STERLZASYON

FGEN TIRN AKSIZ

ikrobiyolojk yk (bioburden), bir rnde bulunan mikroorganizma (MO) says ve trn belirten bir ifadedir. Farmastik Teknoloji asndan bakldnda, retilen formlasyon trlerinin ierecei en yksek mikrobiyolojik yk deerleri farmakopelerde bildirilmitir1. retim sonras saptanan mikrobiyolojik ykn izin verilene eit veya daha az olmas, retimin ve/veya rnn uygunluunun bir kant olarak kabul edilir. zellikle parenteral rn malat iin bu durum ok nemlidir. retim sonrasnda ve sterilizasyon ncesi yaplan mikrobiyolojik denetimlerde saptanan mikrobiyolojik yk, sterilizasyon koullarna karar verilmesinde belirleyici olmaktadr2. Sterilizasyon, steril durumun oluturulmas iin yaplan bir ilemdir. Steril durum, tm yaayan MO'larn uzaklatrldn veya yok edildiini belirten mutlak bir kavramdr. MO'larn lm kinetikleri nedeniyle bu kavrama ulalamaz. Ancak sterilizasyon tekniinin iyiletirilmesi ile bu duruma yaklama olasl artrlr3. Kullanlan sterilizasyon ynteminin ok dikkatli seilmesi gerekir. Kullanlacak yntem, rnde herhangi bir bozulmaya neden olmayan en etkili yntem olmaldr. Mesela, rn sterilizasyon scaklnda bozuluyor ise, formlasyona antibakteriyel bir madde ilave edilerek daha dk scaklkta sterilizasyon ilemini yapmak mmkndr3. MO'larn, szme le yaplan sterilizasyon yntemi hari, sterilizasyon tekniklerine kar gsterdikleri diren farkl olmaktadr. Spor oluturmu

VI

Modern Farmastik Teknoloji

MO'lar zorlayc koullara kar byk bir diren gsterirler ve ok dayankldrlar. Bu nedenle seilen sterilizasyon teknii, MO'nn spor eklini de yok edebilmelidir. Mesela scaklk uygulanarak yaplan sterilizasyonda ortamda nemin bulunmas scakln sporlar zerindeki ldrc etkisini artrmakta ve lm sresini ksaltmaktadr (Tablo 5.1 )3. Sterilizasyon ilemi, scaklk uygulayarak kimyasal madde yardmyla rn szerek n (UV veya radyasyon) vererek yaplabilir.

Mikroorganizmalarn lm Kinetii D deeri: MO'larn lm birinci mertebeden kinetie gre olmaktadr (Eitlik 5.1). lm hz, balangtaki MO says veya deriimi ile ilikilidir.

Bu eitlikte k, MO'larn lm hz deimezini; -dN/dt, zamanla MOderiiminin azalma hzn; N, t zaman (mesela sterilizasyon sresi sonunda) sonra sabit scaklkta (sabit gaz deriiminde veya gama radyasyon dozunda) yaayan MO saysn veya ykn gstermektedir. Bu eitliin integrali alndnda 5.2-5.4 eitlikleri elde edilir. N = N0ekt lnN=lnNo-kt log N - log No - kt log e (5.2)
x (5.3)
'

Seilen sterilizasyon ileminin baars rnn MO ykne (bioburden) baldr. Ne kadar ok ve/veya dayankl MO var ise, bunlar rnden uzaklatrmak iin o kadar ok enerji gerekir. Szme ilemi, MO'larn ldrlmedii bir ilemdir. Gzenek apnn stndeki hibir MO (canl veya l) rne geemez. Ancak dier sterilizasyon tekniklerinde MO'nn hcre yaps bozularak byme ve oalma faaliyetleri geri dnmsz olarak tahrip edilir ve bylece MO lr4.

(5.4)

Bu eitliklerde No, rnn sterilizasyon ncesi MO ykn (bioburden) gstermektedir. N ve No deerleri % olarak veya birim hacimdeki MO says olarak alnabilir (ekil 5.1). Anlalaca gibi, sterilizasyon ncesi rnn MO says ne kadar fazla ise, bunlardan kurtulmak iin o kadar uzun bir zaman gerekmektedir.

Tablo 5.1 Scaklk ve/veya nemin baz bakteri sporlar zerindeki ldrc etki oluturmas iin gerekli sre3 ldrc etki iin gerekli sre (dakika) Nem varlnda Mikroorganizma arbon basili Cl. botulinum Cl.vvelchii Cl. tetani Toprak basili 100C 5-15 330 5-10 5-15 >1020 110C
-

Nemsiz ortamda (kuru scak) 121C 10 120C

-

140C 180 60 5 15

170C 15 7 15

90
-

120 50
-

120

Steri lizasyon

65

Scaklk: Sabit

o1
J2 10
o Q-

9 0 9 9

c o> w

R i S o (D 10-

Logaritmik lm hz
99.9

1\ 1 \ 1 ' c^eer ' i | j 1 1 1 1 1

9 . 9 99

9 . 9 99 9

9 . 9 9 99 9

_ 10 >5 "
S W"

ro 10* i. E ft0 75 ,1S 10* >.

>.

1 ' l 1 " r
4 5

1 1

Dakika

I '

ekil 5.1 Sabit scaklkta mikroorganizmalarn lm grafii5

ekil 5.1'de y ekseni % olarak alnrsa, 106 deeri 100 mL'de 100 000 000 adet MO olduunu, 10 (*=% 100) deeri 100 mL'de 100 adet MO olduunu; 10"2 (=%1) deeri, 100 mL'de 1 adet MO olduunu, 10"3 (=%0.1) deeri 1000 mL'de 1 adet MO olduunu, 10~6 {=% 0.0001) ise, 1000 L'de 1 adet MO olduunu gsterir. Y eksenindeki 10 deerinin altndaki deerler rnde MO bulunma olasln fade eder. Geerli bir sterilizasyon ileminden sonra rnde MO bulunma olaslnn en fazla milyonda bir (IO6) olmas gerekir. Bu, retilen birim says asndan dnlrse, rnn steril olarak kabul edilebilmesi iin 1000000 birim rnden en fazla bir tanesinde MO remesinin kabul edilebilecei anlamna gelmektedir. MO'larn balang miktarnda % 90 azalma, yani balangtaki MO'larn % 90'nn lmesi ve geriye % 10'unun kalmas iin geen zaman "D" sresi olarak bilinir. D deerinin hangi scaklkta olduunu belirtmek iin, scaklk deeri indis eklinde yazlr (D121 gibi). Scaklk, gaz deriimi veya radyasyon dozu arttka

MO'larn % 90'mn lmesi iin gerekli olan sre azalr, lm hz deimezi byr (ekil 5.2).

Dakika

ekil 5.2 B.subtilis var. niger sporlarnn EtO gaz ile deiik scaklklarda sterilizasyonu (Et0=1200 mg/L, bal nem=%40)6

VI

Modern Farmastik Teknoloji

Balangtaki MO says 100 olarak kabul edilirse 5.2 eitlii, aadaki gibi yazlabilir: 10=100ekD n 10- n 100-kD
D

(5.5) (5.6) (5.7)

Bu eitliklerde k, D zamannn scakla bal olarak deitiini gsteren hz deimezidir. D1 ve D2 zamanlar T, ve T2 scaklklarnda saptanmtr. Buradan Z deerinin hesaplanabilmesi iin eitlik, D deerindeki % 90 azalmay gsterecek ekle getirilir (Eitlik 5.13 ve Eitlik 5.15). log 10 = log 100-Zk Z = 1/k (5.13) (5.14)

InlO

2.303

veya log 10=log 100-kD log e

D =-

(5.8)

log 100-log 10 k 0.434 2.303

k yerine 5.12 eitlii yerletirildiinde ise, 5.15 eitlii elde edilir. T2 -T l 1, logD,-logD2 (5.15)

D =

(5.9)

Z deeri, scakla bal lm zaman dorusunun eiminin tersidir (ekil 5.3).

100

Mesela otoklavda 121C'de 10 dakika tutulan bir parenteral rndeki MO saysnn, 4.10s'ten 2.103'e indii saptanm olsun. D121 deerini hesaplayabilmek iin nce MO'larn lme hz sabitlerinin hesaplanmas gerekir. Bu amala 5.2 eitlii kullanlr: 103ln 2 = 10 5 ln4- k10 k= 0.529 dakika1 Daha sonra D=n(10)/k=2.303/k eitlii kullanlarak D121 deeri 4.35 dakika olarak hesaplanr. ZDeeri: Bu deer D deerinde 10 kat deiiklik (1 og dilimi) olmas iin gerekli olan scaklk farkn belirtir. Mesela Z deeri 10C denilince, bu rnn scaklk deerinin 10C artrlmas ile D zamannn % 90 orannda azalaca anlalr. Z scaklnn saptanabilmesi iin scaklk deiimine bal olarak deien D deerleri yar logaritmik grafie geirilir (ekil 5.3). Grld gibi D zamanlar le scaklk arasnda logaritmik olarak dorusal bir iliki bulunmaktadr. Buna gre 5.10-5.12 eitlikleri yazlabilir. D2 = D, 10"k (T2 -T,) logD^logD^VT,)
ke =

o 1

100

110

Scaklk (C)

120

130

ekil 5.3 Scakla bal lm zaman dorusu5 Z ve D deerleri MO'larn szme hari dier sterilizasyon koullarna dayankllnn bir gstergesidir. Mesela Z deeri dk olan bir MO'nn byk olana gre scakla daha az dayankl olduu dnlr (ekil 5.4). Qf0deeri:Scaklkkatsays olarakbilinen bu deer, aralarnda en az 10C fark bulunan iki scaklkta MO'larn lm hz deimezlerinin orandr (5.16 eitlii). Q ^ k / k , (k2>k,) (5.16)

(5.10)
(5.11)

log D,-log P 2 T2 -T I I,

(5.12)

Bu deer szme yntemi dndaki sterilizasyon tekniklerinde etkili olup, scaklk veya etilen oksit deriimi gibi deikenlere bal olarak artar veya azalr.

Steri lizasyon

67

F0 = D521(logN0-logN)

(5.19)

F^ s ile sterilizasyon un zaman/scaklk erisinin integral! alnarak hesaplanabilir (5.17 eitlii). Bu amala genellikle 100C'nin zerindeki scaklk ve zaman deerlerine trapez kural uygulanarak eri altnda kalan toplam alan (Fo) hesaplanr (5.18 eitlii). Burada dikkat edilmesi gereken nokta, T scakl olarak alnan scakln otoklav veya etv scakl deil, rnn scakl olmasdr. zellikle otoklav sterilizasyon un da otoklavn scakl ile rnn scaklnn belli bir sre birbirinden farkl olaca unutulmamaldr (ekil 5.5).2 Eitlik 5.17'de grlen 121C deeri farkl bir scaklk olarak alnabilir. Mesela kuru sda yaplan sterilizasyonda bu deer 170C olarak alnmaktadr. Ayrca Z deerinin de 10C olmas gerekmez. Z deeri MO'nn zelliine gre seilmesi gereken bir deerdir. Eitlikteki 1o(T'121>/z deeri lm hzn gsterir. Eitlik 5.18'de At deeri rnn scaklk lmlerinin hangi zaman aralklarnda yapldn gsterir (her 2 veya 5 dakikada bir gibi). Mesela 121C de yaplan otoklav sterilizasyonu srasnda sterilize edilecek rnn scakl, 30 dakika boyunca her 5 dakikada bir llyor. lmlerde scaklk deerlerinin srasyla 25C, 110C, 118C, 128C, 121C, ve 100C olduu saptanyor. Ayrca nceden Z deeri 10C olarak bulunuyor. Bu koullarda yaplan otoklav sterilizasyon ileminin geerli olabilmesi iin Fo deerinin, Fo = 5 dakika(0 + 0.079 + 0.501 + 0.794 + 5 + 0.0079) = 31.91 dakika olmas gerektii ortaya kmaktadr. Dikkat edilirse, 100C'nin altndaki scaklk deerleri iin hesaplanan 1q(t-uwo deeri matematiksel olarak toplamn tm zerinde ok etkili olmamakta, dolaysyla 100C'nin altndaki scaklklar iin bu hesabn sonucunun sfr olarak alnabilecei anlalmaktadr. Fo zamannn hesaplanmas iin kullanlan 5.19 eitlii ise, rnn mikrobiyolojik yk (No) ve Dl21 sresi hesaplandktan sonra kullanlabilen bir eitliktir. rnn mikrobiyolojikyknn fazla olmas doal olarak daha uzun sre sterilizasyon koullarnda kalmasn

0.1-

0.01i

110

130

150

170

190

210

':

