogeniztoru. Obsah tec misky chrnme ped vzdunou kontaminac steriln gumovou epikou (steriluje se v autoklvu), v n je otvor pro dradlo tlouku. Frekvence otek vrtulovho homogeniztoru nem bt men ne 8 000 otek/min a vy ne 45 000 otek/min a doba homogenizace nem peshnout 2,5 min. Pi pouit homogenizanho pstroje typu Colworth Stomacher se naven vzorek penese do sterilnho sku z uml hmoty a pid se zeovac roztok pro zskn zkladnho zedn. Pro kultivaci pouvme (po ppadnm zedn) pelivovou nebo roztrovou metodu (kap. a Cv.6.10 Poteby : ).

Uren potu mikroorganism v ltkch tuh konzistence vzorek masa, steriln n nebo skalpel, vrtulov homogeniztor, steriln

ndobka k homogeniztoru, steriln voda (40 ml, 9 ml) nebo steriln fyziologick roztok (roztok .1), steriln dlen pipety s uznutou pikou nebo kalibrovan trubiky, 6 zkumavek s MPA (pda .5), elektrick kauter, 6 sterilnch Petriho misek. Proveden : 1. Zva steriln homogenizan ndobku (i s vatovou ztkou, kter ji uzavr) na technickch vahch. 2. Povrch masa oehni plamenem nebo vysteriluj vyhtm elektrickm kauterem. Oehnutm noem rozkroj maso asi do 2/3 hloubky. Ze stedu krjej asepticky mal Strana123

kousky, penes je (asi 10 g) do homogenizan ndobky (ve provdj blzko plamene!), uzavi ndobku a opt zva. 3. Pelij maso v homogenizan ndobce 40 ml steriln vody nebo fyziologickho roztoku a homogenizuj v jemnou suspenzi (po dobu asi 2,5 min). 4. Pipetou s uznutou pikou nebo kalibrovanou trubikou penes po 1 ml tto suspenze do dvou Petriho misek a 1 ml do zkumavky s 9 ml steriln vody a dobe promchej. Novou pipetou s uznutou pikou penes 1 ml zedn suspenze do dal misky. 5. Pelij vzorky na Petriho miskch 45oC teplm MPA a dobe rozmchej. 6. Po ztuhnut inkubuj zaven agar 24-48 h pi 37oC. 7. Po inkubaci spotej vyrostl kolonie a vsledek pepotej na 1 g masa. 6. Stanoven potu mikroorganism na povrchu pedmt Pi stanoven potu mikroorgamism na povrchu pevnch tles zle pedevm na povrchu a velikosti sledovanho tlesa : a) Smvac metoda je vhodn pro drobn pedmty rzn vysokho mikrobilnho zneitn, nebo se u n me pouvat seriov zeovn nebo kombinace s filtran metodou (kap. ). b) Otiskov metoda se pouv pro pomrn ist, rovn pedmty (nap.kontrola sanitanch podmnek v provoze, kontrola myt ndob v hromadnm stravovn apod.). Princip spov v otisknut mikrob na desku ivn pdy. K pprav desky se pouvaj speciln misky (Duchoslavova, Czizarova) nebo nepouit steriln vka konzervovch plechovek, kter se pi inkubaci vkldaj do sterilnch Petriho misek. c) Tamponov metody meme pout pro pedmty nejrznjho stupn mikrobilnho zneitn i pro pedmty s nerovnm povrchem, a vnjm nebo vnitnm, nebo nepravidelnho tvaru. Cv.6.11 Poteby : Smvac metoda Vzorek suenho ovoce, 4 steriln Petriho misky, steriln prachovnice (250

ml) se sklennmi perlami, 100 ml steriln vody, steriln dlen pipeta 1 ml, 4 zkumavky s MPA (PDA .5), pinseta. Proveden :

Strana124

1. Do odven steriln prachovnice s perlami penes asepticky pomoc oehnut a ochlazen pinzety asi 5 plod ovoce a zva na technickch vahch. 2. Plody pelij 100 ml steriln vody, nech stt 10-15 min a pak dkladn tepej po dobu 5 min. Do dvou Petriho misek pipetuj po 1 ml a do dalch svou po 0,1 ml. 3. Pelij znmm zpsobem 45oC teplm MPA (kap. ) a dobe promchej. 4. Inkubuj pi 30oC po 24-48 h. 5. Zjisti poet koloni a vsledky z misek, kter maj 15-150 koloni, pepoti na 1 plod nebo na 1 g vzorku. Poznmky : 1. Obdoby tto metody meme pout pro stanoven istoty malch ndob. Do ndobky pipetujeme steriln vodu a po dkladnm protepn pipetujeme do Petriho misek 1 ml a 0,1 ml a pelvne ivnou pdou (kap. ). Vsledek pepotme na velikost povrchu, ppadn na 100 ml obsaaaahu ndobky. 2. U tko smitelnch povrch (nkter druhy ovoce, obalov materil ap.) je mon do smvac vody pidat mal mnostv (0,02-0,2%) neionogennch povrchov aktivnch smedel (nap.Tween 80). Cv.6.12 Poteby : Proveden : 1. Nalij asepticky na vka Duchoslavovch misek (a po jejich okraj) 45oC tepl MPA, a to tak, aby jeho vrstva byla mrn vypoukl (po ochladnut se objem agaru zmen). 2. Po utuhnut otiskni vzniklou agarovou desku na urit msto ssledovanho pedmtu. 3. Inkubuj zaven agar 24-48 h pi 37oC. 4. Spotej vyrostl kolonie a pepoti na jednotku plochy (plocha Duchoslavovy misky bv vtinou 10 cm2). Cv.6.13 Poteby : Tamponov metoda Steriln kovov ablona s vezem o znm ploe, steriln vatov tampony Otiskov metoda 3 steriln Duchoslavovy misky, 1 zkumavka s MPA (pda .5).

v Petriho misce, pinzeta, 100 ml steriln vody v Erlenmeyerov bace, steriln gumov ztka, 4 zkumaavkyy s MPA (pda . ), 4 steriln Petriho misky, steriln dlen pipeta 1 ml. Strana125

Proveden : 1. Pilo steriln ablonu na povrch pedmtu. 2. Pomoc oehnut pinzety oti tamponem namoenm ve steriln vod plochu vymezenou ablonou (nebo cel pedmt) a penes tampon zpt do steriln vody. 3. To opakuj jet s dalmi tampony na dalch secch povrchu (sta sett 3-5 sek). 4. Erlenmeyerovu baku s tampony uzavi steriln gumovou ztkou a tampony dkladn roztepej ve steriln vod. Pak pipetuj po 0,1 a 1 ml kapaliny do Petriho misek (vdy paralelndv misky), pelij 45oC teplm MPA a dobe rozmchej. 5. Po inkubaci pi optimln teplot 24-48 h.spotej vyrostl kolonie a pepoti na 1 cm2 povrchu. Poznmky : 1. Velikost vyetovan plochy a ve zedn se d stupnm mikrobilnho zneitn povrchu sledovanho pedmtu. U pomrn istch pedmt se me tato metoda kombinovat s filtran metodou (kap. ). 2. U drobnch pedmt nepravidelnho tvaru (nap. hky v odvovn masa, lce apod.) strme mikroby z celho povrchu, jen pjde do styku s potravinou a vsledek vyjadujeme potem mikrob na jednom pedmtu. 7. Zjiovn potu mikroorganism v potravinch a v potravinskch Deskov metody slou ke zjiovn potu mikrobilnch bunk pi mikrobiologickm zkouen potravinskch vrobk a pitn vody. Clem rozbor je kontrola kvality podle eskch ISO norem, v nich jsou uvedeny skupiny nebo druhy zjitovanch mikroorganism, pesn postup pro jejich detekci i mez jejich potu, je nesm bt pekroena. Nejbnjm ukazatelem kvality i dal drnosti potravinskch vrobk je celkov poet mezofilnch bakteri, zjiovan na masopeptonovm agaru s 1 % glukosy (pda .YY) pi 37 nebo 30oC. je tak do jist mry ukazatelem kvality skladovn a distribuce vroku. Velmi cennm ukazatelem hygienickch podmnek pi vrob i distribucije obsah koliformnch bakteri jakoto indiktoru feklnho zneitn, a proto u vtiny potravin jsou udny nejvy ppustn mnostv tchto bakteri. U potravin a potravinskch surovin s ni vlhkost (obiloviny, mouka, krob, suen vrobky) je Strana126

surovinch

dleit obsah plsn (zjiuje se na pd obsahuj kvasnin extrakt, glukosu a vhodn antibiotikum zamezujc rst bakteri, o pH cca 4,0, pi 22o30oC. U kyselch vrobk obsahujcch sacharidy (hlavn slazen nealkoholick npoje, kompoty apod) se zjiuj tak poty kvasinek a to na stejn pd jako pro plsn. U nkterch vrobk blkovinn povahy se stanovuj jet proteolytick bakterie, sledovnm rozkladu kaseinu nebo elatiny v okol jejich koloni (viz kap. 11) anebo lipolytick bakterie a plsn zjitovan na zklad uvolovn volnch mastnch kyselin z neutrlnch lipid. U surovin pro tepeln sterilovan nekysel potraviny se zjiuje jet poet aerobnch a anaerobnch sporotvornch termofilnch bakteri, nebo jejich velmi thermorezistentn spory pevaj pouvan sterilan reim a bhem skladovn pi teplotch nad 30oC mohou zpsobovat kaen tchto potravin. esk zkon o potravinch (Zkon .110/1997 a Vyhlka 298) uvd, e pslun vrobek nesm obsahovat pathogenn, podmnn pathogenn a toxinogenn mikroorganismy pro rzn druhy potravin a rovn uvd tolerovan hodnoty nkterch mikroorganism. Postup jejich stanoven je uren pslunou SN ISO normou. Hlavn dozor nad hygienou potravin m esk zemdlsk a potravinsk inspekce (ZPI) a orgny veterinrn kontroly. Povinnosti vrobce pi zpracovn surovin uruje zkon o potravinch, kter ukld vem vrobcm zavst do vroby systm kontrolnch bod (HACCP Hazard analysis of critical control points). 6.2.4 Stanoven bunn hmoty mikroorganism Nejastji se v mikrobiologii pouv stanoven suiny bunn hmoty, a u pmou vkovou metodou nebo nepmo spektrofotometrem, eventuln t z objemu bunn hmoty. Ve vech tchto metodch dostvme smrodatn vsledky pouze z kultur narostlch na irch pdch. U pd obsaaaahujcch ssraeninu odetme od zjitn suiny suinu pevnch stic nezaokovan ivn pdy, oddlench od pdy obdobnm zpsobem jako buky (tj. centrifugac nebo filtrac). 1. Stanoven bunn suiny vkovou metodou Pro stanoven bunn suiny vkov jsou vhodn dv metody podle charakteru vzorlu, a to : a) Pipetovn mikrobiln suspenze do venek

Strana127

Pouv se u suspenz promytch (2) a resuspendovanch v destilovan vod nebo ve fyziologickm roztoku. V ppad fyziologickho roztoku je teba od zskan hodnoty odest suinu tohoto roztoku. b) Filtran metoda mikrobiln suspenze Pouv se vtinou u bunk ve fermentovan kapalin (zkvas, hlavn kvae), a to jak pro kvasinky a bakterie, tak i pro plsn. Cv.6.14 Poteby : Proveden : 1. Hlinkovou venku s kemennm pskem a s krtkou tyinkou vysu pi 105oC a po vychladnut v exsiktoru zva na analytickch vahch. 2. Do zven misky pipetuj 2-5 ml zkouen suspenze, odpa kapalinu pod infralampou a pak dosu pi 105oC do konstantn vhy. Poprv zva po 1 hodin suen, pak v plhodinovch intervalech. Pi pesuen zane vha opt mrn stoupat. 3. Z rozdlu vah vypotej suinu a pepoti ji na 1 ml suspenze. Poznmka : U hustch suspenz ve fyziologickm roztoku je teba pi vpotu suiny uvaovat suinu fyziologickho roztoku. Cv.6.15 Poteby : Proveden : 1. Do vysuenho zvenho filtru odpipetuj 5-20 ml fermentovan kapaliny. 2. Odsaj kapalinu, tikrt promyj 3 ml destilovan vody a su do konstantn vhy pi 105oC. 3. Tot prove i s nezaokovanm mediem. 4. Vypotej suinu bunk a zkoriguj ji o suinu nezaokovanho media. Vsledek pepoti na 1 ml fermentovan suspenze. Poznmka : U stacionrnch kultur plsn se vtinou stanovuje suina cel koovit vrstvy (deky), vyrostl na povrchu tekutho media. Vpoet se provd na 1 g plsn. Strana128 Stanoven bunn suiny suspenze filtrac Vzorek fermentovanho media, vzorek nezaokovanho media, 2 filtran Stanoven bunn suiny suspenze vkov Promyt suspenze mikroorganism, hlinkov venka, ppadn

s kemennm pskem a s krtkou sklennou tyinkou, pipeta, infra-lampa, surna.

kelmky (S-4 pro kvasinky a plsn, G-5 pro bakterie), odsvaka, vvva.

2.

Stanoven bunn suiny z objemu bunn hmoty Pro rychl orientan stanoven prstk bunn hmoty ve fermentovan

kapalin je mon pout centrifugan stanoven objemu vznikl bunn hmoty. K tomuto elu pouvme centrifugan kyvety dole zakonen zkou kalibrovanou trubikou. Kalibran kivka, tj. stanoven suiny bunn hmoty, se provd paraleln vkovou metodou, a to filtrac fermentovan kapaliny. Pi stanoven objemu objemu bunn hmoty je teba zachovvat stle stejn centrifugan podmnky (tj.poet obrtek/min, vzdlenost od osy rotace a dobu centrifugace). 3. Turbidimetrick stanoven bunn suiny Pro stanoven bunn suiny, ppadn potu bunk, meme pout spektrfotometrick stanoven zkalu. Pi tto metodzjiujeme, kolik svtla bylo pohlceno (absorbovno) zakalenm roztokem. Mezi intenzitou dopadajcho svtla prochzejcho suspenz plat vztah, kter je obdobou Lambert-Beerova zkona v kolorimetrii :

log

= kdc ,

kde I intenzita svtla po projit roztokem nebo suspenz, Iointenzita svtla po projit irm mediem, k konstanta, kter zvis na pstroji a turbidimetrickch podmnkch, d tlouka turbidimetrick kyvety , c koncentrace suspendovanch stic

log spektrofotometr.

..absorbance A (dve extinkce). Tuto hodnotu pmo poskytuje

Men se mus provdt pi optimln vlnov dlce, obvykle v rozmez 640-650 nm. Uveden rovnice plat pouze v uritm rozmez absorbance, v ppad turbidimetrie 0,05 a 0,25, kdy je A pmomrn koncentraci suspendovanch stic.

Strana129

Tuto metodu pouvme pro suspenze mikroorganism v destilovan vod nebo v irch svtlch kapalnch pdch. Vedle stanoven suiny ji meme pout tak pro piblin stanoven potu mikrobilnch bunk. Metoda je mn citliv ne nefelometrie. Minimln koncentrace zjistiteln turbidimetri je 107 bakterilnch bunk/ml. Kalibran kivku pipravujeme na zklad vkovho stanoven suiny. Uv se pro rychl men seriovch analys pi biochemickch pracech, pi stanoven rstovch kivek ap. Cv.6.16 Poteby : Turbidimetrick stanoven bunn suiny Suspenze mikroorganism v destilovan vod, nezaokovan medium (pro

men), pipety, zkumavky, spektrofotometr, poteby pro stanoven suiny (kap.7.2.4.2) nebo pro pm mikroskopick potn, bunk. Proveden : 1. Mikrobiln suspenzi nae destilovanou vodou nebo ivnou pdou tak, aby absorbance pi optimln vlnov dlce byla maximln 0,30. Hodnota 0,30 je ji nevhodn! 2. V takto naedn suspenzi stanov koncentraci, a to stanovenm bunn suiny v 1 ml, pipadn stanov poet bunk. 3. Mikrobiln suspenzi dle naedestilovanou vodou (nebo irm svtlm mediem), a to v pomrech 4:1,3:2,2:3 a 1:4. 4. U takto naednch roztok vetn nezaokovanho media zm absorbance. Kalibran pmku sestroj tak, e na osu seek nanese mnostv bunn hmoty (nebo poty bunk) a na osu poadnic pslun absorbance.. 5. Stanov absorbanci vzorku. Pesahuje-li hodnotu 0,30, ze vzorek pslunm medie tak, aby hodnota absorbance byla ni ne 0,30. 6. Z kalibran pmky zjisti koncentraci suiny nebo poet bunk, psluejc k nalezen absorbanci. Vsledek pepoti naa1 ml pvodnho vzorku. Kontroln otzky ke kap.6 ZJIOVN POTU MIKROBILNCH BUNK V PROSTED 1. Jak mete zjistit poet mikrobilnch bunk v prosted ? Kter z tchto metod je nejrychlej ? Kter je nejuniverzlnl ? Kter metody jsou vhodn pro stanoven potu ivch bunk ? Strana130

2. Kter metody se pouvaj pro hust suspenze bunk a kter pro mikrobiologicky ir roztoky ? 3. Jak jsou rozdly mezi nefelometrickou a turbidimetrickou metodou ? 4. Kdy a jak provdme vkov stanoven suiny bunk ? 5. Kter jsou vhody a nevhody kultivanch metod ? 6. Pro pi hloubkovm okovn do misek temperujeme agarov pdy na 45oC ? 7. Kter faktory ovlivuj velikost koloni u deskovch metod ? 8. Pro u deskovch metod vyhodnocujeme pouze desky ivnho agaru obsahujc 30300 koloni a diagnostickch agar obsahujc pouze 15-150 koloni ? 9. Jak je poet mezofilnch bakteri/ml, jestlie : a) 0,5 ml vzorku poskytlo 425 a 460 koloni a 0,05 ml poskytlo 73 a 78 koloni na deskch b) 0,5 ml vzorku poskytlo 280 a 293 koloni a 0,05 ml poskytlo 33 a 37 koloni na deskch ? 10) Jak jsou principy stanoven koliformnch bakteri ? 11) Jak zjiujeme sporotvorn bakterie ? 12) Jak zjiujeme poet mikroorganism na povrchu pedmt ? 13) Kdy pouvme filtran metody a kdy stanoven MPN ? 14) Zjistte z tabulky MPN (v 1 g vzorku) pro ti paraleln kultury pi potu pozitivnch kultur a) 3,2,0 a inokulu 10 g, 1 g a 0,1 g vzorku nebo 10 mg, 1 mg a 0,1 mg vzorku b) 3,3,2,0,1 a inokulu 10 g, 1 g, 0,1 g, 0,01 g a 0,001 g vzorku.

Strana131

7.

SLEDOVN RSTU MIKROORGANISM Sms mikroorganism rznch druh, velikost a tvar, kterou nachzme v jed-

notlivch typech ivotnho prosted pedstavuje smsnou populaci, kter je adaptovan na dan podmnky. Rst smsnch populac je ovlivovn mnoha faktory a jeho studium je zna-n nron. Rozvoj mikrobiologie byl podmnn studiem istch kultur, tm rozumme populace vznikl z jedin buky. Tato technika umouje studium biochemickch a fysiologickch vlastnost sledovanho mikroorganismu. Tekut kultura mikroorganism po penosu do erstvho tekutho media zahajuje svj rst a dlen. Tento rst m sv zkonitosti a neprobh stle rovnomrn. Je zvisl na mnostv a dostupnosti ivin v kultivanm mediu, tvorbou metabolickch zplodin (organick kyseliny). U aerobnch mikroorganism k tomu pistupuje dostaten provzdunn media, nebo v nedostatku kyslku nerostou. Rst bakteriln kultury lze rozlenit do nsledujcch rstovch fz: 1. Ppravn fze, neboli lag fze, bhem tto fze se buky nedl a probh adaptace na nov prosted. Dlka lag fze je dna mnostvm a velikost zmn, kterm se buky mus pizpsobit (teplota, zdroj C, zdroj N apod.). 2. 3. 4. 5. 6. Dle nsleduje fze zrychlenho rstu, kdy se ji buky ponaj dlit postupn se zvyujc se rychlost a se zkracujc se generan dobou. Exponenciln neboli logaritmick (log) fze, je charakterizovan exponencilnm prstkem biomasy a nejkrat generan dobou. Bhem fze zpomalenho rstu kles rychlost rozmnoovn bunk. Ve stacionrn fzi je prstek a bytek bunk v rovnovze, take celkov poet bunk bhem tto fze je stejn. Ve fzi postupnho umrn poet bunk kles a buky se ji pestvaj rozmnoovat. Grafick znzornn tchto proces je rstov kivka. Prstek potu bunk a biomasy lze sledovat mnoha zpsoby : Rostou-li bakterie v irm mediu, pak je Strana132

nejjednodu mit zmnu optick density ( OD) na spektrofotometru obvykle v rozmez od 600 do 650 nm. Dal zpsob je men prstku suiny sledovan kultury, kdy standardn objem kultury se pefiltruje pes vhodn filtr, promyje a vysu. Rovn je mon pm potn bunk (plat pro kvasinky) v potac komrce, nebo kultivan des-

Schma rstov kivky mikroorganism

Stacionrn fze Mnostv biomasy Log - fze Zpomalen rst

Zrychlen rst Lag - fze

Degradan fze - postupn odumrn

as

kov metoda. Pro suspenzn media se uplatuj alternativn postupy : Men pH nebo prstek obsahu protein na jednotku objemu. Z uvedenho schmatickho grafu je zejn, e z hlediska rychlosti rstu je optimln log-fze, proto je tto fzi vnovna nejvt pozornost. Pi sledovn rstu mikroorganism se ukzalo, e jsou velmi dleit tyto charakteristiky : Doba zdvojen T, rstov rychlost . Pro jejich obecn odvozen vyneseme si rstovou kivku a po zatek stacionrn fze, jak ukazuje nsledujc schma, tj. osa Y je logaritmick a na osu X vynme ekvidistann as : dx = x dt Rst populace bakterilnch bunk lze sledovat, je-li rostouc kultura bunk ve vyvenm stavu. Experimentln bylo zjitno, e je-li tato populace v ustlenm stavu a v log-fzi, pak mnostv biomasy dan populace nebo prmrn hodnoty vech bunk dobe spluj rovnici :

Strana133

Schma rstov kivky mikroorganism II

Log - fze
Mnostv biomasy (log)

as

(1)

Konstanta mrnosti je mra rychlosti rstu a je souasn specifickou rychlost rstu, tj. rychlost rstu vztaenou na jednotkovou promnnou x, jak plyne z uvedenhovztahu (1) :

1 dx x dt

eenm rovnice (1) je zvislost promnn x na ase, kdy x0 je koncentrace v ase 0 a x je koncentrace v ase abychom :

ln xln x0 = t (2)

Strana134

ln

=t

(3) (4)

x = x0e t

Ze vztahu (4) vidme, e promnn x je exponenciln funkc asu t. Podle vztahu (3) je logaritmus podlu okamit koncentrace x k poten koncentraci x0 je linern funkc asu, a proto bv tato fze rstu mikroorganism oznaovna log-fze. Mru rychlosti rstu meme lpe vyjdit ze vztahu (2) :

=
Dobu zdvojen T zskme ze vztahu (3) dosazenm x = 2x0 a t = T : ln 2 = T a odtud
T = ln 2 / = 0,693/

(5)

(6)

Jeliko v jedn generaci z kad matesk buky vznikaj dv buky dcein, meme tak dobu zdvojen oznait jako dobu generan. Pak meme vypotat poet prmrnch rostoucch generac z doby zdvojen. Jeliko :

t=nT
kde n zna poet prmrnch rostoucch generac. Potom :

(7) Tyto vztahy plat, kdy podmnky rstu mikroorganism jsou dny chemicky definovanmi medii, v nich kad fyziologick role kad sloeniny je definovna a naopak kad fyziologick role je zastoupena jednou sloueninou. Tak nap. je-li jednm z cukr glukosa, pak v ppad pdavku laktosy nebo galaktosy, arabinosy, maltosy aj. vznik pi men rstu kivka sloen ze dvou rstovch kivek, oddlench mezi sebou asovou prodlevou (diaxick lag-fze). Tento jev se nazv
diaxie. Poprv byla diauxie popsna Monodem za podmnek, kdy v minerlnm mediu

byly souasn dva zdroje uhlku a energie. Diauxie je vyjdenm regulanch mechanism zajiujcch economii buky v ptomnosti dvou ivin se stejnou funkc. Strana135

Cv.7.1

Stanoven rstov kivky u kvasinek pmm potnm bunk

Poteby : 48 h star kultura Saccharomyces cerevisiae v tekut sladin (pda . XY), 500 ml baky se 100 ml sladiny, steriln 10 ml pipety, 1 % vodn roztok methylenov modi. Proveden : 1. Baku se sladinou zaokuj 10 ml erstv kultury S. cerevisiae, dkladn promchej, odeber asepticky vzorek a spotej v nm pomoc Brkerovy komrky poet mrtvch a ivch bunk (po obarven roztokem methylenov mode). Inkubuj baku pi 28 oC na tepace. 2. 3. 4. 5. Odebrej vzorky po 1,5 h a potej mrtv a iv buky v suspenzi. Sestroj rstovou kivku : osa x = as (v hodinch), osa y = logaritmy potu ivch a mrtvch bunk. Tot prove za statickch podmnek, tj. baka nen tepan, ale inkubovan v ter-mostatu. Porovnej ob rstov kivky a spotej v jednotlivch intervalech rstu generan dobu ( t ), specifickou rstovou rychlost ( ), dobu lagu a rstov lag (1 ) a ( L ) za pouit rovnic uvedench ve (rovnice 1 a 7). Cv.7.2
Stanoven rstov kivky u bakteri spektrofotometricky

Poteby : kultura Escherichia coli v LB mediu (pda . XY), Erlenmayerova baka objemu 250 nebo 300 ml se 100 ml bujonu ( mono i LB pda), steriln pipety 10 a 1 ml, spektrofotometr. Proveden : 1. Zm absorbanci narostl kultury E. coli pi 650 nm proti vod. Ped menm nae vzorek vodou 1 : 10 (aseptick odbr). Absorbance takto naednho roztoku by mla mt hodnotu v rozmez 0,1 0,25 . Pi hodnotch mn ne 0,1 odeber dal vzorek (asepticky) a nae 5x. 2. 100 ml ivn pdy naokuj pomoc pipety tak, aby poten absorbance byla piblin 0,1. Potebn mnostv inokula jsi zjistil pedchozm menm. Nap. byla.li pi edn 1 : 10 absorbance 0,1, pak k naokovn 100 ml pdy pouij 10 ml tekut kultury; pi jinch hodnotch absorbance si potebn mnostv inokula

Strana136

vypotej pmou mrou, tak aby vchoz OD pokusn baky nepesahovalo hodnotu 0,2. 3. 4. Zkontroluj vchoz absorbanci v bace, zapi ji do seitu jako hodnotu v ase 0 a upevni baku na tepaku a inkubuj pi 37 oC. Vzorky odebrej asepticky (vdy novou steriln pipetou) v 30 minutovch intervalecha m absorbanci pi 650 nm. Doshne-li absorbance hodnot 0,5, pi nsledujcm men zani vzorek edit vodou. Do seitu zapisuj hodnoty absorbance vynsoben pouitm ednm. 5. Sestroj rstovou kivku osa x = as (v hodinch), osa y = logaritmus absorbance kultury. Vypotej specifickou rstovou rychlost, podle rovnice 5, generan dobu
t v exponenciln fzi, dobu lagu a rstov lag (1 ) a ( L ) za pouit rovnic

uvedench ve ( rovnice 1 a 7). Cv.7.3

Stanoven diauxie u Escherichia coli

Potebn: kultura Escherichia coli v LB mediu (pda . XY), Erlenmayerova baka objemu 250 nebo 300 ml se 100 ml bujonu ( mono i LB pda), 2 % steriln roztok glukosy, 2 % steriln roztok laktosy, steriln pipety 10 a 1 ml, spektrofotometr. Proveden: 1. Zm absorbanci narostl kultury E. coli pi 650 nm proti vod. Ped menm nae vzorek vodou 1 : 10 (aseptick odbr). Absorbance takto naednho roztoku by mla mt hodnotu v rozmez 0,1 0,25 . Pi hodnotch mn ne 0,1 odeber dal vzorek (asepticky) a nae 5x. 2. Do baky se steriln pdou pidej asepticky po 5 ml od kadho roztoku cukru. Takto se zv objem media na 110 ml. Pidej inokulum tak aby vsledn optick densita dosahovala hodnoty cca 0,1 (OD 650 nm). 3. 4. Zkontroluj vchoz absorbanci v bace, zapi ji do seitu jako hodnotu v ase 0 a upevni baku na tepaku a inkubuj pi 37 oC. Vzorky odebrej asepticky (vdy novou steriln pipetou) v 30 minutovch intervalecha m absorbanci pi 650 nm. Doshne-li absorbance hodnot 0,5, pi nsledujcm men zani vzorek edit vodou. Do seitu zapisuj hodnoty absorbance vynsoben pouitm ednm. 5. Sestroj rstovou kivku osa x = as (v hodinch), osa y = logaritmus absorbance kultury. Vypotej specifickou rstovou rychlost, podle rovnice 5, generan dobu
t abychom v exponenciln fzi, dobu lagu a rstov lag (1 ) a ( L ) za pouit

Strana137

rovnic uvedench ve ( rovnice 1 diauxickho lagu.

a 7). Rovn odeti z grafu dlku

Kontroln otzky ke kap.7 SLEDOVN RSTU MIKROORGANISM

1. Kter znte rstov fze ? 2. m je charakterizovan exponenciln fze ? 3. Jakmi zpsoby je mono stanovit rst mikrobilnch kultur ? 4. Definujte generan dobu, jakm zpsobem ji urte ? 5. Jak se mn generan doba mikroorganism v prbhu rstu, v jak fzi rstu je nejkrat ? 6. Co je doba lagu a m je jej dlka ovlivnna ?

