Protein Ekstraksiyonu

Dr. Behice ZEREN

Moleküler Biyolog
ORCID ID: 0000-0003-1163-9793
Extract(Özüt)=Bir organ/dokunun mekanik olarak
parçalanmasıyla elde edilen yapıdır.Yani homojenizasyonla
elde edilen yapıdır.

Extraction(Özütleme)=Bir çözücüde çözünmüş katı/sıvıdan

bir maddenin çıkartılmasıdır.

Homojenat hazırlanırken açığa çıkabilecek proteolitik

enzimlerin ilgili proteine zarar vermesini engellemek en
önemli noktadır.

Protein ekstraksiyonundaki ilk işlem ilgili proteinin hücrenin

dışında mı yoksa hücrenin içinde mi olduğunu belirlemektir.
 Eğer ilgili protein ekstrasellülerse yani sentezlendikten sonra hücrenin dışına salınan ve
aktivitesini orada gösteren bir proteinse yöntem çok basittir.
Örneğin; Bacillus subtilis bakterisinden alfa amilaz enzimi elde edilecekse;

Bakteri alfa amilaz enzminin substratı olan nişastalı sıvı besiyerinde belli bir zaman kadar üretilir.
(genellikle durağan fazın ortalarına kadar)

o Santrifüj (6,000rpm 10dk.) yapılır.

o Saf olan süpernantant enzim kaynağı olarak kullanılır.

o Filtrasyonla da yapılabilir.

o Homojenat mebran filtreden geçirilir.

o Süspansiyondaki partiküller sıvı kısımdan ayrılır.

Fakat bu yöntem daha çok protein içeren solusyonların konsantre edilmesinde kullanılır.Yani saflaştırmada kolaylık
sağlar.(Solusyonun kolona sığmasını sağlar.)

Böylece çalışılan proteinin neredeyse tamamının sıvı faza geçmesi sağlanır. Fakat sıvı kısmın birazı
çözünmeyen hücresel artıklara yapışıp kaybedilecektir.
Eğer saflaştırılacak protein mebrana bağlıysa yada intrasellüler(hücre içi
proteinse ) kullanılacak yöntem daha karmaşıktır.

oÖncelikle hücre duvarı ortadan kaldırılmalıdır.(Bu aşamada ilgili proteinin

yapısına en az zararı verecek yöntem seçilmelidir.Çünkü örn; sıcaklığa çok
duyarlı bir protein üzerinde yapılan bir çalışma sırasındaki sıcaklık
artışından dolayı ilgili protein denature olabilir.)

oAyrıca ilgili proteini parçalanma sırasında açığa çıkan proteazlardan da

korunmalıdır.
 Hücre duvarının parçalanması için bir çok yöntem vardır.

Nazik
Ozmotik şok(Eritrosit)
Enzim uygulaması(Bakteri-Maya)
Deterjan uygulamsı(Doku kültürü hücresi)
El homojenizatörü/ Havan(Karaciğer vb. yumuşak dokular) Homojenizasyon:İlgili yapıyı
Doğrama /Kesme/Parçalama(Kas vb.) içeren doku/hücrelerin çeper
ve zar yapılarını
parçalamaktır.
Orta şiddet
Bıçaklı homojenizatör(Hayvansal dokular - Bitkisel dokular)
Elde edilen karışıma
Kum ile ezme (Bakteri - Bitkisel dokular)
homojenat adı verilir.

Sert
Fransız basıncı (Bakteri - Bitkisel dokular)
Bilyeli mil (Hücre süspansiyonu)
Ultrasonifikasyon(Hücre süspansiyonu)
Manton gaulin homojenizatörü (Hücre süspansiyonu)

Genelde sert olmayan yöntemler tercih edilmelidir. İşlem sırasında

kollajenli ve selülozik yapıları parçalamak için sindirim enzimleri kullanılabilir.
 Proteinleri denatürasyondan ve inaktivasyondan korumak için

yapılan çalışmanın her aşamasında pH ve sıcaklık kontrol

altında tutulmalıdır.Sıcaklığın olumsuz etkisinden korunmak için

bütün işlemlerin soğuk ortamda (+4 Cº ) yapılıyor.

pH ‘ın istenilen değerde tutulmasını da tampon çözeltiler

sağlıyor.
Ekstraksiyonda tampon yerine saf su da kullanabiliriz.Fakat saf su tüm proteinleri
çözmez.

