Proteinlerin Kristalizasyonu ve 3 Boyutlu Yapısı

Dr. Behice ZEREN

Moleküler Biyolog
ORCID ID: 0000-0003-1163-9793
Proteinler canlı hücrelerde sulu olmayan bileşenlerin en büyük grubudur.

Hemen her biyokimyasal reaksiyon, enzim olarak adlandırılan belirli bir proteini gerektirir.

Proteinlerin diğer tipleri yapısal(örn;bağ dokusundaki kolajen)/ hücre sinyalini düzenleme(örn;hormon

reseptörleri)/ immün cevap(örn;antikorlar) / küçük moleküllerin taşınımı(örn;iyon kanalları) gibi işlevlere

sahiptir. Bu çeşitlilik oldukça geniştir; sadece insanda 20,000’den fazla farklı proteinin var olduğu

bilinmektedir. Bu çeşitliliğe rağmen, tüm proteinlerde benzer (primer,sekonder, tersiyer ve kuarterner)

yapı görülür.
*Proteinlerin primer yapısı protein zincirindeki aminoasit diziliş sırasını ifade eder.

Doğal proteinlerin yapısına 20 amino asit katılır.Bunlar birbirine kovalent olarak peptid

bağlarıyla bağlanır.Ayrıca primer yapının oluşumunda peptid bağlarındaki mezomeri ve C=O

grubu oksijeni ile NH-grubu hidrojeni arasında meydana gelen hidrojen köprü bağları önemli bir

yer tutar.
*Proteinlerin sekonder yapısı bir protein zincirindeki amino asitlerin R- grupları

dikkate alınmaksızın zincirin uzaydaki konformasyonunu ifade eder. Sekonder

yapının oluşumu büyük ölçüde protein zincirinin primer yapısı tarafından belirlenir.

Bir proteinin sekonder yapısı α-heliks ve β-katlanmış yaprak yapısı olmak üzere iki

ana gruptan oluşabilmektedir.

Sekonder yapının oluşumunda özellikle hidrojen bağları görev alır.

α-heliks yapı oluşumunda hidrojen bağları görev alır.

β-katlanmış yaprak yapısının oluşumunda hidrojen ve peptid bağları görev alır.

Proteinlerde a-heliks ve B-pili gibi periyodik olarak tekrarlanan düzenli yapıların

görülmesinin yanında tesadüfi kırılmalar sonucunda oluşan düzensiz yapılarda

görülür.

Random coil
*Proteinlerin tersiyer yapısı üç boyutlu yapısının oluşumunda son derece etkilidir.

Bir proteinin tersiyer yapısı, o proteinin protein zincirinde yer alan aminoasitlerin R-

gruplarının da dikkate alınarak uzaydaki konumunun belirlenmesidir.

Bu konumu protein zincirindeki hidrojen köprü bağları, disülfit köprüleri, iyonik

ilişkiler ve hidrofobik etkileşimler belirlemektedir.

*Birden fazla alt birimden oluşan proteinlerde kuarterner yapı görülür.

Bilindiği gibi pek çok protein alt birim olarak ifade edilen birden çok

polipeptid zincirinden meydana gelir. Bu polipeptid zincirleri arasındaki ilişki

ve toplam molekülün uzaydaki konformasyonu proteinin kuarterner yapısını

oluşturur.
Proteinlerin katalitik aktiviteleri, doğal protein konformasyonlarının

bütünlüğüne bağlıdır; bir protein denatüre edilirse veya alt ünitelerine

ayrıştırılırsa katalitik aktivitesi genellikle kaybolur; bir protein amino asit

komponentlerine yıkılırsa katalitik aktivitesi daima bozulur. Bu nedenle;

proteinlerinin primer, sekonder, tersiyer ve kuarterner yapıları, katalitik

aktiviteleri için esastır.

Belli bir proteinin kimyasal, fiziksel, biyolojik özellikleri ve fonksiyonu onun üç boyutlu yapısına

bağlıdır. Çünkü bir protein sadece katlandığında, proteinin belirli amino asitleri aktif bölgeyi

oluşturacak şekilde biri birine yeterince yakın gelirler. Enzimlerde olduğu gibi bu bölgeler

biyokimyasal reaksiyonları katalizleyebilir veya antikorlarda olduğu gibi spesifik bir

bağlanma bölgesi oluşturabilirler.