Strana138

8.

ZKLADN GENETICK PRCE

Genetika se zabv mechanismy jimi jsou pedvny ddin rysy jednoho organismu na jin. Tchto poznatk lze vyut v medicn, prmyslu a zemdlstv. Pochopen genetickch mechanism umonilo manipulovat mikroorganismy a pipravit nov druhy. Byla pipravena cel ada produknch mikroorganism, kter jsou vyuvny v biotechnologick vrob rznch organickch ltek. Aplikace vzkum vedly k monosti kontroly nkterch nemoc. Dleit je tak aplikace genetickch metod v prenatln diagnostice. Nsledujc lohy se zabvaj monostmi zmny ddinho materilu mikroorganism.

Strana139

8.1

Mutace

Mutace je nhl a trval zmna genetickho materilu, kter nen vyvolna rekombinac. V souasn dob existuje cel ada mutagen jejich mechanismus psoben je znm. Volbou vhodnho mutagenu lze tedy regulovat typ mutace a tm i rozsah psoben. Mutageny psob na rznch mstech vznik cel kla zmnnch mikroorganism. Pro zskn jednotlivch geneticky zmnnch kmen je tedy nutn izolovat vhodn mutanty od pvodnho standardnho kmene. Je nutno poznamenat, e mutagenn inek bv zpravidla nzk a standardn kmen pedstavuje i po mutagennm zsahu populaci o nkolik d etnj ve srovnn s mutanty. Obecn lze rozdlit mutace na ty jejich projev lze i nelze vyut pro selekci. Pkladem mutant kter nen mon selektovat je zmna morfologie nebo barvy bunk. To znamen, e mutant nen zvhodnn oproti standardnmu kmeni a nelze tedy vyut selektivnch podmnek pro jeho pomnoen na kor pvodnho nezmutovanho kmene. V tomto ppad nezbv ne testovat velk mnostv jednotlivch kolonie izolovanch z agarov pdy. Pkladem mutace ji lze selektovat, je zskn resistence k ltce toxick pro standardn kmen (nap. antibiotikum, tk kov atd.). V pd obsahujc danou toxickou ltku lze zcela eliminovat pvodn kmen.
8.1.1 Stanoven rychlosti spontnnch mutac

Pro posouzen stability pouvanch kmen i pro indukce mutant je uiten stanovit nchylnost pslunho kmene k mutacm. Pi biotechnologickch aplikacch se jedn pedevm o zjitn stability urit poadovan vlastnosti a v tomto ppad se sleduje fenotypov projev kmene a zmna fenotypu v dsledku mutac. V nkterch ppadech lze pout selekce nap. resistence k antibiotikm, toxickm analogm metabolit nebo meziprodukt metabolismu nebo ke zven i snen teplot a revertant auxotrofnch mutant. V tchto ppadech lze okovat dov 107 bunk na Petriho misku, z nich zeteln kolonie (obvykle du 101 na jednu misku) vytvo pouze buky sledovanho, dominantnho fenotypu. Ostatn buky bu nerostou vbec nebo vytvej velmi mal kolonie co se pi zmnn masivn inokulaci projev jako slab zeteln zbytkov nrst po celm povrchu misky. Zpravidla je vak teba vyhodnotit zmnu projevujc se metabolickmi odchylkami, zmnou morfologie. asto jsou pouvny diagnostick pdy. Strana140

Mutace mohou vznikat i bez zjevnho vnjho zsahu. Takovto tzv. spontnn mutace nejsou ast a jejich vskyt se pohybuje v du 10-7 10-10 mutac na jednu buku a jedno bunn dlen. Existuj vak nestl geny, nchyln k mutacm, u nich me bt innost tchto mutac a 10-2 mutac na jednu buku a jedno bunn dlen. Frekvence spontnnch mutac je zvisl na povaze sledovanho genu i na celkov genetick vbav buky tj. jejm genotypu. Zjiovn revertant k prototrofii je jednoduch metoda zaloen na snadn detekci mutant. V ppad bakteri se pouv minimln agar s glukosou jako zdrojem uhlku u kvasinek se pouv minimln agar obsahujc vitaminy. Msto sloit ppravy ivn pdy pro kvasinky se pouvaj smsi rstovch ltek a ivin v nich chyb sledovan ltka nap. aminokyselina (nap. Dicfo Yeast Nitrogen Base without Amino Acids). Pro plsn rod Penicillium a Aspregillus se jako minimln ivn pda vtinou pouv Czapek-Doxv agar. Pro zjitn mutant resistentnch k inhibitorm se pouvaj vedle minimln pd i bohat ivn media (nap. masopeptonov agar (pro bakterie) nebo kompletn agar pro kvasinky a plsn. U mutant resistentnch k inhibitorm mitochondriln aktivity tj. resitence k chloramfenikolu, erythromycinu, oligomycinu, mucidinu atd. se pouv glycerolov agar. Dvodem je fakt, e glycerol jakoto nezkvasiteln zdroj uhlku indukuje aerobn respiraci. Mezi mutanty detekovateln bez selekce nle nap. zjiovn auxotrofnch mutant, respiran deficitnch mutant, mutant se zmnou morfologie koloni (nap. R-mutanty, tvoc drsn kolonie nebo mutanty u nich dolo ke zmn barvy nap. nkter mutanty S. cerevisiae s pokozenou syntzou adeninu, je tvo rov kolonie).
8.1.2 Zjiovn auxotrofnch mutant

Auxotrofn (vivov, z lat. auxilium pomoc) mutanty maj pokozen nkter z gen kontrolujcch syntzu urit aminokyseliny, base nukleovch kyselin (u kvasinek adeninu i uracilu, u bakteri tak thyminu) nebo vitaminu. Z tchto dvod auxotrofn mutanty nerostou na minimlnch pdch, kter tyto ltky esenciln postrdaj. Vhodn je pomnoen populace auxotrof na kor prototrof. K tomu lze vyut antibiotik psobch pouze na rostouc buky (nap. penicilin u bakteri a nystatin, amfotericin nebo jin polyenov antibiotikum u kvasinek a plsn). Tato antibiotika se aplikuj do minimlnho media v nm rostou pouze pvodn tj. prototrofn kmeny. Tyto jsou antibiotiky usmrcny a pevaj nerostouc auxotrofn Strana141

mutanty. Aby bylo zabrnno riziku pokozen auxotrof v dsledku zbytkovho rstu za vyuit energie z vnitrobunnch reserv, je nutno buky nejprve vyhladovt na minimlnm mediu bez antibiotika. Metody pro zjitn frekvence spontnnch mutac jsou zaloeny na nkolika zjednoduujcch pedpokladech. Jednm z nich je pedpoklad, e mutanty rostou v pouitm mediu stejnou rstovou rychlost. Proto se zpravidla pro analzu danho kmene pouv porovnn vsledk nkolika metod. V principu se jedn vdy o statistick vyhodnocen frekvence vskytu mutant danho typu. To znamen, e mus bt snadno zjistiteln zmna fenotypu zpsoben mutac. Cv.8.1 Poteby :
Zjitn bakterilnch auxotrof

Suspense bunk E. coli (nap. po UV mutagenesi), 100 ml Erlenka s 15

ml steriln minimln pdy (pda . ) obsahujc 100300 jednotek penicilinu/ml, 5 ml steriln minimln pdy (pda . ) pro vyhladovn na dusk. Proveden : 1. Tikrt promyjte suspensi bunk fysiologickm roztokem. 2. Inkubujte 0,1 ml suspenze v 5 ml minimlnho media bez dusku za tepn pi 37C po dobu 12 h. 3. Pevete 0,1 ml takto vyhladovl kultury do 15 ml stejn minimln pdy s penicilinem a inkubujte za tepn pi 37C. 4. Po 12, 18 a 24 h odeberte asepticky po 4 ml kultury odstete pi 4 000 g a peletu resuspendujte v 7 ml sterilnho fysiologickho roztoku a znovu odstete. Promyjte takto buky jet dvakrt a zskan buky resuspendujte ve 4 ml sterilnho fysiologickho roztoku. 5. Pipravte srii edn tak abyste na misky obsahujc pedsuen masopeptonov agar okovali cca 30300 bunk. 6. Inkubujte 2448 h pi 37C. 7. Misky obsahujc 30 100koloni pouijte pro otisk na pedsuen minimln agar v Pet-riho miskch. Nejprve je teba pesn oznait fixem na dn orientaci tto misky. Stejnm zpsobem oznate i misky na n budete otiskem penet kolonie. 8. Pak vatou ovlhenou ethanolem otete replikan blok (Obr ) a oehnte jej. Pomoc oehnut pinsety peneste na blok steriln samet a ethanolem oten prstenec pro fixaci sametu (Obr. ) ppadn sterilnho filtranho papru.

Strana142

9. Otevenou misku s koloniemi peklopte na samet tak, aby oznaen bod na kraji dna misky souhlasil s bodem na replikanm bloku. Misku lehce pitisknte a mrnm poklepem na dno otisknte kolonie na samet (Obr. aby sti agaru nezstaly na sametu. 10. Stejnm zpsobem pitisknte na samet obsahujc kolonie oznaenou misku s minimlnm agarem. Takto inokulovanou misku inkubujte 24h pi 37C. 11. Dobe izolovan kulat kolnie peneste z misek obsahujcch vce ne 100 koloni sterilnmi prtky na Petriho misky obsahujc : a) minimln agar b) masopeptonov agar 12. Porovnnm nrstu na miskch s minimlnm a masopeptonovm agarem zjistte, kter kolonie rostou pouze na masopeptonovm agaru a vyaduj tedy pomocnou ivinu. 13. Vybran auxotrofn kolonie peokujte na ikm MPA pro uchovvn a ppadn dal testovn.
Obr. Replikan blok pro otisk koloni

). Misku opatrn sejmte tak,

Strana143

Obr. Pichycen sterilnho sametu do replikanho bloku

Obr.Otisk koloni

Obr. Otitn kolonie na sametu

Strana144

8.1.2.1

Zjitn prmrnho potu mutant hledanho typu

Tato metoda je zaloena na stanoven prmrnho potu mutant, piem se k ana-lze pouvaj velk srie paralelnch kultur, v nich jsou potny kolonie se zmnnm fenotypem. Mutan rychlost a se pak vypote dle vzorce: r=

a N a N C ln ln 2 ln 2

kde

r = prmrn poet mutant v kultue (nebo v jejm analyzovanm podlu) N = prmrn poet bunk v kultue (nebo v jejm analyzovanm podlu) C = poet analyzovanch vzork Mutan rychlost a se e iteranm postupem (postupnm dosazovnm a).

Ppadn je mon odhadnout mutan rychlost a, pokud znme podl kultur, kter neobsahuj dan mutanty :
ln P0 2 , N

a=
kde .
8.1.2.2

P0podl kultur, kter neobsahuj dan mutanty N prmrn poet bunk v kultue na konci rstu
Zjitn potu mutant hledanho typu v jedin kultue

V tomto ppad je nutn pout dostaten mnostv inokula tak, aby bylo mon detegovat nkolik mutant ji po prvnm bunnm dlen. Za tchto podmnek je metoda velmi dobe reprodukovateln. Velikost inokula zvis na hodnot sledovan mutan rychlosti a pro mutan rychlost 10-8 mutac na jednu buku a jedno bunn dlen je poteba inokulum, alespo 5 x 108 bunk. Odpovdajc objem kultury by v tomto ppad mel bt cca 300 ml. Pro inokulum je teba volit kultury s co nejmenm potem sledovanch mutant. Pro stanoven se pouv zpravidla 510 paralelnch vzork, kter se inkubuj za optimlnch podmnek do stacionrn fze a pot se v kad kultue stanov celkov poet bunk a poet mutant. Pro kadou kulturu se vypote mutan rychlost podle vzorce :

Strana145

 r r 2 2 1 ln 2 N 2 N1 a= , n kde r1 poet mutant v inokulu N1 celkov poet bunk v inokulu r2 poet mutant po ukonen rstu N2celkov poet po ukonen rstu n poet generac rstu a vzpote se ye vytahu : nln2 = lnN2lnN1 Konenm vsledkem je prmr mutanch rychlost zjitnch v jednotlivch kulturch.
8.1.3 Indukce mutac

Indukce mutant s jejich nsledujc selekc pedstavuje zkladn postup pi lechtn mikroorganism, nebo pi n zskvme nov znaky a vlastnosti, kter pak dalmi genetickmi postupy (viz tab. x) kumulovat s jinmi znaky. Tabulka x
Pehled genetickch postup pouvanch pi lechtn prmyslovch mikroorganism Genetick postup Pouit u mikroorganism el 1. indukce a selekce haploidnch vzcnji vytvoen novch mutant u diploidnch znak 2. ken a rekombinace : a) hybridizace se sexulnm cyklem (tj. kumulace u askomycetnch a bazidionkolika mycetnch kvasinek a plsn) mutac b) parasexuln gramnegativnch bakteri, do jedinho ken aktinomycet a plsn jedince c) fuze protoplast vech krom gramnegativnch

meme penet do jinch jedinc a

d) rekombinace virulentnch fg tho bakteriofg hostitele 3. penos izolovan DNA a) transformace grampozitivnch bakteri a kvasinek b) pouit vektor: transdukce a trans- gramnegativnch kvasinek I. fekce II. sex-dukce gramnegativnch bakteri III. transformace bakteri (hlavn gramnega-

penos uritch gen do recipientn buky

Strana146

umlmi vektory tivnch) a kvasinek Vtina mutagen psob tak, e vyvol tzv. primrn pokozen (neboli lze) DNA, kter podlhaj vnitrobunnm enzymovm opravnm procesm, pracujcch s rznm stupnm pesnosti. Pro zven innosti mutagenu je nutno volit takov
experimentln podmnky, kter zvhoduj nepesn pracujc opravn procesy. Nap.

alkylan inidla aplikujeme za rstovch podmnek, nebo jsou nejinnj v replikan vidlice DNA. UV svtlo aplikujeme jen pi slabm ervenm svtle a tak kultivaci po jeho aplikaci provdme za tmy, aby nedolo k fotoreparaci vzniklch pyrimidinovch dimer. Pi tom se sname zajistit co nejdve maximln rychlost rozmnoovn bunk, aby byla zvhodnna nepesn pracujc poreplikan oprava sek DNA, obsahujcch dimery, oproti pomrn pesn pracujc excisn oprav, fungujc jen u nereplikuj se DNA. Pro lechtn prmyslovch kmen mikroorganism volme vtinou mutageny vyvolvajc bodov mutace ( UV svtlo, alkylan inidla, kyselina dusit), pro zskn rozshlch zmn na mimochromozomln DNA (a k jejmu plnmu odstrann) volme interkalan inidla (akridinov barviva, ethidiumbromid) za rstovch podmnek. Ionizan zen (paprsky, Xpaprsky) zpsobujc pevn chromozomov mutace a mitotick rekombinace, take jsou vhodn pouze k pokozen sexulnho rozmnoovn.
Celkov dvka mutagenu, je se rovn souinu intenzity (u zen) nebo

koncentrace (u chemickho prostedku) a doby psoben, se m volit tak, aby poet mutac dvou rznch gen v jedn buce byl co nejmen. Tm se vyhneme tomu, e by vedle mutace v doucm genu dolo jet k mutaci v dalm genu nebo genech, m by se vlastnosti buky zmnily nedoucm zpsobem. Pi pouit UV zen jsou z tohoto hlediska u haploidnch mikroorganism nejvhodnj takov dvky, je vedou k pevn 1040% bunk, u velmi innch alkylanch inidel (nap. nitrosomethylmoovina nebo nitrosoguanidin) pouvme koncentrace sniujc rychlost rozmnoovn o 1020%. Vtina mutac znamen ve sv podstat pokozen stvajcho genu, i kdy z biotechnologickho hlediska me mt pozitivn vznam. Protoe valn vtina pokozen gen je recesivn, je vhodn podrobit mutagenezi haploidn jednojadern buky (haploidn heterothalick kmeny kvasinek, haploidn jednojadern spory plsn a aktinomycet ap.).

Strana147

Protoe mutageny psob nhodn na rznch mstech DNA, musme ve zmutagenizovan suspenzi nebo kultue najt ty jedince, je maj zmutovan dan gen a maj proto poadovan fenotyp. I po psoben nejinnjch mutagen se dan zmutovan genotyp vyskytuje maximln 10-3, a proto je nutno mt vhodnou selekn a detekn metodu pro jeho zskn. Ped aplikac selektivnch podmnek, kter spovaj v inhibici nebo dokonce usmrcen bunk pvodnho fenotypu, je nutno umonit bukm, aby probhly poreplikan opravn procesy DNA, aby se tak vytvoil nov fenotyp na zklad zmnnho genotypu. K tomu je zapoteb alespo 25 dlen bunk za neselektivnch podmnek. Doba potebn ke vzniku no-vho fenotypu se nazv
fenotypov (nebo fenomov) lag a vtinou se u mikroorganism pohybuje v rozmez

14 bunnch dlen. Mutanty zskan po mutagenezi je nutno testovat na stabilitu. Pitom testujeme alespo 50 koloni zskanch nkterou makroskopickou kontrolovanou izolan metodou (viz kap.). Tento izolan postup a testovn je nutno v prbhu pasovn mutantu na ikmm agaru nkolikrt opakovat. Vedle trval mal stability mutant bez smyslu se objevuje asto jet vysok nestabilita nov zskanch mutant, take vtina z nich ztrat pln svou nov zskanou vlastnost ji po prvm peokovn. Z cvinch dvod uvedeme indukci revertant k prototrofii u bakteri a kvasinek.
8.1.3.1 Indukce mutant pomoc ultrafialovho zen (UV-svtla)

Pro zskn nkterch mutant se nkdy ozauj suspenze bunk a po jejich penesen na selektivn agarovou ivnou pdu v Petriho misce. Nevhodou tohoto postupu je, e nememe za stejnch podmnek sledovat letln inek pouit dvky UV-zen, a e na buky psob bhem kultivace tak sloueniny vznikl psobenm UV-svtla na ivnou pdu. Proto dvme pednost ozaovn nzk vrstvy suspenze bunk ve sterilnm pufru nebo ve steriln vod. Protoe UV-zen m malou pronikavost, mus bt suspenze bhem ozaovn mchan magnetickm mchadlem nebo mrnm pohybem podln tepaky. Maximln koncentrace bunk v tto suspenzi je u kvasinek a spor plsn 2107/ml a u bakteri 108/ml, aby si buky vzjemn pli nestnily. Dvky vedouc k pevn 50% bunk in u standardnch haploidnch kmen S.cerevisiae 30 Jm-2. U rod Rhodotorula a Rhodosporidium se pro indukci mutant pouv 200600 Jm-2. U bakteri bv pi vzdlenosti 2030cm doporuovna expozice 2080s. Mutanty, kter maj pokozen nkter z opravnch proces, Strana148

odstraujcch inek UV-svtla, jsou vak k tomuto zen mnohem citlivj. innost UV kles se tvercem vzdlenosti bunk od zdroje zen. Cv.8.2 Poteby :
Indukce mutant pomoc ultrafialovho zen

4 dny star tepan kultura haploidnho kmene Saccharomyces

cerevisiae, nesouc super-supresibiln alelu ade2-1, cca 250 ml sterilnho roztoku KH2PO4, 13 pesuench desek kompletnho agaru (pda . ), 12 pedsuench desek minimlnho agaru (pda . ), obsahujcho 1% kompletnho media (tj. 0,1 ml tekut pdy . na misku) pro zajitn 23 dlen auxotrofnch bunk, potac komrka, mikroskop, zahnut sklenn tyinka, kdinka s 96%nm ethanolem, pouzdro na Petriho misky, stopky, 2 steriln centrifugan kyvety obsahu 200 ml, steriln Erlenmeyerova baka obsahu 250 ml, steriln zkumavky s patentnm uzvrem, steriln dlen pipety (25 ml, 10 ml, 1 ml), 4 steriln vysok Petriho misky. Proveden : 1. Mikroskopisky zkontroluj kulturu, zda neobsahuje bakteriln kontaminaci nebo vysok procento pucch bunk. 2. Centrifugac za aseptickch podmnek zskej buky z kultury a dvakrt je promyj sterilnm M/15 KH2PO4. Promyt buky suspenduj v M/15 KH2PO4, aby se vytvoila mln zakalen suspenze. 3. Pomoc potac komrky zjisti hustotu tto suspenze (viz kap. ) a piprav 30 ml edn o koncentraci 2 x 107 bunk/ml. 4. Ke zdroji UV v temn komoe si pichystej vechny potebn vci (tj. zkumavky s 9 ml a 9,9 ml sterilnho fyziologickho roztoku, pipety, oznaen Petriho misky s pdami, vysok Petriho misky, pouzdro na Petriho misky, stopky, sklennou tyinku s alkoholem k roztrn atd.) 5. Do 4 sterilnch vysokch Petriho misek asepticky pipetuj po 5 ml suspenze bunk o koncentraci 2107 bunk/ml a za tepn postupn ozauj tyto suspenze pslunou dvkou zen. Doba ozaovn je 5, 10, 20 a 40s. Pesnou dobu ozaovn zajisti odkrytm sklennho vka z misky, v n je suspenze, a optnm pikrytm po uveden dob. Ozaovn i dal zpracovn vzorku provdj v zatemnn mstnosti pi slabm ervenm svtle a bhem ozaovn pouvej ochrann brle. 6. Kadou dvku suspenze zpracuj ihned po jejm ozen. Roztoky napipetovan na pedsuen desky ihned rozeti po povrchu desky zahnutou sklennou tyinkou, dobe oehnutou a ochlazenou na vnitnm vku a na nezaokovan pd. Strana149

7. Z kad dvky suspenze (vetn neozen!) pipetuj 0,1 ml.na 4 desky minimlnho agaru se stopami kompletnho media. Na kompletn agar pouvej tato zedn : Pi ozen 5 vtein : 0,2 ml 0,1 ml 9,9 ml 0,05 ml 1 ml 9,00 ml 0,1 ml = miska 5, = miska 5a, = miska 5b,

1,0 ml 9,0 ml 0,1 ml = miska 5c, pi ozen 10 vtein vyokuj jen zedn pro misky a a b (ozna. 10): pi ozen 20 vtein : 1 ml 9 ml 0,05 ml 1 ml 9,0 ml 0,1 ml 1,0 ml 9,0 ml 0,1 ml pi ozen 40 vtein : 0,05 ml neednho 0,1 ml neednho 1 9 0,1 ml na pesuen desky. Ozna 0a, 0b. 5. Vyokovan misky inkubuj v pevrcen poloze za tmy (tj. v pivenm pouzdru na misky) pi 28o30C 24 h, pak dal 23 dny bez pouzdra. Denn prohlej nrst. 6. Spotej kolonie kvasinek vyrostl na kompletnch agarech a zanes do tabulky prmr ze smrodatnch misek (tj. obsahujcch 30300 koloni) kad dvky zen a % peva-jcch bunk. Do grafu vynes log procenta pevajcch bunk proti dob ozaovn a zjisti tvar kivky pevn. 7. Spotej na minimlnch agarech kolonie o prmru vtm ne 1 mm a vsledky zanes do tabulky. Zjisti pro kadou dvku zen poet revertant na 106 pevajcch bunk a hod-noty zanes do grafu proti dvce zen (oboje v linern stupnici!). Poznmky : = miska 40a, = miska 40b, = miska 40c. = miska 20a, = miska 20b, = miska 20s,

Z neozen suspenze piprav stovkonm zpsobem zedn 10-4 a pipetuj 0,1 a 0,05 ml

Strana150

1. U bakteri je postup obdobn, ale pouit pdy jsou masopeptonov agar (pda . ) pro zjitn pevn a minimln agar (pda . ) a 1% masopeptonovho bujon pro zjitn revertant, a jako kultivan teplota se vol teplota optimln pro uveden druh (nap.37C pro E.coli). Ozaovn se zde provd v pufru o pH 7,0. 2. Letln inek UV stoup exponenciln s dvkou zen, take bychom pi semilogaritmickm vynesen procenta pevn mikrobilnch bunk mli dostat pmku. Protoe vak vy dvky zen pokozuj opravn procesy, dochz k odklonu od linearity a teprve pi dalch dvkch nastupuje opt linern prbh, ale mnohem strmj (pln inaktivace opravnch proces).
8.1.3.2 Indukce mutant pomoc dusit kyseliny

Kyselina dusit pat mezi velmi inn a snadno dostupn chemick mutageny. Mutagenn psob v siln kyselm prosted (pH 3,84,4), a to i za nerstovch podmnek. To je jej velkou vhodou, nebo pi tomto kyselm pH se ji vtina mikroorganism neme rozmnoovat. Protoe je v roztoku nestl, pipravuje se roztok alkalickch dusitan v destilovan vod tsn ped pouitm a psob se jm na promyt buky suspendovan v acettovm nebo citrtovm pufru o pH 4,04,5. Pouvan dvky jsou: u Saccharomyces cerevisiae konen koncentrace HNO2 0,20,4% a psoben 2030 min., u Schizosaccharomyces pombe 0,10,2% po dobu 35 min a u bakteri nap. 0,080,1% po dobu 1020 min. Cv.8.3 Poteby :
Indukce mutant pomoc dusit kyseliny

promyt suspenze bakteri E. coli (trp-) v 0,2 M citrtfosftovm pufru o pH

4,4 obsahujc 108 bunk/ml, dusitan sodn, steriln 0,2 M fosftov pufr o pH 7,2, pedsuen desky masopeptonovho agaru (pda . ) a minimlnho agaru (pda . ) s 1%MPB pro umonn 23 bunnch dlen, zahrnut sklenn tyinka, ethanol, steriln centrifugan zkumavky objemu 200 ml, centrifuga, steriln Erlenmeyerovy baky objemu 100 ml, steriln fyziologick roztok, steriln dlen pipety 10 ml a 1 ml. Proveden: 1. Na analytickch vahch nava do steriln Erlenmeyerovy baky dusitan sodn a tsn ped jeho pouitm k nmu pedej takov mnostv steriln vody, aby vznikl 3,45% n roztok (=0,5 mol/litr).