230

>

250

Scaklk (C)

ekil 5.4 Scakla bal deien D deerleri ve ilgili Z deerleri3 (A: B. Stearotthermophilus sporlarnn buhar sterilizasyonu iin saptanm Z deeri: 10C, B: B. Subtilis var niger sporlarnn kuru s sterilizasyonu iin saptanm Z deeri: 22C, OE.coii endotoksininin kuru s sterizasyonu iin saptanm Z deeri: 54C) F(TZ) deeri: Bu deer, scakln uyguland herhangi bir sterilizasyon ynteminde sterilizasyon un geerli olmas iin gerekli olan sterilizasyon sresini gstermektedir. F deeri temel olarak: o rn kabnn boyutu, ekli ve s geirgenliinden, rnn hacmi ve viskozitesinden, sterilizasyon kazanna yerletirilen birimlerin toplamnn bykl ve yerletirilme eklinden etkilenir. Sterilizasyon scakl 121C ve Z deeri 10C ise, bu scaklk iin gerekli olan sterilizasyon sresi, F0 olarak gsterilir. F deeri iki farkl eitlikle hesaplanabilir (5.17 ve 5.19 eitlikleri).
F

(T.z>

= JlO ,T121)/z dt

(5.17) (5.18)

F0=AtlO(T-121)/1

VI

Modern Farmastik Teknoloji

Yk scakl

Zaman

ekil 5.5 Buhar sterizasyonunda scaklk/zaman erisi2 (dz izgi: otoklav scakl, noktal izgi: rn scakl) gerektirmektedir. Ayrca sterilize edilecek rn sadece tek bir MO trn iermemektedir. zellikle rnde scaa dayankl MO sporlarnn (B.stearothermophilus sporlar gibi) olabilecei dnlmelidir. Bu nedenle sterilizasyon sresinin en kt duruma gre ayarlanmas gerekir2. Mikrobiyolojik yk 102 ve D121 deeri 1 dakika olan bir rnn steril olarak kabul edilebilmesi iin MO saysnn 10^'ya kadar inmesi veya steril olmama olasnn 106 olmas gerekir. Bu durumu salamak iin Fo deerinin 8 dakika olmas yeterlidir. F0 = D 121 (iogN 0 -logN) Fo = 1 dakika (log 102 - log 106) = 8 dakika Yine 5.19 eitlii ile uygulanan sterilizasyon sresinin yeterli olup olmad da hesaplanabilir. Mesela mikrobiyolojik yk 102 ve D121 deeri 2 dakika olan bir rn iin 8 dakikalk sterilizasyon sresinin yetmeyecei hesapla bulunabilir. naktivasyon faktr deeri (F): Szme hari dier sterilizasyon yntemlerinde kullanlan F deeri, sterilizasyon koullarnda t sresince kalan ve belli bir D deerine sahip MO'nn sterilizasyon ncesi saysnn, sterilizasyon sonrasnda ka logaritmik birim azaldn gsterir7. Bu deer malzemenin MO ykne bal olarak deiir. F deeri 5.20 eitlii ile hesaplanr. Mesela mikrobiyolojik yk 106 olan bir malzemenin otoklavda yaplan sterilizasyonunun geerli olabilmesi iin MO saysndaki azalmann 12 logaritmik birim yani 12 D olmas gerekmektedir. F 101/0 (5.20)

Mesela, D121 deeri 1.5 dakika olan bir bakterinin, 121C'de yaplan 15 dakikalk otoklav sterilizasyonu sonucunda saysndaki azalma 10 logaritmik blme kadardr. Eer mikrobiyolojik yk 109 ise, 15 dakikalk srenin sterilizasyon iin yeterli olamayaca anlalr. F deerinden hareketle F0 deeri de hesaplanabilir7. F0 = D121 Zog F Sterilizasyon yntemleri Sterilizasyon teknikleri temel olarak blmde incelenmektedir3,8: I. Fiziksel sterilizasyon yntemleri Scakln uyguland sterilizasyon yntemleri: Kuru s sterilizasyonu Doygun su buhar (saturated steam) ile sterilizasyon (ya s sterilizasyonu) Scakln uygulanmad sterilizasyon yntemleri: UV n ile sterilizasyon iyonize radyasyon ile sterilizasyon Szme ile sterilizasyon (5.21)

Steri lizasyon

69

i!. Kimyasal sterilizasyon yntemleri Gaz sterilizasyonu: Etilen oksit (EtO) gaz ile sterilizasyon Hidrojen peroksit gaz ile sterilizasyon Klor dioksit gaz ile sterilizasyon III. Aseptik yntem Scakln uyguland fiziksel sterilizasyon yntemleri s enerjisinin MO'lar zerindeki ldrc etkisi enerjinin iddetine, malzemenin sda bekletilme sresine ve ortamda nemin bulunup bulunmamasna baldr. Scakln artmas ve nemin varl snn ldrc etkisini artrr. Ortamda nemin bulunmas, dk scaklklarda sterilizasyon yaplmasna olanak vermektedir3. Nemin olmad ortamda, sadece scaklk uygulanarak yaplan sterilizasyonda, s enerjisi MO hcresindeki protein ve nkleik asitlerin okside olmasna neden olur. Scak buhar kullanlarak yaplan sterilizasyonda ise, MO hcrelerindeki enzim ve nkleik asitler hidroliz olmaktadr. Daha byk br s enerjisine sahip olan buharn ldrc etkisi, younlamas srasnda buharlama ssn younlat yzeye aktarmasndan kaynaklanmaktadr9. Scak kuru havann 1 gram 1 kalori s enerjisine sahip iken, 121C'de 1 gram buhar 525 kalori s enerjisine sahiptir. Bu nedenle buharn malzemeleri stma gc kuru havann yaklak 500 katdr3. Scakln uyguland sterilizasyon yntemlerinde bir sterilizasyon dngs {sterilization cycle time) malzemenin ilgili sterilizasyon scaklna gelmesi iin geen zaman (gecikme sresi), bu scaklkta bekleme sresini (sterilizasyon sresi) ve malzemenin oda scaklna gelmesi iin geen zaman (souma sresi) iermektedir. Kuru s (dryheat) sterilizasyonu: Kuru s hem MO'larn, hem de MO'larn metabolik artklarnn (pirojenik maddeler) yok edilmesi amacyla kullanlmaktadr. Doygun su buhar sterilizasyonundan ok daha yksek scaklkta yaplan pirojenierin yok edilmesi ilemi, bu molekllerin kimyasal olarak paralanmas esasna dayanr. Kuru s ile malzemedeki pirojenik maddeler yok

edildiinde ayn zamanda sterilizasyon da salanm olur. Buna karlk, ya s sterilizasyon koullan pirojenik maddelerin paralanmasn salayamaz. Kuru s sterilizasyonu iin F deeri, D deeri ve Z deeri, stlm nem ile yaplan sterilizasyondan farkldr. Kuru s ile yaplan sterilizasyon veya pirojenlerden kurtulma ilemi iin genellikle aada bildirilen koullarda allmaktadr8. Sterilizasyon iin: 160C 120 -180 dakika 170C 90 -120 dakika 180C 45-60 dakika Pirojenierin yok edilmesi iin: 230C 60 -90 dakika 250C 30 - 60 dakika Yaklak 140Cfnin stndeki scaklklara dayanabilen malzeme veya maddeler kuru s sterilizasyonu ile etvlerde sterilize edilebilir. 180C de iki saat veya 260C'de 45 dakika bekleme ile, bata sporlar olmak zere MO'larn tmnn ldrlmesi mmkndr3. Mesela kuru s sterilizasyonuna dayankl olduu bilinen B. stearothermophilus sporlar ve B.subtilis sporlarnn 150C-160C'de bir saat bekletilmeleri lmeleri iin yeterli olmaktadr10. Kuru s sterilizasyonu iin gerekli olan yksek scaklklarda ou maddenin yapsnda deiiklikler meydana gelir. Mesela sellozdan yaplm malzemeler kmrlemeye balar, kauuk oksitlenir ve termoplastikler erir. Bu nedenle kuru s sterilizasyonu, cam veya metal malzemeler, yksek scaklkta bozulmayan ve su iermeyen yalar veya kimyasal maddeler iin uygun bir sterilizasyon yntemidir. Sterilizasyon srasnda baz madde ve malzemelerin yksek scaklkta genileyebilecekleri unutulmamaldr. zellikle cam malzemelerin skarak krlmasna neden olan bu durumun engellenmesi iin malzemelerin yeterince aralk braklarak yerletirilmesi; ya ve benzeri maddelerin ise genileyerek tamalarn engellemek in uygun byklkteki kaplara konmas gerekmektedir3. Kuru s sterilizasyonunda malzemenin snarak sterilizasyon scaklna gelmesi, sterilizasyon odasnn snmasndan daha ge olur. Sterilize edilecek malzeme-

VI

Modern Farmastik Teknoloji

nin ok olmas, s geirgenliinin dk olmas veya slak olmas sterilizasyon scaklna erime sresini etkileyen nemli zelliklerdir. Validasyon almalar srasnda bu etkenlerin sterilizasyon a etkisi dikkatle incelenerek ilemin her aamas iin gerekli olan sreler saptanr3,0. Malzemelerin sterilizasyon scaklnda bekleme sresi, sterilizasyon odasnn en souk noktasnn saptanmas ile belirlenir. Bu amala s duyargalar (termoift, thermocouple) kullanlr. yle ki, sterilizasyon sresi, saptanan bu souk noktann sterilizasyon scaklna gelmesinden sonra balar. Bu arada u husus aklda tutulmaldr: Sterilizasyon odasnda bulunan ve souk noktadan daha nce sterilizasyon scaklna ulaabilen malzemeler daha uzun sre yksek scaklkta bekleyeceklerdir. Bu durum stabilit sorununa neden olabilir. Sonu olarak malzemelerin scaklktaki stabiliteleri bilinmeli ve en uygun scaklk ve sre saptanmaldr3. Kuru s sterilizasyonu iin iki tr etv kullanlr: Bunlar, snn doal konveksiyonla iletildii ve snn zorlanm konveksiyonla iletildii etvlerdir. Normal konveksyonda snan hava ykselerek yerini daha serin havaya brakr. Odann iindeki bu hava devinimi, malzemelerin veya raflarn neden olduu engelle aksar ve verimli bir s dalm elde edilemez. Bu nedenle normal konveksiyonlu etvlerde raflar arasndaki scaklk fark 20C veya daha fazla olabilmektedir. Bu ise sterilizasyon scaklna erimek iin gerekli sreyi uzatr3. Zorlanm konveksiyonlu etvler (ekil 5.6), snm havann malzemeler evresinde dndrld etvlerdir. Bu etvlerde, etv iine gnderilen hava HEPA (High Efficiency Particulate Air)filtrelerdengeirilir. Doal olarak bu etvlerin etkinlii dierlerine gre daha iyidir. yle ki, raflar arasndaki scaklk fark 1C'ye kadar inebilmektedir. Sonu olarak bu etvler ile malzemelerin sterilizasyon scaklna gelebilmesi iin geen sre ok azalmaktadr3. Bu etvlerin i basnc srekli olarak kontrol edilir. Basncn steril olmayan d ortama gre biraz fazla olmas, steril sahaya gre daha az olmas gerekir8. Yukarda aklanan iki etv dnda ila endstrisinde scak hava tnelleri (ekil 5.7) de sterilizasyon amacyla

kullanlmaktadr. Bu yntem cam malzemelerin, zellikle iine parenteral rn doldurulacak ielerin sterilizasyonu iin uygundur. Yntemde cam malzemeler sterilizasyon un gerekleecei scakla kadar stlm bir tnel iinde hareket eden ve paslanmaz elikten yaplm elek eklinde olan yatak zerine yerletirilmitir. Malzemeler tnelden ktklarnda sterilize edilmi olmaktadr. Devaml sterilizasyonun saland bu tnellerde hava HEPA filtrelerden szlr ve havann stlmas R lambalar veya elektrikle yaplr. Sterilizasyon sresi sonunda ortama steril hava gnderilerek malzemelerin soumas salanr. Bu yntemin en nemli faydas, sterilizasyondan hemen sonra ielerin dorudan aseptik ortama gnderilerek doldurma makinalarnda yerlerini almalarnn salanabilmesidir. lem 280C'de 20 dakikadan 300C'de 3-4 dakikaya kadar ndirilmitir. Istmann R ile saland tnellerde, s hem yukardan hem de yryen yatan altndan uygulanr. Bu tr tnellerde HEPA filtreden gnderilen hava yatan hareket ynnn tersine hareket ederek stlmann gerekletii blgeden geerken snr ve malzemenin yklendii ksmda malzemelerin hem kurumasn, hem de snmasn salar. Scak havann HEPA filtrelerden szlerek tnel iine gnderildii teknikte, hareketli yatan hznn azaltlmasna gerek olmamakta ve malzemenin snma sresi ok ksalmaktadr3-8. Kuru s sterilizasyonunun bir nemli zellii, ilem sonucunda zellikle cam malzemenin kuru olarak kullanma hazr duruma gelmesidir. Bu, bekleme srasnda sterilitenin daha kolay muhafaza edilmesini salar. Ayrca ieler iin, lerine doldurulacak parenteral formlasyonun seyrelmesi de engellenmi olur. Sterilizasyon ileminden sonra kullanm iin bir sre beklenecek ise, malzemelerin evresel mikrobik bulamadan korunmas amacyla ak yerlerinin alurninyum varak gibi bir malzeme ile iyice kapatlmas gerekir. Malzemelerin paslanmaz elik bir kutu iinde sterilize edilmesi, kullanlncaya kadar sterilitenin korunabilmesi iin uygun bir yntemdir3. Doygun su buhar (saturated steam) ile sterilizasyon: 121C'de doygun su buharyla yaplan sterilizasyon, dk maliyetli, gvenilir ve deiikliklere izin verebilen bir sterilizasyon yntemidir. Bu sterilizasyon lemi otoklav ad verilen ve genellikle ceketli olarak imal