Computational methods=Bilgisayarlı/Bilgisayımsal/işlemsel/hesaba dayalı metodlar
Proteinler doğrudan gözlem için çok küçüktürler. Proteinler, yalnızca birkaç nanometre ile

ölçülen (1 nm = 1x 10-9m) küçük yapılardır. Bu parçacıklar bu boyutları ile maksimum çözünürlüğe

sahip güçlü ışık mikroskobu ile bile gözlemlenemezler (1 mikron=1x 10-6 m).

X-ışını kırınımı

Protein ve yağ gibi makromoleküllerin 3 boyutlu yapılarını

Nükleer manyetik rezonans (NMR) 'görünür' yapmak için üç önemli teknoloji kullanılır.

Elektron kristalografisi

Biyolojik makromolekül veritabanında bulunan tüm proteinlerin %90’ından fazlasının yapısı

X-ışını kırınımı ile belirlendiğinden, bu yöntem çok önemlidir.

Proteinlerin primer yapısı biyokimyasal yöntemlerle , kuarterner yapısı ise küçük

açı X ışını saçılması (SAXS) yöntemi ve elektron mikroskobu kullanılarak elde edilir.

Sekonder ve tersiyer yapının bilinmesi için protein içindeki atomların düzenleniş

biçimi bilinmelidir. Bu amaçla kullanılan temel yöntem X ışını kristalografisi/X ışını

difraksiyonu (kırınımı)’dır.
Sodyum klorür ve potasyum klorürün difraksiyon desenleri aşağıda verilmiştir.

KCl NaCl ‘e göre daha büyük birim hücreye sahiptir.

Bu sebeple difraksiyon çizgileri daha yakındır.

1950 yılında DNA’nın çift sarmal yapısının X-ışınlarıyla Crick ve Watson tarafından

aydınlatılması, DNA replikasyonunun anlaşılması ile ilgili çalışmalara büyük katkı sağlamıştır.

1960 yılında Kendrew ve Perutz miyoglobin ve hemoglobinin yapılarını çözerek, ilk kez

proteinlerin mimari yapılarındaki karmaşıklığı ortaya koymuştur.

Proteinler, enzimler, DNA kompleksleri ve virüsler gibi çok büyük biyolojik moleküllerin

yapısı XRD yöntemi kullanılarak çözülmüştür.

Protein Veri Bankasında (PDB) kullanılabilir durumda yaklaşık 60.000 kristal yapı

depolanmıştır. Bu kristal yapılar şu yöntemlerle elde edilmiştir.

X-ışınları kristalografisi (∼%86)

Nükleer manyetik rezonans (∼ %13)

Elektron mikroskobu (∼%0.4)

Atom ve moleküller çok küçük olduğu için onları bilinen yöntemlerle göremeyiz. İdeal bir

süpermikroskop kullansak bile göremeyiz çünkü çözünürlük yetersizdir.

Eğer bir nesnenin detayları onu görmek için kullandığımız radyasyonun dalgaboyunun

yarısından daha küçük aralıklarda ayrılmamışsa onu mikroskopla göremeyiz.

Örneğin mavi ışık 200 nm’dir.

Moleküllerdeki atomlar birbirinden 10-8 cm (0,1nm) uzaklıkta olduğu içim dalgaboyu 4-8x10 -5 cm

olan görünür ışıklar kullanılarak görüntü elde edilemez. Ancak atomları görmek için nanometre

boyutunda dalga boyuna sahip X ışını kullanılır.

Yani süpermikroskop kullanırsak görünür ışık

değil X ışını kullanmalıyız.

Protein kristalografisinin temel adımları

Kristalleştirme

Veri toplama

Faz belirleme

Elektron yoğunluğu haritasının yorumlanması

Moleküler modelin arıtımı

Kristalizasyon

Proteinin 3 boyutlu yapısını çözebilmek için ilk koşul, X-ışınlarını difrakte

edebilecek iyi kalitede kristaller üretmektir.

Protein kristalizasyonu, temelde protein çözeltisinden kristallerin yavaşça

çöktürülmesine dayanan bir deneme-yanılma işlemidir ve karmaşıktır.

Kristallerin oluşumu protein konsantrasyonuna (∼5-10 mg/ml ), saflığına (s ≥ %95) ve

proteine eklenen ligand ve iyonların varlığına da bağlıdır.