Strana151

2. Do steriln Erlenmeyerovy baky pipetuj asepticky 13 ml citrtfosftovho pufru, 1,5 ml suspenze bunk a 0,5 ml dusitanovho roztoku a baku tepej ve vodn lzni pi 37C. 3. Po 5, 10 a 20 min odeber 4 ml tepan suspenze do centrifagan zkumavky, pidej 150 ml vychlazenho fosftovho pufru o pH 7,2 (=ukonen psoben HNO2), promchej a buky odste. 4. Po slit irho roztoku pelij buky v kyvet dalm podlem vyhlazenho pufru, promchej a odsteuj. Po slit it kapaliny zbyl buky sespenduj do 4 ml fosftovho pufru a vyokuj po 0,1 ml na pesuen minimln agar. Souasn prove destkovm zpsobem 103 a 104-nsobn zedn promyt suspenze a vyokuj po 0,3 a 0,05 ml na pesuen desky MPA. 5. Krom toho vyokuj podobnm zpsobem i pvodn suspenzi, pouvanou k pokusu, jen s tm rozdlem, e na masopeptonov agar bude okovat 0,1 a 0,3 ml zedn 105-nsobnho. 6. Inkubuj vechny misky 12 dny pi 37C. Zjisti poet koloni na miskch MPA a minimlnho agaru a pepotej na 1 ml needn suspenze. 7. Zjisti frekvenci revertant nevyadujcch tryptofan (vztaeno na 106 pevajcch bunk) v pvodn suspenzi a v sus-penzch zskanch v jednotlivch asovch intervalech a zanes do grafu proti dob psoben dusit kyseliny. 8. Souasn zakresli zvislost log procenta pevn bunk na dob psoben mutagenu. Zjisti, kter doba psoben poskytuje nejvy frekvenci mutant a kter poskytuje nejvt poet mutant na miskch (tj. nejvt vtnost mutant).
8.1.3.3 Indukce mutant pomoc alkylanch inidel za rstovch podmnek

Nejinnjmi mutageny mezi alkylanmi inidly jsou nitrososloueniny, nap. nitrosoguanidin (tj. N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin) nebo nitrosomethylmoovina, kter jsou vak siln kancerogenn, take se s nimi mus pracovat velmi opatrn (za pouvn automatickch pipet a v prostorch s dobe fungujcmi odtahy, nebo inn sloka je tkav). Mn inn je nap. ethylmethansulfont, kter vak nen kancerogenn. Ale i zde je inn sloka tkav, take se s nm mus pracovat opatrn. Protoe alkylan prostedky jsou v roztoku nestl, pipravuj se jejich roztoky tsn ped pouitm, a to do sterilnch pufr o pH v rozmez 6,5-7,5, kdy jsou tyto sloueniny nejstlej a maj nejvy mutagenn inky. Nejastji se psob tmito inidly na buky bhem jejich logaritmick fze Strana152

rstu v kom-pletnm tekutm mediu, nebo jsou nejinnj v mst replikan vidliky DNA. Cv.8.4 Poteby : rstu
Indukce mutant pomoc alkylanch inidel za rstovch podmnek

Tepan kultura haploidnho kmene kvasinek S. cerevisiae v log-fzi mediu, N-nitroso-N-methylmoovina(NMU), 20 ml , avak bez agaru a ve tynsobn

v kompletnm

koncentrovanho kompletnho media (pda .

koncentraci vech sloek), steriln fosftov pufr (0,2 mol/litr) o pH 6,6, steriln H2O, 6 sterilnch Erlenmeyerovch bank, steriln zkumavky, steriln pipety (10 ml, 1 ml), steriln centrifugan kyvety objemu 200 ml, pedsuen desky kompletnho agaru (pda . ) a agaru selektivnho pro dan mutanty. Proveden : 1. Do pti Erlenmeyerovch bank pipetuj asepticky 4 ml kompletnho media a 5 ml pufru, 00,5 ml erstv pipravenho roztoku NMU (pipravuje se asepticky do steriln Erlenmeyerovy baky!) tak, aby jeho konen koncentrace v pokuse byla 0mol/ml, 0,1 mol/ml, 0,2 mol/ml, 0,5 mol/ml a 1,0 mol/ml, dle 0-0,5 ml steriln H2O (k doplnn celkovho objemu na 10 ml) a 0,5 ml bunn kultury. 2. Inkubuj za tepn 1416 h (tj. pes noc) pi 28C. Pak z kultury obsahujc NMU pipetuj 5 ml do sterilnch centrifuganch kyvet, dolij steriln vodou na objem cca 200 ml a po vy-ven kyvet, odste, supernatanty slij a buky tikrt promyj cca 200 ml steriln vody za pouit opakovanho odsteovn. 3. Promyt buky resuspenduj v 5 ml steriln vody a zjisti pomoc potac komrky (viz kap, ) poet bunk/ml a pomoc vitlnho barven (viz kap. ) podl mrtvch bunk. 4. Souasn zjisti stejnm zpsobem poet bunk/ml nepromyt kultury bez NMU. Na zklad tchto vsledk piprav takov postupn zedn (viz kap. ), abys na neselektivn gar (nap. kompletn agar) vyokoval 100300 ivch bunk a na selektivn agary 103106 ivch bunk (v tom ppad se okuj ze t po sob jsoucch destkovch zedn). 5. 0,1 a 0,3 ml vhodnch zedn vyokuj na pesuen desky kompletnho agaru a agaru pro zjitn doucch mutant a inkubuj pi 28C.

Strana153

6. Po nrstu koloni zjisti jejich poet a pepotej na ml promyt suspenze nebo kultury. Vypotej frekvenci hledanch mutant na poet ivch bunk pro kadou koncentraci NMU a zanes do grafu (proti koncentraci tohoto mutagenu v pokusu). Zjisti tak, pi kter koncentraci NMU byl nejvt vtek danch mutant.
8.1.3.4 Indukce mitochondrilnch mutac s S. cerevisiae

U S.cerevisiae se vyskytuj dva zkladn typy mutac mitochondrin DNA (mt DNA) : 1) Delen mutace, pi nich dochz ke ztrt rzn velkch sek mt DNA a cel mt DNA a kter jsou oznaovan (rho-) nebo (rho). Vznikl mutanty nejsou schopny respirace (viz kap. ). 2) Bodov mutace, je vznikaj zmnou jedinho pru bz mt DNA a fenotypov se projevuj nap. rezistenc k inhibitorm syntzy mitochondrilnch blkovin (nap. rezistenc k erythromycinu, chloramfenikolu ap.) Delen mutace mt DNA se indukuj se 100% innost za rstu v ptomnosti interkalanch inidel (nap. ethidiumbromidu). Bodov mutace vznikaj vzcnji. Nejlep vsledky poskytuje rst v ptomnosti Mn2+. Podrobn postup indukce obou tchto typ mutac viz ilhnkov L. v knize Kvasinky ve vzkumu a praxi(ed. D.Vran, Academia, Praha,1985).
8.1.4 Testovn mutagenity chemickch ltek mikroorganismy

Chemizace zemdlstv a rozvoj farmaceutickho prmyslu vedly k tomu, e lovk pichz kadodenn do styku s adou chemickch ltek, z nich nkter mohou mt mutagenn inky a tm ohroovat lidskou populaci.
8.1.4.1 Amesv test

Nejastjm testovacm systmem mutagenity chemickch ltek jsou urit auxotrofn mutanty bakterie Salmonella typhimurium, kter maj jet rozshlou deleci v oblasti DNA, zodpovdn za jejich patogenitu. Z tchto dvod nejsou patogenn a nehroz ani nebezpen, e by revertovaly v patogenn typ. Dle maj deleci v genu zodpovdnm za excizn opravu DNA (gen uvrB), take jsou citlivj tak k mutagennm inkm ady chemickch ltek. Tyto kmeny zavedl do testovn Ames (1971), kter tak vypracoval a dle zdokonalil cel postup testovn, take tento postup Strana154

je oznaovn jako Amesv test. V posledn dob byl do pvodnch Amesovch kmen zaveden plasmid, kter zvyuje efektivnost opravnho systmu tvocho chyby, a tm zvyuje citlivost tchto kmen k mutagennm inkm vtiny chemickch slouenin. Souasn vak zvyuje tento plasmid i spontnn mutabilitu tchto kmen. Jako testovac systm se u tchto bakterilnch kmen pouvaj reverze k prototrofii u mutant auxotrofnch pro histidin, a to jednak reverze vznikl zmnou bz, tedy tranzic nebo travsverz (kmen TA 100 obsahujc plasmid a odvozen od pvodnho kmene TA 1535), jednak reverze vznikl delec bas tedy posunutm ten (plasmidov Ta 98 odvozen od kmene Ta 1538). Paletu testovacch kmen dopluj jet dal dva kmeny s plasmidy, z nich jeden (TA 102) nem pokozenou excizn opravu a me proto detegovat mutageny, je pro svj mutagenn inek naopak vyaduj tento opravn proces. Tento soubor kmen umouje zjistit mutagenitu ltek s velmi rozmanitm mechanismem mutagennho inku. Protoe vechny tyto kmeny maj pomrn vysokou rychlost spontnnch mutac a tak snadno ztrcej plasmid zodpovdn za jejich snadnou mutabilitu, mus se uchovvat lyofilizac, aby nebylo nutn jejich ast peokovvn. K testovn zvolen kultura mus mt pomrn nzkou hladinu mutac a souasn mus bt testovna nkolika znmmi mutageny, zda svou snadnou mutabilitu neztratila. Postup testovn mutagenity spov v tom, e k 0,1 ml rozehtho a vytemperovanho tzv. mkkho agaru se pidvaj stopy histidinu (pro zajitn 23 dlen bunk), 0,1 ml 18 h bujonov kultury testovacho kmene, 0,1 ml roztoku testovan chemiklie (vol se vdy nkolik koncentrac) a po rozmchn se tato sms ihned vlv na povrch se specilnm minimlnm agarem. Pro zjitn, zda u ivoich nedochz ke zmn testovan chemiklie v jet innj mutagen (ili k tzv. metabolick aktivaci chemiklie), se k nkterm podlm mkkho agaru pidv jet tzv. S9 mix (tj. sms kofaktor s jaternm homogentem, zskanm z krys, je ped smrt byly vystaveny inku vhodnho mutagenu [v potrav nebo injekc], m dolo k indukci detoxikanho metabolismu v jejch jtrech). Po 48 h inkubaci vech misek pi 37C se odet poet koloni revetant v kontrolch i pi rznch koncentracch testovan sloueniny, a to v ptomnosti S9 mix (tj. s metabolickou aktivac) i bez n a souasn se zjiuje povaha rstu pozad, tj. auxotrofnch bunk, vytvejcch mlhovit povlak v dsledku vyuit ptomnch stop histidinu. Ni intenzita nebo neptomnost tohoto pozad prozrazuje inhibin ppadn toxick inek testovan ltky na testovac mikroorganismus, co by mohlo vst k falenm negativnm vsledkm. Bli nformace o pstovn a testovn pouitch kmen i o proveden Strana155

test viz nap. B.N.Ames a spol v knize Handbook of Mutagenicity Test Procedures. Stanoven mutagenity pomoc bakteri, kter se nyn vyaduje u vech novch lk a nkterch dalch chemickch produkt, bylo v posledn dob automatizovno firmou Labsystems, Helsinky, je nabz pstroj Mutascreen, umoujc 200 analz bhem 24 h.
8.1.4.2 Pouit kvasinek pro testovn mutagenity chemickch ltek

Kvasinky maj pi testovn innosti chemickch ltek na DNA ped bakteriemi pednost v tom, e krom indukce bodovch mutac chromozomln DNA, je me bt sledovna u bakteri, umouj sledovat tak indukci mitotickch rekombinac, mitotickch genovch konverz a v neposledn ad tak inek na mitochondriln DNA. Pesto se pouvn kvasinek k tomuto elu dostv irho upoteben teprve v poslednch letech. Nejastji se k tomuto testovn pouv diploidn kmen Saccharomyces cerevisiae D7, kter umouje zjitn mitotickch rekombinac (tj. reciprokch vmn sek nesesterskch chromatid homologickch chromosom pi mitotickm dlen jdra) v alelch ade 2-40/ade 2-119 tm,e vznikaj kolonie s rovm a ervenm sektorem mezi blmi koloniemi pvodnch bunk, a souasn umouje sledovat vznik mitotickch genovch konverz (tj. nereciprokch vmn sek nesesterskch chromatid homologickch chromosom pi mitotickm dlen jdra) v alelch trp 5-12/trp 5-27, projevujcch se prototrofi pro tryptofan. Navc kmen D 7 umouje zjistit reverze auxotrofie pro isoleucin, nebo obsahuje v homozygotnm stavu alelu ilv 1-90. Protoe fenotypov projev tto alely me bt potlaen innost nkolika metabolickch supresor, jde pi reverzi k prototrofii pro isoleucin nejen o prav zptn mutace, ale i o supresorov mutace (tedy o mutace dopedu), a tud citliv testovac systm, kter me detegovat irokou paletu mutagennch slouenin s nejrznjm inkem na DNA. Bli o postupu pi pouit kvasinek pro testovn mutagenity viz nap. Zimmermann F.K. a sp. Mutation Research, 28, 381-388 (1975). Poznmka: Pro orientan testovn mutagenity chemickch ltek me bt pouit tak tzv. kapikov test (angl. spot test), pi nm se testovac mikroorganismus vyokuje roztrovou metodou (kap. ) v mnostv 5103 bunk na dv pedsuen desky kompletnho agaru (pda . ) pro kvasinky a . pro bakterie)a v mnostv 5107 bunk na dv pedsuen desky minimlnho agaru (pda . nebo s 1% kompletnho media pro zajitn rstu pozad) a do stedu jedn z misek obou pd se umst krystalek Strana156

testovac ltky nebo kapka jejho roztoku. Po inkubaci (pi optimln teplot) se zjiuje inhibice rstu (srovnn kompletnch agar s testo-vanou ltkou a bez n) a srovnn pozad (na minimlnm agaru s testovanou ltkou a bez n) a mutagenn inek testovan ltky (srovnn potu prototrofnch koloni na minimlnm agaru s testovanou ltkou a bez n). Spot test je vak mlo pesn a negativn vsledek neznamen jet, e testovan ltka nen mutagenn.
8.2 Ken a rekombinace

Ken a z nho pochzejc rekombinace vloh umouje kumulovat pi lechtn mikroorganism vlastnost rodi od jedinho jedince. Tento postup je vhodn proto, e druh stupe mutageneze, kter by vedl ke kvantitativn zmn ji zskanho fenotypu, lze realizovat jen velmi pracn, nebo vtinou nemme k dispozici vhodn selekn postup ani rychlou detekn metodu pro registraci bunk s kvantitativn zmnou studovan vlastnosti. Ken je tak nezbytnou pomckou pro adu teoretickch genetickch prac, jako je charakterizace mutovanho genu a zjitn jeho polohy na chromosomov map danho mikroorganismu, zjitnho pslunosti dvou jedinc k jednomu druhu apod. Ken meme doshnout (viz tab. . 4) spjenm vhodnch haploidnch eukaryotnch bunk druh se sexulnm cyklem (tj. askomycetnch a bazidiomycetnch kvasinek a plsn), konjugac u nkterch gramnegativnch bakteri a u nkterch streptomycet a anastomosou u vhodnch kmen plsn. irok uplatnn m fze protoplast, je je mon u vech mikroorganism krom gramnegativnch bakteri. Podrobnji probereme ken nkterch kvasinek a analzy produkt tchto ken a fzi protoplast, nebo tyto dva postupy maj nejvt vznam pi lechtn mikroorganism pouvanch v biotechnologich.
8.2.1 Ken kvasinek a analza produkt ken

Nejsnze je provediteln ken u heterothalickch kmen, nebo u nich meme udret buky v haploidnm stavu pi peokovvn po velmi dlouhou dobu. Zde tedy provdme ken smchnm bunk opanch provacch typ (tj. a u rodu Saccharomyces nebo Rhodosporidium a h+h- u rodu Schizosaccharomyces) a izolac

Strana157

zskanch zygot (v ppad rod Saccharomyces a Schizosaccharomyces) nebo teliospor (v ppad rodu Rhodosporidium). Nae pekask kvasinky jsou vak vtinou homothalick a po jejich sporulaci dochz velmi brzy ke spjen bunk, take v populaci prakticky nemme haploidn buky. Z tchto dvod se zde mus kit pmo vznikl spory po natrven ask nemi enzymy (viz kap. ). Spory se izoluj i k (tj. vzjemn pibl) na mikromanipulanm agaru ) a inkubuj 24 h pi 28oC, aby zygoty vytvoily pomoc mikromanipultoru (viz kap.

kolonie diploidnch bunk. Pivovarsk kmeny kvasinek jsou polyploidn nebo aneuploidn a velmi patn sporuluj, take ken je zde obzvlt obtn. Zde se nejlpe osvdilo ken pomoc fze protoplast (viz kap. ). Pi ken kvasinek se proto nejdve sname zjistit, zda oba kmeny jsou haploidn. Nejjednodu postup je testovn jejich schopnosti sporulace (viz kap. ), i kdy negativn vsledek zde jet nen dkazem haploidity, nebo sporulace me bt pokozena v dsledku aneuploidie nebo mutace nkterho z kmen, jejich funkce je nutn pro sporulaci. Jestlie kultura sporuluje, izolujeme pomoc mikromanipultoru (viz kap. ) spory nkolika ask a jejich vegetativn potomstvo opt testujeme na sporulaci. V ppad, e opt dochz ke sporulaci, lo bu o polyploidn kulturu (nejastji tetraploidn), je poskytla diploidn spory nebo o homothalick kmen. V kadm ppad vegetativn potomstvo (tj. klony) jednotlivch spor opt testujeme na sporulaci. Jestlie u nkterch klon nedolo ke sporualci, zjistme jejich schopnost ken s bukami provacho typu a i s bukami provacho , m zjistme, zda jsou heterothalick a jak maj v tomto ppad provac typ (viz kap. ). Jestlie vechny monosporov klony vak opt sporuluj, jde o homothalick kmen a musme ke ken pout pmo jednotliv spory bezprostedn po jejich mikromanipulaci a cel proces ken kontrolovat mikroskopicky (viz ve), abychom mli jistotu, e nedolo ke vzjemnmu spjen potomk te spory. Pi ken dvou haploidnch jedinc, licch se ptomnost nebo neptomnost mutace uritho genu, se fenotypov projev ta alela genu, je je dominantn. Vtinou je to nezmutovan alela, nebo zmutovan alely pedstavuj pokozen uritho genu, je je vtinou recesivn. Jestlie se oba rodie li mutacemi rznch gen, (nap. kme kmen lys- s kmenem ade-), pak zskan hybrid je v dsledku recesivity obou mutac schopen rstu na minimlnm agaru. Hovome o komplementaci (tj. vzjemnm doplovn) obou mutac. Tto komplementace se pouv pi stanoven Strana158

kopulanho typu kvasinek (kap.

), dle pro izolaci danch hybrid (kap.

), a pro

charakterizaci recesivnch mutant vyadujcch histidin dostvme diploidy neschopn rst na pd bez histidinu, lo o mutaci tho genu. Jestlie zskan diploidy rostou na pd bez histidinu, ml kad rodi zmutovan jin histidinov gen (neboli lokus) a kme, e komplementan test byl pozitivn. U gen, je kduj dv blkovinn podjednotky (tedy dva rzn polypeptidy) jednoho enzymu, me vak dt komplementan test pozitivn vsledek tak tehdy, jestlie mutace u rodi byla na opanch koncch genu, tedy zasahovala rzn podjednotky enzymu (tzv. intragenov komplementace polrnch mutac). Pro zjiovn provacho typu u auxotrofnch mutant meme pout auxotrofn testovac kmeny vyadujc jin rstov ltky ne testovan kmeny. Pak diploidy vznikl kenm testovanho kmene (nap. lys- ade-) s testovacm kmenem (nap. trp- his-) budou v dsledku komplementace ptomnch recesivnch mutac prototrofn a porostu na minimlnm agaru (pda . ), kdeto testovan ani testovac kmeny na minimlnm agaru nerostou. Tento postup me bt pouit pouze u mutant s velmi nzkou mutan rychlost reverz a pro jistotu je teba pout kmeny, kter maj alespo dv mutace pro auxotrofii.
8.2.1.1 Stanoven kopulanho typu a izolace zygot u S. cerevisiae Jednoduch postup pro jeden testovan kmen

Cv.8.5 Poteby :

2436 h star kultura testovanho kmene z kompletnho agaru (pda .

), stejn kultury testovacho kmene provacho typu a a provacho typu , pedsuen deska kopulanho agaru (pda . ), podlon a kryc skla. Proveden : 1. Na pedsuenou desku kopulanho agaru penes asepticky oko testovan kultury a rozeti na dv kruhov plochy o prmru cca 1 cm. 2. Do dal plochy stejn velikosti penes asepticky oko testovac kultury provacho typu a a souasn rozmchej buky tto kultury s bukami v jednom kruhu testovan kultury a dobe ozna. 3. Do druhho kruhu bunk testovan kultury penes a dobe rozmchej buky provacho typu a dobe rozmchej. Pak oko oehni a po novm nabrn bunk

Strana159

provacho typu je smchej v kruhu obsahujcm buky testovacho kmene a (= kontrola testovacch kmen). 4. Inkubuj desku 1618 h pi 28C a pak piprav ze vech t kruh nativn preparty. Zygoty, tj. pikotovit tvary s jednm pupenem, by se mly objevit v kontrole (tj. v ken testovac kmen a testovac kmen ) a v jednom z dalch kruh. Testovan kmen m pak opan provac typ ne testovac kmen, s nm tvo zygoty. Cv.8.6 Poteby :
Obtiskov (replikan) postup pro prototrofn kmeny

Testovan a testovac kmeny S. cerevisiae na ikmch kompletnch ), 2 steriln samety

agarech, 2 desky pedsuenho kompletnho agaru (pda . vata, mikroskop, steriln zubn prtka. Proveden :

1515cm sterilovan v autoklvu, replikan blok, podlon a kryc skla, 96%n ethanol,

1. Na misky pedsuenho kompletnho agaru vyokuj paraleln pruhy testovanch kmen (maximln 12 kmen viz obr. a) a dobe je ozna na dn misky. Na druhou pedsuenou desku kompletnho agaru vyokuj v pruzch stdav testovan kmen provacho typu a a provacho typu (obr. b). 2. Inkubuj ob desky 36 h pi 30C. 3. Na dn obou misek si ozna startovac bod (kad jinou znakou!) a pomoc sterilnho sametu obtiskni desku s testovanmi kmeny na pedsuenou desku kopulanho agaru, na n je ji oznaen pslun startovac dob. Postup obtisku viz kap . Pak na tut desku obtiskni pomoc dalho sametu desku s testovacmi c). Nezapome opt kmeny, avak kolmo na pruhy testovanch kmen (obr. oznait startovac bod! 4. Inkubuj misku s kenm 4 h pi 28oC a pak dal 24 h pi 6C. 5. Pomoc sterilnch prtek piprav nativn preparty z mst ken dvou ntr a mikroskopicky (pi zvten 1045) zjisti ptomnost zygot. Na zklad ptomnosti zygot uri kopulan typ testovanch kmen. Poznmka : 1. Vhodn je dva z testovanch kmen nahradit testovacmi kmeny, aby byla kontrola, e spolu skuten kopuluj a jsou proto vhodn pro testovn.

