Elektroforez

Dr. Behice ZEREN

Moleküler Biyolog
ORCID ID: 0000-0003-1163-9793
Elektroforez

İlk kez 1937 yılında Arne tiselius tarafından geliştirilmiştir.

Bir ayırma metodudur.
Proteinlerin saflığının tespitinde kullanılır.

Kullanım Alanları
• Saflaştırma
• Saflık kontrolü
• Molekül ağırlığı saptama
• Kalıtsal veya kalıtsal olmayan hastalık saptama
• Enzim izozimlerinin saptanması
• İmmünoloji ve Moleküler biyoloji
Elektroforez

Elektriksel bir alanda ayırıcı bir matriste makromolekülleri ayrıştırma tekniğidir.

Elektriksel alanda elektrik akımıyla proteinler hareket ettirilir.

(ma--şekil --yük --büyüklüklüğe göre)

Özel bir sıvı ortamda, parçacıkların elektriksel yüküne göre farklı hızda ve farklı yönde
hareket etmesi sonucu, bütün bir maddenin yapısındaki farklı yapıların ayırt edilebilmesini
sağlayan bir yöntemdir.

Elektroforez tüm partikül türlerinin göçünü sağladığından iyontoforez terimi özellikle küçük
iyonların göçünü ifade eder.
Elektroforezde katedilen mesafe;

Net yük ile doğru orantılıdır.

Molekül büyüklüğü ile ters orantılıdır.

Elektroforetik ortamın viskozitesi ile ters orantılıdır.

Elektroforez için gerekenler;

İyonların hareket edebileceği uygun bir destek ortamı

(kağıt/selüloz asetat / nişasta /agaroz jeli / poliakrilamid)

Elektriksel alanı oluşturmak güç kaynağı

Uygun pH’da bir tampon çözelti

Birbirinden ayrılan bantları kantitatif olarak değerlendirebilen dansitometri

Matriks elektrot bölmelerinin arasına yerleştirilir.

Matriks tamponla doğrudan / fitiller aracılığı ile ilişkilendirilir.

Her iki tampon tankında elektrotlar vardır.

Bu elektrotlar güç kaynağına bağlanır.(Böylece devre tamamlanır.)

Matrikse uygulanan numune, akım uygulandığında göç eder.

Elektroforez tamamlandıktan sonra, matriks boya ile muamele edilir.

Ayrılmış fraksiyonların identifikasyonu sağlanır.

Boyanmış destek ortam dansitometride okunur.

Dansitometri absorbans ölçümüdür ve destek ortamdaki boyanın absorbansını ölçüp , bir

grafik oluşturur.
Elektroforez genel prosedürü

Uygulama

Yürütme

Boyama

Temizleme
( Matriks boya içine konduğunda tamamen boyanır.Ancak biz sadece incelenecek kısmın boyalı kalmasını
isteriz. Bu nedenle matriks bir temizleme sıvısında(% 5 asetik asit) bir süre tutulur.)

Şeffaflaştırma
(Dansitometri de okuma yapılabilmesi için destek ortamının şeffaf olması gerekir.Bunun için %30-40
dimetilsülfoksit gibi şeffaflaştırıcılar kullanılabilir.)

Değerlendirme
(Dansitometride yapılır.)
BOYAMA
Elektroforezden sonra matriks boyanır ve ayrılmış fraksiyonların identifikasyonu sağlanır .

Coomassie Brilliant Blue 0.1 g proteine duyarlıdır.

Ag boyama Coomassie Brilliant Blue’ya göre en az 100 kat daha duyarlıdır.

Önceden Coomassie ile boyanmış jele de , hiç boyanmamış jele de uygulanabilir.

En iyi boyalar
 Elektroforezde Göç Hızı;

Molekülün net elektriksel yüküne

Molekülün yapısı ve büyüklüğüne

Elektriksel alanın gücüne

bağlıdır.
Destek ortamın özelliğine

Uygulama ısısına
IV.ELEKTROFOREZ TÜRLERİ

1. Kağıt elektroforezi

2. Selüloz asetat elektroforezi

3. Kapiller elektroforez

4. İmmünoelektroforez

5. Jel elektroforezi

a) Agaroz jel elektroforezi

b) Nişasta jeli elektroforezi

c) Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE)

Kağıt elektroforezi

Matriks olarak kaliteli filtre kağıdı kullanılır.