Protein kristalini büyütme, makromolekülün süper- doymuş çözeltisinden başlar. Süper doyum

koşulları ise çöktürme ajanlarının eklenmesi ve çözeltinin pH ve sıcaklık gibi, bazı iç

parametrelerinin değiştirilmesi ile elde edilir.

Protein kristalizasyon deneyleri, genellikle bu parametrelerin bir kaçının kombinasyonunun

denemeleridir. Kristalizasyon robotları ve ticari olarak bulunan kristalizasyon kitleri sayesinde

çok sayıda kristalizasyon deneyi otomatik ve hızlı bir şekilde yapılmaktadır.

Kristalizasyon deneylerinde kullanılan protein miktarı çok azdır. En iyi kristalizasyon koşulu

için çok sayıda deney yapılmalıdır.

Protein kristaleştirme 4 adımda gerçekleştirilir.

Kristal oluşturmak için protein saflığı belirlenir.

Kristal formuna uygun olan bir çözeltide protein çözülür.

Çözelti aşırı doymuş hale getirilir.

Çekirdek oluştuğunda gerçek kristal büyümesi başlar.

Protein kristalografisi içinde en sık kullanılan yöntem buhar difüzyon yöntemidir.

Bu yöntemde, bir miktar kristalizasyon solüsyonu rezervuarın kristalizasyon haznesine konur.

Protein solüsyonu ve kristalizasyon solüsyonunun bir damlası bu haznenin merkezinde bulunan

bir damlanın üzerine pipetlenir.

Tüm solüsyonlar ekledikten sonra buharlaşmayı önlemek için hazne mühürlenir.

Kristalizasyon solüsyonunda tuz iyonlarının konsantrasyonu haznenin merkezinde bulunan

damladakinden daha yüksek olduğu için, gaz fazında buhar difüzyonu ile çözücü (solvent)

moleküller protein damlasından rezervuara doğru hareket ederler.

Bu işlem sırasında, damladaki proteinin çözünürlüğü azalır.

Sonunda aşırı doymuş hale gelen protein solüsyonu termodinamik olarak kararsız

durumdur.

Bu durum, damladaki proteinin bir kısmının sonuçta daha büyük kristallerle

büyümesini sağlayan kristal çekirdeği oluşturmasına /X ışını analizinde kullanışsız amorf bir

proteini çökeltisine neden olur.

Kristalizasyon ve çöktürme birbiriyle yarış halinde olan süreçlerdir.

Bu yüzden istenen kristalizasyonla sonuçlanacak optimal koşulları tespit etmek çok önemlidir.
Kristalleştirme yöntemleri
Buhar Difüzyon yöntemi
Hanging Drop BDY
Sitting Drop BDY

Batch(grup) kristalleştirme yöntemi

Tohumlamayla kristalleştirme yöntemi

Diyaliz yöntemi

Sıvı-sıvı difüzyon yöntemi

Asılı damla buhar difüzyon yöntemi

Protein çözeltisi (0.1–1 μL) ile kristalizasyon bufferinin karışımıyla (genelde 1:1 oranında) oluşan damla,

aynı kristalizasyon bufferını (0,1-0,5 mL) bulunduran bir rezervuarın üzerine asılır.

Buhar difüzyonu ile rezerv çözelti ile damlacık arasında bir reaksiyon dengesine ulaşılır. Su

molekülleri uzaklaştıkça damlacıktaki protein ve çözeltinin konsantrasyonu artar.

Aşırı doyma noktasına gelindiğinde, pH ve sıcaklık gibi parametrelerde doğru ise damlacık

içinde protein kristalleri oluşur. Yani çekirdeklenme ve ilk büyüme gerçekleşir.

Sitting Drop Buhar Difüzyon Yöntemi

Bütün kimyasal reaksiyonlar aynı olmasına rağmen Sitting Drop yönteminin Hanging Drop yönteminden tek

farkı, mikro-köprülerin kullanılmasıdır. Mikro-köprülerde maksimum 40μL hacminde damlacıkların

konulabileceği kuyular vardır.

Tamponda çözülmüş protein çözeltisinin çöktürücü ile belli oranlarda karıştırılmasıyla damlacıklar elde edilir.
Son zamanlarda buhar difüzyon deneyleri 96 kuyucuklu platelerde ve otomatik sistemlerde yapılmaktadır.

Farklı pH /iyonik özelliklere vb. sahip çözücülerde çözünen proteinler 96 kuyuya sahip platelerde soğutma,

buharlaştırma ve antiçözücü eklenmesi gibi endüstriyel işlemlerle kristalleştirilir.