Strana160

2. Pi ken heterothalickch kmen S. Pombe se postupuje stejn jako v kap. jenom s tm rozdlem, e se k replikaci pouvaj 48 h star ntry na kompletnm agaru (pda . ), replikj se na 34,5% sladinov agar a inkubuj 25 dn pi 30C. Po inkubaci se zjist sporulace peklopenm oteven Petriho misky nad ndobku, v n se zahvnm vyvjej z krystalk jodu jodov pry. Osporovan seky ntru se jodovmi parami zbarv svtle fialov, kdeto neosporovan zeloutnou. Parami jodu se stejnm zpsobem testuje i haploidita kmen urench ke ken; kultivace na sladinovm agaru se vak prodluuje a na 7 dn, ppadn se jet tento agar uchovv dalch 7 dn pi 4C. Cv.8.7 Poteby : Proveden: 1. Postupuj stejn jako je uvedeno v bodech 1) a 3) ve cv.8.6, ale inkubaci provdj 2436 h pi 28C. Pak misku s vyrostlm kenm (obr. startovac body) a inkubuj 12 dny pi 2830C. 2. Zjisti, v kterch mstech ken dolo na minimlnm agaru v dsledku komplementace k rstu (obr. testovanch kmen.
8.2.1.2 Postup pi zskvn hybrid kvasinek Replikan postup vyuvajc komplementaci

podobn jako ve cv.8.6 a navc jet jeden steriln samet a pedsuen

deska minimlnho agaru.

c) otiskni pomoc

sterilnho sametu na pedsuenou desku minimlnho agaru (nezapome oznait

d) a na zklad toho uri kopulan typ

Pro zskn hybrid heterothalickch kmenu S. cerevisiae vychzme z haploidnch kmen a postupujeme nkterou z metod popsanch pro stanoven kopulanho typu (viz (viz kap. (obr. ). Jestlie alespo jeden z rodi je prototrof, nememe pi ken vyut komplementace a zygoty musme izolovat pomoc mikromanipultoru ). Na mikromanipulan agar nanme v zk e pomoc kliky dkou b) je nebezpe, e suspenzi bunk z ken a po vsknut vyizolujeme alespo 4 zygoty tvaru trojlstku a). U zygot pucch z nkter rodiovsk buky (obr. pupen vznikl jet ped karyogami, take dostaneme sms haploidnch a diploidnch bunk. Mikromanipulace zygot je nutn i pi pracch, jejich kolem je analza spor,

Strana161

nebo pvodn rodie mohou obsahovat tak diploidn buky vznikl kopulac se sousedn nezmutovanou bukou. Pouije-li se pi ken komplementace (kap. rkovac metodou (viz kap. ) je nutno buky vyrostl na minimlnm agaru suspendovat ve steriln vod, peistit ) a na kompletnm agaru se pesvdit, e v ntru nejsou ptomny jednotliv auxotrofn buky, kter by mohly zkreslit genetick analzy. Ken rznch auxotrof S. cerevisiae se me asov urychlit pi pouit tekutch pd. Smch se 107 bunk 24 h starch kultur opanch provacch typ a komplementanch marker (tj. rznch rstovch poadavk) v 10 ml kompletnho tekutho media (pda . ) a inkubuje za velmi mrnho tepn 90 min pi 30C. Pak se buky sedimentuj odstednm a ponechaj v klidu 30 min pi 30C. Supernatant se slije a buky a zygoty se odsted, dvakrt promyj steriln vodou a po resuspendovn v 10 ml vody ve se 0,1 ml penese do 10 ml minimlnho media (pda . bunk na pedsuen minimln agar (pda . , ale bez agaru) a inkubuje v klidu asi 1 h pi 30C. Z tto kultury se pipetuje 50300 diploidnch ) a inkubuje 23 dny pi 30C. Dal postupy ken v tekut pd uvd nap. Weber H. (Zellbiologie und Genetik der Hefen) nebo Kovov V. (Genetick analza mikroorganizmov. I. skriptum). Auxotrofie jednoho z partner se pi komplementanm testu me nahradit mitochondriln mutac rho, (je se zsk rstem v ptomnosti interkalanho inidla viz kap. ). Selekce diploid se pak provd na minimln glycerolov pd (pda . , v n je glukosa nahraena 20 g glycerolu).
8.2.1.3 Hybridizan postup zskvn polyploidnch kmen S. cerevisiae

Pro zskn polyploidnch kmen kvasinek se vyuv spontnnch mutac provacho typu v diploidnch bukch, take pvodn buka a v aa se me kit s bukou ppadn s . Protoe mutace provacho typu jsou pomrn vzcn, provd se hybridizace vtinou v tekut pd (viz kap. pouv selekce, zaloen na komplementaci mutac.
8.2.1.4 Sporulace diploidnch kmen a analza spor

) a pro zskn polyploid se

Hybridn kmeny nechvme osporovat z tchto dvod:

Strana162

1) 2)

pro zskn rekombinanch spor (nutn pro kumulaci recesivnch mutac do jedinho jedince). pro provdn tetrdov analzy, je se pouv pro charakterizaci novch mutac(viz kap. ). Sporulovat mohou pouze dobe iven diploidn buky v dobrm fyziologickm

stavu a penesen na vhodn sporulan prosted. Sporulac S. cerevisiae pro genetick ely provdme vdy po pomnoen jedin diploidn buky (viz ve) pi optimln teplot na presporulanm agaru (pda . ) bohatm na duskat iviny a obsahujcm pomrn hodn zkvasitelnho cukru (46%). Z tohoto agaru penme dobe narostl kolonie (tj. po 48 h rstu) na sporulan agar (pda . ), kter obsahuje octan draseln, mal mnostv duskatch ltek a velmi mal mnostv glukosy. PH tohoto agaru, kter je v dsledku ptomnho octanu velmi vysok, stimuluje tvorbu spor. Jednotliv kolonie z presporulanho agaru nutno penst na sporulan agar ve form hustho ntru, nebo buky se zde ji prakticky nerozmnouj. Inkuban teplota bhem tvorby spor sm bt maximln 25C a doba inkubace 23 dny. Stupe osporovn se zjist ve vodnm prepartu pi zvten (45 60)10. U dobe sporulujcch kmen dojde ke sporulaci 5075% bunk. Dlouhodob uchovvn spor na sporulanm agaru vede ke snen ivotnosti spor. Sporulace heterothalickch kmen Schizosaccharomyces pombe, je se velmi asto pouvaj ke genetickm studim, probh po jejich ken na sladinovm agaru (viz kap. . ).
8.2.1.5 Tetrdov analza

Tetrdov analza spov v roztpen bunn stny ask pmoc mikrobilnch enzym nebo enzym trvcho traktu hlemd Helix pomatia a v oddlen jednotlivch spor kadho asku (tedy tetrdy) a zjitn fenotypu jejich klon (tj. jejich vegetativnho potomstva), z nho se pak usuzuje na genotyp pvodnch spor. Zjiuje se tedy pomr potu spor uritho fenotypu k potu spor dalch fenotyp v jednotlivch tetrdch, a hovome o tpnch (ili segreganch) pomrech uritch vlastnost. tpn pomry mohou bt 2:2, 1:3, 3:1, 4:0, 0:4 nebo 1:1:1:1 Vznam tetrdov analzy objasnme na tchto ppadech :

Strana163

1)

kenm zskanho auxotrofu s prototrofem meme zjistit, zda sledovan auxotrof m mutaci jen v jednom genu (tpn pomr prototrofy : auxotrofy je 2:2) nebo ve vce genech (pevldaj auxotrofn spory):

2)

kenm dvou monogennch mutant stejnho fenotypu meme zjistit, zda jde o mutace v tomt lokusu (vechny spory budou mt stejn fenotyp shodn s pouitmi mutanty) nebo ve dvou rznch lokusech (vytpuj se tak spory standardnho fenotypu), v tomto druhm ppad pak z podlu standardnch spor urme, zda tyto lokusy jsou umstny na rznch chromosomech (standardn spory pedstavuj 1/4 vech spor).

3) 4)

kenm monogennch mutant vyadujcch rzn rstov ltky meme z % rekombinovanch spor zjistit vzjemnou vazbu pslunch lokus. kenm studovanho mutantu s mutanty o znm poloze zmutovanch gen na chromosomov map meme lokalizovat mutovan gen studovanho mutantu na tto map (viz kap. ).

5)

kenm revertovanho auxotrofnho kmene s prototrofem meme prokzat ptomnost supresoru (vytpuj se auxotrofn spory, akoliv oba rodie byly prototrofn). To je jen nkolik pklad nejjednoduch genetickch analz. Pi tchto

pracch pouvme jednak tetrdovou analzu, jednak hromadnou izolaci spor a jejich testovn. Cv.8.8 Poteby :
Tetrdov analza

osporovan kultura hybridnho kmenu S. cerevisiae na acettovm ), mikromanipulan komrka,

sporulanm agaru, mikromanipulan agar (pda .

mikromanipultor napojen na mikroskop, mikromanipulan jehly, dv pesuen desky kompletnho agaru (pda . 30), pedsuen desky minimlnho agaru (pda . 29) s doplkovmi ivinami, replikan blok, steriln samet, steriln va ze zavacho traktu Helix pomatia (nap. komern prepart firmy Koch-Light, Laboratories, Ltd., Anglie), steriln voda, kryc sklka, steriln Petriho misky, steriln pipety, pinzeta, n. Proveden : 1. Piprav nativn prepart osporovan kultury a pi zvten 1045 nebo 1060 zjisti etnost asku se tymi sporami. Pedstavuj-li alespo 25% vech bunk, penes

Strana164

oko tto kultury do 0,1 ml trvic vy (nap. komern prepart edn 10) ve steriln zkumavce a inkubuj pi 28C. 2. Sleduj v nativnch prepartech stupe natrven stn ask (u komernho prepartu po 1 h a pak v 1/4 a 1/2 h intervalech). Sprvn natrven je takov, kdy jsou ptomny jet mal zbytky stny ask, take se nemohou tvoit falen tetrdy uvolnnch spor. 3. Natrvenou suspenzi osporovan kultury ze cca 1 ml steriln vody, lehce rozmchej a nanes v zkm pruhu na mikromanipulan agar na krycm sklku podle pokyn (v kap. 6.2.2.2) a pomoc mikromanipultoru oddl od sebe spory jednotlivch tetrd tak, e spory kad tetrdy jsou vdy v ad nad sebou, vzdleny od sebe 1,52 mm a vzdlenost jednotlivch tetrd je minimln 3 mm, take po jejich inkubaci dostane monosporov kolonie jako v obr. mikromanipulovn je uveden v kap. 6.2.2.2. 4. Inkubuj mikromanipulan agar s tetrdami na desce pedsuenho kompletnho agaru pi 28C do vzniku zetelnch koloni prmru cca 1 mm, je se vak nesm spolu dotkat (viz obr. 54). Vtinou je nutno inkubovat 23 dny. 5. Sterilnmi prtky penes jednotliv monosporov kolonie tetrd na desku kompletnho agaru podle ablony pro 52 koloni (viz. obr. pi 28C. 6. Po nrstu koloni na desce jisti jednotlivch koloni fenotypov projevy mutac obsaench v pvodnm hybridu. V ppad auxotrofnch mutac obtiskni desku tohoto kompletnho agaru na desky minimlnho agaru s poadovanmi rstovmi ltkami krom jedn. Nap. obsahoval-li hybrid mutace trp-his-ade-leu-(vechny v heterogennm stavu!), trp + ade +leu (tj. bez his), trp + his +leu (tj. bez ade), trp + his +ade (tj. bez leu). Z jednoho sametu je mono natisknout a 6 replik, pi em jako posledn dvme zase kompletn agar, jako kontrolu. Replikan postup (tj. manipulace s replikanm blokem) je podrobn popsn v kap. 10.1.1.1. 7. Inkubuj repliky 2448 h. pi 28C. Pak vyhodno rst jednotlivch spor na rznch agarech a vsledek zanes do tabulky podle vzoru v tab. .xxx5. Zjisti z tto tabulky, zda se vechny mutace vytpuj monofaktorilnm tpnm pomrem (tj. 2+ : 2-). Jestlie se odchylka vyskytuje jen v jednom markeru, me jt tak o meiotickou genovou konverzi, je vak je pomrn vzcn (< 5% tetrd), je-li odchylka v nkolika markerech (tj. lokusech) jedin tetrdy (viz tetrda . 3 v tab. 5) jde o 51a) a inkubuj 12 dny 54. Postup

Strana165

falenou tetrdu, vzniklou spojenm dvou cizch dvojic sporu pli natrvench ask. Dle zjisti vskyt tetrd typu PD, NPD a TT pro jednotliv kombinace marker a vyhodno. Tabulka xxx5
Fenotyp spor po tetrdov analyse hybridu trp his ade leu

Kolonie Rst na pd bez . trp his ade leu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

2)

fenotyp spor trp his

typ tetrd u lokus trp-his ade-leu trp-ade trp-leu ade-his

+ + + + +

+ + + + +

+ + + + + +

+ + + + + + +

hisadeleu ade leu trp trphisleu

TT

PD

PD

PD

TT

trphisadeleu PD + ade trp his trp trphisade hisadeleu

TT

TT

NPD

TT

falen tetrda

Mapovn gen u S. cerevisiae

Jestlie mme zjistit polohu uritho zmutovanho genu na chromozomov map S. cerevisiae, musme heterothalick kmen , kter obsahuje tento zmutovan gen, kit s kmeny obsahujcmi mutace gen, jejich poloha je znm, ale n gen obsahuj ve standardn alele. Pi tchto kench se mus fenotypov projev naeho genu vytpovat pouze v pomru 2+ : 2-, co je dkaz, e jde o mutaci jedinho genu a e fenotypov projev tto mutace nen ovlivnn mutacemi mapovacho kmenu, pouitho v ken. Z kadho ken je teba mikromanipulovat spory alespo 70 tetrd (v ppad ni ivotnosti nkterch spor je teba mikromanipulovat tolik ask, a doshneme kolonie ze 70 plnch tetrd) a sledovat frekvenci rodiovskch dityp (PD), nerodiovskch dityp (NPD) a tetratyp(TT) pro kombinace analyzovan mutace s jednotlivmi mutacemi mapovacho kmenu (viz tab. . xxx5). Jestlie oba

Strana166

geny sledovan dvojice jsou na rznch chromosomech a pomrn vzdleny od svch centromer je poet PD : NPD : TT = 1:1:4, jestlie jsou oba geny blzko svch centromer, kles frekvence TT. Jestlie vak jsou ob mutace na homologickch chromosomech (tj. dan geny se vyskytuj na tomt chromosomu), je frekvence PD > NPD. Z tchto dvod nejdve zjistme statistickmi metodami (pomoc testu 2), zda je frekvence PD prkazn vy ne frekvence NPD. V ppad, e tomu tak je a jestlie poet NPD je velmi nzk a jestlie tak poet TT nen vysok, meme vzdlenost mapovanho genu (v centimorganech ili cM) vypotat podle Perkinsova vzorce: [cM] = 50 TT + 6 NPD PD + NPD + TT

Tento vzorec dv pesn vsledky pouze pro velmi mal mapovac vzdlenosti (tj. 3540 cM), nebo pedpokld, e ve zjitnm mapovm intervalu dochz pouze k jed-noduchmu nebo dvojitmu peken chormatid (tj. crossing overu). Pi vtch vzdlenostech vak dochz tak k vraznmu vskytu trojitch a vych vmn chromatid, take Pekrinsovm vzorcem bychom dostali ni vsledek, ne je skutenost. Proto je teba v tomto ppad kit n kmen s dalm kmenem, kter obsahuje mutaci takovho genu, je le ble naemu mapovanmu genu. Obyejn je nutno analyzovat nkolik mutac na tomt rameni chromozomu, na nm le n gen. Za tm elem byly pipraveny kmeny obsahujc nkolik zmutovanch gen na jedinm chromosomu, tzv. multimarkerov kmeny, take vsledek zskme analzou 70 plnch tetrd jedinho ken. Protoe vak nevme, na kterm chromosomu n zmutovan gen le, kme nejdve kmen, kter jej obsahuje, s multimarkerovmi kmeny obsahujcmi mutace v genech, je jsou ve vazb s jednotlivmi centromerami (tzn. e jsou pomrn blzko centromery pslunho chromosomu). Protoe u haploidnch kmen S. cerevisiae je znmo 17 chromozom, je nutno sledovat 17 zmutovanch gen, je mohou bt rozdleny do dvou kmen. Kme n kmen s jednm z tchto mapovacch kmen a v 70 plnch tetrdch analyzujeme frekvence PD, NPD a TT v kombinacch mapovanho genu s jednotlivmi centromerovmi marekry (viz tab. . xxx5). Nen-li v dnm ppad prkazn PD > NPD, zjiujeme, zda je frekvence TT prkazn men ne 4/6 vech tetrd (tedy odchylka od pomru 1:1:4). Jestlie tato frekvence nen men, le n gen daleko od sv centromery, ppadn na nkterm za ty znmch fragment. o nich se dosud nev, ke kter centromee nle. Jestlie je tato frekvence v kombinaci s jednm centromerovm markerem prkazn vy ne 4/6 (tj. 67%), pak mapovan gen le Strana167

pravdpodobn na tomt chromozomu, ale velmi vzdlen od sv centromery. Toto zven je zpsobeno tzv. chiasmovou interferenc, je se u S. cerevisiae vyskytuje ve vtin chromosomovch oblast. Je-li vak frekvence TT prkazn ni ne 4/6 (tj. 67%), le n gen mn ne 60 cM od sv centromery a proto n kmen kme s kmenem nesoucm zbvajc centromerov markery. Jeden z tchto marker by ml s nam genem poskytnout frekvence PD prkazn vy ne frekvence NPD, take bychom mohli bu pout Perkinsv vzorec pro bli lokalizaci naeho genu na tomt chromosomu, nebo pout jet ken s dalmi makrery tho chromosomu, nebo pout jet ken s dalmi markery tho chromosomu. Druh postup je astj, nebo je tak nutno zjistit, na kterm rameni chromosomu n gen le, ppadn zda le mezi centromerovm markerem a centromerou nebo na opan stran od centromerovho markeru. Opt zkoume pout Perkinsv vzorec. Kdyby vak gen, vzan na centromeru, nevykazoval vazbu se dnm z gen vzanch na centromery znmch 17 chromosom, musel by bt na dosud neznmm chromosomu. Pro mapovn gen, je jsou v tsn vazb na svou centromeru, meme pout tak frekvence segregac pi druhm meiotickm dlen pi jejich ken s kmenem obsahujcm mutaci genu, jen je rovn ve velmi tsn vazb se svou centromerou, ale na jinm chromosomu, a jeho frekvence segregac pi druhm meiotickm dlen je znma (segregace alel pi druhm meiotickm dlen je zpsobena crossing-overem v oblasti mezi centromerou a pslunm genem). Pro frekvenci tetratypu (tj. f (TT)) plat vztah: f(TT) = x + y 3/2xy , kde x je frekvence segregac alel pi druhm meiotickm dlen jdra pro gen z prvnho rodie a y je tot pro gen druhho rodie. Centromerov markery trp 1, pet 8 a met 14 maj frekvenci segregace alel pi druhm meiotickm dlen < 1%, take pi ken s kmenem o neznmm genu, kter je blzko sv centromery, se tyto hodnoty mohou zanedbat a f(TT) = x. Vzdlenost tohoto genu se pak piblin rovn polovin frekvence segregac pi druhm meiotickm dlen, a v tomto ppad tedy polovin frekvenc TT.
3) Hromadn analza spor

Hromadn analza spor, kter je mn pracn ne tetrdov analza, m nkolik zdroj chyb, a proto mus bt pi dkladn genetick analze vdy doplnna analzou Strana168

alespo nkolika mikromanipulovanch tetrd. V dnm ppad neme bt pouita pro mapovn gen. Prvnm zdrojem chyb pi hromadnm zskn spor je monost, e diploidn vegetativn buky nebyly vechny odstranny. K jejich odstrann se pouv bu 10 minutovho psoben 50%nho ethanolu, nebo zahvn po dobu 23 min na teplotu 56,5o57 ,5C nebo izolace spor do vrstvy sterilnho parafinovho oleje. Jeliko odolnost spor a vegetativnch bunk k fyziklnm a chemickm prostedkm nen pli odlin, je nutno tyto zkroky provdt velmi pesn a kontrolovat jejich innost u jednotlivch kmen. Dalm zdrojem chyb me bt nedostaten mechanick oddlen jednotlivch spor od sebe. Sloen povrchov vrstvy sporov stny vede toti ke shlukovn spor opanch provacch typ, take pak dojde ke spjen takovch dvou sousednch spor. Tomu lze zabrnit dkladnm rozetenm spor po povrchu ivnho agaru, je se jet zlep, jestlie se spory nejdve dobe rozmchaj do kapky roztaven elatiny (30o33C). Pouit elatiny je nutn tehdy, jestlie k izolaci spor bylo pouito parafinovho oleje. K chybnm zvrm na zklad vsledk z hromadn zskanch spor me dojt tehdy, jestlie jedna nebo nkolik kategori segregant m snenou ivotnost, take vznikl spory za danch podmnek nevykl nebo jich vykl jen urit podl. Protoe tento jev nen ojedinl, je nutno vdy analzu hromadn zskanch spor doplnit analzou alespo nkolika tetrd. Snen ivotnost se me v hromadn zskanch sporch prozradit tm,e urit mutace je mezi sporami v nedostatku (tj.nevyskytuje se u poloviny potu spor). Analza hromadn zskanch spor je vak vhodn pro zjitn suprese mutac (tj. zda pi ken dvou standardnch kmen se objev zmutovan spory), pro charakterizaci dominantnch mutac (tj. zda pi ken dvou mutant stejnho fenotypu se objev spory standardnho typu) apod. Cv.8.9 Poteby :
Hromadn analza spor

osporovan kultura hybridnho kmene S. cerevisiae na sporulanm agaru,

0,1 ml roztoku trvicch enzym (koncentrace 10 mg suchho enzym.prepartu/ml), pedsuen desky kompletnho agaru (pda .xx30), steriln 15%n elatina (1 ml), steriln balotino, steriln parafinov olej, steriln voda, mikroskop, podlon a kryc sklka, steriln prtka, steriln centrifugan kyvety, steriln pipety (1ml), steriln zkumavka s tsncm kovovm uzvrem. Proveden:

Strana169

1. Mikroskopicky zkontroluj stupe sporulace na sporulanm agaru. V ppad dostatenho mnostv spor penes oko z tho ntru do 0,1 ml roztoku enzym neho zavacho traktu v patentn zkumavce a inkubuj pi 28C 23 hodiny.
2. Mikroskopicky zjisti, zda je blna ask dodaten naruena a v kladnm ppad

pipipetuj 1,0 ml steriln vody a zahvej suspenzi na vodn lzni o teplot 56,5o 57,5C. za neustl kontroly teploty lzn. Pak rychle ochla pod tekouc vodou nebo v kdince s vodou o teplot 10o15C.
3. K suspenzi asepticky pidej steriln balotino a intenzivn tepej po dobu 10 min.

Pak pidej 2 ml sterilnho parafinovho oleje a tepej intenzivn dal 3 min. 4. Pelej sms asepticky do centrifugan kyvety, vyplchni zkumavku 1 ml steriln vody, pidej vplach do kyvety a ve odste. Penes okem spory z parafinov vrstvy do 1 ml steriln rozeht elatiny (30o32C) a okem v elatin dkladn rozmchej. Pak naber okem suspenzi spor v elatin a roztrej izolan rkovac metodu (viz kap. 6.2.1.3) na pedsuenou desku kompletnho agaru. Tento postup opakuj u nkolika desek. 5. Inkubuj zaven agar 23 dny pi 28C. 6. Vyrostl kolonie penes pomoc sterilnch prtek na 2 desky kompletnho agaru za pouit ablon pro 52 koloni na desce (viz obr. a) a ozna kolonie . 1 na kad desce. Pouit prtka vkldej ihned do kdinky s 96%nm ethanolem. Zaokovan desky inkubuj 12 dny pi 28C. Vyrostl kolonie na desce kompletnho agaru pak pouij pro otisky (nap. na minimln agary, v nich chyb vdy pouze jedna z poadovanch ivin, nutnch pro analzu zskanch sporovch klon).
8.2.2 Fze protoplast

Sexuln hybridizace i parasexuln ken mohou bt pouity jen u nkterch mikroorganism (viz tab. x4). Tento nedostatek je odstrann monost pevst mikrobiln buku v protoplast, navodit umlou fzi protoplast a vznikl fugty (i pvodn protoplasty) opt regenerovat v buky. Fze protoplast lze provdt u nejrznjch typ mikroorganism (s vyjmkou gramnegativnch bakteri, u nich se zatm nepodailo pipravit prav protolasty schopn fze) a dokonce i u rostlinnch a ivoinch bunk. Dokonce se podaila spn fze i u protoplast zskanch z velmi vzdlench organism (nap. z ivoinch bunk a kvasinek, rostlinnch bunk a

Strana170

kvasinek apod.), kter vak neposkytly stabiln hybridn produkt, nebo vznikl hybridn buka neme zvldnout tak obrovsk rozdly genetickho vybaven obou fuzujcch rodi. Tak mezirodov a dokonce i mezidruhov hybridy jsou nestabiln. U eukaryot tho druhu vak zskme z haploidnch protoplast protoplasty diploidn i polyploidn, take zde dochz tak ke karyogamii, a to i tehdy, jestlie fuzuj heterothalick buky tho parovacho typu. Meme tak kit tak prmyslov kmeny kvasinek. U grampozitivnch bakteri dochz pi fzi nejdve k pechodnmu typu dvouchromosomln buky, avak ob DNA rekombinuj a po nkolika dlench zskvme stl jednochromosomov rekombinanty. Velmi vysok frekvence rekombinac (vce ne 1%) poskytuj vnitrodruhov fze protoplast u streptomycet, kter se jet vrazn zv (a na 10-20% regenerovanch spor, tj. na 104 nsobek frekvence Fze rekombinac protoplast pi se parasexuln navozuje konjugaci streptomycet) pidnm (nap. dimethylsulfoxidu (14% hm.). pdavkem fusogennho inidla polyethylenglykolu, kter odvoduje protoplasty a v ptomnosti Ca2+ vyvolv interakce membrn protoplast) nebo novji tak elektrickm okem. Fze protoplast, podobn jako jejich pprava i regenerace v buky, nastv pouze v osmoticky stabilizovanm prosted (tj. v prosted o stejnm osmotickm tlaku, jak panuje uvnit buky), je brn lysi protoplast. Regenerace fzovanch i normlnch protoplast v buky nastv pouze v polotuh ivn pd (tj. agarov nebo elatinov), nebo se mus zabrnit odplavovn vytvoench prekursor (tj. stavebnch kamen) bunn stny do ivnho prosted. Syntza bunn stny je pomrn zdlouhav (u kvasinek trv 1014h) a teprve po n zan rozmnoovn bunk. Prvn 2-3 bunn cykly po regeneraci jsou jet nenormln, a s vraznmi morfologickmi odchylkami. Za velmi dobr vsledek se pokld regenerace 5-50% protoplast. Protoe fze protoplast je nhodn, je pro zskn hybridnch protoplast nutno pout vhodn oznaen kmeny a jejich selekci (nap. komlementujc auxotrofn kmeny a selekci prototrof na minimlnm agaru). U kvasinek se jako marker me pout tak pokozen dchn (tj.nitochondriln mutace rhoo), je se kombinuje s auxotrofi (nap. rhoo ade-) a selektuje se na minimlnm glycerolovm agaru, kde neme rst ani jeden z rodi, ale jejich fugt ano. V posledn dob se pi fzi protoplast prmyslovch kmen kvasinek jako marker pouv tak produkce killer-toxin (neboli zymocin) u kmen obsahujcch killer-faktory. Nap. protoplasty rhoo kmenu obsahujcch killer-faktor se sms s protoplasty normlnho (rhoo) kmene, kter je Strana171

citliv k pslunmu zymocinu. Na glycerolovm agaru me rst jen potomstvo fzovanch protoplast. Bli viz Vondrejs a sp.,Folia Biologica,29,373 (1983). Fz vhodn znaench jadernch kvasinkovch protoplast s bezjadernmi kvasinkovmi protoplasty, zskanmi z pucch bunk k penosu pouze cytoplazmatickch faktor ddinosti (nap. k penosu mitochondriln DNA nebo killer-faktor), co je oznaovno jako cytodukce. Sms protoplast vhodn znaench t haploidnch kmen kvasinek me bt pouita tak pro zskn triploidnch a vce ploidnch kmen, nebo polyethylenglykol navozuje tak fzi nkolika protoplast souasn. Nap. pi smchn protoplast argleu- leu- lys- lys- arg- porostou na minimlnm agaru pouze buky, kterm prvn kmen poskytl schopnost syntetizovat lysin, druh kmen schopnost syntetizovat arginin a tet kmen schopnost syntetizovt leucin. Principu fze protoplast se pouv tak pi genovm inenrstv kvasinek, nebo, abychom doshli transformace kvasinkov buky plazmidovou DNA, musme kvasinkov buky pevst v protoplasty a plazmidovou DNA obalit umlou fosfolipidovou membrnou tepnm plasmid s emulz fosfolipid. Transformace pak probh za podmnek fze protoplast a mus bt nsledovna regenerac protoplast v buky. Cv.8.10 Poteby :
Pprava protoplast u Saccharomyces cerevisiae

100ml pdy . xx34 v 500 ml bace, steriln voda, steriln roztok KCl o

koncentraci 0,6 mol/litr, steriln roztok enzym trvicho traktu Helix pomatia (ne enzym), steriln centrifugan kyvety, centrifuga, rotan tepaka, reciprok tepaka, box o teplot 28oC, mlad kultura S. cerevisiae na ikmm agaru, potac komrka. Proveden : 1. Tekutou pdu v 500ml bace naokuj klikou z mlad kultury S. cerevisiae na ikmm agaru a inkubuj pes noc (10-12 h) pi 28oC za tepn, aby koncentrace bunk byla 107108/ml (exponenciln fze rstu). 2. Odcentrifuguj buky (310 min pi 1000 G) ve steriln kyvet, supernatant slij a buky resuspenduj ve steriln vod a znovu odcentrifuguj. Toto promyt opakuj jt jednou a pak buky resuspenduj do roztoku KCl (0,6 mol/litr) a opt odcentrifuguj. 3. Rozmchej buky do roztoku enzym trvicho traktu hlemd Helix pomatia tak, aby koncentrace bunk byla 108/ml (zjisti potac komrkou, viz kap. xxx7.2.) a mrn tepej na reciprok tepace pi 280C. Strana172

4. Po 45 min a pak v 15 min intervalech sleduj mikroskopicky v nativnm prepartu v kapce 0,6 M KCL ptomnost protoplast a v kapce H2O jejich lyzi (zvten je v obou ppadech 4510 nebo 6010). 5. Kdy se vtina bunk pemnila v protoplasty, pidej asepticky 100 ml roztoku KCl o koncentraci 0,6mol/litr, jemn promchej a odste (1000 G, 3 min). 6. Pak promyj stejnm zpsobem jet jednou. Supernatant by ml bt ir; je-li, zakalen, svd to bu o nedokonal centrifugaci nebo o sten lzi protoplast. Poznmka : Pro urychlen rozkladu stn nem enzymem se doporuuje susupendovat buky odstedn z kultivanho mdia na 10 min do roztoku obsahujcho Tris-HCl (10mmol/litr), sodnou sl ethylediaminotetraoctov kyseliny (EDTA) v konen koncentraci 5 mmol/litr a 1% 2-merkaptoethanolu s pH upravenm na 9,0. Koncentrace bunk m bt 108/ml roztoku. Pak se buky odsted, resuspenduj ve stejnm objemu 0,6 M KCl, znovu odsted a promyj KCl. Na odstedn buky se aplikuje zedn ne enzym a postupuje se, jak je uvedeno ve.