Steri lizasyon 71

eki! 5.6 Zorlanm konveksiyonlu etvlere bir rnek8

ekii5.7Sterilizasyon amacyla kullanlan scak hava tneline bir rnek8

VI

Modern Farmastik Teknoloji

edilmi basnca dayankl sterilizasyon odalarnda yaplr. Otoklavn buhar ile temasta olan ksmlar yksek kaliteli (316 kalite) paslanmaz elikten imal edilir8.ekil 5.8'de otoklav ematik olarak gsterilmitir.

rekir. Bu buhara doygun buhar denir. Eer buhar az da olsa su damlas ieriyor ise, sterilizasyonun etkinlii azalr10. 121C'de doygun su buhar baz nemli zelliklere sahiptir. Bunlardan birincisi, su buharnn younlamasyla sahip olduu enerjinin aa kmasdr. Mesela 1 kg 121 C'deki buhar soumadan younlatnda yaklak 525 kcal (kilokalori) enerji aa kar. kinci nemli zellik ise basncn ve scakln birbirine bal deerler olmasdr. Belli scaklktaki doygun buharn basnc sabittir. Basn artarsa, buharn younlamamas iin scaklnn da artrlmas gerekir. Bu, buharn scaklnn deimesiyle basncnn da deieceini gsterir. Mesela, scakl 121C olan su buharnn basnc 2.05 bardr (atm). Bu, otoklav steril izasyonu srasnda ilem odasnn sadece scaklnn veya sadece basncnn kontrol edilmesinin yeterli olaca anlamna gelmektedir8. 121C'de veya 2.05 bar basntaki su buharnn bir dier zellii de, bir molnn (sv halde 18 g veya 18 mL) hacminin 15 L olmasdr. Ksaca belirtmek gerekirse, bir mol su buhar younlatnda, hacmi yaklak 1000 kez klecek ve younlamann olduu blgede ksmi vakum oluacaktr8. Vakumun olutuu blgeyi ise, hemen taze scak buhar dolduracaktr. Bu olay, yzeyin buharla ayn scakla gelmesine kadar devam eder3,7,8. 121C'desu buhar ile sterilizasyon yaplrken, su buharnn MO ile temas etmesi arttr. Buharn MO'lar zerinde ldrc etkisinin olumas, ya dolayl yoldan, ya da dorudan gerekleir. Cerrahi malzemelerin otoklav sterilizasyonunda ikinci durum geerli olurken, sulu zelti tayan ampul gibi az kapal birimlerin sterilizasyonunda birinci durum geerli olmaktadr. Az kapa/, ii bo veya su iermeyen yal bir karmla dolu olan bir ampulun ksm bu koullarda otoklav sterilizasyonu ile sterilize edilemez. Cam iedeki sulu zeltinin sterilizasyonu srasnda, ie iindeki basn otoklav odasndaki basntan biraz daha fazla olur. Bunun nedeni, otoklav iindeki havann ekilmi olmas; buna karlk ie iindeki havann uzaklatrlamamasdr. iedeki zeltinin st tarafndaki havann basnc yaklak 1 bar kadardr.

SJf
uucnh UZ 2Z2Z| (j G
f/7773

.Su buharnn kt vana

HB tri!

Kapak tutucu

& O / \ . 0 O 'o o - l A / u n n *m t D * m ft f x) n

Kaynayan su

[\/wvyvw|
Is kaynai

ekil 5.8 Ceketli otoklavn ematik gsterimi2 Otoklav sterilizasyonu ile, hermetik olarak kapatlm parenteral rnler, cam malzemeler, kauuk kapaklar, deiik filtreler, ayrca cerrahide kullanlan aletler ve kuma benzen malzemeler sterilize edilebilir. Sterilizasyon sonras malzemeler slak olur. lem sonrasnda kurutma amacyla vakum uygulanmas malzemenin tmyle kurumasn salayamamaktadr. Eer tmyle kuru malzeme gerekiyor ise, vakumlu etvler bu ama iin kullanlabilir. Sterilize edilecek malzeme koruyucu bir ambalaj malzemesi ile sarlm ise, bu malzemenin slanmaya kar dayankl olmas, buharn kolayca ieriye girmesine ve havann rahatlkla darya kmasna izin verebilmesi, sterilizasyondan sonra sterilize edilmi malzemenin bu zelliinin devamn salayabilmesi gerekir. Otoklav sterilizasyonunda malzemelerin ambalaj iin zel bir parmen kad olan Kraft kad ve Tyvek kullanlr. Dakron ise, otoklav sterilizasyonundan sonra tekrar kullanlabilen bir ambalaj malzemesidir3. Otoklavda en yksek verimi elde edebilmek iin, hi su damlac iermeyen kuru buharn kullanlmas ge-

Steri lizasyon

73

Sterilizasyon koullarnda ise, bu boluktaki ksmi buhar basnc 2.05 bar olur. Ayrca scakln etkisi ile sv iinde znm olan gazlarn svy terkederek svnn stndeki gaz fazna gemesiyle de basn yaklak 0.3 bar kadar daha artmaktadr. Bu durumda ienin iinde zeltinin stndeki basn yaklak 3.35 bara kadar kar. Otoklav sterilizasyon unda kullanlan cam malzemeler bu basn artna kar dayanabilen yaplardr. Ancak sterilize edilecek sulu karmn esnek ambalaj malzemeleri iinde olmas, bu kaplarn imesine neden olabilir8. Otoklav sterilizasyonunda, otoklav iinde var olan veya buharla beraber oda iine giren havay oluturan gazlarn molekler arlklar dolaysyla dansiteleri su buharndan yaklak 1.5-2 kat fazladr (ayn scaklk ve basnta). Otoklav odasna gnderilen buhar bu nedenle oda iindeki havay odann alt ksmna iter ve hava buhar ile karmadan bu blgede tabakalamaya neden olur. Buradaki hava en fazla buharn scaklna kadar snabilir. Buhar bu blgedeki yzeylerle temas edemedii iin sterilizasyon gerekleemez. Otoklav sterilizasyonu sresi iinde buharla temas etmeyen yzeylerin steril izasyonu, 121C'de yeterince uzun sre kalamadklar iin salanamaz. Bu sorunu ortadan kaldrmak iin sterilizasyon ncesi otoklav odasnn havas vakum uygulanarak ekilir. Ayrca malzemeler, aralarndaki havann kolayca kabilmesine ve buharn

bu blgeleri doldurabilmesine olanak verecek ekilde yerletirilir. Uygulanan vakumla oda iindeki havann % 90 kadar boaltlabilmektedir3,8. Otoklavla sterilizasyonda, ilemde temel olarak aama bulunmaktadr. Bunlar: sterilizasyon odasndan havann ekilmesi, stma ve sterilizasyon aamas sterilizasyon sonras aama olarak incelenmektedir (ekil 5.9)5. Istma aamasnda nemli miktarda buhar younlar. Oda iindeki basn veya scaklk deerinde azalmaya neden olmamas iin, younlaan su darya alnr. Otoklav sterilizasyonunda malzemelerin sterilizasyon scaklna gelmesi iin geen srenin, kuru s sterilizasyonunun aksine, toplam sterilizasyon dngs sresi iindeki yeri ok nemli deildir. Bunun nedeni, malzemelerin ok daha yksek enerji ile kar karya kalarak daha ksa srede snmalardr3,8. Sterilizasyon sonras aama temel olarak sterilizasyon odasnn basncnn normal basnca indirilmesi, yani scakln normale drlmesi aamasdr. Sterilizasyon ileminin toplam sresinin azaltlmas iin, souma aamasnn mmkn olan en ksa srede tamamlanmas gerekir. Ayrca sterilizasyon ilemi sonras mal-

ekil 5.9 Havann vakumla alnd otoklav sterilizasyonunda scaklk/basn grafiis

VI

Modern Farmastik Teknoloji

zemelerin scak ortamda bekletilmemesi istenir. Bu amala sterilize edilmi malzemenin cinsine bal olarak deiik uygulamalar yaplmaktadr. Olduka uzun bir zaman almasna ramen, otoklav sterilizasyonu sonucunda sterilizasyon odasndaki scakln kendi kendine azalmas beklenebilir. Scaklk azaldka oda iindeki su buhar younlaacak ve yksek olan basn da azalacaktr. Scaklk srekli olarak azalacandan, younlama ilemi de devam edecektir. Oda iindeki basn 1 bar'a indiinde otoklav kapa alarak malzeme dar alnabilir. Otoklavda sterilize edilmi malzeme sulu zelti ieren bir malzeme deil ise, oda iindeki su buharnn vakum uygulanarak dar alnmas ve yerine normal scaklkta steril hava verilmesi malzemeye bir zarar vermez. Bylece malzeme hem daha hzl kurumu hem de soumu olur. Ancak iinde sulu zelti bulunduran kaplara bu ekilde hzl bir soutma yaplamaz. Bunun nedeni, sterilizasyon sonucunda vakumla oda iindeki buharn alnmas ve yerine normal scaklkta steril hava verilmesi sonucu kaplar/ieler bir anda daha serin bir ortamla karlarlar. Ancak kap iindeki sv, sterilizasyon odasnn souma hzyla ayn hzda souyamaz. Ayrca ienin iindeki boluu dolduran su buhar bir anda younlaarak ie iinde vakum olumasna neden olur. Bu vakumun etkisi ile, iedeki scak sulu zeltinin yapsndaki su dk basnta buharlaarak (kaynama) ienin stndeki bolukta yksek bir buhar basnc olumasna neden olur. Sonuta kap camdan imal edilmi ise patlayabilir; plastik bir malzemeden yaplm ise iebilir. Otoklav sterilizasyonu sonucunda zelti ieren cam kablarn mmkn olan en yksek hzda soutulmas iin gvenli yntemler gelitirilmitir. Bunlardan bir tanesi malzemelerin stne bulut eklinde distile suyun pskrtlmesidir3'8-15. Distile suyun kullanlmasnn nedeni, cam malzemenin dna bulam suyun kurumasndan sonra yerinde tuz yapsndaki maddelerden kaynaklanan lekelerin olumamas iindir. Bu uygulama ile sterilizasyon odasnn basnc kademeli olarak azalr, buna karlk kaplarn iindeki basn ayn hzda dmez. Ancak kullanlan cam malzeme bu basn farkna dayanacak gtedir. Cam kaplarn iindeki sv scaklnn 70-80C'ye inmesi le soutma ilemine son verilerek malzemeler dar kartlr. Malzemenin

sahip olduu bu s enerjisi, dndaki su damlalarnn buharlamasn da salar. Dier bir hzl soutma yntemi, yksek basnl su buharnn oda iine gnderilmesidir. Bu uygulamada, yksek basnl buhar oda iine girince bir anda genilerken scak malzemeden s enerjisini eker. Daha sonra buhar dar ekilerek hem basn, hem de scaklk azaltlm olur. Ayn ilem birka defa tekrarlanr. Sonuta kademeli olarak malzemelerin scakl azaltlm olur. Aklanan bu yntemler srasnda, ielerin iindeki basn ile odann basnc arasndaki fark ok artrmamak iin odaya kademeli olarak hava verilebilir. Otoklav sterilizasyonunda her zaman sadece scak doygun su buhar kullanlmaz. Baz durumlarda hava/ buhar karmnn kullanlmas gerekir. Doal olarak bu karmn s kapasitesi saf buhardan daha azdr. Buhar iinde havann olmas, sterilizasyon odasnn basncn kontrol etmeyi kolaylatrr. Bu durum zellikle plastik torbalara konmu parenteral rnlerin veya sklabilir tpte ambalajlanm sulu jellerin otoklav sterilizasyonunda nem kazanmaktadr. Saf buhar ile yaplan otoklav steril izasyonu nun souma aamasnda bu ambalajlarn iip patlama olasl vardr. Hava/buhar karm kullanlp havann basnc bamsz olarak denetlendiinde, ambalajn iindeki basnca e bir basn ayarlanabilir. Ancak bu uygulamada buhar ve havann tabakalar halinde ayrlma eilimi olmas nedeniyle karmn srekli olarak kartrlmas gerekir35. Bu uygulama iin hava+buhar karmnn kullanld otoklavlar gelitirilmitir (ekil 5.10)8. Bu otoklavlar doygun buharla alan otoklavlardan daha yksek basnta alrlar. lerindeki hava boaltlmaz. Hava+buhar karm otoklav odasnn alt ksmndan verilir. Karmn ksmi hava basnc odaya girmeden nce ayarlanr. Odann tavan ksmnda hava/buhar karmnn srekli karmasn salayan bir pervane bulunur. Oda iine gnderilen hava/buhar karm eride stlr ve 121C'ye gelmesi salanr. Souma aamasnda ise, gnderilen hava basnc ayarlanarak, hem buharn younlamas salanr, hem de zamanla hava buharn yerini alr8. Hava/buhar karmnn kullanld otoklavlarn yansra, ar stlm suyun kullanld otoklavlar da gelitirilmitir (ekil 5.11). Bu otoklavlara malzeme yklen-