Veri toplama
Protein kristalleri ∼ %50 solvent içerdiği için havada kurur ve parçalanırlar. Oda sıcaklığında yüksek

şiddette X ışınları ile bombardıman edilirse radyasyon hasarı sebebi ile difraksiyon güçlerini kaybederler.

Kristal ömrünü uzatmak ve veri kalitesini arttırmak için X ışını ölçümleri 80-110K’de yapılır.

Kristal önce 10-20 μm çapında ince naylon ilmeklere (loop) monte edilir ve sıvı azota gömerek hızlıca

dondurulur. Buz kristali oluşumunu önlemek için kristalin çevresindeki ana sıvıya gliserol/ düşük molekül

ağırlıklı polietilen glikol/ yüksek tuz/krayo protektan eklenir.

Kristal, gonyometre başlığına yerleştirilir.

Döner anot X-ışını kaynağı /Sinkrotron radyasyon kaynağında ölçümler yapılır.

X ışını deney düzeneği

Veri toplama sırasında, kristal yavaşça döndürülür, Bragg koşulu sağlandığında difraksiyon
gerçekleşir. Difraksiyon deseni CCD detektörlerine / görüntü plakalarına (image plate)
kaydedilir.

Yüksek kalitede X-ışını veri setinin toplanma süresi iyi kristaller/sinkrotron radyasyon ışını
kullanıldığında birkaç saat, zayıf kristaller/ konvansiyonel X ışını jeneratörleri kullanıldığında
birkaç gündür.

Dedektörlerden alınan difraksiyon desenleri bilgisayar aracılığıyla yansıma şiddetlerine

dönüştürülür. Kristalin kalitesine ve birim hücrenin büyüklüğüne bağlı olarak , kristal başına
binlerce yüzbinlerce yansıma kaydedilir.
Sinkrotron Radyasyon (SR) kaynağı, parçacık hızlandırıcıları teknolojisine dayanan çok güçlü bir ışık

kaynağıdır. Bir sinkrotronda, elektronlar vakum altında uzun-halka biçimli tüplerde (storage ring), ışık hızına

yakın hızlarda dönerler. Bu döngü sırasında elektronlar, özel magnet sistemlerinin etkisine bağlı olarak dalga

boyu infrared radyasyondan X ışınlarına kadar değişen skalda sinkrotron ışınımı yayınlarlar.

Yayınlanan ışın, halkaya bağlı farklı optiksel sistemler (beamline) tarafından toplanır ve deney odalarına

taşınır.Böylece bir çok deney ayna anda yapılabilir.Bu sebeple çok önemlidir.
Difraksiyon şiddetlerinden moleküler yapıya geçiş;

X ışınları kristal üzerine geldiğinde elektronlar tarafından soğrulur.

Elektronlar salınım (osilasyon) yapmaya başlar.

Salınan bu elektronlar bir X ışını kaynağı gibi davranarak her yöne X ışını fotonları yayar.

Kristalin farklı bölümlerinden saçılan bu fotonlar, toplanır.

Böylece ölçülebilen bir X ışını şiddeti oluşmuş olur.

NOT:Kristalde paralel düzlem takımlarının varolduğunu varsayan Bragg koşulunun sağlandığı bu

durumda, saçılan X ışınları yapıcı girişim yaparak birbirini güçlendirir.

Her difraksiyon noktası yani spot X ışınlarının kristaldeki özel bir düzlem setinden (hkl)

yansımasıyla oluşur.

Kristalde aynı d aralığında ve yönelime sahip düzlemler üzerinde çok sayıda atom varsa,

Bragg koşulu sağlandığında buna karşı gelen spot çok şiddetli olacaktır.

Kristalde aynı d aralığında ve yönelime sahip düzlemler üzerinde sadece birkaç atom

varsa bu düzlemden oluşan yansıma zayıf olacaktır.

Faz belirleme
Kristalde var olan karmaşık yapı, kırınımla düzlem setlerine karşılık olarak gelen spotlara dönüştürülür.

Burada tüm yansımalar için, yansımalara karşılık gelen yoğunluk dalgaları toplanır.

Bu toplamayı yapabilmemiz için yoğunluk dalgasının genliğini bilmek yetmez.

Onun tüm diğer yoğunluk dalgalarına bağıl konumunu (faz) da bilmeliyiz.