Cv.8.11
hybrid.

Fze protoplast u S. cerevisiae, jejich regenerace a izolace

Poteby :

jako ve cv.8.10 a jrt mlad kmen S.cerevisiae s komplementanmi

markery s kmenem ze cv.8.10, steriln roztok CaCl2 (0,3 mol/litr), steriln 30%n roztok polyethylenglykolu (o mol hmotnosti 4 000 nebo 6 000) v 0,1 M CaCl2, osmoticky stabilizovan agar (pda . xx36), 5 desek osmoticky stabilizovanho minimlnho agaru (tj. pda . xx28 nebo .yy29, u nich je vak destilovan voda nahrazena roztokem KCl (0,6 mol/litr). Proveden : 1. Piprav protoplasty z mladch kultur uvedench kmen kvasinek (oddlen pro kad kmen) postupem uvedenm ve cv.8.10. 2. Kdy se vtina bunk pemnila v protoplasty, zbav je centrifugac (1000 G, 10 min) neho enzymu a zbytk bunk a promyj zskan protoplasty nejdve 0,6 M KCl a pak 0,3 M CaCl2 za pouit centrifugace. 3. Pomoc potac komrky spotej hustotu protoplast v obou suspenzch a suspenze smchej ve steriln zkumavce tak, aby se z kadho kmene pouilo 108 protoplast.

Strana173

4. Pak sms opt odste, protoplasty resuspenduj ve 2 ml roztoku CaCl2, pidej k nim 2 ml 30%nho roztoku polyethylenglykolu v 0,1 M CaCl2, opatrn zamchej a nech stt 15 min. 5. Pozoruj agregaci protoplast pouhm okem i mikroskopicky v nativnm prepartu (bez pdavku vody). 6. Piprav desetinsobn zedn tto suspenze v roztoku polyethylenglykol-CaCl2 a pidej 0,5 ml tohoto zedn k 9,5 ml osmoticky stabilizovanho agaru (pda .xx36) v 100 ml Erlenmeyerov bace, kter je vytemperovan na 43o44C. 7. Rozmchej sms opatrnm krouivm pohybem a pipetuj 2 ml na 5 desek osmoticky stabilizovanho minimlnho agaru a rozlij (opatrnm naklnnm a krouenm misky) tento povrchov agar po celm povrchu desek. Po utuhnut inkubuj desky 36 dn pi 28C. 8. Spotej vyrostl kolonie a zjisti frekvenci komplementace (v % na pvodn poet protplast). Poznmka : Pro zjitn frekvence reverz protoplast se me suspenze protoplast v osmoticky stabilizovanm agaru zaokovat tak na stabilizovan komletn agar a pokraovat pak stejn jako u stabilizovanho minimlnho agaru.

Kontroln otzky ke kap.8 Zkladn genetick prce

1. Jak zjiujeme auxotrofn mutanty, respiran deficitn mutanty a mutanty rezistentn k uritmu antibiotiku? 2. Na em jsou zaloeny selektivn metody zjiovn mutant uritho fenotypy a jak citliv jsou tyto metody? Uvete pklady! 3. Meme pout selektivn metody tak pro zskn auxotrof a jak bychom pi tom postupovali ? 4. Jak znte postupy lechtn mikroorganism a kdy kter pouvme. 5. Co je to fenotypov lag a kdy k nmu musme pihlet? 6. Pro pi mutagenezi ultrafialovm zenm pracujeme v zatemnn mstnosti? 7. Jak je vztah mezi innost UV svtla a vzdlenost od ozaovanho objektu? 8. Jak m prbh kivka pevn po psoben UV svtla? 9. Jak znte chemick mutageny a jak je aplikujeme? Strana174

10. Co je to Amesv test a kdy se provd? Jak mikrobiln kmeny se pi nm pouvaj? 11. Co je to metabolick aktivace mutagenu a kdy a jak ji zjiujeme? 12. Jak testujeme haploiditu kvasinek? 13. Jak znte postupy ken a kdy je pouvme ? 14. Jak zskme polyploidn kmeny? 15. Co je to komplementace a kdy j pouvme? 16. Jak doshneme sporulace u kmen S.cerevisiae, jak u Schizosaccharomyces pombe? 17. K emu slou tetrdov analza a jak ji provdme? 18. Kdy pouvme hromadnou analzu spor u kavsinek a jak jsou jej vhody a nevhody? 19. U kterch mikroorganism pouvme fzi protoplast a v em spovaj jej vhody?

Strana175

HOSTITELSK KMENY ESCHERICHIA COLI

Nejbnj bakteri pouvanou v metodch molekulrn biologie je Escherichia coli, obsahujc cirkulrn chromosom o velikosti cca 3x106 pr bas. V bohatch medich poskytujcch krom nezbytnch minerlnch ltek i aminokyseliny, vitaminy, prekursory nukleovch kyselin a dal metabolity m E. coli v exponenciln fzi rstu za intenzivnho tepn pi 37C (v bace objemu minimln 5 vtm ne je objem media pro zajitn dostaten aerace) generan dobu cca 20 min. Ve stacionrn fzi je zpravidla dosaeno koncentrace cca 2x109 bunk/ml. Tato bakterie vak roste dobe i v minimlnm mediu obsahujcm glukosu jako jedin zdroj uhlku a energie a soli slouc jako zdroj dusku, fosforu, sry a stopovch prvk. Tto skutenosti lze vyut pro inkorporaci znaench prekursor do produkt metabolismu. Jedn se nap. o inkorporaci izotop 15N, 3H nebo 35S do protein pi bakteriln expresi. Detekn limit takto radioaktivn znaench produkt je o nkolik d ni ve srovnn s monost detekce neznaench protein. Znaen pomoc
15

N nebo

13

C se pouv pro znaen

protein ke strukturnm studim pomoc NMR spektroskopie. Pro klonovn jsou nejvhodnj bakteriln kmeny zajiujc stabilitu rekombinantn DNA, tj. kmeny zbaven schopnosti syntzy restriknch endonukleas, enzym schopnch degradovat cizorodou DNA. Je rovn vhodn pout kmen s poruenou schopnost homologn rekombinace (mutant recA), co sniuje riziko poruen integrity klonovan DNA. Hostitelsk buky pro bakteriofgy zpravidla obsahuj mutace potlaujc fgov mechanismy vedouc nap. k lyzi membrny E. coli. Pi vbru vhodnho kmene je teba se dit clem, k nmu m bt pouit, nap. pro amplifikaci DNA i expresi gen. Pro ely molekulrn genetiky byla pipravena ada mutant, jejich genotyp se obvykle udv jako seznam mutovanch alel. Ve vech manulech zabvajcch se metodami genovho inenrstv je uveden takovto seznam, Strana176

doplnn fenotypovmi projevy jednotlivch mutac. Jednotliv kmeny jsou komern dostupn a jsou dodvny vtinou spolenost zamench na produkty pro molekulrn genetiku. Nsledujc pehled zahrnuje jen nkter nejpouvanj kmeny a jejich genotypy.

9.1 DH1

Nkter bn uvan kmeny E. coli

recA1 endA1 thi-1 hsdR17 supE44 gyrA96 relA1 - rekombinan deficientn kmen, pouvan pro amplifikaci plasmidov a kosmidov DNA

DH5 DH5 JM101

odvozen od pedchozho, pouvan ke stejnm elm obsahuje navc mutace: 80 lacZM15 umoujc -komplementaci F traD36 proAB+ lacIq lacZM15 supE thi (lac-proAB) - kmen, pouvan pro amplifikaci plasmidov a kosmidov DNA, vhodn pro vektory nesouc amber mutaci

TG1 JMN110

odvozen od pedchozho, obsahuje navc mutaci hsd5, zabraujc modifikaci DNA, nedochz vak k jej restrikci dam dcm F traD36 proAB+ hsdR17 lacIq lacZM15 supE44 thi leu rpsL lacY gal ara tonA thr tsx (lac-proAB) - methylan deficientn kmen pro amplifikaci plasmidov DNA, nedochz vak k restrikci syntetizovan DNA

BL21(DE3)

hsdS gal cIts857 ind1 Sam7 nin5 lacUV5-T7 gene1 - kmen pouvan k vysok expresi gen klonovanch do vektor, obsahujcch promotor bakteriofga T7. Gen pro RNA polymerasu bakteriofga T7 je soust bakteriofga DE3, kter je integrovn do chromosomu bunk BL21

9.1.1 Genotyp

Fenotypov projev nkterch mutac Fenotypov projev

(DE3)

bakteriofg nesouc gen pro T7 RNA polymerasu je

integ

Strana177

ara dam, dcm endA1 F galK gyrA hsd lacI lacY lacZM15 komplementaci) proAB recA relA rpsL supE44 Sup+ thi1 tonA traD36 uvrA
9.2

blokuje katabolismus arabinosy DNA nen methylovna ve specifickch sekvencch (dam mutace endonukleasy (vysok kvalita plasmidov DNA) ptomnost F episomu schopnost utilizace galaktosy (Nal ) EcoKR-(M-)
r

meth

resistence ke kys. nalidixov (ovlivnn DNA gyrasy) nemodifikuje ani netp DNA nadprodukce lac represoru, inhibice transkripce z lac mutace galaktosidpermeasy, blok utilizace laktosy parciln delece genu -D-galaktosidasy (pro -

prom

prolinov auxotrof Recdefektn rekombinace relaxovan fenotyp - syntza RNA i bez syntzy protein mutace S12 30S ribosomln podjednotky - resistence ke ptomnost supresorovho genu tRNA, suprese nonsense mutac thiaminov auxotrof mutace proteinu vnj membrny resistence k T1 blok transferu F episomu UV citlivost k UV zen

strep

bakte

Uchovvn bakterilnch kultur pro genetick studie

Vzhledem k tomu, e je teba zachovat genetickou stabilitu pozmnnch kmen nen vhodn jejich uchovvn pasovnm na agarov pd. Tento zpsob toti zvyuje riziko rekombinac a dalch genetickch zmn. Proto je mon na agarovch pdch uchovvat pouze kmeny uren k brzkmu zpracovn (nap. nov transformovan buky, kter budou pouity pro ppravu DNA nebo expresi). Pro dlouhodob skladovn je vhodn uchovvat kultury zpsobem, pi nm nen nutno buky asto pomnoovat. Nejpouvanj metody jsou zmraen na velmi nzk teploty (-70C), lyofilizace nebo uchovn kultury narostl v mkkm agaru po inokulaci vpichem.

Strana178

Mnoho bakterilnch kmen me bt uchovvno na ikmm agaru pelitm sterilnm parafinovm nebo minerlnm olejem. K tomuto elu je vhodn pout buky z logaritmick fze rstu ppadn bakteriln sporult. Kultura je inkubovna na ikmm ivnm agaru a pot je zkumavka s kulturou doplnna parafinovm olejem tak, aby byl cel agar ponoen (tm je zabrnno jeho vysychn). Takto pipraven konservy lze uchovvat v lednici po nkolik let. Podobnm zpsobem lze uchovvat i kvasnin buky.

CV.9.1 Poteby : Proveden :

Pprava zmraen kultury

steriln glycerol, such led, ethanolov lze (70%), kryogenn ndobky se

roubovacm vkem 1. Smchejte v kryogenn ndobce 2 ml kultury ze stedn logaritmick fze s 1 ml sterilnho glycerolu. 2. Vlote do ethanolov lzn obsahujc such led (cca -70C). 3. Zmraen kultury uchovvejte pi -70C. 4. Pi oiven kultury sekrbnte steriln klikou nebo prtkem trochu zmrzl suspenze a rkujte na Petriho misku se ivnm mediem. 5. Dbejte na to, aby pi manipulaci s konzervou kultura neroztla (nejlpe je uchovvat ji na suchm ledu po celou dobu operace). Cv.9.2 Poteby : Proveden : 1. Do steriln, roubovac ndobky naplnn do 2/3 LB agarem, upravenm k tomuto elu ponote okovac kliku s kulturou. Nkolikrt vpich opakujte. 2. Inkubujte 8-12 h pi 37C s mrn povolenm vkem. 3. Pot pevn uthnte vko a skladujte pi 15 a 20C. 4. Pi oiven kultury naberte sterilnm okem mal kousek agaru a rozetete na Petriho misku rkovnm tak, aby byly po inkubaci zskny jednotliv kolonie. Cv.9.3
Pprava kultur s vrstvou parafinovho oleje Pprava kultur inokulovanch vpichem

kryogenn ndobky se roubovacm vkem naplnn do 2/3 LB agarem

Strana179

Poteby : Proveden :

zkumavka se ikmm ivnm agarem, steriln parafinov olej (olej se

steriluje suchm teplem pi 180C po dobu 2 h) 1. Okovac klikou inokulujte ikm agar s bohatou ivnou pdou vhodnou pro pslun kmen. 2. Inkubujte (v ppad E. coli cca 16 h, kvasinky cca 2 dny) pi optimln teplot do dosaen dostatenho nrstu. (v ppad inkubace na selektivnch minimlnch medich je teba dobu inkubace vrazn prodlouit). 3. Asepticky pelijte sterilnm parafinovm olejem. 4. Uchovvejte pi 4C. 5. Pi oiven postupujte stejn jako pi okovn z bnho ivnho agaru
9.3 Bakteriln plasmidov a fgov vektory

V souasn dob jsou pouvny ti zkladn typy vektor pro izolaci, amplifikaci (po-mnoen) a expresi klonovan DNA v prokaryotickch bukch. Jedn se o plasmidy, kosmidy a bakteriofgy. Vektory vech t skupin byly upraveny tak, aby vyhovovaly specifickm elm. Volba pslunho vektoru zvis na metod, k n m bt pouit. Byly konstruovny vektory vhodn, nap. pro ppravu velkho mnostv plasmidov DNA, vysokou expresi protein, clenou mutagenezi, ppravu radioaktivn znaench sond i genomovch knihoven.
9.3.1 Bakteriln plasmidy

Bakteriln plasmidy jsou extrachromosomln elementy velikosti cca 1000-200 000 pr bas, kter jsou schopn autonomn replikace. Jsou tvoeny dvojetzcovou, uzavenou, kruhovou DNA. Jejich replikace me, ale nemus, bt synchronizovan s replikac bakterilnho chromosomu a s cyklem bunnho dlen. Pokud oba procesy nejsou synchronizovan me poet plasmid v buce doshnout nkolika set kopi (tzv. relaxovan plasmidy). Obecn se za plasmidy s velkm potem kopi (high copy number) potaj takov, kter se vyskytuj ve vtm potu ne 20 v jedn buce. Tyto plasmidy jsou vhodn pro zskn velkho mnostv DNA pro dal prce. Vechny plasmidy v souasn dob pouvan ke klonovn jsou oproti pirozenm plasmidm upraven. Krom potku replikace obsahuj marker umoujc Strana180

zvhodnn rst transformovanch bakteri, nebo i za optimlnch podmnek je toti plasmid vnesen pouze do mal sti bunn populace. Proto je teba vyvinout selekn tlak pro podporu rstu tchto bunk. Pro tento el bv zpravidla pouit gen, jen se fenotypov projevuje jako dominantn rezistence k uritmu antibiotiku. Nejastji se pouvaj geny zodpovdn za rezistenci k ampicilinu, tetracyklinu, chloramfenikolu a kanamycinu. Tato antibiotika psob rznm mechanismem (viz tab.xxx ) a vdy je teba erstv transformovan buky inkubovat nejprve v mediu bez inhibitoru tak, aby byl pekonn tzv. fenotypov lag. Bhem tto doby (30-60 min) dochz k syntze genovho produktu odpovdajcho za rezistenci. Dalm sekem, kter upednostuje umle konstruovan plasmidy ped pirozenmi, je polyklonovac msto, co je sek DNA umstn mimo ostatn dleit sekvence, kter obsahuje clov sekvence pro restrikn endonukleasy. Tato restrikn msta jsou obsaena v plasmidu v jedinm exempli, co zaruuje snadnou monost inzerce dalho seku DNA.
9.3.2 Plasmidov inkompatibilita

Buky obvykle nemohou obsahovat dva rzn typy plasmid. Tento jev se nazv plasmidov inkompatibilia a plasmidy, nap. pMB1 a ColE1, jsou pak oznaovny jako vzjemn inkompatibiln. Lze tak ci, e pat do spolen inkompatibiln skupiny, kter zahrnuje plasmidy se stejnch potkem replikace. Dvodem inkompatibility je vzjemn kompetice o faktory iniciujc replikaci. Nsledujc tabulka uvd nkter bn pouvan plasmidy a jejich replikony zodpovdn za pslunost do jednotlivch inkompatibilnch skupin.
Derivty plasmidu Replikon Poet kopi v buce

pBR322 pUC pACYC pSC101 ColE1

pMB1 pMB1 p15A pSC101 ColE1

15-20 500-700 10-12 ~5 15-20

Plasmidy obsahujc replikony ColE1 a pMB1 jsou vzjemn inkompatibiln. Jsou vak kompatibiln s ostatnmi plasmidy v tabulce. Strana181

9.3.3

Bn pouvan plasmidov vektory pBR322

1)

Klasickm plasmidovm vektorem se stal pBR322 (viz. obr.). Jedn se o mal (3,2 kb) plasmid, kdujc rezistenci k ampicilinu a tetracyklinu. V obou tchto genech jsou vhodn restrikn msta, kter se neopakuj na jinm mst v plasmidu, take lze rezistenci k tmto antibiotikm v ppad poteby zruit (tzv. inzertn inaktivace). Ztrta rezistence k antibiotiku tedy dokazuje, e dolo k spnmu vloen inzertu. Tento vektor byl v posledn dob vytlaen vhodnjmi, nov konstruovanmi plasmidy.

2)

pUC18 a pUC19

Strana182

Jedn se o toton plasmidy s tm rozdlem, e nesou opan orientovan polyklonovac msta. Jako selekn marker slou rezistence k ampicilinu. Vektory pUC se vyskytuj v transformovanch bukch ve velkm potu kopi, nebo neobsahuj gen (tzv. rop-gen), kdujc protein zodpovdn za kontrolu jejich replikace. Tyto plasmidy obsahuj krtk sek DNA kdujc regulan sekvenci a potek genu pro -galaktosidasu (lacZ). Do tohoto seku bylo vloeno polyklonovac msto tak, aby nedolo k posunu techo rmce. Vzhledem k velmi mal dlce inzertu a zachovn techo rmce nen vrazn poruena struktura ani aktivita produktu. Genov produkt zmnnho seku sm nevykazuje enzymovou aktivitu, ale po jeho expresi v bukch kdujcch pouze zbyl C-koncov sek enzymu me dojt ke spojen obou podjednotek a k tvorb katalyticky aktivnho proteinu. Dochz tedy ke komplementaci mutantu s delec N-koncovho seku pomoc plasmidu obsahujcho tuto chybjc st. Tento typ je nazvn -komplementace. Lac+ bakterie lze snadno detegovat na zklad modrho zbarven koloni vyrostlch v ptomnosti chromogennho substrtu, tj. 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galaktosidu (X-gal). Vloenm inzertu do polyklonovacho msta plasmidu dojde k peruen sekvence kdujc N-koncovou st enzymu. Takto pokozen sek ji nen schopen komplementace. U bunk obsahujcch takovto plasmid tedy nedochz ke tpen Xgal a vznikl kolonie zstvaj bl. Pro potvrzen struktury tchto plasmid lze opt pout restrikn analzu.

Strana183

9.4 9.4.1

Izolace plasmidov DNA Lyze bakterilnch bunk

Pro izolaci vtiny v souasnosti pouvanch plasmid postauje bunn kultura kultivovan do pozdn logaritmick fze v tekutm mediu obsahujcm antibiotikum zajiujc selekci pslunch transformant. V ppad plasmid s nim potem kopi lze bhem kultivace pout pdavek chloramfenikolu, kter inhibuje syntzu bunnch protein a tm i replikaci bakterilnho chromosomu. Replikace plasmid vak jet po nkolik hodin pokrauje, co vede k nahromadn vtho potu kopi plasmidov DNA. Nkdy vede ke zven mnostv plasmidov DNA kultivace v bohatm mediu (nap. TB). Vbr vhodnho postupu zpravidla zvis na velikosti plasmid. Plasmidy vt ne 15 kb jsou keh a je nutno pout etrnjch metod pro jejich izolaci. Bakteriln stny jsou v tomto ppad degradovny v izotonickm roztoku sacharosy pomoc lysozymu a EDTA. Vznikl sfroplasty jsou lyzovny pdavkem detergentu (nap. SDS). Pro izolaci malch plasmid z bakterilnch bunk lze pout drastitj metody lyze nap. varem nebo pdavkem NaOH. 1)
Preparace plasmidov DNA

Volba postupu zvis krom velikosti plasmidu i na poadovanm mnostv a istot DNA. Pro adu el postauje velmi mal mnostv DNA zskan z 1-2 ml kultury. Vtek zvis tak na pouitm bakterilnm kmeni E. coli. Dobr vsledky poskytuj nap. kmeny DH1, DH5, C600 a LE392, zatmco kmeny HB101 a srie JM100 maj vy nukleasovou aktivitu, kter nen zcela inaktivovna varem. ada laboratornch pruek doporuuje pi selhn jedn metody zkusit jinou.

Strana184

Metoda alkalick lyze je zaloena na faktu, e vtina chromosomln DNA, bakterilnch protein a SDS precipituje pi neutralizaci siln alkalickho roztoku pomoc octanu draselnho. Precipitt je odstrann centrifugac. V ppad poadovan vy istoty se zbyl kontaminujc ltky extrahuj ekvimolrn sms fenolu a chloroformu. Plasmidov DNA je pot ze supernatantu precipitovna ethanolem nebo isopropanolem. Pi varn metod jsou buky lyzovny lysozymem, Tritonem-X100 a nslednm varem. Chromosomln DNA zstv po tomto zsahu pichycena k bakteriln membrn a je peletovna krtkou centrifugac stejn jako varem denaturovan proteiny. Plasmidov DNA je pot precipitovna ethanolem nebo isopropanolem. Minipreparace alkalickou lyz slou k rychl pprav DNA v mnostv a istot dostaten pro sekvenovn nebo pro restrikn tpen i pro transformaci hostitelskch bunk. Cv.9.4 Poteby :
Minipreparace alkalickou lyz

LB medium, antibiotikum (ampicilin 50 mg/ml) - skladovat pi -20C,

ethanol velejemn, sms fenol-chloroform 1:1, - skladovat v temn lahvi pi 4C, fenol je nutno ped pouitm pro ppravu smsi ekvilibrovat na pH nad 7,8 (viz dodatky), pi nim pH by mohla DNA pechzet do organick fze; RNasa, zbaven DNasy 10 mg/ml - skladovat pi -20C; Roztok I: (glukosa/Tris/EDTA) pH 8,0, Roztok II: (NaOH/SDS) Roztok III: 4C; ledov lze. Kultivace bunk : 1. Zaokujte jednu kolonii nebo ekvivalentn mnostv bunk ze ikmho agaru do 2 ml LB media obsahujcho ampicilin (50 l zsobnho roztoku). 2. Inkubujte 12-24 h pi 37C za intenzivnho tepn. Lyze bunk a izolace DNA : 1. Pevete 1,5 ml kultury do mikrozkumavky, odsteujte 1 min. pi 12 000-15 000 G pi 4C. Odsajte supernatant tak, aby byla peleta co nejsu. 50 mM glukosa - skladovat pi 4C, 25 mM Tris.Cl 10 mM EDTA, lysozym (na piku pachtle); 0,2 M NaOH - pipravit vdy erstv, 1 % SDS; 3 M NH4COOH, 1.5 % CH3COOH - skladovat pi

Strana185

2. Resuspendujte bakteriln peletu ve 100 l ledovho roztoku I opakovanm pipetovnm a vortexovnm. Je nutn dokonale resuspendovat! Pidejte lysozym (na piku pachtle). Inkubujte 5 min. za laboratorn teploty. 3. Pidejte 200 l erstv pipravenho roztoku II. Pevn uzavete zkumavku a promchejte obsah pevracenm (cca 5) tak, aby byl cel vnitn povrch zkumavky oplchnut. Nevortexujte a nemchejte intenzivn! Inkubujte na ledu 5 min. 4. Pidejte 150 l ledovho roztoku III. a vortexujte 2 s tak, aby dolo k plnmu promsen. Inkubujte na ledu 10 min. 5. Odsteujte 5 min pi 12 000 G pi 4C a pevete supernatant do nov mikrozkumavky. Pidejte 1 l RNasy (10 mg/ml) a inkubujte 30 min. pi laboratorn teplot. 6. Pidejte stejn objem (cca 400 l) smsi fenol-chloroform (1:1). 7. Dobe promchejte vortexovnm a odsteujte 2 min. pi 12 000 G pi 4C. Pevete supernatant do nov mikrozkumavky. Vyvarujte se odebrn mezifzovho rozhran! 8. Precipitujte plasmidovou DNA dvojnsobnm objemem ethanolu. Inkubujte na ledu 10 min. Odsteujte 10 min. pi 12 000 G pi 4C. Opatrn odsajte supernatant tak, abyste neporuili peletu. Odstrate zbvajc kapky roztoku na stnch. 9. M-li bt DNA pouita ke tpen restriknmi endonukleasami, oplchnte peletu 1 ml 70 % ethanolu (4C), odstrate supernatant, vysute peletu a rozpuste ji v 50 l vody nebo TE (pH 8,0). Poznmka : Pi prci s fenolem pouvejte rukavice a bute obzvlt opatrn. Fenol me zpsobit tk popleniny! Potsnte-li se fenolem okamit oplchnte postien msto dkladn vodou. Cv.9.5 Poteby : Proveden : 1. Bunnou kulturu narostlou pes noc za tepn pi 37C ve 200 ml LB media odstete pi 5 000 G 20 min, 4C. 2. Peletu resuspendujte ve 14 ml roztoku I (glukosa/Tris/EDTA), rozdlte do dvou 50 ml kyvet (Falcon se roubovacm uzvrem) a pidejte lysozym (na piku pachtle). Inkubujte 10 min pi laboratorn teplot.
Izolace DNA z velkho objemu

stejn jako cv.9.4

Strana186

3. Nsledujc objemy jsou udvny pro jednu z kyvet. 4. Pidejte 14 ml roztoku II (NaOH/SDS). Uzavete kyvety a jemn promchejte nkolikansobnm obrcenm uzaven kyvety. Ponechte 5-10 min pi laboratorn teplot. 5. Pidejte 11,5 ml ledovho roztoku III (NH4COOH /CH3COOH). Promchejte nkolikrt a ponechte alespo 10 min na ledu. Bhem tto doby se vytvo bl, vlokovit precipitt, obsahujc chromosomln DNA, RNA, a komplexy sol, SDS a protein. 6. Odsteujte 15 min pi 4C pi 4 000 G (cca 4 000 rpm, Sorval TC6. Pokud se nepoda odstranit precipitt, odstete pi vych otkch 5 000 rpm). 7. Opatrn odstrate bl povlak z povrchu a opatrn pevete pipetou supernatant do nov zkumavky. Pidejte 15 ml smsi fenol-chloroform (1:1) a dkladn protepte. Odstete 10 min pi 3 000 G. Supernatant pevete do 50 ml kyvety (Beckman). Pokud nen supernatant ir, opakujte fenol-chloroformovou extrakci. 8. Pidejte stejn objem ethanolu nebo isopropanolu a ponechte na ledu nebo pi -20C alespo 10 min (lze ponechat libovoln dlouho). 9. Odstete pi 20 000 G (cca 12 000 rpm, rotor Beckman J-20), 15 min pi 4C. 10. Odlijte supernatant, ponechte kyvety v obrcen poloze na filtranm pape tak aby mohlo vytci rozpoutdlo. Odsajte zbytky rozpoutdla, oplchnte peletu 70%nm ethanolem a vysute ji. 11. Rozpuste peletu v 0,5 ml TE. V ppad poteby purifikujte nsledujcm postupem cv.9.6). 2)
Purifikace plasmidov DNA

Pokud je poadovna plasmidov DNA velmi vysok istoty, lze pout pro purifikaci prepartu, zskanho jednm z ve zmnnch postup, centrifugaci v gradientu CsCl. Nevhodou tto metody je jej asov nronost a nkladnost, co se tk nejen zazen (ultracentrifuga), ale i chemikli (velk spoteba CsCl). Dal monost purifikace je precipitace polyethylenglykolem. Tato metoda je rychl a relativn inn. Existuje tak cel ada komernch souprav zaloench na chromatografick purifikaci nebo na sorpci plasmidov DNA na membrny uchycen v mikrozkumavkch. Izolovanou DNA lze skladovat po nkolik tdn v TE pufru pi 4C nebo zmraenou na -20C nebo -70C po nkolik let.

