T.C.

BALIKESR NVERSTES FEN-EDEBYAT FAKLTES BYOLOJ BLM BTRME ALIMASI

Konu: HSTOLOJDE KULLANILAN RUTN BOYAMA

YNTEMLER

renci No: 200720102044 renci Ad: Gamze CMERTOLU Tez Danman: Yard. Do. Dr. Olga SAK

BALIKESR-2011

HSTOLOJDE KULLANILAN RUTN BOYAMA YNTEMLER

Dokularn genellikle ou boyasz olup, bunlarn incelenmesi iin ncelikle boyanmalar gerekmektedir. Ayn zamanda, bu yolla kimyasal maddeler de belirlenebilir. Boyamalar, amaca uygun olarak yaplr.En basit boyamada, hcrelerin iki temel esi ayr zellikteki boyalarla boyanr ve ekilli oluumlar, mikroskop altnda grlebilir hale gelir. Buna gre, rutin boymada ekirdek hematoksilenle ve sitoplazma eozinle boyanr. Histolojik kesitlerde kullanlan boyalar, suda veya alkolde znen ve anyon ve katyonlarna ayrlabilen tuzlardr. Asidik ve bazik boyalar, histoloji pratiinde genellikle ardk olarak kullanlrlar. Boyalar dokulardaki negatif ykl ve asidik reaksiyonlu ksmlar tarafndan, asidik boyalar ise pozitif ykl bazik ksmlar tarafndan tutulur. Genelde, bazik boyalar mavi-mor ve asidik boyalar ise pembe-krmz renk verirler. 1-Asidik Boyalar: Eozin, pikrik asit, asit fuksin, orange G, eritrosin, Kongo krmzs ve light greendir. 2-Bazik Boyalar: Thionin, hematoksilen,metilen mavisi, toluidin mavisi, bazik fuksin, jansiyon viyole ve safranin

HEMATOKSLEN EOZN BOYAMA YNTEM

Genel doku boyas olarak; nukleus ve sitoplazma ayrmnda kullanlan, histolojik boyalar iinde en geni kullanm olan, dokunun farkl blgelerini farkl olarak boyayan bir boyadr. Hematoksilen genellikle; nukleusu mavi-siyah renkte boyayarak intrankleer detay iyi gsterir. Eosin ise; hcre sitoplazmasn ve ba dokusu elemanlarn eitli varyasyonlarda pembe, turuncu ve krmz renkte boyar. Hematoksilen log aac (Haematoxylum ampechianum)veya kalp aac ad verilen meksika kaynakl bir bitkinin kabuklarnn scak su ile ilenmesi ve reile karttlarak suda znr hale getirilmesiyle hazrlanr.

Hemotoksilen bazik bir boya olarak kullanlsa da aslnda bir boya deildir. Boya olarak etki etmesi iin zincirlerinden birinde bulunan guioid' in hematein' e okside olmas gerekir. Ana oksidasyon rn olan Hematein asl renklendirme iinden sorumlu maddedir. OKSDASYON 1-Doal oksidasyon (ripening): Ik ve havayla maruz braklarak yaplr. Aylar sren uzun bir sretir. Bu ekilde okside olan boyalarda dayankllk da daha fazladr. (Ehrlich ve Delafield) 2- Kimyasal oksidasyon: Sodium iodat (Mayers) veya civa choloride ( Harris) kullanlarak ok hzl gerekleir. Bunlarn hazrlandktan sonra ksa sre iinde kullanlmas gereklidir. mrleri doal okside hematoksilene gre daha ksadr. Kimyasal okside hematoksilenlerde hava ve kla temas nedeniyle oksidasyon devam eder ve zaman iinde hematein paralanarak boyanma yeteneini kaybeder. Hematein zayf, anyon ykl, krmzmtrak - sar bir boyadr. PH s ntrale yakn 6,5' tur. Dokulara balanma kapasitesi dktr. Boyann dokulara balanmasnda kovalent balarn bulunmas boyanmasnn etkinliini arttrmaktadr. Burada metal iyonlaryla mordantlamann rol olduu kabul edilmektedir. Mordant kullanlmad takdirde ekirdek boyamas baarl deildir. Metal kompleks boyalar genellikle hidrofiliktir. Bu nedenle alkolik dehidratasyonlara direnlidir. En sk Mordant olarak : aluminyum tuzlar, Demir, Tungsten Molybdenum Kurun (seyrek argyrofil ekirdeklerin gsterilmesinde ) Kullanlan mordantn zellii de dokunun ekirdein boyanma zelliini etkiler. Gnmzde artk ou laboratuarn tercihi olarak kullanlan hazr solsyon eklindeki boyalarda hemateinle mordant olarak kullanlan maddeler genellikle Aliminyum ve demir tuzlar, Aliminyum ve demir aplar ( alum) dr. En ok kullanlan aplar Potasyum alum: K2S04Al2 (SO4)3 24 H2O Ammonium alum : (NH4)2 SO4'A12 (SO4)324 H2O Demir alum : (NH4)2SO4 Fe2(SO4)324 H20 dur.