Faz problemi denilen bu durum çeşitli tekniklerle çözülür.

Çoklu izomorf yerdeğiştirme (Multiple Isomorphous Replacement, MIR)

Anormal saçılma (Anomalous Scattering, AS)

Moleküler yerdeğiştirme(Molecular replacement)

Çoklu izomorf yerdeğiştirme

Kristal ağır atom (Hg, Pt, Au vb.) tuzlarının bulunduğu çözeltiye bırakılır.

Böylece birkaç ağır atom protein molekülündeki iyi tanımlanmış olan konumlara bağlanır.

Orijinal kristalin ve ağır atom katılmış kristalin kırınım desenleri arasındaki farka bakılarak bu ağır

atomların konumu bulunur.

İki yada daha fazla ağır atom bulunduğunda buradan fazlar tahmin edilebilir.

Böylece sonra da elektron yoğunluğu haritası hesaplanabilir.

Anormal saçılma
Bu yönteme çoklu-dalga boyu anarmal dağınım (MAD) da denilir.
Yeni proteinlerin yapılarının çözümünde çok popülerdir.

Ağır elementlerin iç elektronları, belirli bir X ışını dalga boyu aralığında soğurma kenarlarına sahiptir.

İyi difraksiyon veren kristallerde, doğal proteinde var olan sistein ve metioninden gelen
anormal kükürt sinyalleri kullanılır.

Burada tek kristal kullanılır.

Ama sinkroton radyasyonu gereklidir.

Ayrıca buradaki protein selenometionin (selenyum içeren metiyonin) ile etiketlenmiş olmalıdır.

Daha sonra saflaştırılıp, kristalleştirilmelidir.

Moleküler yerdeğiştirme (Molecular replacement)

Bilinmeyen kristal uygun bir modeli kullanılarak faz problemi çözülür.

Örneğin bir enzimin yapısı aynı enzimin farklı bir kristal formda olan inhibitor kompleksinin

yapısını bulmada kullanılır.

Genellikle PDB’dan alınan uygun model, dönme ve öteleme ile bilinmeyen kristalin birim

hücresine yönlendirilir ve konumlandırılır.

Bu şekilde faz bulunur.

Daha sonrada elektron yoğunluğu haritası bulunabilir.

Model oluşturma ve arıtım
İlk elektron yoğunluğu haritası elde edildiğinde kristalograf tarafından yorumlanır.

Çoklu izomorf yerdeğiştirme (MIR) ve anormal saçılma(AS) durumunda öncelikle alfa karbon atomu

yerleştirilir.

Sonra ana zincir inşa edilir.

Sonra yan zincirler inşa edilir.

Moleküler yer değiştirme durumunda ise kullanılan modelin kristalde var olan molekülü aksettirecek şekilde
geliştirilmesi gerekir.

Model çoğunlukla benzer bir proteindir.

Ama bazı aminoasitler yer değiştirmiş olabilir. Eklentiler ve kaybolan gruplar olabilir.

Yani bazı looplarda küçük değişiklikler gerekebilir.

Yeniden model oluşturulana kadar model arıtılır.

Arıtım gözlenen difraksiyon genliği ile model yapıdan hesaplanan difraksiyon genliği arasındaki fark en küçük
olana kadar sürer.

Böylece aynı anda yapının geometrisi optimize edilmiş olur.

Arıtım yapısal parametreler ve atomik koordinatlar en iyi değerine ulaşana kadar sürdürülür.

Yapı çözüldükten sonra atomik koordinatlardan bağ uzunluk ve açıları hesaplanabilir.

Molekülün molekül içi ve moleküler arası etkileşimleri (örn; disülfit bağları, hidrojen bağları, van der waals)

belirlenebilir.

Son olarak da koordinatların son seti PDB depolaması için hazırlanır.

Daffodil lektin (Narcissus pseudonarcissus lektin – NPL)

(Amaryllidaceae, Lilliacae ve Alliacae ailesi- kardelen, zambak, çan çiçeği)

HIV‘nin hücrelere bağlanmasını engellediği gösterilmiştir.

NPL bir Fetuin-agarose kolonu kullanılarak, ion-exchange kromatografisi ile elde edildi. Kristaller, saf NPL

proteininden alınan 10-20μl damlacıklar içinde, sitting drop- buhar difüzyon yöntemiyle büyütüldü.
NPL tersiyer yapı

NPL kuarterner yapı

Teşekkürler
…