Ayrıca hücrede tuz , fosfolipit ve nükleik asit gibi bir çok yüklü molekül vardır.Normal
bir hücrede sitoplazmadaki iyonik kuvvet 0,15-0,2 arasındadır.(Yani bu koşullarda ancak
sitoplazmadaki proteinler çözünür haldedir.) Eğer homojenizasyon sırasında saf su
kullanırsak homojenatın iyonik kuvveti 0,05 ‘ten küçük olur bu da yüklü partiküllerin
özellikle bazik proteinleri absorblamasına sebep olur.

o20-50 mM fosfat(pH 7-7,5)

En çok kullanılan tamponlar
o0,1 M Tris.HCl(pH 7,5)

Eğer organel izole edilecekse tampona sükroz , mannitol , sorbitol eklenebilir.

oEDTA

o2-Merkaptoetanol
İlgili proteinin stabilitesini arttıran
oSistein katkı maddeleri
oZn+2

oPiridoksal fosfat
 Canlı hücrelerin sitoplazmalarında nükleaz , polisakkarit hidrolaz , fosfataz , proteaz gibi birçok
hidrolitik enzim vardır.Parçalanma sonrasında proteinleri bu proteazların parçalayıcı etkisinden
korumak için tampona proteaz inhibitörleri de konulmalıdır.

*Serin proteazlarının inhibitörü olarak en çok PMSF kullanılır.Bu madde suda

az çözündüğü için aseton/etanol ile hazırlanır.PMSF maddesi çok hızlı hidrolize
uğrar bu sebepten kullanılmadan hemen önce hazırlanıp ve direkt proteazın
bulunduğu ortama konulmalıdır.

*Metalloproteazların inhibitörü olarak EDTA kullanılır.Çünkü bu enzimlerin

aktivitesi için +2 değerlikli metaller gereklidir eğer ortama EDTA eklersek
enzim inhibe olur çünkü EDTA metal iyonları ile kompleks oluşturur yani metal
iyonlarını bağlar.
Hücreler parçalandıktan sonra homojenatın pH ‘ı kontrol edilmelidir.

Çünkü parçalanma ile birlikte pH ‘ı değiştiren metabolitler açığa çıkabilir.

Eğer metabolik değişmelerle ortam pH ‘ı 5 – 6 gibi değerlere gelirse partiküler bir

araya gelip çökelir bu partiküllerin böyle kendiliğinden çökmesi de daha düşük devirlerde
santrifüje olanak verir.

İşte ribozamal proteinleri / nükleoproteinleri bu işlemle de uzaklaştırabiliriz.

Ayırmak istediğimiz proteinin asidik pH ta çökmediğini ve oluşan çökeltiye de sonradan

yapışmadığını yani stabilitesini koruduğunu biliyorsak bu yöntemi de kullanabiliriz.

opH uygun asitlerle( örn;1M asetik asit) düşürülmelidir.

o10 – 15 dakika karıştırıldıktan sonra oluşan çökelti santrifüjle uzaklaştırılır.

oSüpernatant pH ı tekrar ayarlanır.

Protein çalışmalarında taze materyaller ile çalışmak genellikle daha uygundur.

Çünkü dondurularak saklama sırasında proteinler zarar görür.

Serbest olan su donar ve buz kristalleri oluşur.Bu kristaller mebranların yüzeyinde ve

organellerde parçalayıcı etki yapar. (Örn;zarar gören lizozomlardan çıkan proteazlar
aktivite gösterebilir.)
Ayrıca sıcaklık düştükçe sıvı kısımdaki proteinlerin ve diğer tuzların derişim giderek
artar bu da pH değişiklikleri yapar.(Örn;-15 –25 C arasındaki sıcaklıklarda saklama
yapılırsa materyalin pH ı değiştiği için donmadan kalma olasılığı da olur .)