Steri lizasyon

75

Boaltm <] Manyetik pervane Ak ayarlayc

Hava + buhar k

Saf buhar

Istclar
eme suyu

Boaltm

ekil 5.10 Hava+buhar karmnn kullanld otoklav8 dikten sonra, alt ksmda bulunan depo su ile doldurulur. Otoklav odas iindeki hava boaltlmaz. Depodaki su stcdan geerek snr ve odann tavanndaki bir dzenekten oda iine pskrtlr. Otoklav iine gnderilen basnl hava, suyun buharlamasn engelleyerek suyun stclarda 121C'ye kadar ar snmasn salar. Bu su kademeli olarak malzemeleri ksa srede str. Souma, steril suyun oda iine pskrtlmesi ile salanr. Bu arada hava verilerek oda iinin basnc esBuhar

nek ambalaj malzemesinin imesini engelleyecek dzeyde tutulur. Sonuta 15 dakikadan daha ksa srede malzemelerin scaklklar 70C'nin altna iner. Bu otoklavlar le plastik torba veya plastik/aluminyum ambalaj indeki sulu karmlar, ileri nceden doldurulmu enjektrler, ambalaj ii ile oda arasndaki basn fark ortadan kaldrlarak veya belli bir deerde sabit tutularak hibir sorun yaanmadan sterilize edilebilmektedir.8

p-Xjj

su yTO=^=

Istc

Havay sterilize eden filtre

Su k " O

Hava + buhar k

ekil 5.11 Ar stlm suyun kullanld otoklav8

VI

Modern Farmastik Teknoloji

Scakta zellikleri deien veya bozulan gzenekli malzemeler iin, formaldehit varlnda dk scaklktaki doygun buharla sterilizasyon yapmak mmkndr. Otoklav kullanlarak yaplan bu sterilizasyonda formaldehit gaz ve su buhar birarada kullanlr. lem scakl 65C ile 80C arasnda, gaz deriimi ise 3.3 mg/L ile 100 mg/L arasnda deimektedir. Sterilizasyon sresi genellikle 2 saat olarak alnmaktadr. Bu sterilizasyon iin yksek derecede vakum uygulanabilen otoklavn kullanlmas gerekir. lem srasnda formaldehitin polimerize olmamas iin scaklk denetiminin ok dikkatli yaplmas gerekir. Sterilizasyon ilemine balamadan nce odadan ve malzemelerden hava, vakum uygulanarak uzaklatrlr. Daha sonra buhar verilerek malzeme nem ile doyurulur. Son olarakformaldehitgaz odaya gnderilir. Sterilizasyon sresinin sonunda odadaki gaz/buhar karm vakumla ekilerek yerine doygun buhar gnderilir. Bu ileme, formaldehit malzemeyi terk edinceye kadar devam edilir. Daha sonra oda iine steril hava gnderilerek ilem sonlandrlr9-11. Scakln uygulanmad fiziksel sterilizasyon yntemleri UV ile sterilizasyon: UV , dalga boyu 328 ile 210 nm arasnda olan nlardan olumaktadr. MO'lar zerinde en ldrc etki, 240 ile 280 nm dalga boylar arasndaki UV n ile elde edilir. Dalga boyu 253.7 nm olan n, ldrc etkinin en fazla grld UV ndr. Ova buharl lambalarn verdii UV nn % 90'dan fazlas, dalga boyu 253.7 nm olan ndan olumaktadr12. Bu nedenle sterilizasyon amacyla bu lambalar kullanlmaktadr. UV nn MO'lar zerindeki ldrc etkisi veya UV na kar MO'larn gsterdikleri diren, MO tipi (Tablo 5.2), MO says, MO'nn durumu, ortamda organik yaplarn bulunup bulunmamas, scaklk, hangi dalga boyundaki UV nnn kullanld ve MO'nn kendini tedavi etme zellii gibi deiik nedenlere baldr. Bakteri sporlarnn UV nna kar ok daha dayankl olduklar bilinmektedir (yaklak 3-10 kez). Virsler de UV nda lrler ve gsterdikleri diren bakteri sporlarndan daha azdr. MO saysnn ok olmas, bunlarn yok edilmesi iin gerekli olan UV n dozunun daha fazla olmasn gerektirir. Ayrca MO'nn kendi yaam dngsnn hangi aamasnda bulunduu, UV nna kar gsterdii direnci etkilemektedir. Bunun yansra

ortamda nemin bulunmas, ldrc etkinin olumas iin gereken UV n iddetinin/dozunun daha az olmasna neden olmaktadr. MO'nn bulunduu ortamda kan ve serum gibi organik bir yap varsa, ldrc etkinin olumas iin gerekli UV n dozunun artrlmas gerekmektedir. Dk scaklklarda ou MO, UV nna kar ar bir hassasiyet gsterir ve dk dozlarda ldrlmeleri kolaylar. MO'larn bazlar, UV nnn neden olduu hasar tamir edebilme yeteneine sahiptir ve bu nedenle bu MO'larn UV nna kar direnleri daha fazladr12. Tablo 5.2 UV na kar MO'larn bal direnci12 Diren Yksek rnek mikroorganizma Micrococcus radiodurans B. subtilis / B.globgii sporlar Sarcina iutea M. Sphaeroides Salmonella typhimurium Saccharomyces trleri Sreptococcus lactis Grip virs . coli Staphylococcus aureus Proteus vulgaris

Orta

Dk

MO'lar zerinde en fazla ldrc etki oluturan UV n, cva buhar lambalarnn 253.7 nm dalga boyunda oluturduu ndr. UV n oluturan nlar dz bir izgi zerinde hareket ederler. Inn iddeti, katettii mesafenin kare kkyle ters orantldr. UV nlar giri yapabilme zelliklerinin zayf olmasndan dolay her yapya nfuz edemezler. Mesela temiz hava ve temiz suya rahatlkla girebilmelerine ramen, tanecik iermeleri durumunda (kirli hava veya zelti) bu yaplara giri yetenekleri ok azalr. Dier kat yaplara girileri ise, hemen hemen imkanszdr, bu nedenle temel olarak yzeylerde ve havada bulunan MO'larn ldrlmesi amacyla kullanlrlar3. UV bir yapnn ine girdii zaman, sahip olduu enerjiyi bu yapy oluturan atomlarn evresindeki elektronlara aktarr. Atomlar bu ekilde yksek enerjili bir konuma gelince kimyasal reaksiyona girme zellikleri tmyle deiir. Bu olayn MO'daki temel molekl-

Steri lizasyon 7 7

leri (nkleik asitler gibi) oluturan atomlarda meydana gelmesi, MO'nn yaamsal faaliyetlerinin deimesine neden olur. Bu durumda MO ya lr, ya da kendini yenileyemeyecek duruma gelir.3 UV n karsnda spor oluturmayan bakterilerin DNA'snda bulunan timinin dier bir timin ile dimer bir yap oluturduu saptanmtr. Bu olay, zellikle 253.7 nm dalga boyundaki UV n ile maksimum seviyede grlmektedir. Bakteri sporlarnda da buna benzer bir reaksiyonla daha deiik bir dimer yapsnn olutuu, ancak bu yapnn aklanamayan bir mekanizma ile bakteri hcresi iinde yokedildii saptanmtr. Bakteri sporlarnn daha dayankl olmasnn nedeninin de bu olduu belirtilmitir12. Her MO'nn UV nna kar direncinin farkl olmas nedeniyle, sterilizasyonun salanabilmesi iin yeterli iddetteki UV nnn yeterli sre verilmesi gerekir3. Tablo 5.3'de baz MO'larn 253.7 nm dalga boyundaki UV n etkisi ile lmesi iin gerekli olan enerji deerleri (pW/saniye/cm2) verilmitir. Buna gre 20 pW/cm3 iddetindeki UV n ile B. Subtlis'in lmesi iin 550 saniye, bu bakterinin sporlarnn lmesi iin ise 1100 saniye yetecektir. Tablo 5.3 Dalga Boyu 253.7 nm olan UV n ile baz MO'larn lmesi iin gerekli enerji miktarlar3 Mikroorganizma
Aspergillus niger Rhizopus nigricans Sarcina lutea Pnicillium roqueforti B. subtiiis sporlar S. cerevisiae P. aeruginosa E.col S. aureus St Hemolyticus Ebethella typosa

mundan korunmalar gerekir. MO zerindeki ldrc etkileri lambann eskimesi ile azalr. Bu nedenle n yayma gleri % 30-50 orannda azaldnda deitirilmelidirler. UV lambalarnn bulunduu ortamlarda alan kiilerin ciltlerini ve gzlerini UV nndan korumalar iin zel nlem almalar arttr. Bu kiiler bir saat iinde 2.4 pW/cm2'den daha fazla UV nna maruz kalmamaldr. yonize radyasyon ile sterilizasyon: yonize radyasyon, elektromanyetik radyasyon ve taneciklerden kaynaklanan radyasyon olmak zere iki grupta incelenir. Elektromanyetik radyasyon gama nlar ve X nlarndan kaynaklanmaktadr. Taneciklerden oluan radyasyon ise, alfa tanecikler, beta tanecikler, pozitronlar, ntronlar ve hzlandrlm yksek enerjili elektronlardan oluur. Sterilizasyon amal olarak sadece iki radyasyon kayna kullanlmaktadr. Bunlar, gama nlar ve hzlandrlm yksek enerjili elektronlardr1011. yonize radyasyonla yaplan sterilizasyonun en nemli zellii, s enerjisine gerek duyulmadan malzemelerin ambalajlar iinde sterilize edilebilmesidir2. Bu nedenle bata etilen oksit sterilizasyonu olmak zere, scakta gerekletirilen dier sterilizasyon yntemlerine alternatif bir yntemdir13-11. Ayrca iyonize radyasyonla, hi kesintisiz olarak sterilizasyon ilemi gerekletirilebilir. Hzlandrlm yksek enerjili elektronlar ya dorusal hzlandrclardan (linear accelerator) ya da Van de Graaff hzlandrclardan elde edilir. Dorusal hzlandrclarda ok yksek frekansl mikrodalgalar, katotdan elektronlar toplar ve elektronlar bir vakum tp iinde ilerlerken bunlar hzlandrrlar. Elektronlarn hz neredeyse k hzna yaklar. Sonuta aletten kan elektronlarn enerji dzeyleri 3-15 milyon elektron volt (meV) kadar olur. Sterilizasyon iin enerji dzeyi 9 meV'dan fazla olan elektronlar, radyoaktif madde oluumuna neden olabilecekleri iin kullanlmaz. Ayrca enerji dzeyi 5 meV'dan az olan elektronlar da yapya giri yeteneklerinin yetersiz olmas nedeniyle sterilizasyon amacyla kullanlmaz. Van de Graaff hzlandrclar ise, enerji seviyesi 3 meV olan elektronlar oluturma gcne sahiptir313. Hzlandrlm elektronlarn enerji

Enerji miktar
(pW/sa niye/cm2) 330000 220000 26400 26400 22 000 13200 10500 6 600 6 600 5500 4 100

UV lambalarnn etkilerinin en st dzeyde devam etmesi ve verdikleri UV nnn iddetinin azalmamas iin, toz, ya ve yzeylerinde herhangi bir izik oluu-