Strana187

Izolace plasmidov DNA na komernm nosii (pevzato z Technickho Bulletinu firmy Promega) umouje pomrn innou purifikaci DNA bez pouit ultracentrifugy, ovem s pouitm komernch kolon na jedno pouit. Uveden metoda je zaloena na purifikaci DNA z bunnch lyzt na kolonch firmy Promega. Analogick kity lze zskat i od jinch spolenost nap. Quiagene a dalch. Pro purifikaci DNA z fgovch lyzt lze pout krom metody izolace DNA pomoc stupov a rovnovn centrifugace v gradientu CsCl i peitn na ionexovm nosii. Bakteriofgy jsou separovny od bunk a bunnch zbytk pomoc centrifugace a nsledn je odstrann CsCl. Cv.9.6 Poteby : Proveden : 1. Odstete 10 ml bunn kultury (narostl pes noc) 2. etrn resuspendujte buky ve 300 l pufru (resuspension buffer) a pidejte 2 l zsobnho roztoku RNasy A. Pevete do mikrozkumavky. 3. Pidejte 300 l lyzovacho pufru a opatrn promchejte nkolikansobnm pevrcenm. Bunn suspenze by se mla rychle vyeit - pokud ne pokraujte v mchn do vyeen. 4. Pidejte 300 l neutralizanho pufru a opatrn promchejte nkolikansobnm pevrcenm. 5. Odsteujte 3 min v mikrocentrifuze pi maximlnch otkch (~15 000 g). 6. Pevete supernatant do nov mikrozkumavky a opakujte odstedn. 7. Rozdlte vyeen supernatant do dvou mikrozkumavek (po cca 400 l) 8. Pidejte po 500 l purifikan pryskyice WizardTM Miniprep do kad mikrozkumavky, dobe promchejte a ponechte 5 min pi laboratorn teplot (obas promchejte). 9. Pevete obsah obou mikrozkumavek do 5 ml injekn stkaky. Opatrn do n zasute pst a pomalu protlate do minikolony. 10. Promyjte 3 - 4 ml promvacho roztoku (protlaenm roztoku pomoc injekn stkaky) 11. Odstrate stkaku a vlote minikolonu do mikrozkumavky. Odstete pi maximln rychlosti po dobu 1 min.
Izolace plasmidov DNA na komernm nosii

Wizard kit pro purifikaci DNA, RNasa A - 20 mg/ml.

Strana188

12. Pevete minikolonu do nov mikrozkumavky a aplikujte na ni 100 l steriln deionizovan vody zaht na 70C a ponechte 1 min. 13. Eluujte DNA 1 min centrifugac. Cv.9.7 Poteby : 7,5], 5 ml elatina [2%]), CsCl, ekvilibrovan fenol, chloroform, TE [pH 8,0]. Proveden separace fgovch stic : 1. Odstete bunn zbytky centrifugac 1 l fgovho lyztu pi 18 000 G 10 min pi 4C. 2. Pevete 800 ml supernatantu do 1 l odmrnho vlce a pidejte 200 ml roztoku 5 x PEG. Pekryjte vlec parafinem a promchejte nkolikansobnm jemnm otoenm. 3. Ponechte precipitovat pes noc pi 4C. 4. Odlijte st supernatantu do kdinky (cca 50 ml) pro vyplchnut zbytku precipittu. 5. Vylijte opatrn (aby nedolo ke ztrt precipittu) zbyl supernatant a pevete precipitt do 50 ml kyvety (Falcon). Vyplchnte nkolikrt vlec supernatantem (z kroku 5) a pidejte podly suspenze do kyvety. 6. Odstete 10 min pi 3 000 G pi 4C. 7. Vlote kyvetu na led a opatrn odstrate supernatant. 8. Resuspendujte blou pastu v minimlnm objemu SM (objem pidanho SM by neml peshnout trojnsobek objemu pasty). Zmte objem suspenze a pevete ji do 150 ml baky. 9. Pidejte ve tyech stejnch alikvotech pevn KCl tak, aby jeho finln koncentrace v suspenzi byla 1 M. Po kadm pdavku dkladn promchejte. Inkubujte na ledu 15-30 min. 10. Pevete suspenzi do 50 ml kyvety (Falcon) a odstete 10 min pi 12 000 G pi 4C. (PEG zstane v pelet, zatmco bakteriofg je v supernatantu.) Proveden izolace fgovch stic :
Izolace DNA z lyzt bakteriofga pomoc stupov a rovnovn

centrifugace v gradientu CsCl

5 x polyethylenglykol 8 000 (PEG), SM pufr (na 1 l, 5,8 g NaCl, 2 g MgSO4.7.H2O, 50 ml Tris.Cl [1 mol, pH

Strana189

1. Pipravte do kyvety SW-28 gradient CsCl o tech koncentracch (je-li k dispozici jin rotor zachovejte piblin vzjemn pomry : 3,5 mld=1,7 g/ml, 2,5 mld=1,5 g/ml, 2,5 mld=1,3 g/ml. 2. Jednotliv vrstvy mus bt pidvny injekn stkakou se irokou jehlou velmi pomalu, aby nedolo k jejich promchn. 3. Opatrn pevrstvte lyztem fga (supernatant z pedchozho protokolu). 4. Doplte cca 2 mm pod okraj SM. Odsteujte 2 h pi 100 000 G pi 15C. 5. Opatrn odsajte znu obsahujc bakteriofg pomoc injekn stkaky zasunut zpotku tsn pod ni. Pomalu posunujte jehlu vzhru v prbhu odsvn. (Zna obsahujc bakteriofg je zpravidla na rozhran dvou hustch roztok. Nen-li zna viditeln nem zpravidla vznam pokraovat v izolaci). 6. Pevete roztok do zatavovac kyvety a doplte ji roztokem CsCl o koncentraci 1,5 g/ml. 7. Odstete 24 h pi 80 000 G pi 15C. 8. Odsajte znu obsahujc fga (mla by bt vidt pouze jedna zna). Proveden extrakce fgov DNA : 1. Dialyzujte 4 h za mchn proti 0,5 l pufru (50 mM NaCl, 50 mM Tris.Cl, pH 7,5, 10 mM MgSO4) pi 4C. Dvakrt opakujte. 2. Tikrt extrahujte stejnm objemem pufrovanho fenolu. 3. Extrahujte dvakrt stejnm objemem chloroformu. 4. Dialyzujte 8 h za mchn proti 0,5 l TE pi 4C.
9.4.2 Vnesen plasmidov DNA do bakterilnch bunk

Vstup izolovan molekuly DNA do bakteriln buky se nazv transformace. K to-muto procesu me dochzet spontnn u recipientnch bunk ve stavu kompetence, co je schopnost transportovat DNA z media do buky. Pro inn vnesen DNA do bakterilnch bunk existuje nkolik metod. Nejinnjm postupem je tzv. elektroporace. Tato metoda je velmi rychl, ale vyaduje speciln, nkladn zazen. Elektroporace rozila aplikan monosti penosu DNA i na velk plasmidy a buky, u nich ostatn techniky selhvaly. Pi tto technice jsou buky podrobeny velmi silnmu elektrickmu oku, kter zpsob lokln

Strana190

zmny v membrn a tm vznik pr, jimi DNA prochz do bunk. Elektroporac lze doshnout frekvence 109-1010 transformant na 1 g plasmidov DNA. Dal metodou je pouit CaCl2 pro ppravu bunk schopnch pijmout plasmidovou DNA, tzv. kompetentnch bunk. Tato metoda sice neumouje zskn tak vysokho mnostv transformant jako pedchoz, ale je pomrn jednoduch a zskan kompetentn buky lze skladovat po nkolik msc pi -70C. Velmi dleit je pi tto metod optimln fysiologick stav bunk. Proto je teba pesn dodret pedepsan kultivan podmnky a zskat buky z potku logaritmick fze (OD590 cca 0,375). Dle je teba dbt na to, aby vechny kroky nsledujc po kultivaci byly provdny pi 4C. Vzhledem k tomu, e buky se stvaj citlivmi k mechanickmu pokozen, je nutn zachzet s nimi jemn, tzn. nemchat je intenzivn a odsteovat pi nzkch otkch (max. 1 600 G). Je znmo opt nkolik modifikac, jako je pouit Rb+, Mn++ nebo K+ iont msto Ca++ a pdavky rznch inidel, jako dithiothreitol nebo dimethylsulfoxid. Pro uspokojiv vsledek pi pprav kompetentnch bunk pomoc CaCl2 a jejich transformaci je teba zajistit dostatenou aeraci a odbr z potku exponenciln fze rstu (pi nrstu kultury nad OD550 ~ 0,4 dochz ke snen innosti transformace). Pot jsou buky vystaveny psoben CaCl2 za snen teploty. Takto pipraven kompetentn buky jsou schopn pijmout plasmidovou DNA. Cv.9.8 Poteby :
Pprava kompetentnch bunk pomoc CaCl2 a jejich transformace

LB medium tekut; LB - agar s ampicilinem; CaCl2 - 100 mM, pH 8,0 -

vychlazen; vychlazen kyvety a pipety. Proveden ppravy kompetentnch bunk : 1. Pipravte inokulum E. coli ve 20 ml LB media. Inkubujte pes noc za tepn pi 37C. 2. 1 ml zskanho inokula pouijte pro zaokovn 100 ml pedehtho LB media v 1 l bace. 3. Inkubujte za intenzivnho tepn pi 37C do OD550 ~ 0,375. 4. Ponote baku s kulturou do ledov tt a inkubujte 10 min. Od tto doby mus vechny manipulace probhat v chladu! Buky jsou rovn velmi citliv na mechanick pokozen - nelze je tedy vortexovat, intenzivn mchat a odsteovat pi vysokch otkch. Strana191

5. Odsteujte 10 min. pi 4C a 1500 G. Resuspendujte buky v 50 ml vychlazenho roztoku CaCl2 a asepticky pevete do vychlazench, sterilnch kyvet. Inkubujte na ledu 20 min. 6. Odsteujte 10 min. pi 4C a 1500 G. Pelety resuspendujte ve smsi 1,75 ml ledovho roztoku CaCl2 a 0,75 ml glycerolu a rozdlte po 100 l. 7. Inkubujte alespo 30 min. na ledu. Buky, kter nebudou ihned pouity k transformaci lze zmrazit v lzni obsahujc sms ethanolu a suchho ledu (- 70C) a uchovvat pi - 80C. Proveden transformace : 1. Roztavte v ledov lzni mikrozkumavku obsahujc 100 l suspenze kompetentnch bunk 2. Do mikrozkumavky obsahujc 100 l suspenze kompetentnch bunk pidejte plasmidovou DNA (objem odpovdajc 10 ng-1g). Jemn zamchejte a ponechte 10 min na ledu. 3. Vystavte buky tepelnmu oku 2 min pi 42C. 4. Pidejte 1 ml LB media a inkubujte 1 h pi 37C. 5. Dobe ochlazenou steriln sklennou hokejkou rozetete max. 200 l alikvoty na Petriho misky obsahujc ampicilin. Jako kontrolu pouijte netransformovan buky. 6. Inkubujte pes noc pi 37C.
Identifikace koloni obsahujcch rekombinantn plasmid

9.4.3

Selekce na pd obsahujc ampicilin zajist rst pouze tch koloni, v nich je ptomen plasmid nesouc a exprimujc gen pro -laktamasu, tj. enzym degradujc toto antibiotikum. Selekce transformovanch bunk vak nedv informaci o innosti ligace, tj. vloen pslunho fragmentu DNA. Ptomnost vloenho inzertu do pslunho vektoru je mono prokzat nkolika zpsoby. Bn metoda je analza velikosti DNA nebo ptomnosti novch restriknch mst (vnesench inzertem) v DNA izolovan z jednotlivch klon po ligaci a transformaci. Dal metody jsou zaloeny na inzern inaktivaci enzym kdovanch vektorem (izern inaktivace a komplementace). Hybridizace koloni vyaduje pouit znaen sondy (tj. specifickho fragmentu DNA odvozenho od sledovan sekvence).

Strana192

9.5

Bakteriofgov vektory

Nzev bakterilnch vir tedy bakteriofg nebo zkrcen fg je odvozen z eckho phage jst a popisuje vyjeden plaky viditeln na agarov misce porostl bakteriln kulturou.
9.5.1 Bakteriofg

Genom bakteriofga obsahuje piblin 50 kb a je uloen v dvojetzcov DNA. Tato molekula se nachz ve fgovch sticch v linern form s jednoetzcovmi komplementrnmi konci (tzv. cos msta). Tato msta umouj cirkularizaci fgovho genomu a tm i jeho replikaci. Po infekci hostitelsk buky se toti tyto konce spoj za vzniku kruhov molekuly. Zlomy jsou pot doplnny ligasou hostitelsk buky na uzavenou kruhovou DNA, kter slou jako templt pro replikaci a transkripci. Genom bakteriofga me bt pi lyzogenn infekci integrovn specifickou rekombinac do chromosomu hostitelsk buky. V tto form se stv soust genomu dalch bunk infikovan populace. Pi lytickm cyklu je fgov DNA velmi inn replikovna. Vznik velk mnostv kopi fgov DNA, kter jsou inkorporovny do nov vznikajcch fgovch hlaviek. Buka je pot lyzovna a bakteriofgy jsou uvolnny a mohou napadnout dal buky. Povrchov proteiny, kter vykonvaj funkci receptor zodpovdnch za pichycen bakteriofga slou buce zrove jako penae maltosy. Vzhledem k tomu, e syntza tohoto penaee je indukovna maltosou, mus bt bakterie, kter maj bt infikovny bakteriofgem kultivovny v mediu obsahujcm maltosu. Kultivace bakteriofg se ponkud li od bn kultivace bakteri. Pi inokulaci je nutn nejprve smchat promyt buky E. coli s bakteriofgem a inkubovat v MgSO4 roztoku, kter stimuluje sorpci fga na povrch bakteri. Zpravidla je teba pipravit nkolik edn bakteriofga. Po uchycen fg se suspenze rozmch v rozehtm agaru vytem-perovanm na 47C a rychle vylije na povrch agaru na Petriho misce. Po 12-16 h inkubaci pi 37C se v souvislm bakterilnm nrstu objev transparentn zny tzv. plaky nebo dvorce. Kad plak je vlastn vsledkem infekce jedin buky jednou fgovou stic. Fgy uvolnn po lyzi napaden buky mohou v omezenm prostoru

Strana193

migrovat polotuhou agarovou pdou a napadat dal buky v bezprostednm okol. Kad plak tedy obsahuje geneticky homogenn populaci bakteriofg. V souasn dob je k dispozici velk vbr bakteriofgovch vektor pro rzn ely. Neexistuje universln vektor, kter by sploval poadavky pro klonovn vech fragment DNA, kter pichzej v vahu. Pi vbru bakteriofgovch vektor jsou nejdleitj nsledujc kriteria : Ptomnost vhodnch restriknch mst, Velikost inzertu, kter m bt klonovn, Dal pouit vloen sekvence; nap. exprese genu. Vbr vektoru splujcho prvn kriterium nen problmem. Jednotliv vektory se li rznmi kombinacemi restriknch mst v polyklonovacch secch. Vtm problmem zstv omezen velikosti inzertu. Pro lytick cyklus bakteriofga jsou nutn pouze asi dv tetiny genomu. Centrln tetina genomu me bt nahrazena inzertem, ani by byl zasaen ivotn cyklus fga . Jeho ivotnost vak prudce kles jeli genom vt ne 105% nebo menm ne 78% ve srovnn se standardnm kmenem. Je tedy nutn najt vhodnou kombinaci vektoru a inzertu zajiujc optimln dlku genomu. Toto omezen me bt vyuito pro selekci vektor obsahujcch inzert, byla-li ped klonovnm z vektoru centrln oblasti odstranna. .Obdobn jako u plasmidovch vektor, pouvaj se i u fgovch vektor genetick markery, umoujc detekci rekombinantnch bakteriofg. Nejpouvanjm je ve zmnn gen pro -galaktosidasu (lacZ). Rekombinantn bakteriofgy tvo bezbarv plaky, zatmco bakteriofgy postrdajc inzert rozkldaj chromogenn substrt a tvo modr plaky. Krom detekce pomoc lacZ existuj v ppad vektor obsahujcch genom bakteriofga dv selekn metody.
9.5.2 hfl- selekce

Tento typ genetick selekce je zaloen na vyuit genu kontrolujcho lyzogenii, tj. genu cI. Tento gen kduje represor, kter se ve na opertory OL a OR, blokujc tanskripci asnch gen a tm i lytick rst. represor se ve tak na vlastn promotor, m stimuluje vlastn transkripci. Tent protein tedy psob zrove jako represor i aktivtor transkripce. Tento gen je zodpovdn za velmi innou indukci lyzogenie v kmenech E. coli nesoucch mutaci hfl- (high frequency of lysogenisation). Takovmto vektorem je nap. gt10. Produkty hfl gen stabilizuj produkt genu cII, kter je

Strana194

pozitivnm regultorem genu cI. V tchto mutantech se tedy akumuluj produkty gen cI a cII. Vsledkem je potlaen lytickho cyklu a velmi inn navozen lyzogenie. Principem selekce je v tomto ppad inaktivace cI genu v nm je umle vytvoeno EcoRI restrikn msto. Bakteriofgy, obsahujc inzert v tomto genu lyzuj hfl- kmeny E. coli a tvo zeteln plaky, zatmco fgy s nepokozenm cI genem plaky netvo.
9.5.3 spi- selekce

Tento zpsob selekce je zaloen na faktu, e bakteriofg neroste v lyzogennch, bakterilnch kmenech, nesoucch profga P2, oznaovanch spi+ (sensitivn k P2 interferenci). Naopak mutantn fgov kmeny neobsahujc geny pro rekombinaci red- a gam- rostou v P2 lyzogennch kmenech a vykazuj spi- fenotyp v rec+ kmenech. Vektory bn pouvan pro tento typ rekombinace nap. 2001 nebo EMBL3 obsahuj fragment s red+a gam+ geny. Tyto vektory netvo plaky na P2 lyzogenech, dokud nedojde k odstrann red+a gam+ fragmentu a jeho nhrad fragmentem klonovan DNA.
9.5.4

ZAP - bluescript M13 Plasmidy pojmenovan bluescript M13+ a bluescript M13- obsahuj potek

replikace bakteriofga M13. Li se orientac tohoto seku a v dsledku toho poskytuj v ppad infekce bakteriofgem jednoetzcovou DNA bu
+

nebo - orientace. Mohou

tak poskytnout RNA, kter je komplementrn k jednomu z obou etzc inzertu, nebo na koncch polyklonovacho msta obsahuj opan orientovan promotory bakteriofg T3 a T7 .
9.5.5 Tvorba bakteriofgovch plak

Clem tto metody je stanovit poet jednotek tvocch plaky na ml (pfu/ml plaque forming units/ml). Toto stanoven je mtkem koncentrace infeknch fg a je zkladem pro dal prci a ppravu poadovan koncentrace fg pro dal prce tak, aby nedochzelo k pekryvu jednotlivch plak pi inkubaci fg. Nejpouvanj metodou je pelivov metoda, jej pomoc se sleduje poet vytvoench przranch plak (dvorc) v souvislm nrstu bakteri na agarov pd v Petriho misce. Princip spov v tom, e se zedn suspense bakteriofga resuspenduj v roztaven a vytemperovan agarov pd. Pak se sms s bukami citlivho bakterilnho kmene. Tato sms se aplikuje na Petriho misky, kde po rozprosten vytvo tenkou vrstvu. Po

Strana195

inkubaci se v mstech, kde byly ptomny fgov stice vytvo transparentn kruhov zny, jejich poet je mrn koncentraci bakteriofga. Cv.9.9 Poteby :
Tvorba bakteriofgovch plak

SM suspensn medium (na litr 5.8 g NaCl, 2 g MgSO4.7H2O, 50 ml 1 M LB medium, agar (10g Trypton, 5g Yeast Extract, 5g NaCl, 100l 10 m

Tris-HCl [pH 7.5], 0,1 g elatina [Difco]), NaOH; doplte H2O do 1l, pro ztuen pidejte 15g bacto-agaru, sterilujte v autoklvu). NZY medium, agar, top agarosa (5g NaCl, 2g MgSO4.7H2O, 5g Yeast Extract, 10g NZ Amine-A [kaseinov hydrolyzt], 300l 10 m NaOH; doplnit H2O do 1 l, pro ztuen pidejte 15g bacto-agaru, pro vytvoen top agarosy pidejte 7g agarosy, sterilujte v autoklvu. Po autoklvovn, pidejte 50 ml 20% maltosy na litr NZY Autoklvovn me oxidovat maltosu a dal sacharidy. Proto mus bt maltosa pidvna ze 20% zsobnho roztoku sterilizovanho filtrac.) Proveden : 1. Kultivujte pes noc kmen E. coli citliv k bakteriofgu do stacionrn fze v mediu obsahujcm maltosu (represor tvorby LamB proteinu, receptoru bakteriofga ) a Mg++ ionty (usnaduj adsorpci bakteriofga). 2. Roztavte vrchn agar v mikrovlnn troub nastaven na odmraen (Uvolnte uzvr a kontrolujte var. Kdy se objev bubliny opatrn vyjmte lhev a agar promchejte. Opakujte do plnho roztaven.) nebo na vrouc vodn lzni (15 min). 3. Ponechte agar zchladnout 5 min pi laboratorn teplot a pot vlote do vodn lzn na 45-50C. Ponechte temperovat dostaten dlouho; vy teplota by usmrtila buky. 4. Pipravte tyi sriov edn (1:100) suspense bakteriofga v SM : 1:100; 1:10 000; 1:1 000 000 a 1:100 000 000. 5. Oznate est mikrozkumavek pro kad edn bakteriofga a jednu pro kontrolu bez fga a jednu pro kontrolu obsahujcho bakteriofga bez bunk. 6. Stejnm zpsobem oznate 6 NZY agarovch ploten a pedehejte na 37C. 7. Pidejte po 0,3 ml bakteriln suspense v NZYM mediu do kad z oznaench zkumavek s vjimkou posledn kontroly (bez bunk). Do tto kontroln zkumavky pidejte pouze 0,3 ml sterilnho media. 8. Pidejte po 100 l suspense kadho sriovho edn do zkumavek a dle pidejte po 100 l SM do dvou kontrolnch zkumavek.

Strana196

9. Inkubujte pi laboratorn teplot za mrnho tepn po dobu 20 min. Pi tto inkubaci se bakteriofg sorbuje na bakteriln povrch. 10. Inkubujte pi 37C po dobu 10 min. Bhem tto doby vnese bakteriofg svoji DNA do bakteriln buky. 11. Pidejte 3 ml NZY medium top agarosy do kad zkumavky, mrn zamchej vortexovnm a nalij na 100 mm NZY agarov misky. Rozprostete agarosu na povrchu misek mrnm naklnnm. 12. Inkubujte zaokovan misky pi 37C po 812 h. Pi del inkubaci by mohlo dojt k vy-tvoen plak nadmrn velikosti, co by znamenalo jejich vzjemn pekrvn. 13. Spotte vytvoen plaky pro jednotliv edn a pepotte na pfu/ml zsobn kultury. 14. Misky mohou bt skladovny pi 4C po dobu minimln jednoho tdne. Cv.9.10 Poteby :
Pprava lyztu bakteriofga

LB medium (10 mmol MgCl2/10 mmol CaCl2), NZC medium (na 1 l 10 g NZ Amine-A [kaseinov hydrolyzt],5 g NaCl, 2

g MgCl2.6 H2O; autoklvovat 30 min a pot pidat 5 ml 20% Cjako aminokyselin), zeovac pufr (20 mmol Tris.Cl [pH 8], 20 mmol MgCl2). Proveden : 1. Inkubujte pes noc v LB mediu pi 37C kmen E. coli sensitivn k bakteriofgu . 2. Pevete sterilnm prtkem jeden plak do 0,4 ml zeovacho pufru a ponechte 2 h pi 4C, aby se fg mohl uvolnit. 3. Smchejte 0,1 ml roztoku fga s 0,1 ml bakteriln kultury a 0,1 ml roztoku MgCl2/CaCl2. 4. Inkubujte na vodn lzni 15 min pi 37C. 5. Pevete tento roztok do 50 ml NZC media a inkubujte za intenzivnho tepn pi 37C, dokud nedojde k lyzi (cca 6 a 8h; od 6 h je nutno kulturu asto kontrolovat a po vyeen ihned odstedit). 6. Pidejte nkolik kapek chloroformu pro lyzi zbylch bunk a pevete roztok do novch kyvet. Odstrate bunn zbytky odstednm pi15 000 G pi 4C. 7. Lyzt pevete do novch kyvet, pidejte pr kapek chloroformu a krtce vortexujte. Uchovvejte pi 4C.

Strana197

9.6 9.6.1

Analza a manipulace s DNA Elektroforza v agarosovm gelu

Elektroforza v agarosovm i polyakrylamidovm gelu se pouv k identifikaci, separaci a purifikaci fragment DNA. Fragmenty DNA jsou dleny v elektrickm poli v zvislosti na jejich velikosti (viz obr. ). Touto metodou me bt detegovn a 1 ng DNA. Rozdlen fragmenty DNA lze izolovat pmo z gelu a pout pro dal prce. Volbou typu a koncentrace gelu lze zajistit vhodn podmnky pro dlen fragment v rznch rozmezch molekulovch hmotnost. Standardnmi agarosovmi gely lze snadno separovat DNA velikost 0,5 a 25 kb (viz tab.). Dlen vtch molekul ji nen snadn. V tomto ppad lze pout pulsn elektroforzu, kterou lze rozdlit molekuly o velikosti a 2 000 kb. Jednotliv formy DNA o stejn molekulov hmotnosti maj rznou pohyblivost. Nadroubovicov (superhelikln cirkulrn) forma je nejkompaktnj a za standardnch podmnek migruje nejrychleji. Oteven cirkulrn forma se zpravidla pohybuje o nco pomaleji ne linern forma. Vzjemn pohyblivost je vak zvisl na podmnkch elektroforzy, zejmna na iontov sle pufru, napt, koncentraci ethidium bromidu a mnostv nadroubovicovch zvit u superhelikln formy. Tabulka . Rozmez molekulovch hmotnost DNA separovanch v agarosovm gelu o rznch koncentracch agarosy Koncentrace agarosy (% w/v) 0,3 0,6 0,7 0.9 1,2 1,5 2,0 Rozmez molekulovch hmotnost separace linernch molekul DNA (kb) 5 60 1 20 0,8 10 0,5 7 0,4 6 0,2 3 0,1 2

Protokol agarosov elektroforzy lze rozdlit do t fz : 1. Pprava gelu vhodn hustoty, volen tak, aby bylo zajitno optimln rozdlen oekvanch fragment DNA (viz tab.).