Yani proteinlerle ilgili çalışmalarda biyolojik materyal ve ya homojenizasyon sonrasında

elde edilen homojenatı –25 C altında hızla dondurmak ve hatta –70 C de saklamak
gerekir.

Protein çalışmalarında dondurulmuş materyalin çözünme hızı da önemlidir.

Çözünmenin yavaş ve tampon içinde olması gerekir.

MEMELİ DOKULARINDA EKSTRAKSİYON

Özel bir materyalin kullanılması gerekli değilse proteinlerle ilgili çalışmalarda

hayvansal obje olarak (sıçan ,tavşan, inek , domuz ) kullanılabilir.

Eğer insan proteinleri ile ilgili bir çalışma yapılacaksa kan ve plasenta kullanılabilir.

Çoğu hayvansal doku bol miktarda su bağlayan ve çözünmeyen hücresel materyal

içerir .Yaklaşık olarak baştaki doku miktarına eşit hacimde kalıntı bırakır.

Bu sebepten karaciğer , kas , kalp dokularından homojenat hazırlanırken doku

ağırlığının 1,5-2 katı kadar tampon konulur.

Fakat aşırı miktarda tampon kullanımı da konsantrasyonu düşürecektir.(Yani

materyal çok azsa yada çok değerliyse ekstraksiyon tekrarlanmalıdır.)
oDoku küp şeklinde kesilir.
oDokudan bağ dokusu ve yağlar iyice temizlenir.

o1 gram doku başına 2-3 hacim soğuk ekstraksiyon tamponu ilave edilip
dokular parçalanır.(Bu iş için kullanılacak olan araç doku miktarına göre seçilir.Eğer yaş ağırlığı
30 gram altında olan yumuşak dokular porselen havanda ezilir.Daha ağır olanlar ise karıştırıcılı

homojenizatörde parçalanır.)(Kullanılan araçlar soğuk olmadır.)

oHomojenat 10-15 dakika tamponla çalkalanır.(Bu sırda ph kontrol edilmeli ve gerekirse

ayarlanmalıdır.)

oSantrifüjleme(5,000-10,000 x g 15-60 dk. ) yapılır.

oSüpernatant cam yününden süzülerek süpernatanttaki yağ partikülleri

uzaklaştırılır.(Çok yağlı dokulardaysa bu işlem aseton tozu ile yapılır .)
•Aseton tozu:Homojenizasyon 0 C altındaki soğutulmuş aseton ile yapılır.(Aseton derin dondurucuya
konulmaz buz banyosunda soğutulur.)

•Yağın büyük kısmını çözer.

aseton tozu
•Proteinlerin de doğal yapısını bozmadan çöktürür.

•Çökelti tekrar soğuk asetonla yıkanarak kurutulur. İşte bu kurumuş toza uygun bir tampon eklenirse

proteinler çözünür ve çözeltiye geçer.

ERİTROSİTLERDEN EKSTRAKSİYON
• Kan santrifüjlenir.(3,000 x g 20 dk.)

•Böylece eritrositler çöker.

•Çöken eritrositler izotonik NaCl çözeltisine alınır.(%0,9 0,15 M)

•Tekrar santrifüj yapılır.

•1 hacim hücre 2 hacim su ile ozmotik şoka uğratılır .

Burada patlayan hücrelerden çözeltiye proteinler geçer.Bu proteinlerin %90 ‘ı hemoglobindir.