VI

Modern Farmastik Teknoloji

seviyesinin gama nndan daha fazla olmas, sterilizasyon sresinin daha az olmasna neden olmaktadr . Gama n kayna olarak radyoaktif bir izotop olan kobalt-60 ( Co) kullanlmaktadr. Co'dan iki proton ve bir elektron yaylr. Bu toplam olarak 2.81 meV'luk enerjiye karlk gelmektedir. Genellikle kan ve kan rnlerinin sterilizasyonunda kullanlan sezyum-137 (137Cs) de gama n kayna olarak kullanlmaktadr. Ancak yayd nn enerji dzeyi (0.66 meV) dk olduu iin, baz durumlarda tercih edilmektedir8'11. iyonize edici radyasyonla yaplan sterilizasyonda radyasyonun dozu malzemenin emdii gama nndan veya malzemenin 1 cm2'sine arpan elektron saysndan saptanr. Malzeme tarafndan emilen radyasyonun dozu "rad" ile gsterilir. Bir rad, 1 gram maddenin emdii 100 erg'lik enerji miktardr. 2-2.5 megarad (Mrad) (=20-25 kiloGray) dozundaki gama nnn steriliteyi salamak iin yeterli olduu bildirilmektedir3-13. lemin validasyonunun yaplmas artyla, mikrobiyolojik yk az olan madde veya malzemeler iin daha dk doz kullanlabilir22. Gama radyasyonda kullanlan radyoizotopun zor bulunmas ve masnn istendii zaman bitirilememesi, hzlandrlm elektronlarda ise, hzn ayarlanabilmesi veya mann durdurulmasnn mmkn olmas, iyonize radyasyon kayna olarak yksek enerjili elektronlarn daha fazla tercih edilmesine neden olmaktadr14. yonize radyasyonla; hastanede kullanlacak aletler, kontakt lens zeltileri, bebek emzikleri, her trl tbbi malzeme, baz vitaminler, baz antibiyotikler, baz steroitler, baz hormanlar, baz kanser ilalar, kemik ve dokular sterilize edilebilir. inde su bulunan ila ekilleri, iyonize radyasyonla sterilize edilmezler. Bunun nedeni, su moleklnden oluan peroksitin ve serbest radikalin formlasyonu oluturan yaplarla reaksiyona girme tehlikesinin olmasdr36-8. Spor oluturmam bakteriler yonize radyasyona en hassas MO'lardr. Bunlar kf, mantar, spor eklindeki bakteriler ve virsler takip eder6. Sporlarn ve virsle60 60 11

rin iyonize radyasyona kar gsterdikleri diren, spor oluturmam bakterilerden drt be kat fazladr3. ou bakteri sporunun D deeri 0.2-0.3 Mrad, ou virsn D deeri ise, 0.5 Mrad olarak bulunmutur. ekil 5.12'de, radyasyona byk diren gsteren baz MO'larn iyonize radyasyonun etkisi ile lm erileri grlmektedir13.

G a m a r a d y a s y o n u dozu (Mrad)

ekil 5.12 Kuru durumda olan baz MO'larn gama radyasyonun etkisi ile etkisiz duruma getirilmeleri (gama radyasyon kayna:60Co)13 yonize radyasyonun MO'lar zerindeki ldrc etkisi deiik yollarla olumaktadr. Bunlardan birincisi, hcredeki DNA zerinde mutasyona neden olarak hcrenin oalmasn engellemesidir. Bir dier etki, hcredeki temel molekllerden serbest radikallerin oluumunu salamasdr. Bu radikaller hcredeki dier molekllerle reaksiyona girerek nemli molekllerin ilevini bozar. Bunlarn yansra su molekln iyonlatrarak serbest radikal ve peroksitlerin oluumunu salar ve bu yaplar hcre indeki nemli molekllerde enerji deiimine neden olarak metabolizma faaliyetlerini durdurur3'10'14. Szme ile sterilizasyon: Sterilizasyon amacyla yaplan szme, herhangi bir svdan veya gazdan MO'larn uzaklatrlmas ilemidir. Steril szme tm MO'lar tutacak zellikte olmaldr. Bu nedenle kullanlan filtrenin gzenek apnn MO'y geirmeyecek boyutta olmas gerekir. Steril szmede temel olarak membran filtreler

Steri lizasyon

79

kullanlr {Bkz. Blm: 4, Szme). Ancak az da olsa, porselen veya cam filtrelerin de bu amala kullanlabilecei bildirilmitir2'3-6. Svlarn sterilizasyonu amacyla kullanlan cam veya porselen filtreler esas olarak derinlemesine szme yaparlar. Sterilizasyon ileminden sonra ykanp temizlenerek tekrar kullanlabilir duruma gelirler. Temizlenmeleri iin kuvvetli asitle ykanrlar veya yksek scaklkta braklrlar. Temizleme ilemi sonrasnda gzeneklerinde byme ihtimali olmas nedeniyle, her temizlemeden sonra steri! szme yapp yapamayacaklar kontrol edilmelidir36. Sterilizasyon amacyla kullanlan membran filtreler tek kullanmlktr. ok ince olmalar nedeniyle kolaylkla yrtlabilirler. Szme ilemi srasnda da basn fark nedeniyle ayn olay gerekleebilir. lem srasnda filtreyi tayan, ykanp sterilize edilerek tekrar kullanlabilen tutucu/tayc olmadan szme ilemi yaplamaz. Baz durumlarda, membran filtrenin tutucu iine sktrlarak retildii tmyle kapal szme takm kullanlr. Szma tehlikesinin en az grld bu szme sistemleri, ilem bitiminde atlr. Sterilizasyon amacyla 0.2 pm gzenek apna sahip membran filtreler kullanlr. En kk bakteri ve en byk virs yaklak 0.3 pm apnda15 olduuna gre, bu gzenek apna sahip bir filtre btn bakterileri tutacak zelliktedir. 0.2 pm ortalama bir deerdir. Filtre bunun altnda ve stndeki byklkte gzenekleri de ierebilir. Bu koullarda, boyutu 0.2'pm den daha kk olan yaplarn filtreden geme tehlikesi vardr. Bu nedenle szme ile geerli bir sterilizasyonun salanabilmesi iin, baz aratrclar gzenek ap 0.2 pm olan iki membran filtrenin seri olarak kullanlmas gerektiini, baz aratrclar se, gzenek ap 0.1 pm olan membran filtrelerin kullanlmas gerektiini bildirmilerdir. Ancak 0.2 pm gzenek apna sahip membran filtrenin steril szme yapt kabul edilmektedir2-3. Sterilizasyon amacyla kullanlan bu filtreler, 1 cm2'sinde, 107 adet P.diminuta (ATCC 19146)'nn hepsini 30 psi (=2 bar) basn altnda tutabilen filtrelerdir22. Kabaca fikir vermesi asndan baz yaplar ve kullanlan membran filtrelerin gzenek aplar ekil 5.13'te gsterilmitir. Sar humma virs 0.45 |um gzenek apl filtre Pseudomonas

Su iei virs

0.22 [im gzenek apl filtre 0 Grip virs

Sar humma virs ocuk felci vir; " 2 illTi ekil 5.13 Baz mikroorganizmalarn boyutu ve membran filtre gzenek aplar14 Membran filtrelerin szme hz, gzenek apna, boluk oranna, yzey alanna, st ve alt yz arasndaki basn farkna ve szlecek karmn viskozitesine baldr (Bkz. Blm: 4, Szme). Bu deikenler iinde szme hzn artrmak amacyla ayarlama yaplabilecek sadece iki deiken vardr. Bunlar, basn fark ve viskozitedir. Filtrenin alt ve st yz arasnda basn fark oluturmak amacyla genellikle pozitif basn, baz durumlarda ise vakum uygulanmaktadr. Basn uygulamasnda gnderilen havann steril olmas gerekir. retici firmalar imal ettikleri membran filtrelerin geerli bir sterilizasyon ilemi yapacann garantisini

VI

Modern Farmastik Teknoloji

verirler. Ancakfiltreningzenek ap ve btnlnn istenen durumda olduu, kullanc tarafndan gerekli kontroller yaplarak tekrar gsterilmelidir. zeltilerin szlerek sterilize edilmesinde esas sorun, zeltinin steril duruma getirilmesinden sonra bu zeltinin sterilitesini bozmadan ambalajlara aktarlmasdr. Bu ilem iin aseptik bir ortamn salanmas gerekir. Aseptik teknik, bir sterilizasyon yntemi deildir. Ancak retim srasnda steril durumun korunmas amacyla gerekli olduu iin sterilizasyon teknii olarak kabul edilebilir3,6. Kimyasal sterilizasyon yntemleri Gaz sterilizasyonu: Gaz kullanlarak yaplan sterilizasyon eskiden beri kullanlan bir sterilizasyon yntemidir. Formaldehit ve kkrt dioksit buhar, sterilizasyon amal olarak uzun bir sre kullanlmtr. Bu yaplar, kolayca reaksiyona girebilen, ancak zor uzaklatrlan gazlardr. Bu nedenle kullanmlar snrl kalmtr. Daha az sorunlu olan (EtO) ve beta-propiyolakton bu gazlarn yerini almtr.3 Formaldehitle yaplan sterilizasyon Amerika'da yaygn olarak kullanlmamasna ramen, baz Avrupa lkelerinde, EtO gaz yerine tercih edilmektedir. Baz avantajlar nedeniyle hidrojen peroksit ve klor dioksit gazlar da sterilizasyon amacyla kullanlmaktadr8.

Etilen oksit gaz ile sterilizasyon: Etilen oksit (EtO, [CH2]20) oda scaklnda gaz durumunda olan kokulu ve renksiz bir maddedir. Dk scaklklarda svdr. Atmosfer basncnda kaynama noktas 10.8C'dir. Tek bana yanc olup hava ile % 3'n stndeki oranlarda karnca, patlayc bir zellik kazanr. Bu nedenle C0 2 veya florlu hidrokarbonlarn (Freonlar) bir veya birka ile kartrlarak kullanlr (Tablo 5.4). Karm gazlar hava ile hangi oranda karrlarsa karsnlar, patlama tehlikesi oluturmazlar. Son zamanlarda saf EtO'in basn altnda svlatrlm ekl kullanlmaya balanmtr. Sv EtO, daha nce 28 in Hg (=720 mm Hg) dzeyinde vakum uygulanm sterilizasyon odasna gnderildiinde derhal buharlar, Bu uygulamada vakum nedeniyle ortamda oksijen olmad iin, herhangi bir patlama tehlikesi de yoktur. EtO plastik, kat veya toz ktlesine kolayca girebilir. Gaz durumunda, ou kat madde iin kimyasal olarak zararszdr. Basn uygulanarak sv duruma getirildiinde ise, baz plastik yaplar ve kauuu zmesi nedeniyle dikkatli kullanlmaldr. Sterilizasyon sresinin uzun olmasna ve uygulamada deiik zorluklarla karlalmasna ramen dier bilinen yntemlerle sterilize edilemeyen madde ve malzemeler EtO ile sterilize edilebilmektedir.

Tablo 5.4 Etilen oksit sterilizasyonunda kullanlan gaz karmlar ve kullanm koullar (% 60 bal nemde 60 dakika bekletilen malzemeler iin)3 Ticari isim Carboxide" 0xyfume-20 Cry-Oxcide6 Karmdaki % oranlar Et0:10 C02:90 Et0:20 C02:80 Et0:20 TCFMrf:54 DCFMe:35 EtO: 12 DCFM:88 Gaz deriimi (mg/L) 450 670 920 450 850 650 Basn (Psg)' 28 18 30 5 18 7 En az temas sresi(saat) 6 4 3 5 3 4

Pennoxidec

Union Carbide ehem.Co., bThe Matheson Comp., Pennsylvania Eng.Com p., dTrikloroflorometan, eDikloroflorometan, f inch kare bana pound