Strana198

2. Vzorky DNA jsou aplikovny do jamek v gelu a dleny za napt vhodnho pro elektroforzu po dobu odpovdajc optimln separaci. Pro dosaen optimlnho rozdlen fragment vtch ne 2 kb se doporuuje napt odpovdajc 5 V/cm (cm vyjaduj vzdlenost mezi elektrodami. 3. Rozdlen lze monitorovat na zklad rozdlen pruh barviv o znmch molekulovch hmotnostech. Pro tento el se nejastji pouv bromfenolov mod, kter putuje s fragmenty DNA o hmotnosti cca 0,5 kb a xylen cyanol zpravidla putujc s fragmenty velikosti 5 kb. Take bromfenolov mod, odpovdajc nejkratm fragmentm je indiktorem dlky gelu, v n dolo k rozdlen. 4. Gel je barven ethidium bromidem (asto je ethidium bromid ptomen ji bhem elektroforzy). Ethidium bromid je interkalan inidlo, kter se ve mezi vlkna DNA a erveno-oranov fluoreskuje po ozen UV zenm o vlnov dlce 260360 nm. Komplex DNA a ethidium bromidu je vizualizovn osvtlenm pomoc zdroje UV zen. V ppad ptomnosti ethidium bromidu v gelu a pufru bhem elektroforzy, lze pozorovat rozdlen fragment ozenm pmo v elektroforetickm pstroji. Detekce na transilumintoru je vak podstatn citlivj. V ppad poteby je mono podit fotografick zznam pomoc Polaroidu opatenho vhodnm filtrem. 5. Pro posouzen velikosti jednotlivch fragment se pouvaj markery molekulovch hmot-nost, co jsou komern dostupn smsi fragment DNA definovanch velikost. Na obr. jsou velikosti fragment nejastji pouvanch marker a jejich vzjemnou polohu po rozdlen na gelu o 1%n koncentraci agarosy.

Strana199

Lambda DNA/HindIII Marker

GeneRuler 1kb DNA Ladder

OBR. Markery molekulovch hmotnost fragment DNA

Pro dlen malch fragment DNA lze pout polyakrylamidov gel (viz. tab.) nebo speciln pipravenou agarosu (sieving agarose). V obou ppadech lze fragmenty z gelu purifikovat (nejastji elektroeluc). Elektroforzou v polyakrylamidovm gelu za denaturujcch podmnek lze dlit jednoetzcov molekuly DNA.

Tabulka .xxx Koncentrace akrylamidu poskytujc optimln rozdlen DNA fragment Akrylamid (%) 3,5 5,0 8,0 12 20 Cv.9.11 Poteby : Velikost fragment 100 - 1000 100 - 500 60 - 400 50 - 200 5 - 100 Migrace bromfenolov (bp)modi (bp) 100 65 45 20 12

Elektroforza v agarosovm gelu

Agarosa, TBE pufr, markery molekulovch hmotnost, vzorkov pufr pro

agarosovou elektroforzu Proveden ppravy gelu :

Strana200

1. Pipravte 30 ml 0,7 % agarosy v TBE pufru. Rozvate agarosu v mikrovlnn troub.

POZOR! Me nastat prudk var a vzkypn agarosy. Zamchejte vdy, kdy zane

roztok vt! 2. Po dokonalm rozvaen agarosy (rozputn plovoucch vloek) ponechte roztok zchladnout na cca 60C a nalijte do utsnn elektroforetick vany. Do zez pi okraji gelu vlote heben a ponechte gel ztuhnout.
Obr. Pstroj pro agarosovou elektroforesu

Pprava a aplikace vzork 1. Roztok DNA naete 1:1 vzorkovm pufrem a promchejte. 2. Nalijte 150 ml TBE do elektrodovho prostoru tak, aby byl ponoen cel gel. Vyjmte heben. Pidejte do vzorkovho pufru po 5 l roztoku ethidium bromidu (10 mg/ml) na ob strany gelu a promchejte pikou mikropipety. (Pozor! Ethidium bromid je siln mutagen. Pi prci s nm pouvejte ochrann rukavice a pracujte opatrn) 3. Pipetujte po 5 l vzorku tsn nad jednotliv jamky. Vzorek se dky velk viskozit vzorkovho pufru snadno usazuje na dn. Do jedn z jamek aplikujte marker molekulovch hmotnost (3 l). Elektroforetick dlen a detekce nukleovch kyselin 1. Uzavete pstroj a pipojte ke zdroji. Dodrujte sprvnou polaritu indikovanou barevnm oznaenm (DNA m za danho uspodn zporn nboj a putuje tedy k anod). Nastavte konstantn napt 120 V. 2. Sledujte elo, tvoen bromfenolovou mod (migruje piblin rychlost srovnatelnou s dvojroubovicovou DNA dlky 300 pr bas). Druh barvivo obsaen ve vzorkovm pufru migruje stejn jako DNA dlky 4 kb.

Strana201

3. Pi dosaen vhodnho rozdlen tchto marker vypnte zdroj a vyjmte gel i s podlokou. (Pracujte s rukavicemi!). 4. Sesute gel na UV transilumintor. Nasate si ochrann brle a zapnte UV zdroj. 5. V ppad poteby dokumentace, fotografujte gel pstrojem Polaroid. Piblinou molekulovou hmotnost lze urit porovnnm s markery (viz. obr. )

10

IDENTIFIKACE MIKROORGANISM

Identifikace mikroorganism a jejich klasifikace, tj. zaazen izolovanho mikroorganismu do urit skupiny, jinak eeno taxonomie, je samostatnou disciplinou. Vechna klasifikan schemata se sna zaadit organismy do skupin podle jejich podobnch vlastnost. Nejlep klasifikan systmy dvaj do skupin ty organismy, kter maj spolenou evoluci a vyluuj nepbuzn typy. Podobn jako v taxonomii rostlin a zvat je pro bakteriln taxonomii zkladn jednotkou druh. Souasn uvan systmy jsou zaloeny na tvaru buky, typu stny (Gramovo barven) a metabolismu. Jako identifikan biochemick znaky byly vybrny takov schopnosti, kter jsou dobe zjistiteln a jsou pomrn stl. Vechny tyto znaky lze shrnout pod oznaen fenotypickch znak. K uren evolunch vztah a pbuznosti druh se pouv porovnn nukleotidovch sekvenc DNA a rovn sekvenc 16S ribosomln RNA, kter pat mezi znaky genotypov. V neposledn ad se uvaj pro identifikaci immunochemick metody, kter jsou jsou zaloeny na schopnosti protein tvocch biky nebo povrchov struktury bakteri (jedn se o antigeny) reagovat se

Strana202

specifickou protiltkou, za vzniku komplexu antigen protiltka, kter bv indikovn rznmi zpsoby. Velk vtina vech identifikac vak probh v klinickch a potravinskch laboratoch, kde se jedn o uren rodu a druhu pslun bakterie a evolun vztahy k ostatnm organismm nejsou tm nejpodstatnjm, i kdy v souasnosti nabv na vznamu uren specifickch gen pomoc polymerasov etzov reakce (PCR), kter dv vsledky o hodn rychleji, neli standardn kultivan metody. Souasn taxonomick schma, kter pouv nejnovj poznatky, je Bergeys Manual of Systematic Bakteriology, kter m nsledujc lenn: Svazek1 Gramnegativn
prmyslov vznam organismy majc obecn, lkask nebo

Svazek 2 Grampozitivn organismy, s vyjmkou aktinomycet Svazek 3 Archebakterie,

organismy cyanobakterie a zbvajc Gramnegativn

Svazek 4 Aktinomycety Krom popisu organism obsahuj vechny tyi svazky daje o ekologii, metodch pomnoovn, kultivanch podmnkch, izolaci mikroorganismu a metody k jejich udrovn a konzervovn. Nejdleitj a bezpodmnenou podmnkou pi jakmkoli identifikanm postupu je, abychom studovan kmen mli v ist kultue, nejlpe na ikmm agaru. O istot kultury se pesvdme tm, e ji podrobme nktermu izolanmu postupu (nejastji se uv rkovn na agarovou desku) a pak zjiujeme shodnost biochemickch test vybranch izolt. Biochemick testy vyuvan pro diagnostiku bakteri byly vybran tak, e sledovan vlastnosti nevykazuj velkou promnlivost a vskyt mutant sledovanho znaku je pomrn vzcn. Pesto vak vskyt tchto mutant u vech sledovanch znak v posledn dob stoup v d-sledku stoupajcho zamoen ivotnho prosted mutagennmi ltkami. Z tchto dvod se v souasnch vyhodnocovacch tabulkch uvd procento kmen, kter vykazuj pozitivn reakci (od 100 a do 0). Identifikace eukaryotnch mikroorganism (kvasinek a plsn) je vt mrou zaloena na morfologickch znacch. Vchoz publikac pro taxonomii kvasinek je publikace The Yeast , Lodder. Kl k uren rod kvasinek a zkrcen kle pro uren nejdleitjch druh jsou uvedeny v knize A. Kockov-Kratochvlov Kvasinky a kvasinkovit mikroorganismy(Alfa, Bratislava,1982). Strana203

Dal kle pak slou k urovn rod plsn. Nap. v etin je publikace O. Fassatiov Plsn a vlknit houby v technick mikrobiologii( SNTL, Praha, 1979).

10.1

Biochemick identifikan testy bakteri

Pro potebu klinickch a potravinskch laborato byly pro rychlou identifikaci vybranch skupin mikroorganism vyvinuty biochemick testy. Biochemick testy zjiuj schopnost organism syntetizovat urit enzymy. Jsou pouvny enzymy pro asimilaci a zkvaovn rznch uhlkatch slouenin a tpen duskatch ltek od mooviny a po jednotliv aminokyseliny a blkoviny. Pro diagnostiku reakce se uv cel ada indiktor, kter pi pozitivn reakci vrazn mn barvu media. Dve se proto soubor tchto test nazval pestr ada. V souasnosti se nepipravuj pdy pro tyto testy individuln, ale vyuvaj se soubory test dodvan rznmi vrobci. Pdy jsou dodvan nadvkovan, vysuen a pochopiteln steriln. Nejuvanj je pro diagnostiku skupiny koliformnch bakteri (Enterobacteriacae) ENTEROtest. Pro diagnostiku aerobnch nefermentujcch tyinek NEFERMtest. Diagnostika stafylokok se provd STAPHYtestem apod.
10.1.1 Pehled hlavnch testovanch vlastnost Test na tvorbu H2S

1)

Nkter bakterie uvoluj z aminokyselin obsahujcch sru (methionin, cystein) sulfan (sirovodk). K detekci se uv komplexn pda s glukosou a solemi eleza nebo se solemi dalch tkch kov (Pb, Bi). V pozitivnm ppad vytvoen sulfan, pochzejc ze sirnch aminokyselin peptonu, reaguje s ionty eleza a dv vznik tmavo-edmu a ernmu sulfidu(sirnku). Reakce se odet pmo. Tvorba sulfanu je charakteristick pro hnilobn bakterie, kter jsou nedoucmi kontaminanty v potravinskm prmyslu.
HS_CH2_CH_COOH NH2 CH3_CH_COOH

H2S

NH2

2)

Voges-Proskauerv test - VPT

Strana204

Tato reakce nazvan podle svch objevitel detekuje tvorbu diacetylu, neboli acetoinu, (vznik oxidac acetylmethylkarbinolu) a guanidinovch zbytk peptonu. K prkazu se po nrstu naped pidv KOH (roztok VPT I.) a pak -naftol (VPT II.). Pozitivn reakce dv vznik ervenmu zabarven, kter se projev do 20 minut. Reakce je typick pro rod Enterobacter. 3)
Test zjiovn tvorby indolu IND

Nkter bakterie na pd bohat na pepton tvo z tryptofanu indol. Jeho tvorba je zvisl na zvenm obsahu tryptofanu v mediu a vyaduje neptomnost glukosy. Ptomnost indolu se indikuje pdavkem p-dimethylaminobenzaldehydu, se kterm tvo syt rov reakn produkt. Pozitivn reakce je typick pro Escherichia coli.

CH2_CH_COOH N H NH2

H2O N H

+ +

CH3_CO_COONH4+

4)

Test zjiovn dekarboxylace lysinu LYS

Jedn se o reakci, kter potvrzuje ptomnost lysindekarboxylasy. Test se provd v nutrin bohat pd s pdavkem lysinu a barviva bromkresol purpuru, kter
NH2_CH2_CH2_CH2_CH2_CH_COOH NH2 NH2_CH2_CH2_CH2_CH2_CH2_NH2

CO2

v pozitivnm ppad dv evenofialov zbarven. Enzym je specifick pro danou aminokyselinu a psob nejlpe za anaerobnch podmnek 5)
Test zjiujc schopnost rst na citrtu, jako jedinm zdroji uhlku SCI

Test vyuv pdy nazvan podle svho objevitele Simmonsv citrt. Jako indiktor rstu je pouita bromthymolov mod. Pozitivn reakce dv modr nebo modrozelen zbarven. 6)
Test k zjitn dekarboxylace ornithinu ORN

Strana205

Jedn se o reakci, kter potvrzuje ptomnost ornithindekarboxylasy . Enzym je specifick pro danou aminokyselinu a psob nejlpe za anaerobnch podmnek Test se provd v nutrin bohat pd s pdavkem ornithinu a barviva bromkresol purpuru, kter v po-zitivnm ppad dv evenofialov zbarven. NH2_CH2_CH2_CH2_CH_COOH NH2 7) NH2_CH2_CH2_CH2_CH2_NH2

CO2

Test na potvrzen ptomnosti ureasy URE

Ptomnost enzymu ureasy se testuje na pd s pdavkem mooviny. Pozitivn reakce dv erven probarven (fenolov erve) reakn smsi, kter se objev v dsledku alkalick reakce zpsoben uvolovanm NH3. H2N-CO-NH3 8)
Test prkazu -galaktosidasy

2 NH3 + CO2

kolem testu je zjitn produkce enzymu-galaktosidasy. Tvorba enzymu se detekuje na syntetickm substrtu o-nitrofenylgalaktosidu (ONPG), kter psobenm enzymov hydrolysy uvoluje lut zbarven nitrofenol.

9)

Test na ptomnost lipasy LIP

Reakce uruje, zda je degradovna povrchov aktivn ltka Tween 80 (polyoxyethylen sorbitan monoolet), kter slou jako modelov lipid. V ptomnosti lipolytickch enzym vznik dky pidanmu indiktoru tyrkysov zbarven. 10)
Test zkvaovn manitolu MAN

Clem testu je zjistit zkvaovn manitolu. V pozitivnm ppad vznikl organick kyseliny zpsob zmnu barvy acidibasickho indiktoru, tj. reakn sms zeloutne. 11)
Test zkvaovn inositolu INO

Clem testu je zjistit zkvaovn inositolu. V pozitivnm ppad vznikl organick kyseliny zpsob zmnu barvy acidibasickho indiktoru, tj. reakn sms zeloutne

Strana206

12)

Test prkazu deaminace fenylalaninu FEN (PHE)

Sleduje se deaminace fenylalaninu, kter pidan do testovac pdy. Pidnm inidla (okyselen roztok FeCl3) se prokazuje pozitivn reakce, nebo sms se tmavozelen zabarv.

CH2_CH_COOH NH2

CH2_CH2_COOH

NH3

13)

Test dekarboxylace argininu ARG

V tomto testu se ovuje aktivita enzymu arginin dihydrolasy. Enzym je specifick pro danou aminokyselinu a psob nejlpe za anaerobnch podmnek. V ppad rozkladu argininu se reakn sms zbarv syt mode.
NH=C NH2 NH CH2 _CH2_CH2_ CH_COOH NH2 NH=C_NH_CH2_CH2_CH2_CH2_ NH2 NH2

CO2

14)

Test utilizace malontu MAL

Clem testu je zjistit vyuit malontu pro rst. V pozitivnm ppad vznikl organick kyseliny zpsob zmnu barvy acidobazickho indiktoru, kterm je v tomto ppad bromthymolov mod reakn sms je syt modr. 15)
Test rozkladu eskulinu - ESL

V tomto testu se sleduje tvorba degradanch produkt eskulinu, kter maj tmavohnd zabarven. Vvoj temn hndho zabarven je pozitivnm prkazem rozkladu eskulinu. 16)
Testy na zkvaovn dalch cukr.

V ad komernch test je pipravena cela ada dalch cukr, kter slou k testovn schopnosti mikroorganism je zkvaovat. Jsou to hlavn tyto ltky: adonitol

Strana207

(ADO), cellobiosa (CEL), sacharosa (SUC), trehalosa (TRE), sorbitol (SOR), rhamnosa (RHA), melibiosa (MLB), rafinosa (RAF), dulcit (DUL) a pochopiteln glukosa (GLU). K detekci se pouvaj acidobazick indiktory, kter v pozitivnm ppad, tj. tvorb organickch kyselin mn zabarven reakn smsi.

10.1.2

Dal biochemick testy Hydrolza krobu

1)

krob je polysacharid, kter je tpen psobenm amylas na dextriny a ppadn a na maltosu (disacharid), kter slou mikroorganismm jako zdroj utilisovatelnho uhlku. ada mikroorganism produkuje extracelulrn enzymy typu -amylasy nebo amylasy. Principem stanoven je skutenost, e nativn krob se barv roztokem jodu mode, del dextriny jsou ervenohnd a oligosacharidy nedvaj s roztokem jodu dn zabarven. Cv.10.1 Poteby :

Hydrolza krobu
24h star kultury bakteri, Petriho miska se krobovm agarem (pda .XY),

Lugolv roztok (roztok . XX), kontroln mikroorganismus (nap. Bacillus subtilis).

Proveden : 1. Rozdl misku na dv poloviny arou po vnj stran dna micky. Jednu polovinu zaokuj rovnou rkou zkoumanou kulturou, na druhou zaokuj testovac kmen. 2. Inkubuj 48 h pi 30 oC. 3. Po inkubaci polij povrch ivn pdy s narostlou kulturou Lugolovm roztokem a pozoruj, zda vznikj nezbarven zny kolem povrchu koloni (hydrolza krobu). Pda s nerozloenm krobem se barv intensivn mode. Vsledky je nutn odetat ihned, protoe modr zbarven krobu po krtk dob miz. 2)
Test na proteolytickou innost bakteri (ztekucovn elatiny )

elatina je blkovina zskvan hydrolzou kolagenu. Pi rozpoutn ve vod tvo gel, kter se psobenm extracelulrnch proteas nkterch bakteri rozpout, elatina ztekucuje. Rozklad elatiny me bt blokovn ptomnost glukosy, proto Strana208

test provdme v bezcukernm mediu (nejastji masopeptonov elatina - MP), bu klasickou metodou vpichu do MP a pomrn dlouhou inkubac pi laboratorn teplot, piem sledujeme tak zpsob ztekucen elatiny, nebo modernjmi metodami, kter pouvaj agarovou pdu s 0,4 vhovmi % elatiny. Rozklad elatiny je na agarov pd detekovn po inkubaci silnm okyselenm pdy, nebo nasycenm roztokem (NH4)2SO4. Cv.10.2 A) Poteby : Proveden : 1. Zaokuj vpichem elatinovou pdu a inkubuj pi laboratorn teplot (pp.30 oC) po 3-5 dn. Jednu nezaokovanou zkumavku inkubuj jako kontrolu. 2. Po inkubaci ochla zkumavky v lzni se studenou vodou, nebo v chladnice a sleduj ptomnost ztekucen a po ochlazen. U zkumavky inkubovan pi laboratorn teplot uri tvar ztekucen podle obr. ( 55) Obr.55 (str 161)zobrazuje 4 zkumavky s nsledujcmi typy ztekucen: a) miskovit, b) nlevkovit, c) pytlovit, d) vodorovn. B) Potebn : 24 h star kultury bakteri, Petriho misky s MPA a 0,4% elatiny (pda .XX), 10% kyselina octov nebo nasycen roztok (NH4)2SO4, kontroln organismus (Bacillus subtilis). Proveden : 1. Naokuj sledovan mikroorganismus technikou rkovn na Petriho misku se ivnou pdou. Inkubuj 23 dny pi optimln rstov teplot. 2. Po inkubaci nalej na misku roztok octov kyseliny nebo nasycen roztok (NH4)2SO4. Jestlie dolo k enzymovmu rozkladu elatiny, objev se kolem koloni projasnn zny. 3. V mstech, kde elatina zstala beze zmny, se pda mln zakal. Reakce se sranem amonnm probh pomalu, odetn provdme za 15 30 minut, pi pouit kyseliny octov je mono reakci odetat ihned. 24 h star kultury bakteri, zkumavky s MP (pda .XZ), kontroln mikroorganismus (Bacillus subtilis)

Test na ztekucovn elatiny

Strana209

3)

Hydrolza kaseinu

Kasein je zkladn slokou blkovin mlka. Nativn kasein tvo koloidn suspenzi, kter je pinou neprhledn bl barvy mlka. Nkter bakterie tvo proteolytick enzymy schopn rozkldat tuto blkovinu na krat seky, kter jsou rozpustnj a v roztoku prsvitnj, a jsou oznaovan jako peptony. Tato reakce se nkdy nazv peptonizace. Cv.10.3 Poteby :

Peptonizan test
Petriho miska s kaseinovm agarem (pda .xx), 24 h star kultury bakteri,

kontroln mikroorganismus (Bacillus subtilis). Proveden : 1. Zaokuj testovanou bakterii v rovn e na misku s kaseinovm agarem a inkubuj pi 48 h pi optimln rstov teplot. Kontroln mikroorganismus naokuj na zvltn misku. 2. Po inkubaci sleduj tvorbu vyjasnnch zn kolem koloni vyrostlch na agarov pd, kter indikuj tvorbu proteolytickch enzym. Poznmka : Vyjasnn zny se nejlpe pozoruj proti tmavmu pozad.

4)

Redukce peroxidu vodku

Vtina aerobnch bakteri tvo enzym katalasu, kter rozkld toxick peroxid vodku na vodu a molekulrn kyslk. Anaerobn bakterie vtinou tento enzym netvo. Ptomnost katalasy dokazujeme v MPB, do kterho po inkubaci pidvme peroxid vodku. Za ptomnosti katalasy se vyvj plyn (ve form bublinek). Cv.10.4 Poteby : Proveden : 1. Zaokuj zkumavku kulturou bakteri a inkubuj pi optimln teplot 48 hod. 2. Po inkubaci pidej do zkumavky 1 ml peroxidu vodku a nech 15 min stt. Zatepej zkumavkou, ptomnost katalasy se projev uniknm plynu ve form bublinek :

Test na ptomnost katalasy

24 h star kultura bakteri, zkumavky s MPB (pda . XZ.), 3 % roztok

peroxidu vodku, kontroln mikroorganismus Escherichia coli.

Strana210

2 H2O2 5)

2 H2O + O2

Hemolytick innost bakteri

Nkter bakterie, zvlt pak pathogenn, maj schopnost rozkldat erven krevn barvivo hemoglobin tak, e se ztrc erven barva krve (hemolza). Primrnm mstem, kter obsahuj hemolytick enzymy jsou erven krvinky, ale nkter hemolysiny napadaj i jin buky. Na deskch s krevnm agarem je mon pozorovat dvoj typ hemolzy: 1. - hemolza (alfa reakce), pi kter dochz k plnmu rozruen ervench krvinek a kolem koloni narostlch na krevnm agaru se vytvo vyjasnn prsvitn zny; 2. - hemolza (beta reakce), pi kter dochz jen k stenmu rozloen hemoglobinu a za ptomnosti H2S vznik zelenohnd pigment methemoglobin. Cv.10.5 Poteby : Proveden : 1. Na povrch krevnho agaru narkuj zkouman kmen bakteri a inkubuj pi 37oC, po dobu 2448 hod. 2. Pozoruj typ hemolzy a uri jej typ. Poznmky : 1. U rodu Staphylococcus se oznaen hemolzy pouv k rozlien hemolytick aktivity. Vi beranm nebo krlim erythrocytm je .hemolza. 2. Proti lidskm erythrocytm oznauje se . 3. Chladov hemolzy beranch erythrocyt je . 4. Jako -reakce se oznauj ppady, pi nich k hemolze nedochz, netvo se dn zny.

Hemolytick test
24 h star kultura bakteri, Petriho miska s krevnm agarem (pda .xz),

kontroln mikroorganismus Staphylococcus aureus.

10.1.3

Identifikan soupravy

V klinickch a kontrolnch potravinskch laboratoch se zvyuj nroky na mikrobiologick vyeten vzork, a to pedevm z hlediska identifikace ptomnch Strana211

bakterilnch druh. Tyto stoupajc poadavky se daj zvldnout pouitm diagnostickch souprav, kter znan zrychluj a usnaduj prci tchto laborato. Diagnostick soupravy se na svtovm trhu zaaly objevovat ji v sedmdestch letech a principy na nich jsou zaloeny se neustle vyvjej. Diagnostick soupravy maj nkolik spolench rys : a) Maj dostaten dlouhou skladovac dobu (obvykle 6 12 msc). b) Pouvaj mikrometody, co et laboratorn sklo, kultivan pdy, energii i poadavky na personl. c) V jedn diagnostick souprav je sdrueno deset a vce ne dvacet test. d) Testy jsou jednoduch a snadno se provdj, nebo odpad pprava pd. e) K urychlen interpretace vsledk slou diagnostick tabulky. f) Firmy, kter dodvaj testy na trh zaruuj monost telefonick konsultace ve spornch ppadech. g) K vyzen tchto ppad pouvaj potaovch databaz a daj z vlastn databanky. h) Toto ve plat v ppad, e je k identifikaci pouita ist kultura,
nekontaminovan doprovodnou mikroflorou.

V souasn dob se vyrb ji destky systm zavedench v mnoha zemch. Za vechny uvdme esk soupravy od firmy LACHEMA, dle pak API systm, bioMerieux a ENTERO-tube. Ze vech tchto firem m API systm nejir sortiment souprav pro rzn skupiny bakteri, nejvt banku dat a tak pro identifikaci bakteri pomoc potae (API-LAB), co v roce 2000 zavedla i LACHEMA.