 BİTKİSEL DOKULARDA EKSTRAKSİYON

oBitki hücrelerini parçalamak selülozik hücre duvarı sebebiyle daha zordur.

oBitkisel proteinlerle çalışmak zordur.Çünkü mevsimsel değişikliklerden bitkideki

protein içeriği de etkilenir bu sebepten sera/büyüme odalarında yetiştirilen
bitkiler kullanılır.

oBitki dokuları asidiktir ve kloroplast gibi yağlı (yani zorla çöken ) partikülleri
içerir.Fakat nişasta gibi kolay çöken partikülleri de içerir.

oYaprak ve tohumdan protein izolasyonu diğer kısımlara göre daha kolaydır.

oBitkideki kofulda bolca asit çözeltisi ve proteaz vardır.

oBirçok enzimin bulunduğu sitoplazma ise hücrenin hacminin %1 – 2 sini oluşturur.

Bu sebepten bitkisel ekstreler çok az miktarda tamponla hazırlansa bile ekstredeki

protein miktarı düşüktür.

oEnzim/protein çalışmalarında en dikkat edilmesi gereken nokta sıcaklığın sürekli +4 C de

kalmasıdır.Çünkü don–çöz yapınca proteinin yapısı bozulur.Ayrıca donunca buz

kristallerinin oluşup hücre içi yapılara zarar verir.

NOT:Dondurulmuş materyalin tampon içerinde çözünmesi gerekir çünkü tamponun koruyucu

özelliği de vardır.
Çalışılacak materyalin miktarına göre mekanik parçalama yöntemi seçilir.( Porselen havan vb.)

1 gram kuru materyal için 4 ml

Tampon kullanılır.
1 gram yaş materyal için 0,5 – 1 ml

Tampona ayrıca şu bileşiklerde ilave edilebilir;

o2-Merkaptoetanolamin (Fenol oksidazların etkisini azaltır.)

oPolivinilpirolidon (Fenolik maddeleri absorblar.)

oPMSF (Proteazları inhibe eder.)

Oksitlenmenin düşük olması için santrifüjleme hızlıca yapılmalıdır.( 5,000-10,000xg 20dk.)

SOYA FASÜLYESİ KOTİLEDONLARINDA EKSTRAKSİYON

Bu bitkide peroksidaz enziminin aktivitesini görmek isteniyor bunun için belli koşullarda

yetiştirilmiş ve dondurularak saklanmış kotiledonlar kullanılır.

o Buz dolu bir kabın içine oturtulmuş porselen bir havana 1 g materyal konulur.

o Üzerine 1 ml Tris taponu (4 C 0,1 M pH 8,3) konulur ve ezilir.

o Ekstraksiyon etkinliğini arttırmak için cam tozu eklenebilir.

o Tampon miktarı 3 ml olana kadar tampon ilaveleri yapılıp ezme işlemine devam edilir.

o Havandaki homojenat santrifüjlenir.(4 C 10,000xg 20 dk.)

o Süpernatant enzim kaynağı olarak kullanılır.

Bitki hücresinin az bir kısmı sitoplazmadan, büyük bir kısmıysa geniş kofullardan ve hücreler arası

boşluklardan oluşur.Yani parçalanmayla çok miktarda sıvı açığa çıkar.

Homojenizasyon sırasında asidifikasyon , oksidasyon, proteoliz gibi istenmeyen olayların meydana gelmesini

engellemek için ortama katkı maddeleri eklenebilir.

Örn; PMSF(fenilmetilsülfonilflorür)______________________ proteaz inhibitörüdür.

Bitkisel çalışmalardaki en büyük problem fenolik maddelerdir. Çünkü bunlar endojen fenol oksidazların

etkisiyle koyu renkli pigmentlere dönüşür.Bu pigmentlerde proteinlere kovalent bağlarla bağlanarak

proteinleri inaktif eder.

Bunu engellemek için ortama

2-Merkaptoetanol__________________________________ fenoloksidazların etkisini azaltır.

PVPP(polivinilpolipirolidon)_____________________________fenolik maddeleri absorblar.

*İşlemler soğuk ortamda yapılmalıdır.

*Tampon soğukta tutulmalıdır.

*Tampona triton gibi maddeler de eklenebilir.Bu madde hücre duvarını çözer böylece

tampon hücreye kolayca girer.