Steri lizasyon 81

Etilen oksit, sporlar da dahil olmak zere tm MO'lar ldrr. Bu ldrc etki, molekln bakteri proteinini alkilleyici zelliinden kaynaklanmaktadr. Alkillerine, amino, karboksil, hidroksil gruplarnn ve slfdril zerindeki hidrojenin, hidroksi etil radikali ile yer deitirmesi eklinde olmaktadr. Bylece MO'nn temel metabolik reaksiyonlar iin gerekli olan gruplar engellenmi olur. EtO moleklnn MO hcresi iindeki hayati neme sahip molekllere rahatlkla ulaabilmesi, ortamda yeterli dzeyde suyun bulunmasna baldr'6. Alkilleyici reaksiyon ayn zamanda zelti iinde bulunan ila moleklleriyle de oluabilir. Bu nedenle farmastik formlasyon asndan sadece toz halinde, su iermeyen rnlere EtO sterilizasyonu uygulanabilir. Buna karlk her eit plastik ve kauuk malzeme, hassas optik aletler bu yolla sterilize edilebilir. Ayrca paslanmaz elik malzemelerin bu yolla sterilizasyonu, buhar sterilizasyonuna gre mrlerinin uzamas nedeniyle tercih edilmektedir. Plastik veya kat ile ambalajlanm parenteral rn uygulama setleri, ineler, plastik rngalar ve benzeri malzemeler ambalajlar iinde bu ekilde sterilize edilebilir. Ancak kullanlan ambalajn hava, gaz ve nemin giriine/kna izin verip MO'lann dardan giriini engelleyecek zellikte olmas gerekir. Ayrca ambalajn geirgenlii veya gzeneklilii basn ve vakum uygulamalar ile deimemelidir. Polietilen, polipropilen, naylon, polivinil klorrve kattan imal edilmi ambalajlar bu koullar yerine getirmektedir. Bunlar iinde naylon, dier plastiklere gre geirgenliinin daha dk olmas nedeniyle daha uzun sterilizasyon sresi gerektiren bir maddedir. Ambalaj maddesi olarak sklkla kullanlan aluminyumun, geirgen olmamas nedeniyle EtO sterizasyonu uygulanacak bir malzemenin ambalajnda kullanlmamas gerekmektedir17. EtO steril izasyon unda ilemin yaplmasna olanak veren etvler kullanlr (ekil 5.14). nce sterilize edilecek malzemenin su buhar ile doyurulmas nerilmektedir. Malzemelerin sterilizasyonun gerekleecei odaya yerletirilmesinden sonra oda 55C'ye kadar stlarak 0,902 atm {-27 in Hg) dzeyinde vakum uygulanr ve hava darya ekilir. Bundan sonra EtO gaz karm ile beraber % 50-60 bal nem salayacak kadar su buha-

r odaya gnderilir. Oda iinde gerekli EtO deriimini salayabilmek iin Tablo 5.4'de verilen basnlardan biri seilir. MO ykne (bioburden) bal olarak bu koullarda 6 ile 24 saat arasnda beklenir. Scakln daha dk olmas gereken durumlarda bu sre 36 saata kadar kabilmektedir11. Bu srenin sonunda oda iindeki gaz karm 0.836 atm (=25 n Hg) deerinde vakum uygulanarak geri ekilir ve yerine szlerek sterilize edilmi hava gnderilerek oda basncnn atmosfer basncna kmas salanr3. Sterilizasyon dngs ve vakum ile basncn uyguland aamalar ekil 5.15'de gsterilmitir17
Bakteri tutucu filtre

Hava girii Buhar giri

Vakum pompas

ekil 5.14 EtO ile yaplan sterizasyon ileminde kullanlan sterilizatr6

, Su buhar J t j. .Basn uygulanmas

ncesi

li

>

Zaman diirnieri

ekil 5.15 Etilen oksitin kullanld sterilizasyon dngs17 Etilen oksit ile MO'larn ldrlmesi, ortamdaki bal nem oranna, EtO deriimine, scakla ve sterilizasyon koullarnda malzemelerin bekleme sresine baldr17. EtO'e kar bakteri sporlarnn be kat daha direnli olduu gsterilmitir16

VI

Modern Farmastik Teknoloji

EtO sterilizasyonu iin nemin varl oknemlidir. Mesela bakteri sporlarnn kuru durumda olmas, EtO'in etkisinin ok azalmasna neden olmaktadr. Sporlarn EtO'e kar gsterdii direnci krmak iin ortamda yksek oranda nem bulunmaldr. % 40-70 {ortalama % 50) orannda bal nem, kuru spor oluumunu en alt dzeyde tutacak kouldur. Yaplan bir almada, bal nemin % 97 olmas ile EtO'in ldrc etkisinin, bal nemin % 28 olmasna gre 10 kat artt bulunmutur17. Nemini kaybetmi MO'larn nem ieriklerini normal duruma getirmek zaman alr ve EtO ile beraber su buharnn sterilizasyon odasna gnderilmesi, MO'larn kaybettikleri nemi yerine koymaya yetmeyebilir. Bu nedenle sterilizasyon ilemine balamadan nce, oda iine yerletirilen malzemenin nem ile doyurulmas nerilir ve odaya % 98 relatif nem salayacak kadar su buhar gnderilerek en az 60 dakika beklenir. EtO sterilizasyonunda, steril izasyonu gerekletirecek gaz karmnn, odacn her tarafna eit olarak yaylabilmesi iin vakum pompas ile odack iindeki hava ekilir. Uygulanan vakum, sterilize edilecek malzemeden ve MO'lardan da bir miktar suyu uzaklatracaktr. lem srasnda scakln 55C'ye kadar karlmas su kaybn daha da artrr. Bu nedenle kaybolan suyun yerine konabilmesi iin sterilizasyon odasna gaz le birlikte su buhar da gnderilir16. Scakln yksek olmas, EtO'in bakteri hcresine giriini kolaylatrmakta ve sterilizasyon iin gerekli zaman azaltmaktadr. Bu nedenle sterilizasyon odas yaklak 55C'ye kadar stlr. Scaklk artnn, EtO sterizasyonu zerine etkisi ekil 5.2'de bir rnekle gsterilmitir. EtO miktarnn fazla olmas da sterilizasyonu olumlu ynde etkiler ve sterilizasyon sresi ksalr. EtO'in etkili olduu en dk deriim, 450 mg/L'dir. Bu deriim 1500 mg/ L'ye kadar kartabilmektedir11. EtO sterilizasyonunda malzemeler sterilizasyon odasnn iine, hem odann eperleri ile hem de kendi aralarnda nem ve gazn rahatlkla dolaabilecei ekilde boluk brakarak yerletirilmelidir. Bu, sterilizasyon ileminden sonra gazn kolaylkla uzaklatrlmas iin gerekli bir durumdur. lem sonras rnn gazdan tmyle kurtarlmas iin scaklk ayarlanp kontroll hava akm salanr. Bylece EtO ve artklar kolayca havaya kararak sterilizasyon odasndan uzaklatrl-

m olur. Ancak kauuk veya baz plastiklerden EtO'in uzaklatrlmas zaman alr. Bu nedenle havalandrma ilemi 24 saate kadar kabilmektedir. Bu sre iinde rnden alnan rneklerde EtO kalnt testi yaplarak, EtO'in farmakopelerde bildirilen st snrn altna inip inmedii takip edilir. Plastik malzemede EtO ve artklarnn kalmas insan sal asndan baz sakncalar oluturmaktadr3-17. Sterilizasyon sonucunda rnde, EtO'in yansra toksik zellikli iki reaksiyon rnnn (etilen klorohidrin ve etilen glikol) kalma olasl vardr. Bu maddelerin alma koullarnda kar karya kalnan deriimlerinin mutasyona ve kansere neden olup olmad aratrlmaktadr17. EtO'in tmyle uzaklatrlamad malzemelerin deri ile uzun sre temas etmesi, iritasyona neden olmaktadr. Ancak sterilizasyon ilemi ile rnn kullanm arasnda geen srede rn inde kalan EtO'in malzemeyi terkedecei belirtilerek, esas sorunun sterilizasyon ilemini gerekletiren kiilerin bata solunum yolu ile olmak zere bu moleklle temas etmeleri olduu bildirilmitir16. Hidrojen peroksit (HP) gaz iie sterilizasyon: Oda scaklnda sv olan HP buharlatrldnda, deiik aletler ve ambalaj malzemeleri iin etkili bir yzey sterilizasyon maddesi olarak kullanlr. Dondurarak kurutma ve deiik doldurma sistemleri gibi ok karmak aletlerin sterilizasyonunun yan sra temiz oda oluturmak iin de kullanlmaktadr. Bu sterilizasyon ileminde gazn, sterilize edilecek yzeyin her tarafna temas etmesi salanmaldr. HP gaz ile yaplan baz sterilizasyon ilemlerinde, HP scak ve nemli ortamda kullanlr. Bu ekilde ilem sresi ksalmakta ve HP'in ortamdan uzaklatrlmas kolaylamaktadr. Bu uygulamada nce 80C'ye kadar stlm kuru hava HEPA filitreden geirilerek sterilize edilecek alana gnderilir. Daha sonra ortama buhar verilerek yzeylerin scaklnn 100C'ye kmas salanr. Bu esnada HP de verilir ve sterilizasyon balam olur. Sterilizasyon sresi sonunda nem ve peroksit verilmesi kesilir ve kuru scak hava gnderilmeye balanr. Bu, HP'n byk bir ksmnn dar atlmasn, kalannn ise su ve oksijene dnmesini salar. En son olarak steril hava gnderilerek lem bitirilir.

Steri lizasyon 8 3

Su buhar ve HP, steriiizasyon ilemi srasnda sinerjikbir etki oluturmakadr. yle ki, B. stearothermophilus'un 121C'de yaplan otoklav sterilizasyonu 27 dakika srerken, 100C'de normal atmosfer basncnda HPile yaplan sterilizasyonu iin 12 dakika yeterli olmaktadr. Klor dioksit (KD) gaz ile steriiizasyon: Klor dioksit (euchlorine) yeil-sar renkli bir gazdr. Bakterisit, virsit ve sporisit etkilidir. Ozon tabakasna da zarar vermez. Vakumda ve dk deriimde kullanlmas nedeniyle, EtO'in yerine kullanlabilecek bir gaz olarak kabul edil* mektedir8. Klor dioksit gaz yksek basnta depolanamaz ve saklanamaz, kimyasal reaksiyon sonucunda elde edilir. Bu amala seyreltik klor gaz (% 2 CI2+% 98 N2) ve kat sodyum hipoklorr kullanlr. Seyreltik gaz ve NaCI02 biraraya gelince KD gaz oluur ve bu hemen steriiizasyon blgesine gnderilir. Steriiizasyon ileminden sonra bu gaz bir dntrcde sodyum tiyoslfat, sodyum slfata dndrr. Bylece havaya azot gaz ve ancak ppm dzeyinde KD karm olur. Bu gazla steriiizasyon ilemi uygulanrken, nce steriiizasyon odasna vakum uygulanr. Daha sonra % 70 - 85 bal nem salayacak kadar buhar gnderilerek 30-60 dakika beklenir ve ortama 10-30 mg/L deriimde KD gnderilir. Bu arada basn biraz ykselir ve N2 gaz ile hava karm gnderilerek basncn 80 kPa'a (kiloPascal) kadar kmas salanr. Bu koullarda yaklak bir saat beklendikten sonra vakum uygulanarak oda iindeki gaz karm alnp yerine sterilize edilmi hava gnderilir. Bu lem birka kez tekrarlanr. Yaklak 15 dakikalk havalandrma ilemi sonunda sterilize edilmi yzey zerinde en fazla 1 ppm KD kalmaktadr. Steriiizasyon scakl 30-32oC'dir. B. subtilis sporlar ile yaplan bir almada 10 mg/L deriimdeki gaz ile 45 saniyelik D sresi saptanmtr. Deriim 30 mg/L'ye kartldnda bu deer 7 saniyeye kadar dmtr. Bu gazla naylon, polietilen, polipropilen, polistiren ve teflon herhangi bir sorun olmadan sterilize edilebilmektedir. Polikarbonatn ve poliretann ise, renkleri kaybolabilmekte ve gerilme zellikleri azalabilmektedir. Paslanmaz elik malzemeler KD'den etkilenmezken, bakr ve alminyum malzemelerde deiiklikler olumaktadr.