Aliminyum ile demirin verdii renk morluu birbirinden farkldr. Aliminyum mavi-mor bir renk verir. Suda erir, dokuya temas ettikten sonra ne su ne de etil alkol onu tekrar kartabilir. Aliminyum hematein, bazik boya gibi etki eder (yani katyonik bir boya vazifesi grr). Demirli hematein ise siyah veya lacivert renk verir , fakat etkisi birincisi kadar bazik deildir. Rutin teknikte, kesitler nce mordantladr sonra boya ile hematein muamele edilir, fazla mordant solsyonda differansiye edilir. Bu sartlar altnda hematin bazik boya olarak tesir eder. Differansiyasyon ilemi genellikle % 1 lik HCL solsyonu ile beraber eme suyu ya da amonyakl su ile salanr.

Differansiyasyon ileminin uyguland ve uygulanmad preparat rnekleri

Gnmzde histopatoloji laboratuarlarnda en sk iki tip hematoksilen kullanlmaktadr: Mayer ve Harris metodlar. Ortopedik rnekler alan laboratuarlarda regressif bir metod olan Harris metodu kullanlr. Dekalsifikasyon genellikle ekirdein bazofilik boyanmasn azaltt iin bu metod tm hcre ksmlarn boyar rnein ekirdek sitoplazma ba doku vs. ve bu boyamay optimum ekirdek boyanmas iin kontroll renk karma ve bluing ilemi takip eder. Dier laboratuarlar Mayer hematoksilen kullanrlar bu sadece ekirdei boyayan progresif bir yntemdir. Mavi rengi arttrmann yolu lamelleri akan su altnda tutmaktr.

HEMATOKSLEN EOZN BOYAMA YNTEM VE BLMSEL KONTROL

Histolojik olarak H-E boyamann kesin kimyasal reaksiyonlarla ve metotlarla baarlabildii gsterilmitir. Fakat daha az kesinlik kazanm kimyasal ve fiziksel yntemlerle de baarlmaktadr. Bu boyama yntemlerinin ok saydaki farkl faktrlere gre olduka deiecei anlamna gelmektedir. Bu ayn zamanda gelitirilen boyama tekniklerinin okluunun nedenini ortaya koymaktadr. Hematoksilen pH dzenli olarak kontrol edilmelidir. Maviletirme solsyonundan (amonyakl su gibi) ktnda kesitler mikroskopta kontrol edilmeli, hematoksileni ald ve fazlaln uzaklatrldndan emin olunmaldr. Boyama sonras ise H-E boyas tam olarak kontrol edilmelidir

BOYAMA YNTEM
Lamlar parafinden arndr (deparafinizasyon) ve su ile muamele et 1-Xylen 3dk 2-Xylen 3dk 3-Xylen 3 dk 4-Alkol %70 2dk deparafinizasyon 5-Alkol%80 2dk 6-Alkol%90 2dk 7-Alkol%100 2 dk Harris hematoksilen ile 6 ila 15 dakika boyayn. Akan musluk suyunda 2 ila 5 dakika ykayn. %1lik asit alkolle 1-2 kez batrarak ayrn ve musluk suyunda ykayn. Zayf amonyak solsyonu ya da doymu lityum karbonat solsyonu ile preparatlar parlak mavi bir renge boyanncaya kadar bekletin. Akan musluk suyunda 5 dakika sreyle ykayn. %80 etil alkolde 1-2 dakika bekletin. Eozin-phloxine solsyonunda 2 dakika zemin boyama (counterstain) yapn. 1-%95 lik Alkol 3dk 2-%95 lik Alkol 3dk 3-Absol Alkol 3 dk 4-Absol Alkol 3 dk 5-Xylen 2dk 6-Xylen 2dk 7-Xylen 2 dk Kapama ilemi

effaflanma

KAPAMA LEM Preparasyondaki son aama lam zerindeki dokuyu zerine lamel kapatarak yaplan kapama ilemidir. Bu ilem lamn kalc olarak kapatlmasna ve mikroskobik olarak incelenmesine izin verir. Lameli sabitlemek iin tip kapama maddesi kullanlabilir: doal reine, sentetik reine ve su ierikli media Lameli kapatrken; rnek iin uygun boyutta lamel seilmelidir. Lameli lama doru ekilde kapatarak hava kabarc olumas engellenir. Tiftik iermeyen bir peete ya da uygun solvent ile nemlendirilmi gazl bez ile lamelin kenarlarndan taan kapama maddesini temizleyin.