*Homojenat hazırlanırken ezme işlemi sırasında hücre duvarını parçalamaya yardımcı olan

sand (kum) bitkisel dokularda kullanılabilir.

*Bazı bitkisel yapılarda ezme işlemi için sıvı azotta kullanılabilir.

Mikroorganizmalardan protein ekstraksiyonu genellikle logaritmik üreme fazında yapılır.

Mikroorganizmalardan
Hücre duvarındaki ve bazı hücre dışındaki materyaller bulanıklık yapabilir. protein ekstraksiyonunda
oluşabilen problemler
Hızlı üreyen hücrelerde ekstredeki nükleik asit miktarı fazladır.

Streptomisin , protoamin , polietilenimin gibi bazı maddeler ortama eklenerek nükleik asit vb.

bileşikler çöktürülebilir.

Streptomisin, ribozomlarla etkileşip ribonükleoproteinlerin çökmesini sağlayan bir antibiyotiktir.

Protamin, spermden elde edilen bir proteindir ve DNA’ yı bağlar yani ortama eklenirse DNA ve

RNA komplekslerin büyük kısmı çöker.

NOT: Ekstredeki diğer bazı proteinlerde bu nükleik asitlere bağlanıp çökebilir.

CHİTOSAN gibi bazı maddeleri ortama katarsak hücreler bir araya gelip toplaşır. Böylece

homojenizasyondan sonra hücre kalıntıları kolayca çöker.

Bulanıklık sonraki aşamalar için önemlidir.

Eğer sert parçalama yöntemlerini kullanırsak hücre duvarı daha ince partiküllere

ayrışacağından bulanıklık artar böyle bir durum oluşursa santrifüj hızını arttırarak

bulanıklığı azaltabiliriz.
MAYADAN PROTEİN EKSTRAKSİYONU

En büyük sorun maya hücre duvarının kalınlığıdır.(Bu parçalanmayı zorlaştırır.Bu sebepten sert

parçalama metodlarını kullanırız hatta bazen birkaçını beraber kullanırız.)

Ekmek (bira)mayası(Saccharomyces cerevisiae ) çalışmaya uygun bir objedir.

Kurutulup preslenerek hazırlanmış mayalar neredeyse %100 saflıktadır.(Bunlar 0 C da birkaç

hafta yada –20 C da birkaç ay saklanabilir.)

Kurutma sırasında bazı enzimler aktivitesini kaybetse de genelde enzim ve protein için iyi birer

kaynaktırlar.
Mayalardan proteinlerin ayrıştırılması için şu teknikler kullanılır.

Mekanik parçalama için balistik homojenizatörler kullanılır.

1 gram yaş maya örneği için 3 ml tampon kullanılır.( Cam boncuk/bilye ilave edilir.)

Bu karışım balistik homojenizatöre yerleştirilir.

Daha sonra boncuklardan ayrılmış homojenat santirfüjlenir.

Bu işlem mayalar haricinde koklar içinde kullanılabilir.

Bu işlemi elde de yapabiliriz hücre süspansiyonu ve cam boncukları bir şişeye koyarak 10

dakika kadar elde çalkalanır sonrada filtre ile süzme yapılır böylece boncuk çıkar sadece

homojenat kalır.Daha sonra boncuklardan ayrılmış homojenat santirfüjlenir.

Toluen Uygulaması
Mayalar santrifüjle çöktürülür.
Üst sıvı atılır.
Alttaki kısım toluenle (35–40 C 20-30dk.) karıştırılır.(Toluen hücre duvarını çözer.)
karışıma tampon eklenir ve beklenir(oda sıcaklığında 1-2 saat / soğukta 1 gece )
Toluenin uzaklaştırılması için etil asetat kullanılır.

Amonyak Uygulaması
Kuru mayalarda kullanılır.
Basit ve hızlı bir yöntemdir.Fakat bazı proteinler bu pH a dayanıklı olamayabilir.
1 gram aktif kuru maya + NH4OH(2 ml 0,5 M )karıştırılır.(oda sıcaklığında 16-20 saat )
Santrifüjlemeden önce su(1-2 ml) eklenir.
pH’ı uygun düzeye getirmek için asetik asit kullanılır.