Aseptik yntem (Aseptik ortamn salanmas) Aseptik yntem, MO'larn ilem sahasndan uzak tutulmas durumudur17. Aseptik teknikte havadaki olas MO'lar ldrmek iin UV lambalar veya kimyasal aeresoller kullanlr. ounlukla yaplan ilem MO'nn aseptik alana giriini engellemektir. Bu amala hava HEPA filitrelerden szlerek alma ortamna verilir18. HEPA {High Efficiency Particulate Air) filtrelerin kullanld alma alan, tek ynde laminar hava aknn saland bir ortamdr. Bu ortamlarda hava nce bir n filtreden, sonra HEPA filtreden geirilir. HEPA filtrelerin yaps, selloz, cam pamuu, cam iplikikleri veya poiitetrafloro etilen (PTFE)'nin, reine veya akrilik balayclarla birlikte kullanld bir yapdr. Bu maddelerin sktrlmas ile elde edilen tabakalar akordeon tarznda katlanarak plise oluturulur. Daha sonra bu tabakalar st ste konarak metal bir ereve iine sktrlrlar. Aseptik koulun saland ortamlar ngiliz standartlarna gre Snf 1 (Class 1), Amerikan standartlarna gre ise Snf 100 (Class 100) olarak isimlendirilmilerdir. Snf 1, bir metrekp havada 0.5 pm veya daha byk boyutta en fazla 3000 adet MO olabileceini gsterir. Snf 100 ise, bir metrekp havada 0.5 pm veya daha byk boyutta en fazla 3500 adet MO olabileceini gsterir. Snf 1 koulunu salayacak HEPA filtrenin szme veriminin % 99.997 olmas gerekir. HEPA filtrelerden en yksek verimi alabilmek iin hava hznn 0.300.45 metre/saniye olmas gerektii belirtilmitir. HEPA filtrenin Snf 1 koulunu salayp salayamad DOP (dioktilfitalat)testi yaplarak anlalr18-19. Bu madde s ile buharlatrldnda, hepsi 0.3 pm boyutuna sahip damlacklar oluur. DOP buhar HEPA filtreye gnderilerek filtreden geip geemedii incelenir. Sterilizasyonun Denetimi Steriiizasyon ileminin denetimi, ilem-i (in-process control) ve ilem sonras (product control) olmak zere iki aamada yaplmaktadr11. lem ii denetimler Sterilizasyonda ilem ii denetimler iin temel olarak kullanlan ynteme ait baz fiziksel lmler yaplr. Ayrca kimyasal indikatr veya biyolojik indikatr (B) kullanlarak olmas gereken steriiizasyon koullarnn

VI

Modern Farmastik Teknoloji

salanp salanmad, ksaca ilemin geerli olup olmad saptanr11-20. Fiziksel lm yaplarak ilemin incelenmesi Kuru sda veya scak doygun buharla yaplan sterilizasyon yntemlerinde scaklk kontrol iin ounlukla termometre kullanlmaktadr. Ancak duyarl ok iyi olmad ve belli zamanlarda kalibre edilmesi gerektii iin termometre yerine, scaklk duyargalarnn (thermocouple, termoift) kullanm tercih edilmektedir. Diren (resistance) termometreleri ve termistorlar da scaklk deiimine ok duyarl olmalarna ramen, otoklav koullarnn andrc etkisine yeterince diren gsteremedikleri in bu amala pek kullanlmazlar. Scaklk lm, sterilizasyon odasnn veya malzemenin en souk ve en ge snan blgesinin tespiti veya sterilizasyon srasnda ulalmas gereken scakln salanp salanmadnn tespiti iin yaplan ok nemli bir lmdr. Sterilizasyon srasnda basncn deiimi ise, uygun zellikteki bir basn lerle saptanabilir. Scaklk ve basn iin uygun lme yntemleri kullanlmasna ramen, oda iindeki bal nemi veya buharn doygunluk derecesini len baarl bir yntem yoktur. Bu amala kullanlabilecek iy noktas (dew point) higrometreleri sterilizasyon koullarndan etkilenmekte, kalorimetre lmleri ise, ok yava sonu vermektedir. Sterilizasyonun filtre kullanlarak yaplmas durumunda ise, ilem ii denetim olarak filtrenin kontrol yaplmaktadr. Bu amala filtrenin gzenek ap saptanmakta ve btnlnn tam olduunu gsteren kabarck noktas deneyi yaplmaktadr (Bkz. Blm:4, Szme). Steril szme ileminin aseptik koullarda yaplmas gerektii iin bu koulun salanmasnda havann szlmesi amacyla kullanlan HEPA filtrelerinin kontrol DOP testi kullanlarak yaplr. Radyasyonla sterilizasyon srasnda uygulanan radyasyonun dozunu tespit edecek dozimetreler, gaz ile sterilizasyon yapldnda ise, gaz analiz aletleri sterilizasyon odasnn iine yerletirilerek ilgili yntemlerin fiziksel denetimleri yaplabilir. Kullanlan sterilizasyon aletinin denetimi ve kalibrasyonunun dzgn olarak zamannda yaplmas, ilem ii fiziksel kontrol sonularnn tam olmasn salar.

Kimyasal indikatr kullanlarak ilemin incelenmesi Kimyasal indikatrler11-20, sterilizasyon ileminin bir veya iki deikeninin kimyasal yntemle takip edilmesini salayan madde veya madde karmlardr. Byk bir ksm ilgili sterilizasyon koulu salandnda renk deitirir. Kimyasal indikatrler bir sterilizasyon ileminde sterilizasyonun gerekletii aamaya ait zaman, nem oran, gazn veya nemin malzemelere giri yapp yapamad gibi, ok nemli baz parametrelerin tm hakknda yeterli bilgi veremez. Bu indikatrler dier denetimlerle beraber deerlendirildiinde anlaml bir sonu elde edilebilir. Kuru s iin kullanlan kimyasal indikatrler, ilgili scakla ulaldnda ya eriyen ya da renk deitiren yaplar iermektedir. Otoklavda kullanlmak zere gelitirilmi indikatrler ise, ya ilgili scakla ulaldnda eriyen, ya da doygun buhar ortamnda oluan kimyasal br reaksiyon sonucunda rengi deien maddeleri iermektedir. Is veya s+doygun buhar ortamnda kullanlabilecek ok sayda ticari kimyasal indikatr bulunmaktadr. Bunlardan bazlar aada rnek olarak anlatlmtr: Bowie-Dick testi zellikle ameliyathane giysi veya rtlerinin, sterilize edilmesi gereken her trl kuma benzeri malzemenin steril izasyonu iin kullanlan, yksek vakum gcne sahip otoklavlarda, hergn uygulanabilecek bir testtir. Bu amala zerinde X eklinde aret bulunan zel bir kat kullanlr. aret, sya hassas maddeler ierir. Bu kat, malzemelerin ortasna su buharnn zor girebilecei blgeye yerletirilir. Sterilizasyon ilemi sonunda rengin tmyle deimesi, havann tmyle ekildiini ve su buharnn bu blgeye kadar girebildiini gsterir. Browne tpleri, s ile sterilizasyon yntemlerinde ok kullanlan ucuz ve ticari kimyasal indikatrlerdir. Tmyle kapal olan ve krmz renkli bir sv (etilen klorhidrin) ieren bu tpler ilgili scakla gelindiinde renk deitirirler ve yeile dnerler. Renk deitirdikleri scakla gre drt farkl eit tp bulunmaktadr: l.tp (siyah noktal): 126C'nin altndaki scaklkta, 2.tp (sar noktal): yksek vakumun uyguland otoklavlarda (130C ve yukars), * 3. tp (yeil noktal): kuru s ile yaplan etv sterilizasyonunda (160C)

Steri lizasyon 8 5

4. tp (mavi noktal): R ile stlan scak hava tnellerinde yaplan steriiizasyon iin (180C) Mor renkli KHntex katlar buhar ortamnda renklerini kaybeden ticari kimyasal indikatorlerden biridir. yle ki, steriiizasyon ileminden sonra "autoclaved" (otoklavlanm) kelimesi siyah renkte belirirken, kadn zemini beyaz renge dnmektedir. EtO sterilizasyonu iin kullanlan indikatrler, EtO ile kimyasal reaksiyona girip, zaman ve scakla bal olarak renk deitiren maddelerdir. Bazlar ortamn nemine kar da duyarldr. "Royce sachet" olarak bilinen bu indikatr, magnezyum klorr, HCI asit ve bromofenol mavisi ieren polietilen bir torbadr. EtO deriimi ve temas sresine bal olarak torba iine giren EtO, etilen klorohidrin oluumuna neden olur ve renk sandan pembeye dner. yonize edici radyasyonun kullanld steriiizasyon iin kullanlan indikatrlerin bir ksm radyasyon varlnda renk deitiren maddeleri ierir. Kalitatif dozimetre olarak bilinen bu yaplar iin radyasyon dozunun az veya ok olmas nemli deildir. Bazlar ise, aldklar radyasyon dozunun deiik yntemlerle saptanmasna olanak veren kimyasal yaplar iermektedir. Kantitatif dozimetreler olarak bilinen bu indikatrler krmz polimetil metakrilat veya naylon-polivinil klorrden imal edilmi ince eritlerdir. Bunlardaki optik younluk steriiizasyon ileminden sonra grnr dalga boyunda spektrofotometrede dorudan okunur ve steriiizasyon ncesi ile kyaslanr. Biyolojik indikatr kullanlarak ilemin incelenmesi Biyolojik indikatrler (B) steriiizasyon ileminin denetlenmesi iin kimyasal indikatorlerden ok daha gvenilir sonular vermektedir11-20. Bunlar dorudan malzemenin iine yerletirilebilir. B'ler steriiizasyon ilemi sonunda uygun besi ortamlarna ekilir ve MO remesinin olup olmad incelenir. Alnan sonu, sterilizasyonun tm iindir ve tm deikenlerin birlikte deerlendirilmesini salarlar. Steriiizasyon yntemi iin kullanlmas gereken B'n ilgili ynteme en dayankl MO olmas gerekir. Bu amala genellikle direnli bakteri sporlar kullanlr. Ancak doru sonucu alabilmek iin seilen MO'nn steriiizasyon ileminden sonra kendi kendini yenileme zelliinin olup olmadna bakl-

maldr. Ayrca B'n saklama koullarnn ok dikkatle belirlenmesi gerekir. Belli bir steriiizasyon yntemi in kullanlan biyolojik indikatrn ilgili steriiizasyon koullarna uygun olarak hazrlanm olmas tercih edilir. Mesela, otoklavda kullanlacak B, MO'nn sulu sspansiyonu eklinde, kuru s iin kullanlacak B ise MO'nn kum iinde hazrlanm ekli olabilir. En fazla kullanlan B'ler aada verilmitir15: I. Scak doygun su buharnn kullanld steriiizasyon teknii iin: 0 B. stearothermophilus ve 0 B. Coagulans Filtre kad zerinde kurutulmu ekilde PVC eritler zerinde kurutulmu ekilde Sulu sspansiyon eklinde M Kuru s sterilizasyonu iin: . 0 B. subtilis var. niger ve 0 Cl. sporogenes Alminyum yaprak zerinde kurutulmu ekilde Cam zerinde kurutulmu ekilde Paslanmaz elik ince erit zerinde kurutulmu ekilde Steril ykanm kum inde kurutulmu ekilde III. yonize radyasyonun kullanld steriiizasyon teknii iin: 0 B. pumilus ve 0 B. sphaericus Filitre kad zerinde kurutulmu ekilde Alminyum yaprak zerinde kurutulmu ekilde IV. EtO gaznn kullanld steriiizasyon teknii iin: 0 B. subtilis var. niger Alminyum yaprak zerinde kurutulmu ekilde PVC eritler zerinde kurutulmu ekilde Yukarda bildirilen ve ticari olarak satlan indikatrlerin ierdii spor says genellikle 105 ile 107 arasnda veya daha fazla olabilmektedir. Steriiizasyon odas iine veya malzemelerin arasna ilgili B biriminden en az 10 adet yerletirilir.

VI

Modern Farmastik Teknoloji

Sterilizasyon amal szme ileminde de baz durumlarda B kullanlmas gerekebilir. Bu durumda belli sayda MO ieren belli hacimdeki zelti filtreden szlerek, szntye MO geip gemedii saptanr. Bu amala Serratio marcescens, Pseudomonas diminuta veya B. subtilis var, niger sporlar kullanlr. Dk scaklkta formaldehit varlnda yaplan sterilizasyon iin ise, B. stearothermophilus sporlar kullanlmaktadr. lem sonras denetimler lem sonras yaplan denetimlerde sterilizasyonu tamamlanan ve steril olduu varsaylan malzemenin steril olup olmad mikrobiyolojik yntemle saptanr. Bu amala steril olduu dnlen malzemeden uygun koullarda ve ekilde rnekler alnp, uygun kltr ortam ile inkbasyona braklr. Deney sonucunda MO reyip remedii incelenir. Bu denetimde dikkat edilmesi gereken baz konular vardr7. Bunlar: 1. Bu kontrol, sterilizasyon odasndan kan btn birimlere tek tek uygulanamaz. Bunlar iinden uygun sayda rnek alnarak yaplan denetim sonucunda, tm birimler iin steril olma olaslndan veya mikrobiyolojik bulama seviyesinden bahsedilebilir. Bu konu daha sonra aklanmtr. 2. Seilen reme ortam (besi yeri), says ok az bite olsa MO'nn rahata byyecei ve reyebilecei zellikte olmaldr. Bu zellikle patojen MO'lar iin ok nemlidir. Ancak malzemede olma olasl olan deiik MO'larn hepsi iin uygun bir besi yeri ayarlamak ok zordur. 3. Malzemede antimikrobik zellikli bir yap var ise, bunun etkisinin yok edilmesi salanmaldr. 4. Deney srasnda dardan herhangi bir bulama olmamas iin, almann aseptik koullarda ve bu konuda uzmanlam kiiler tarafndan yaplmas gerekir. Mikrobiyolojik bulama seviyesi/oran: Aseptik ortamda yaplan ilemler iin strilit gven dzeyinin (sterility assurance level, SAL), dier bir ifadeyle, rnn kontamine olma olaslnn, 10~3 olmasnn yeterli olaca bildirilmitir. Bu deerin dier sterilizasyon teknikleri iin 10~6 olmas gerekmektedir. 106'nn anlam udur: Sterilizasyon sonunda rnn