PAS BOYAMA
Bu boyama yntemi organizmada deiik karbonhidrat gruplarn boyamak iin kullanlr. Glikojen,mkz salg ve glikoproteinler de bulunan 1,2-glikol veya 1,2 amino alkol gruplarnn ve dolaysyla aldehit gruplarnn gsterilmesinde kullanlr. nce, periyodik asitile dokular okside edilir ve aldehit gruplar aa karlr. Bu aldehit gruplar,daha sonra sodyum metabislfit ile renksizletirilen bazikfuksin (aartlmfuksin) ile yaplan Schiff ayrac ile reaksiyona girer. Bylece, sz konusu aldehit gruplar renkli fuksine dnr. Bu ksm, koyu pembe-mor (leylakrenginde) grlr. Dokularda PAS reaksiyonu tespit etmek amac ile alkol ieren tespitlerin kullanlmas gerekir. PAS reaksiyonu, periyodik asidin glikol kalntlar zerinde Schiff reaktifi ile reaksiyon veren aldehid gruplarnn olumas esasna dayanr.

Pas boyasnn uygulanabilecei blmler: Polisakkaritler: Glikojen, niasta ve selloz Ntral mukopolisakkaritler: Mide msini, bazal membran salglar, hipofizin gonadotrop hormon salglayan hcreleri, tiroid bezinde mevcut olan tiroglobulin gibi glikoproteinler. Glikolipitler: Pek ok hcre zarnn esidirler ve sinir hcrelerinin plazma zarnn nemli bileen ksmn olutururlar. Doymam lipit ve fosfolipitler Bazal membran Glikokaliks Goblet hcrelerince retilen mkz salg Kollajenler

Schiff Reaktifinin Hazrlanmas 100 cc saf su kaynatlp hemen ateten alnr. 1 gr bazik fuksin iinde eritilir. Solusyon 60OC ye soutulur. Szlr , 2 gr Na, slfit yada potasyum meta dislfit (K2S2O5) ile 20cc 1N HCL eklenir. Oda ssnda yada buzdolabnda 18-24 saat bekler. 300 mg aktif kmr konur. 1 dk kuvvetlice alkalanr. 2-3 kez szlr. 0-5 OC de saklanr solusyon ak sar parlak renkte olmaldr. Pembeye dnnce atlr. BOYAMA PROSEDR Kesitlerin parafini giderilir,suya indirilir. P.A30 dakika Akarsuda..10 dakika alkalanr. Saf su..3 kez alkalanr. Schiff solusyonu(karanlkta).30 dk Ykama solsyonu.3 kere 5 dk Akarsu.5 dk Haris hematoksilen..7 dk (hazr boyada sre azalr.) Akarsuda maviletirme.10 dk Alkol ve Xylollerden geirilir ve kapatlr.

Giemsa veya May Grunwald+Giemsa boyas

Bu boyann kullanm alan yayma kan preparatlar oluturulmasdr. Bu boya ile boyanan kromatinler mor, bazofil sitoplazma soluk mavi, eozinofil granller krmz, bazofil granlleri ise koyu mor grnr.

Tampon zeltisi iin; Anhidre di potasyum dihidro fosfat 9.1 gr+1000 ml distile su karmndan ..38.9 ml Anhidre di sodyum dihidro fosfat 9.5 gr+1000 ml distile su karmndan 61.1 ml 38.9 ml di potasyum+ 61.1 ml di sodyum+ 900 ml distile su ile tampon zeltisi hazrlanr.

Boyama teknii Metil alkol veya giemsa ile 3 dk. fiksasyon 12 damla Giemsa+10 ml tampon zeltisini 15 dk. tabakalandr. eme suyunda yka. Kurumaya brak. (Malarya veya Kala azar inceleme iin Giemsa boya sresini 45-60 dkya uzatnz.)

May Grunwald+Giemsa teknii (Pratik) May Grunwald ile 3 dk. Fiksasyon 1/9 distile su ile ykama ve tabakalandrma 3 damla Giemsa, kartr 8 dk beklet. eme suyunda yka ve kurut.

KAYNAKA
http://www.epd.org.tr/pdf/30.pdf http://www.turkpath.org.tr/files/8_boyama_kapama_ZK.pdf http://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:CKgbmMvkwKsJ:tip.sdu.edu.tr/akademikyapd ersnotlar/histolojiembriyoloji/Histolojiye_giris.pdf+histoloji&hl=tr&gl=tr&pid=bl&srcid=ADGEEShyD9 f_cWDDTKGF_GSANIwHrRvMWWDuxPX9G4MFD8Fc44QJ07Xg6cKJxLuzY5HvFz9Ztzu3iuC4hDE0eeJxvT lGBdLTYcIMULkvWTgmy9YlLtm6hZYPj60VHP_OlOdfaw9uFSo&sig=AHIEtbTydKpnIYre3MYLwOuW2UJ PWTA4rg