10.2 (PCR)

Amplifikace DNA in vitro pomoc polymerase chain reaction

Polymerase chain reaction (polymerasov etzov reakce neboli PCR) je enzymov metoda slouc k rychl syntze velkho mnostv definovanho seku DNA in vitro. Tato metoda, podobn jako molekulov klonovn, umonila adu experimentlnch pstup, je byly dve neprovediteln a poet aplikac PCR neustle vzrst. PCR nachz uplatnn, nap. pi detekci patogennch i kontaminujcch mikrobilnch kmen, syntze fragment DNA pro klonovn do expersnch vektor na zkladn chromozomln DNA nebo cDNA pi in vitro mutagenezi pro pm Strana212

klonovn, prenatln diagnostiku ddinch chorob, analzu alelickch sekvennch zmn a sekvenovn DNA. Vzhledem k vysok citlivosti detekce je mon PCR pout pro zjitn ptomnosti specifickch sekvenc DNA i RNA, a tak detegovat jinak nezjistiteln mnostv kontaminujcch biologickch vzork. Zkladem spn reakce je pouit neporuenho seku DNA, kter m bt amplifikovn (pomnoen). Velmi dleitm pedpokladem pro spnou reakci je navren vhodnch primer tak, aby byla zajitna specifita reakce. Jak nvrh oligonukleotidovch primer, tak programovn reaknch krok vychz z obecn znalosti struktury DNA a ze znalosti sekvence, k n jsou pslun oligonukleotidy komplementrn. Pomoc PCR lze syntetizovat st DNA, pro n jsou k dispozici oligonukleotidov primery komplementrn k 3a 5 koncovm sekvencm seku, jen m bt amplifikovn. Tato metoda poskytuje a 10 nsobn pomnoen bhem 2-3 h. Jednotliv kroky amplifikace zahrnuj : 1) denaturaci templtu 2) pipojen primer 3) extensi pipojench primer DNA polymerasou Opakovn tchto krok vede k syntze segmentu definovanho primery, kter jsou inkorporovny do nov vznikajcch molekul. Fragmenty tto dlky tvo hlavn produkt reakce, ale krom toho vznikaj i del fragmenty DNA (viz obr. ). Jejich podl se vak v prbhu reakce sniuje. Pi prvnm reaknm cyklu vznikaj del fragmenty, ne odpovd vzdlenosti vymezen zvolenmi primery. Ve druhm cyklu poskytuj tyto molekuly fragmenty DNA poadovan dlky, jejich podl exponenciln roste v nsledujcch krocch reakce. Del molekuly budou produkovny i nadle, ale jejich mnostv bude stoupat pouze linern rychlost. Doba zdvojen odpovd jednomu cyklu denaturace templtu, pipojen a extenze primeru. Vzhledem k tomu, e je pi kadm cyklu DNA zahvna na vysokou teplotu (kolem 95C), byl mon rozvoj tto metody a po objevu termostabilnch DNA polymeras, kter nejsou touto teplotou inaktivovny. Pouit termostabiln DNA polymerasy (Taq DNA polymerasa z termofiln bakterie Thermus aquaticus) zajiuje dostatenou aktivitu enzymu po celou dobu amplifikace. Taq DNA polymerasa m teplotn optimum pi 75C a poloas inaktivace je piblin 40 min pi 95C. Jedn se o enzym, kter m pouze 5-3 polymerasovou aktivitu a postrd 3-5 exonukleasovou
6

Strana213

aktivitu. Taq polymerasa me inkorporovat dUTP msto dTTP, eho lze vyut k zabrnn kontaminace produkty PCR. Krom tohoto enzymu jsou pouvny tak Tth DNA polymerasa a Pwo DNA polymerasa. Tth DNA polymerasa je enzym izolovan z bakterie Thermus thermophilus, kter m stejn teplotn optimum jako Taq DNA polymerasa. Pednost tohoto enzymu je jeho schopnost psobit i jako reversn transkriptasa a tedy monost ppravy cDNA. Kombinace reversn transkripce a amplifikace jejho produktu se zkrcen nazv RT-PCR. Tato metoda slou k detekci, kvantifikaci, klonovn a analze genov exprese na rovni RNA. Pwo polymerasa m krom 5-3 polymerasovou aktivitu tak 3-5 exonukleasovou aktivitu. Tato aktivita zajiuje zven pesnosti syntzy (cca 10 pesnj ve srovnn s Taq DNA polymerasou). Pesnost in vitro polymerace je jednm z nejdleitjch parametr pi PCR. Je-li pouita k amplifikaci sekvence dlouh 200 pr bas Taq DNA polymerasa, jej frekvence inkorporace chyb je cca 210-4 chyb/basi, bude pi 106 amplifikac obsahovat cca 56% amplifikanch produkt jednu nebo vce nesprvn inkorporovanch bas. Vysok pesnost PCR produkt je vyadovna pedevm pro : Klonovn fragment, studium alelickho polymorfismu jednotlivch RNA transkript, charakterizace jednotlivch bunnch populac v kultue, charakterizace mlo astch mutac ve tkni. Vechny zmnn termostabiln DNA polymerasy mohou inkorporovat i modifikovan base Cv.10.6 Poteby : Proveden : 1. Pro kadou reakn sms pipetujte nsledujc mnostv individulnch komponent : l 10 x pufr :500 mM Kcl, 100 mM Tris.Cl, pH8,4, 15 mM MgCl2, 200 g/ml elatina, 2 l sms dNTP,

Polymerase chain reaction (PCR)

viz reakn sms

Strana214

po 1 l primery, 5 l templtov DNA (podle koncentrace), voda - doplnit na 49 l. 2. Denaturujte 3-4 min pi 94C, pidejte 1 l Taq polymerasy a spuste nsledujc pro-gram : 45 s 1 min 2 min pi 94C pi 50C pi 68C

Tento cyklus opakujte 37. Reakn produkt analyzujte pomoc elektroforzy v agarosovm gelu.

10.3

Imunologick metody

Pro identifikaci a izolaci pathogennch mikroorganism, byla vyvinuta celada imunologickch metod, umoujcch efektivn kontrolu prbhu onemocnn vyvolanho tmito mikroorganismy a stanoven ptomnosti toxigennch mikroorganism v prosted, zejmna v potravinch, imunochemickm stanovenm vyprodukovanch toxin. Imunologickch metod se vyuv tak pi serologick identifikaci a typizaci nkterch mikroorganism.
Pathogenita , znamen schopnost mikroorganism zpsobit onemocnn a je

specifickou vlastnost uritch druh mikroorganism (nap. Corynebacterium diphtheriae je pvodcem zkrtu). Jednotliv kmeny uritho pathogennho druhu maj rozdlnou schopnost napadat hostitele, jedn se o rznou virulenci kmen tho druhu (kmeny Corynebacterium diphtheriae mohou bt virulentn nebo nevirulentn). Virulence pathogennho kmene je urena dvma faktory: a) schopnost mnoen v tle hostitele, b) schopnost produkovat kodliv ltky toxiny. Proniknut mikrobilnho parazita do buky hostitele vede k indukci specifick obrann reakce, imunologick reakce. Hostitelsk organismus reaguje na ptomnost cizch bunk tvorbou obrannch ltek protiltek, co jsou blkoviny globulinovho typu, produkovan specifickmi krevnmi bukami lymfocyty. Protiltky maj schopnost specifick vazby na molekuly, struktury nebo buky, kter primrn indukovaly jejich tvorbu a kter souhrn oznaujeme jako antigeny (imunogeny).

Strana215

Antigenn povahu maj prakticky vechny blkoviny, ada polysacharid, lipidy a nukleotidy, jsou-li vzan na blkoviny. Nzkomolekulrn ltky s antigennmi vlastnostmi nazvme hapteny, jsou aktivizovny navznm na makromolekulrn nosi (nejastji serov albumin). Hapteny specificky reaguj s odpovdajcm mstem na molekule protiltky. Reakce antigenu s protiltkou me bt sledovan in vitro rznmi metodami. Protiltky v krevnm seru se prokazuj rznmi kvalitativnmi i kvantitativnmi srologickmi reakcemi pomoc znmch antigen, s ktermi specificky reaguj (nap. mikroorganismy o znmch antigennch vlastnostech). Naopak lze identifikovat rzn mikroorganismy, jsou-li k dispozici specifick protiltky proti jejich povrchovm blkovinm s antigennmi vlastnostmi. Pi reakci antigenu s protiltkou, vznikaj zesovan struktury, kter jsou asto viditeln pouhm okem. Podle typu reakce rozeznvme : a) aglutinaci (antigen m korpuskulrn charakter, nejastji bakterie), b) precipitaci (antigen je molekulrn povahy exotoxiny, viry), c) fixace komplementu jedn se o vazbu komplementu (soust krevnho sera) na komplex antigen-protiltka, psob lyzi antigenu, nap. bakteriln buky.

10.3.1

Aglutinan reakce

Aglutinan reakce mezi homologickou protiltkou a korpukulrnm antigenem probh v ptomnosti elektrolytu, (vtinou fyziologick roztok). Po smchn suspenze bunk (bakterie) s pslunou protiltkou (antiserem) dochz ke shlukovn
aglutinaci bunk. Pi pouit standardn suspenze bunk a serie edn protiltky se

me titrac stanovit mnostv protiltky v antiseru. Antisera obsahujc protiltky se piprav injikovnm antigenu (nap. Salmonella \sp.) do pokusnho zvete (krysa, krlk). Po urit dob se z krve imunizovanho zvete piprav serum, kter obsahuje pslun protiltky. Aglutinanmi testy lze z antibakterilnch protiltek stanovit jen protiltky proti povrchovm antigenm obsaenm v bunn stn, v bikch nebo v pouzdrech. Extrahovan, koloidn antigeny mus bt ped vlastn reakc adsorbovny na inertn nosie.

Strana216

Aglutinan reakce lze vyut pro serologickou identifikaci a typizaci bakteri (nap. rodu Salmonella nebo Campylobacter ), nebo naopak pi pouit znmho kmene lze urit ptomnost protiltek v krevnm seru (Widalv test pro stanoven protiltek proti enterobakterim a ostatnm G- tyinkm). Nejjednodu metodou proveden aglutinanho testu je sklkov metoda. Cv.10.7 Poteby : Proveden : 1 Na podlonm skle dokonale rozeti 12 kliky agarov kultury zkoumanho kmene v nkolika kapkch fyziologickho roztoku tak, aby vznikl suspenze byla mln zakalen. 2 Na del podlon sklko nanes nkolik kapek tto suspenze (45 kapek). 3 K suspenzi pidej vt kapku tetovanho antisera a sms dobe promchej prtkem nebo klikou a naklnnm sklka. 4 Proti ernmu pozad sleduj vytvoen shluk aglutinace. Poznmka : Pro zvraznn reakce lze bakterie obarvit. Sklkovho aglutinanho testu lze vyut pro serologick stanoven pathogennch vlatnost rznch druh prmyslov vyuvanch kmen rodu Saccharomyces ( S. cerevisiae, S. uvarum, S. elipsoideus )
10.3.2 Precipitan reakce

Sklkov metoda
24 h star kultura testovan bakterie na ikmm agaru, fyziologick roztok,

testovan antiserum, podlon sklka, pipety.

Precipitan testy se pouvaj k prkazu ptomnosti nebo titru protiltek proti koloidnm, rozpustnm antigenm, pedevm bakterilnm exotoxinm, cizorodm proteinm a virm. Ve srovnn s aglutinac vyaduje tato reakce vrazn vy mnostv molekul protiltky, aby dolo ke vzniku sraeniny vizuln detekovateln. Precipitaci lze zkoumat ve zkumavkch (prstencov test) nebo v agarovm gelu (imunodifuse podle Ouchterlonyho-imunoelektroforesa).
a. prstencov test

Tmto testem lze kvalitativn, pop. kvantitativn, urit titr protiltek i antigenu. Do tenk trubiky nebo zkumavky, pro vt stabilitu upevnn v plastelin, se napipetuje pslun mnostv zkoumanho antisera, kter se pevrstv antigenem proti Strana217

nmu sledujeme tvorbu protiltek. V pozitivnm ppad se za nkolik sekund a minut, ale nkdy i hodin vytvo na syn ploe precipitan prstenec, zeteln proti tmavmu pozad. Je-li vak v seru siln nadbytek protiltek, k precipitaci nedojde a zskme chybn negativn vsledek. Pi kvantitativnm stanoven se geometrick ada edn vyetovanho sera pevrstv stejnm mnostvm antigenu. Titr protiltek se posuzuje podle toho , v kterm zedn se jet vytvoil precipitt. Stejnm zpsobem lze stanovit i titr antigenu pi konstantn koncentraci sera a promnn koncentraci antigenu. Dleit je, pidvat roztoky antigenu do zkumavky opatrn, nejlpe stknm po stnch, aby se tak zabrnilo smchn antigenu se serem.
b. Ouchterlonv imunodifuzn test

Tato metoda je kvalitativn a je charakterizovan tzv. dvojitou imunodifuz ob sloky reakce, protiltka i antigen, difunduj proti sob v agarovm gelu rznou rychlost, kter je ovlivnna koncentrac antigenu, protiltky a vlastnost gelu. V mst svho styku tvo precipitan zny, jejich poet zvis na mnostv komponent antigenu a na tom, proti kolika z nich jsou ve vyetovanm seru protiltky. Cv.10.8 Poteby : Proveden : 1 V agaru na Petriho misce vyzni korkovrtem jamky dle obr. 48 tak, aby centrln jamka byla 58 mm vzdlena od jamek okrajovch. 2 Do centrln jamky pipetuj antiserum (protiltku) v mnostv 2050 l , v zvislosti na velikosti jamek. Do okrajovch jamek napipetuj dle nvodu asistenta bu rzn koncentrace sledovanho sera nebo rzn sera. 3 Inkubuj pi 37oC a sleduj tvorbu precipitanch zon po dobu 7 dn kad den. Metodu lze pout i pro stanoven toxigenity mikrobilnch kultur. V tom ppad se pipetuje do centrln jamky vhodn edn antitoxin inn proti toxinu, jeho ptomnost m bt prokzna. Jedna nebo dv protilehl jamky se napln referennm toxinem a ostatn jamky filtrty bujonovch kultur zkoumanch kmen. V ppad, e mikrobiln kmen produkuje nkolik serotyp toxinu, lze k testovn pout sms protiltek. Misky se inkubuj v prosted nasycenm vodn parou 24 h pi 37oC nebo 25oC. Strana218

Ouchterlonv imunodifuzn test

Petriho miska s Ouchterlonovm agarem (pda . RT), korkovrt, pipety,

sera a antisera dle vbru asistenta.

4 Vyhodnocen se provd sledovnm precipitanch zon a srovnnm se zonami, kter vznikaj mezi protiltkou a referennm toxinem. Je-li toxin shodn s referennm, pechzej ry plynule do sebe. Nejsou-li shodn, k se. Mon ppady pro bivalentn protiltku a dva toxiny viz obr. 49. obr.48 (str 121) Rozloen jamek pi imunodifuzn metod PL protiltka, SA standardn antigen, A urovan vzorek antigenu

Obr. 49 Tvorba precipitanch zon v ppad bivalentn protiltky a kombinac dvou odpovdajcch antigen Poznmka : Dleit pedpoklad pro pouit tto metody jsou vhodn koncentrace pouvanho antigenu a protiltky, protoe precipitt vznik pouze pi jejich optimln konventraci (tzv.zona ekvivalence).
10.3.3 Imunoelektroforeza

Difuzi antigenu a protiltky v agarovm gelu lze urychlit psobenm stejnosmrnho elektrickho proudu. Z tchto dvod se vlastn precipitan reakce kombinuj s elek-troforetickmi pat mezi metodami. Imunoelektroforza metody, a protismrn jednoduch imunoelektroforza kvalitativn kdeto

elektroimunodifuze (tzv. raketov elektroforza dle laurella) a dvojrozmrn imunoelektroforza pat mezi metody kvantitativn.
10.3.4 Komplement fixan reakce

Touto reakc se ve vyetovanm seru prokazuje ptomnost specifickch protiltek (lysin) proti bakterim, virm, parasitm a jinm bunnm antigenm. Pi reakci antigenu s protiltkou vznik komplex, na kter se ve nespecifick soust sera komplement. Vsledkem je lyze antigenu, kter je jen ve vjimench ppadech detekovateln vizuln (nap. v ppad ervench krvinek). Komplement je nestabiln thermolabiln komplex blkovin obsaen v krevnm seru teplokrevnch ivoich.

Strana219

Lyze bakteri, vir a dalch specifickch i nespecifickch koloidnch antigen nen makroskopicky prokazateln a dokazuje se nepmo prkazem neptomnosti volnho komplementu pdavkem hemolytickho systmu obsahujcho erven krvinky (beran a krli serum) obsahujc hemolyzin proti tmto krvinkm. Cv.10.9 Poteby : Proveden : 1. Vyetovan serum zahej na 56oC po dobu 30 minut, aby se inaktivoval komplement ptomn v seru v nekonstantnm mnostv. 2. K inaktivovanmu seru (0,2 ml) ve zkumavce pidej 0,5 ml naednho komplementu (erstv serum z krve morete), kter obsahuje o nco vce ne 2 hemolytick jednotky (hemolytick jednotka je mnostv komplementu zjitn jeho titrac, kter prv rozpust pouvan hemolytick systm). 3. Pidej 0,5 ml antigenu. 4. Promchej a inkubuj pi teplot 37oC 1 h ve vodn lzni. 5. Pidej 0,5 ml hemolytickho systmu sms stejnch objem 2% suspenze beranch krvinek a hemolyzinu. 6. Inkubuj 15 30 minut pi teplot 37oC. 7. Pozoruj reakci ve zkumavkch a vyhodno: a) Jestlie byly ve vyetovanm seru ptomny protiltky, komplement se nave na komplex antigen protiltka a k hemolyze krvinek nedojde. b) V ppad, e v seru protiltky ptomny nejsou, komplement zstane voln a po pidn hemolytickho systmu se podl na rozkladu ervench krvinek. Pi reakci je nutno souasn provdt kontroln men: se standardnm pozitivnm serem : Kontrolu sera pidnm antigenu, kontrolu antigenu bez pidn sera, kontrolu komplementu : komplement s hemolytickm systmem (pozitivn reakce), kontrola krvinek (v edcm roztoku) (negativn rekce).

Fixan reakce
steriln zkumavky, pipety, sera a antisera dle vbru asistenta.

Poznmka :

Strana220

K edn pouvme fyziologick roztok s veronalovm pufrem. Komplement fixan reakce se vyuv k serologickmu vyetovn ady bakterilnch, virovch a parazitrnch onemocnn. Tato metoda m hlavn uplatnn v klinick mikrobiologii a je zde uvdna pro zskn pehledu pouvanch imunologickch metod.

10.3.5

Imunofluorescence

Pro stanoven ptomnosti pathogennho nebo kontaminujcho mikroorganismu ve smsn kultue lze s vhodou pout imunofluorescenn techniku. Vyuv schopnosti nkterch fluoreskujcch ltek (rhodanin, fluorecein, isothiokyant aj.) pevn se vzat na globulinov molekuly, piem nemn jejich vlastnosti. Tmto zpsobem je mon znait blkovinn molekuly protiltek, ani by se zmnila jejich imunologick aktivita, a pitom po reakci s antigenem vznik komplex, antigen
protiltka - fluorescenn barvivo, kter fluoreskuje v UV svtle a je snadno

pozorovateln fluorescenn mikroskopi. Imunofluorescenci lze provdt dvojm zpsobem. Bu jako pmou
imunofluorescenci, kdy se fluorescenn barvivo nave na protiltku, kter pak

reaguje s pslunm antigenem, nebo jako nepmou fluorescenci, kdy se nejdve nave protiltka na antigen a na tento komplex se ve fluoreskujc ltka oznaen protiltka proti globulinu pouitho antisera (nap. mikrobiln buky krli specifick antiserum protiltka proti krlimu globulinu s fluoreskujc ltkou). Imunofluorescence se tedy vyuv k pm diagnostice pathogennch kmen z pathologickho materilu, potravin a k serologick identifikaci a typizaci kmene, kter nelze jednodue zskat v ist kultue. Pro zjednoduen detekce mikroorganism tmto zpsobem v potravinch nebo jinch vzorcch, je vhodn pomnoen v neselektivnch, pop. selektivnch, medi pro urit sledovan mikroorganismus (nap. rod Salmonella v selenito-cystinovm mediu). Tmto zpsobem se stanovuje ptomnost cizch kvasinek v pekaskm drod nebo pivovarskch kvasnicch, a to bu znaenm kulturnch kvasinek nebo cizch kvasinek. Cv.10.10

Imunofluorescence

Strana221

Poteby :

Suspenze Saccharomyces cerevisiae ve fyziologickm roztoku, suspenze

divokch kvasinek, antiserum proti S. cerevisiae znaen fluorescein-isothiokyantem, podlon sklka. Proveden : 1. Vytvo tenk ntr suspenze S. cerevisiae smchan s rznou koncentrac divokch kvasinek na podlonm sklku. 2. Usu na vzduchu, fixuj plamenem a nech reagovat se znaenou protiltkou ve vlhk komrce, pi pokojov teplot po dobu 30 minut. 3. Pebytek konjugtu odstra jemnm oplachovnm pufrovanm fysiologickm roztokem o pH 7,0 po dobu 10 minut. 4. Sklko penes do roztoku pufrovanho glycerolu (9 st glycerolu a 1 st fyziologickho roztoku o pH 7,0). 5. Mikroskopuj fluorescenn technikou a spotej buky S. cerevisiae a divokch kvasinek v 30 polcch. Pomr divokch kvasinek vyjdi v procentech. Poznmka : Pro lep odlien obou typ kvasinek je vhodn pout jako zdroje vedle svtla UV i upraven viditeln svtlo (fzov kontrast). Znaen buky zelen fluoreskuj a divok kvasinky jsou ern.

10.3.6

Speciln metody

V posledn dob se pro stanoven neznm koncentrace antigenu vyuvaj nov imunochemick techniky vyznaujc se velkou citlivost a pesnost. Jsou zaloen na principu tzv.saturan analzy, kter spov v souti tzv. ligand o vazbu na omezen mnostv va-zebn blkoviny, v ppad imunochemickch reakc jde o dvojici antigen protiltka, kdy antigen ve stanovenm vzorku sout o vazebn msto na protiltce s konstantnm mnostvm tho, ovem znaenho antigenu. Podle typu znakovac ltky rozliujeme rzn typy imunostanoven : a. RIA radioimunostanoven, kdy antigen je znaen radionuklidem, b. EIA enzymoimunostanoven , kdy antigen je znaen enzymem, c. FIA imunofluorostanoven, kdy je antigen znaen fluorescennm inidlem.

Strana222

RIA metody lze nap. vyut pro stanoven ptomnosti, produkovanch plsn Aspergillus flavus, v potravinch nebo krmivech.

10.3.7

Vyuit imunologickch metod v potravinsk mikrobiologii

Imunologick metody se pevn vyuvaj v klinick mikrobiologii pro identifikaci patogennch mikroorganism nebo schopnosti napadenho hostitelskho organismu tvoit protiltky. V potravinsk analytice se serologick metody k rychl identifikaci patogennch mikroorganism obsaench v potravinch. Velkho rozen si zskaly Latex testy, kdy je specifick protiltka navzan na kuliky latexu a v ptomnosti antigenu (hledan patogenn mikroorganismy) dochz k precipitaci na podlon destice. Tyto testy jsou vyvinuty pro salmonely a dokonce i pro toxiny produkovan nktermi patogeny. Jedn se nap o toxiny produkovan Clostridium perfringens nebo Staphylococcus aureus.

11

SEZNAM ROZTOK

R-1 Fyziologick roztok NaCl...8,5 g H2O1000ml R-2 Krystalov viole (Gram I) A: kystalov viole.5g Ethanol (96%n)200ml B: 1%n oxalt amonn Smchej 20 ml roztoku A a 80 ml roztoku B a zfiltrtuj R-3 Lugolv roztok (Gram II) I2..1g KI.2g H2O..300ml R-4 Kabofuchsin A: Fuksin basick1g Ethanol 96%n10ml B: 5%n fenol v H2O100ml Smchej oba roztoky a zfiltruj. R-5 Safranin

Strana223

Safranin.0,5g H2O..200ml Po rozputn zfiltruj R-6 Methylenov mod pro barven bakterilnch spor methylenov mod0,3g ethanol(96%n).30ml H20..100ml Rozpus barvivo v ethanolu,pidej destilovanou vodu,dobe rozmchej a zfilruj. Uchovvej v tmav lhvi. R-7 Methylenov mod pro barvan mrtvch bunk kvasinek methylenov mod,vodn roztok 1 : 5000.100ml 0,2 M KH2PO4 s pH upravenm na 4,6 pomoc NaOH ( 1 mol/l)..100ml R-8 Jodov roztok pro barven glykogenu R-9 Laktofenol R-10 Dornerv roztok nigrosaninu Rozpus 10g nigrosaninu ve 100 ml destilovan vody,va 30 min,pidej 0,5 ml 40%nho formaldehydu jako konzervan prostedek, dvakrt zfiltruj pes skldan filtran papr a uchovvej za asepticch podmnek R-11 Raulinv roztok R-12 Giemsv roztok R-13 Roztok bromthymolov mode (pprava pdy pro zkvaovn cukr P- ) bromthymolov mod.1,6g ethanol 95%50ml voda50ml Rozpus barvivo v ethanolu,pidej vodu a zfiltruj. R-14 Roztok methylerven (dkaz tvorby kyselin) 0,1 g methylerven rozpus v 300 ml 95%nm ethanolu a ze na 500 ml destilovanou vodou. R-15 Pufr pro bakterofgy R-16 Kysel roztok sublimtu R-17 Bohmova inidla na indol I. p-dimethylaminobenzaldehyd1g ethanol 95%n95ml

Strana224

HCl(konc.)20ml II. nasyc. vod. roztok persranu draselnho R-18 Kovacsovo inidlo n-pentanol...................75ml p-dimethylaminobenzaldehyd 5g HCl koncentrovan.25ml R-19 Tlumiv peptonov voda Pepton 5,0 g NaCl 8,5 g Na2HPO4.12 H2O 9,0 g 1,5 g KH2PO4 Voda 1000 ml pH 7,2

12

Seznam pd P-1 Plate count agar (PCA) Trypton 5,0 g Kvasnin extrakt 2,5 g Glukosa 1,0 g Agar 10,0 g Voda 1000 ml pH 7,0 0,2 P-2 Glukosov medium s kvasninm extraktem a oxytetracyklinem Kvasnin extrakt 5,0 g Glukosa 20,0 g Agar 12,0 g Biotin 0,0001 g Agar 12,0 g Voda 1000 ml pH 7,0 0,2 Po sterilizaci a vytemperovn pdy na 50o C se asepticky pid roztok 50

mg oxytetracyklinu rozputnho v 10 ml steriln vody

P-3 Czapek-Doxv agar pro plsn NaNO3 2,0 g KCl 0,5 g Mg glyrofosft 0,5 g 0,01 g Fe SO4 0,35 g K2SO4 Sacharosa 30,0 g Agar 12,0 g Voda 1000 ml pH 6,8 0,2

Strana225

P-4 Luria-Bertaniho medium LB Bakto-trypton 10,0 g Kvasnin extrakt 5,0 g NaCl 5,0 g Voda 1000 ml pH 7,2 0,2 P-5 Luria- Bertaniho agar (LBA) Bakto-trypton 10,0 g Kvasnin extrakt 5,0 g NaCl 5,0 g Agar 15,0 g Voda 1000 ml pH 7,2 0,2

P-6 Sabouradv agar Mykologick pepton Maltosa Agar Voda pH 5,6 0,2 P-7 Mueller-Hintonv agar Hovz vtaek Hydrolyzt kaseinu krob Agar Voda

10,0 g 40,0 g 15,0 g 1000 ml

300,0 g 17,5 g 1,5 g 17,0 g 1000 ml

pH 7,4 0,2
P-8 Pda pro rod Pseudomonas Pepton 16,0 g Hydrolyzt kaseinu 10,0 g 10,0 g K2SO4 1,4 g MgCl2 Agar 11,0 g Glycerol 5 ml Voda 1000 ml pH 7,1 0,2 Po vysterilizovn v autoklvu a po ochlazen na 50oC je mono pidvat roztoky antibiotik. P-9 Kompletn agar Kvasnin extrakt Pepton

5,0 g 3,0 g

Strana226

Hydrolyzt kaseinu Glukosa Voda Agar pH 7,0 0,2

P- 10 krobov agar Trypton Kvasnin extrakt Glukosa krob Agar Voda pH 7,0 0,2

5,0 g 10,0 g 1000 ml 18 g

5,0 g 2,5 g 1,0 g 10,0 g 10,0 g 1000 ml

P-11 Kopulan agar pro Saccharomyces cerevisiae Kvasnin extrakt 5,0 g Pepton 20,0 g Glukosa 20,0 g Agar 20,0 g Voda 1000 ml pH 7,0 0,2 P-12 Pda pro sledovn asimilace zdroj uhlku kvasinkami 5,0 g (NH4)2SO4 1,0 g KH2PO4 0,5 g MgSO4. 7 H2O Kvasnin extrakt 10 mg Voda 1000 ml pH 6,6 0,2 Jednotliv cukry se pidvaj do konen koncentrace 1%. Jedn se o glukosu, laktosu, maltosu a sacharosu.

Strana227