steril olmama olasl milyonda birden (1/106) fazla olamaz. Bir milyon birim ieren bir retimde sterilizasyon sonucunda birimlerden en fazla bir tanesi steril olamaz, geriye kalan btn birimlerin steril olmas gerekir. Benzer ekilde 10~3, aseptik ortamda yaplan ilem sonucunda rnn steril olmama olasl binde birden (1/103) fazla olamaz eklinde aklanmaktadr. Ksaca aseptik ortamda yaplan ilemlerde ilemin geerli olabilmesi iin mikrobiyolojik bulama orannn en fazla %0.1 olmas gerekmektedir. Aseptik ortamda retilmi ve N birimden oluan bir retimin iinden R adet rnek alndn varsayalm. Seilen R adet birimin hepsinde MO reme olasl R/N kadardr, "p" ile gsterilen bu oran, seilen R birimin steril olmama olasln (MO bulama olasln) verir. "q=1-p" ise, retimde MO remeyen kesri, yani geriye kalan birimlerin steril olma olasln gsterir. Bnomiyal bir dalm szkonusu olduuna gre N birimden oluan retime ait standart sapma (SS) deeri ile hesaplanr. Ayrca 200'den fazla birim szkonusu olduunda, % 95 olaslkla student t deeri 1.96 olarak kabul edilir ve retime MO bulama olaslnn alt ve st limitleri pl.96 SS = p l . 9 j ^ j hesaplanabilir . rnek: Aseptik bir ortamda 3000 birimden oluan bir retimin yapld ve bu ilem srasnda 5 birime MO bulat bildirilmitir. Bu durumda tm retimin aseptik koullarda yaplp yaplmadna (steril olup olmadna) karar verebilmek iin mikrobiyolojik bulama oran aadaki gibi hesaplanr. zm: p 5/3000 5 q = 1-p = 13000 Standart sapma (SS) =
L J 2

ilemi ile

(5/3000) [l-(5/3000)]j

rnn steril olmama olaslnn st snr: p + (l.96 SS] = 0.003 = %0.3

Steri lizasyon

87

rnn steril olmama olaslnn alt snr: p-(l .96 SS) = 0.0002 = %0.02 Sonuta rnn steril olmama olaslnn en fazla % 0.1 olmas gerekirken, % 0.3 olarak bulunmutur. Bu durumda aseptik retimin geerli olmad sonucuna varlr: rnn steril olarak kabul edilme olasl (P'): Bu deer retilen seriden rasgele seilen rnek saysna (n) ve strilit gven dzeyine (=MO bulama olasl, p) baldr. 5.13 eitlii kullanlarak hesaplanan P* deerleri Tablo 5.5'de gsterilmitir. P*=(l - p)n (5.22)

Steri lizasyon un validasyonu Bu balk altnda farmastik teknolojide daha geni bir alanda kullanlan buhar sterilizasyonu ve aseptik ortamda yaplan szme ileminin validasyonundan bahsedilecektir3-21. Buharla yaplan sterilizasyon ileminin validasyonu, uygulanmas gereken bir dizi admdan oluur. Bunlar aada verilmitir: Sterilizasyonda kullanlacak alet (sterilizatr) denetlenmen, ilemi tam ve doru yapaca saptanmal ve bu ilemlerin hepsi belgelendirilmelidir. Buhar steri lizasyon una dayankl uygun bir biyolojik indikatr seilmeli; bu MO iin D ve Z deerleri deneysel olarak saptanmaldr. Sterilizasyon odas boken scaklk dalm saptanmal ve en serin blge saptanmaldr. Sterilizasyon odas, sterilize edilecek malzeme ile doldurulduktan sonra s dalm ve en serin blge tekrar saptanmaldr. Sterilizasyon odasnn en serin blgesinde bulunan malzemeye ve s penetrasyonunun en yava olduu blgeye s girii (penetrasyonu) saptanmaldr. Zaman, scaklk ve sterilize edilecek malzemenin yerletirili eklinin biyolojik indikatrn yok edilmesi zerine ve Fo deeri zerine etkisi deerlendirilmelidir. stenen Fo deerine ve/veya biyolojik indikatrn yok edilmesinde istenen olasla ulaabilmek iin sterilizasyon ilem sresi saptanmaldr. stenen hedeflere ulalncaya kadar sterilizasyon ilemi tekrar edilmelidir.

Deiik kaynaklar ve farmakopelerde de olan bu tablodan anlalaca gibi, kontaminasyon oran azaldka rnn steril olarak kabul edilme olasl artmaktadr. Ayrca seriden alnan rnek says arttka, kontamine olma olasl olan serinin steril olarak kabul edilme olasl azalmaktadr. Strilit kontrol deneyleri srasnda alnan numunelerden birinde bile MO remesi saptanrsa, retilen bu serinin steril olmad sonucuna varlr720. Diyelim ki, retilen seriden 20 birim alnd. alma koullarnn MO organizma bulama dzeyi 103 (=% 0.1} ise, retilen serinin steril olarak kabul edilme olasl, P* = 1 - - ^ - = 0.980 100 olarak bulunur.

Tablo 5.5 Farkl MO bulama seviyelerinde, retilen serinin steril olarak kabul edilme olasl (P*) Mikroorganizma bulama seviyesi (% veya p olarak) Seriden alnan rnek says (n) 5 10 20 50 100 300 500 % 0.0001
(=10-6)

0.999995 0.99999 0.99998 0.99995 0.9999 0.9997 0.9995

% 0.01 MO-4) 0.9995 0.999 0.998 0.995 0.990 0.970 0.951

%0.1 (=10" ) 0.995 0.990 0.980 0.951 0.904 0.740 0.606

3

% (=102) 0.951 0.904 0.818 0.605 0.366 0.049 0.00657

%10 <=10->) 0.591 0.348 0.122 0.00515 ~0 ~o ~0

VI

Modern Farmastik Teknoloji

Sterilizasyon dngsnn niteliini gsteren ve kontrol edilmesini salayan bir program kurulmaldr. Gelecekte yaplabilecek deiiklikler veya ortaya kacak sorunlar da dnlerek standart sterilizasyon ilemi kartlmaldr. Aseptik ortamdaki szme ileminin validasyonu iin ise aadaki ilemler yaplmaktadr: Aseptik szme yaplacak ortam veya alan, kullanlacak aletler, hava kalitesi ve dier mhendislik ltleri uygun ekilde deerlendirilmelidir. Aseptik szme alanndaki yzeylerde ve havada, normal koullarda varolan mikrobiyolojik bulama seviyesini saptamak iin mikrobiyolojik kontrol yaplmaldr. Mikrobiyolojik kontrolde kullanlacak MO'larn remesi iin hassas bir besi ortam ve aseptik szme validasyonu iin en uygun MO seilmelidir. Daha nce valide edilmi bir sterilizasyon yntemi ile szmede kullanlacak tm alet veya malzemeler ile besi yeri sterilize edilmelidir. Yukardaki ilemler tamamlandktan sonra yaplacak aseptik szme ilemi nceden denenmelidir. Bunun iin daha nce sterilize edilmi kaplarn iine, aseptik ortamda steril szme iin kullanlacak filtre ile bilinen deriimde bilinen bir MO'y ieren besi yeri szlr. Bu ilem MO iermeyen besi yeri ile de yaplr (kontrol grubu). Daha sonra kontrollerle birlikte szlen rn inkbasyona braklr ve yzde mikrobiyolojik bulama seviyesi saptanr. Bu ilem istatistikdeerlendirme yaplabilmesi iin yeter sayda tekrar edilmelidir. Mikrobiyolojik bulama seviyesi % 0.1'den fazla bulundu se, btn deneysel test sonular, sterilizasyon kaytlar, dier veriler ve test koullar tekrar gzden geirilerek mikrobiyolojik bulama seviyesinin % 0.1 'in altna dmesi salanmaldr.

Kaynaklar
1. Parker MS, "Microbiological contamination and preservation of pharmaceutical preparations" Pharmaceutics: The Science of Dosage Form Design, (Ed: ME Aulton), Churchill Livingstone, New York ,1988, s.479-490. 2. Groves MJ, "Sterilization and depyrogenation", Parenteral Technology Manual, (Ed: MJ Groves), Interpharm Press Inc., USA, 1989, s. 119-144. 3. Avis KE, Aker MJ, "Sterilization" The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, (Ed: L Lachman, HA Ueberman, JL Kanig), Lea & Febiger, USA, 1986, s.619-638. 4. Brooks GF, Butel JS, Morse SA,"The growth, survival and death of microorganisms",Jawetz, Melnick, Adeiberg's Medical Microbiology, (Ed: GF Brooks, JS Butel, SA Morse), Appieton Lange, Stamford-Connecticut, 1998, s.47-55. 5. Swarbrick J, Boylan JC,"Autoclaves and autoclaving", Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, (Ed: J Swarbrick, JC Boyfan), Marcel Dekker Inc., New York, 1988, s.393-413. 6. Philips GB, Miller MS,"Sterilization" Remington's Pharmaceutical Sciences, (Ed: A Osol, GD Chase, AR Gennaro, MR Gibson, CB Granberg, SC Harvey, RE King, AN Martin, EA Swingyard, GL Zink), Mack Pub. Co., Easton Pennsylvania, 1980, s. 1390-1402. 7. Soper CJ,"Principles of sterilization", Pharmaceutics: The Science of Dosage Form Design, (Ed: ME Aulton), Churchill Livingstone, New York, 1988, s.472-478. 8. Garfinkle BD, Henley MW,"Sterilization", Remington:The Science and Practice of Pharmacy, (Ed: AR Gennaro), Lippincott Williams-Wilkins, USA, 2000, s.753-779. 9. Russell AD, Hugo WB, Ayliffe GAJ, "Heat sterilization", Principles and Practice of Disinfection, Preservation and Sterilization, (Ed: AD Russet!, WB Hugo, GAJ Ayliffe), Blackweil Scientific Pub., London, 1982, s.433-453. 10. Hanion GM, Hodges NA, Parker MS,"The action of physical and chemical agents on microorganism" Pharmaceutics: The Science of Dosage Form Design, (Ed: ME Aulton), Churchill Livingstone, New York, 1988, s.472-471. 11. Soper CJ,"Sterilization Practice", Pharmaceutics: The Science of Dosage Form Design, (Ed: ME Aulton), Churchill Livingstone, New York, 1988, s.700-711. 12. Russell AD, Hugo WB, Ayiiffe GAJ, "Ultraviolet radiation", Principles and Practice of Disinfection, Preservation and Sterilization, (Ed:AD Russell, WB Hugo, GAJ Ayliffe), Blackwell Scientific Pub., London, 1982, s.534-547. 13. Russell AD, Hugo WB, Ayliffe GAJ, "Radiation sterilization", Principles and Practice of Disinfection, Preservation and Sterilization, (Ed:AD Russell, WB Hugo, GAJ Ayliffe), Blackwell Scientific Pub., London,1982, s.511-533.

14. De Luca PP/Steriie producs" Sprowls'American Pharmacy, {Ed: LW Dittert), Lippincott Co., Toronto, 1974, s.451-491. 15. Prescott LM, Harley JP, Klein DA,"Procaryotic cell structure and function", Microbiology, Ed: LM Prescott, JP Harley, DA Klein, McGraw Hill, Boston s.39 (1999). 16. Russell AD, Hugo WB, Ayiiffe GAJ,"Gaseous sterilization", Principles and Practice of Disinfection, Preservation and Sterilization, (Ed: AD Russell, WB Hugo, GAJ Ayiiffe), Blackwell Scientific Pub., London, 1982, s.548-568. 17. Marino FJ, Benjamin F,"Industrial sterilisation: A Review of current principles and practices", Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, 8th Ed: KE Avis, L Lachman, Lieberman HA), Marcel Dekker Inc., New York, 1986, s.1-54. 18. Russell AD, HugoWB, Ayiiffe G A J,"Gaseous sterilization", Principles and Practice of Disinfection, Preservation and Sterilization, (Ed:AD Russell, WB Hugo, GAJ Ayiiffe), Blackwell Scientific Pub., London, 1982, s.569-609, 19. Soper CJ,"Design and operation of clean rooms" Pharmaceutics: The Science of Dosage Form Design, (Ed: ME Aulton), Churchill Livingstone, New York, 1988, s.686-699. 20. Russell AD, Hugo WB, Ayiiffe GAJ, "Filtration sterilization", Principles and Practice of Disinfection, Preservation and Sterilization, (Ed:AD Russell, WB Hugo, GAJ Ayiiffe), Blackwell Scientific Pub., London, 1982, s.610-630. 21. Akers MJ, Anderson NR,"Sterilization validation of sterile products: Fundamentals" Pharmaceutical Process Validation, (Ed: IR Berry, RA Nash), Marcel Dekker Inc, New York, 1998, s. 25-87. 22. USP 17, NF 20, United States Pharmacopeial Convention, Inc. MD, USA, 2002, s: 2250-2255.