Enzimatik Parçalama
Mayadaki hücre duvarını parçalamada en etkin yöntemlerden biridir.
Bazı mikroorganizmalardan elde edilen enzimler kullanılır. (mannaz, glukanaz...)
Fakat bu ticari preperatlar pahalıdır.
Schizosaccharomyces pombe ekstraksiyon

Bir gecelik S.pombe kültüründeki hücreler santrifüjlenir.( 10,000xg 10dk. +4 C)

Pelet alınır.

Daha sonra bu hücreler parçalama tamponu(10 ml) ile yıkanır .

[Tris.HCl (100mM pH 8) + DDT((ditiotreitol)1mM) + %20 gliserol ]

Santrifüjlenir.

Çökelti + parçalama tamponu (20ml)+ cam boncuk (15 gram) balistik homojenizatöre (15

dk)yerleştirilir.

Parçalanan hücrelerin içeriği tampona geçecektir.

Homojenat santrifüjlenir.(14,000xg 10 dk. +4 C)

Süpernatant protein kaynağıdır.

BAKTERİLERDEN EKSTRAKSİYON

Bazı bakterilerinde sindirim enzimleri / ozmotik şokla parçalanabilen kalın hücre duvarı vardır.

Bazılarında ise titreşimli mekanik uygulamalarla hemen parçalanabilen hücre duvarları vardır.

Bakteriler genelde ultrasonikatör , biyeli mil yada fransız basınç hücresi gibi sert yöntemlerle

parçalanır.

Ama çalışılacak bakteri miktarı çoksa bu sert yöntemler uygun değildir. Ama alumina gibi sert

malzemeler kullanılarak yapılan ezerek parçalama(orta şiddet) işlemini de kullanabiliriz.

Gr(+) bakteriler lizozime duyarlıdır.

Bu sebepten Gr(+)kültürüne yumurta lizozimi(0,2mg/ml) ekleyip inkübasyona bırakırsak (37 C 15 dk. )

sitoplazmanın bileşenleri açığa çıkar.

Ayrıca buna deoksiribonükleaz l ( 0,01mg/ml ) katılırsa viskozite azalır.Böylece ekstrenin kalitesi

artar.

Gr(-)bakterilerse lizozime daha az duyarlıdır.

Bu organizmalarda dış mebran bulunduğundan bu bakterilere çeşitli ön işlemler yapılır.

Öncelikle iyonik olmayan deterjan (örneğin;Triton X-100) ilave edilir.

Ozmotik şok verilir.

Lizozim uygulaması yapılır.

Not: iyonik olmayan deterjanlar hücre zarında çözünme yapar böylece parçalanma kolaylaşır.
Tween 80

Triton X-100

Triton X-114
Mebran proteinlerinin ekstraksiyonunda
Lubrol kullanılan bazı deterjanlar
Dijitonin

Dodesil sülfat

Deoksikolat

Kolat
Bakterilerde kullanılan genel yöntem şudur;

Uygun sıvı besi yerinde ve uygun üreme fazına kadar bakteriler geliştirilir.

Kültür santrifüj edilir.(4 C 7,000xg 20dk.).Böylece hücreler besi yerinden ayrılır.

10 g hücre(yaş ağırlık) + 50 ml tampon (pH>7) karıştırılır.

TritonX-100 (%0,1)+lizozim(0,2mg/ml)+Dnaz l (0,01mg/ml)

NOT;Bu ortama PMSF(proteaz inhibitörü) gibi ek maddeler eklenerek ekstraksiyon etkinliği arttırılabilir.

Bu karışım 37 C de sürekli karıştırılır.( 1 gece)

Santrifüjlenir.(20,000xg 20dk.)

Süpernatant protein kaynağıdır.

E. coli için ekstraksiyon;
Uygun besiyerinde ve uygun üreme fazına kadar bakteriler üretilir.

Kültür santrifüjlenir.(4 C 7,000xg 20dk.) Böylece hücreler besi yerinden ayrılır.

Hücre çökeltisi 20mM’lık fosfat tamponu ile 2 kez yıkanır.

(1 mM EDTA ve 2 mM 2-merkaptoetanol içeren)

Tekrar santrifüjlenir.

Oluşan çökelti 1 gece bekletilir.(-20 C)

60mg yaş ağırlık/ml olacak şekilde tampon eklenir.

Bu süspansiyondaki hücreleri sonikasyonla parçalanır.

Süspansiyon santrifüjlenir.(4 C 12,000 x g 30dk. )

Süpernatant protein kaynağıdır.

Saf koloni steril LB‘ye aktarılır.
(Bu işlemler sırasında sürekli alevle çalışılıp kontaminasyona izin verilmemelidir.)

Aşılanmış tüp shaker-inkübatöre konulur.

(37 C 200rpm 8 saat)

Kültür temiz santrifüj tüpüne aktarılıp santrifüjlenir.

(12,000rpm 4C 10dk.)

Pelet alınır ve fosfat tamponuyla yıkanır.

(Fazla broth yıkanır.)
Sonikasyonla hücreler parçalanır.
(Hücre içeriğinin tampona geçmesi sağlanır.)

Santrifüjlenir.
Süpernatant alınır.

Süpernatanta Trizol eklenir ve vortekslenir.

(DNA ,RNA ve proteinleri birbirinden ayırır.)
Kloroform eklenir ve 5dk. beklenir.
Santrifüjlenir. RNA

3 tabaka oluşur. PROTEİN

En üst tabaka pipetle çekilip atılır.
DNA

Tam alkol eklenir ve 3 dk. karıştırılır.

(Orta tabakanın çözünmesi sağlanır.)

Santrifüjlenir.
(5 dk. 2,000rpm)

Süpernatant protein içerir.

(DNA dibe çökmüştür.) Protein

DNA
Süpernatant alınır ve aseton ilave edilir.
(Aseton proteinlerin çökmesini sağlar.)

-20 C en az 1 saat bekletilir ve santrifüjlenir.

Süpernatant atılır.
Pelet (pembe) yıkama solusyonuyla 4 kez yıkanır.
(Yıkama solusyonu=Guanidium-HCl+%95’lik etanol)
(Rengin çıkmasını sağlar.)
Pelet renksizleşene kadar santrifüjlenir.
Pelet alınır.

Rehidration tapmonu ile vortekslenir.

(Mebran proteinlerinin çökmesini sağlar.)

– 20 C‘de saklanabilir.
Yağlı dokulardan ekstraksiyon
Çoğu hayvansal doku ve bazı bitkisel dokular homojenizasyonu

zorlaştıracak düzeyde yağ içerir.

Bu lipitlerde çözeltiye dağılır ve saflaştırma aşamasında büyük

problemlere sebep olur işte bunu önlemek için

aseton tozu / yağları çözecek deterjanlardan yararlanılır.

NOT:Eğer fazla deterjan eklersek bu deterjanı ekstraksiyon

ortamından uzaklaştırmak zor olacaktır.

MEBRAN PROTEİNLERİNİN EKSTRAKSİYONU

Hücrelerin içindeki ve dışındaki sıvı fazda çözünmeyen birçok protein vardır.

Eğer protein bir organelin içindeyse önce o organel diferansiyel santirfüjleme ile izole edilir. Sonra

ilgili enzim için ekstraksiyon yapılır.

Çalışılacak protein tamponda çözünmüyorsa yani mebrana bağlıysa yine bu teknik uygulanır.

Prokaryotlarda hücre mebranındaki proteinler ve periplazmik proteinler bu tiptedir.

Ökaryotlarda ise hem hücre ve organellerin zarlarında bu tip proteinler vardır.

Burada istenilirse hücrenin tamamının ektraksiyonu yapılabilir yada organeli izole edip onun ilgili

proteininin ekstraksiyonu yapılabilir.

Her zaman için organelin izole edilip ekstraksiyonun sonra yapılması daha avantajlıdır. Çünkü eksremiz

daha temiz olacaktır.

Organel yalıtımında en önemli nokta organele zarar verilmemesidir.(Çünkü ilgili protein organelin

zarındadır.)
Diferansiyel santriüjleme tekniği kullanılır.(Yani giderek artan hızlarda santrifüjlemeler yapılır

santrifüjlemenin başında tüm partiküller homojen olarak dağılmıştır fakat santrifüjlemenin devamında

partiküller sedimentasyon derecelerine göre çökerler.)

Düşük devir 10dk. ..................parçalanmamış hücreler+nükluslar +mikrotübüller +mikroflamentler

Orta devir 20 dk. ...................mitokondriler +lizozomlar+ peroksizomlar dipte

Yüksek devir 1 saat..................mikrozom + küçük vesikül

Çok yüksek devir 30 saat...........ribozom +virüs

Çok yüksek devirde yapılan santrifüjde üst sıvıda sadece çözünebilen proteinler kalır.
Mebran yüzeyine zayıf şekilde bağlı olan periferal proteinler mebranın tamamen

çözünmesine gerek kalmadan azda olsa mebrandan ayrılabilirler.

Yani bu tip bir proteinle çalışacaksak tüm materyalden ekstraksiyon yapabiliriz.

Mebrana gömülmüş olan integral proteinlerle çalışırken daha dikkatli olmalıyız.

Çünkü bu proteinlerin açığa çıkması için mebranın tamamen çözünmesi gerekir.

Ayrıca ortamda lipofilik maddeler bulunmalıdır.(Örnek;deterjan)

Çünkü integral proteinin hidofobik yüzeyi vardır bu uç lipitlerle etkileşime girerek

kümeleşmeler yapar.
Mebran proteinlerini elde etmek için kullanılan yöntemler;

1)Sonikasyon

2)EDTA veya EGTA uygulaması

3)İyonik olmayan deterjan kullanımı

4)n-butanol gibi organik çözücüleri kullanımı

5)Fosfolipaz kullanımı

6)İyonik kuvveti yüksek çözelti kullanımı (1 M NaCl)

Neredeyse tüm proteinler SDS(sodyum dodesil sülfat) gibi iyonik deterjanlarda

çözünür.Ama bu şekilde geri dönüşümsüz olarak denatüre olurlar.Bu sebepten

ekstraksiyonlarda yumuşak deterjanlar kullanılmalıdır.

 Ekstraksiyon ortamına katılacak deterjanın miktarı mebran miktarıyla doğru orantılıdır.

(1 mg mebran için 2 mg deterjan kullanılmalıdır burada ki deterjanın 1 mg’ı lipit için ,

1 mg ‘ı protein içindir.)

Bazı mebran bileşenleri ancak sert iyonik deterjanlarla denatüre edilerek

çözünebilirler.Denatüre proteinlerin saflaştırılması zordur. Ama daha yumuşak koşulların

birçok proteini çözmesi ve ortamdan uzaklaştırılması önemli bir avantaj sağlayabilir.

Triton X-100 dışındaki birçok deterjanın suda çözünürlüğü düşüktür.

Çözünürlüğü artırmak için çözelti ısıtılırsa biri az biri çok deterjan içeren 2 faz oluşur.

Triton X-114 ‘de bu olay 20 derecede olur.

0’a yakın sıcaklıklarda Triton X-114 kullanılarak periferal proteinlerin neredeyse hepsi

integral proteinlerinde çoğu çözünür hale gelir.

Çözünmeyen kalıntılar santrifüj ile uzaklaştırılır.

Ekstrenin sıcaklığının 25 dereceye gelmesi sağlanır.

Bu sıcaklıkta faz ayrımı olur ve kısa bir santrifüjden sonra iki faz tamamen ayrılır.

Bir fazda integral proteinler diğer fazda da periferal proteinler bulunur.