Rutin / araştırma maksatlı olarak kullanılabilir.

Özellikle aminoasitlerin ayrımında kullanılır.

Metodun avantajı ;

•Ucuzdur.

•Yüksek gerilime dayanabilir.

Ancak deney süresi uzun olduğundan rutinde pek kullanılmaz.

Selüloz asetat elektroforezi

Selülozun hidroksil grupları, asetik anhidrit ile reaksiyona sokulunca selüloz asetat elde edilir.

Avantajları:
•Hem elektroforez süresi kısaır. (30-0 dk)
•Deney bittikten sonra numuneleri uzun süre korumak mümkündür.

Bu sebepten rutinde bolca kullanılır.

Dezavantajları:
•Standardizasyonu iyi değildir.
•Aynı firmaca üretilen aynı parti içinde bile farklılıklar görülebilir.
Jel Elektroforezi:
Matriks olarak jel kullanırsa buna jel elektroforezi denir.
Jel elektrik akımını geçiren ve tampon çözeltiyi emen bir ortamdır.

Poliakrilamid jel daha çok proteinler için uygundur.

Agaroz jel nükleik asitler için iyi sonuç verir.

Agoroz jel , Agar Agar kırmızı alginden elde edilmiş bir polisakkarittir

İkisinin karışımı ise izoelektrik odaklamada kullanılabilir.

Agaroz jel elektroforezi

Matriks olarak bir karbonhidrat polimeri olan agaroz / agaropektin kullanılır.

Bu maddelerin proteinlere affinitesi az olduğundan protein bantları birbirinden daha iyi ayrılır.

Ayrıca çok iyi şeffaflaştıkları için dansitometrik değerlendirmeleri daha güvenilirdir.

Deney süreside oldukça kısadır (30-90 dk.)

Bu nedenle rutin uygulamalarda sıkça kullanılmaktadır.

Serum proteinleri, nükleik asitler, hemoglobin varyantları, laktat dehidrogenaz ve kreatin kinaz

izoenzimleri, lipoprotein fraksiyonları ve diğer bazı maddelerin analizlerinde başarı ile

kullanılmaktadır.
Nişasta jeli elektroforezi

Destek materyali olarak nişasta kullanılır.

Doğal nişasta jelleşmediğinden kısmen hidrolize olarak kullanılır.

Nişasta jel elektroforezi yük + molekül büyüklüğüne bağlı olarak ayırt edilen

makromoleküler iyonların özelliklerinin anlaşılmasına izin verir.

Agaroz jelde olduğu gibi, nişasta jelde de işlem yatay gerçekleştirilir.

Poliakrilamid jeli elektroforezi(PAGE)
PAGE: Elektriksel çekim kuvveti kullanılarak proteinleri boyutlarına göre ayırmak için

kullanılan ortama denir.

En yaygın kullanım alanı olan elektroforez tipidir.

Serum proteinlerinin, proteinlerin genetik varyasyonlarının ve izoezimlerin analizinde en iyi

sonuç veren elektroforez tipidir .

PAGE ‘de 20 ya da daha fazla fraksiyon elde edilir.

Tüp / düzlemsel(slab) jellerde gercekleştirilir.

Düzlemsel jeller, aynı anda çok sayıda örneğin analiz edilebilmesine imkan verdiği için

tüp jellere göre daha geniş çapta kullanılırlar.

POLİAKRİAMİD JEL:
Poliakrilamid, polimerizasyondan önce akrilamid içeriği değiştirilerek porozitesi değiştirilebilen inert

bir destek materyalidir

Poliakrilamid jel =Akrilamid + çapraz bağlayıcı bisakrilamidden oluşur.

Akrilamid ve bisakrilamid molekülleri arasında çapraz bağların oluşması ile polimerleşen bir jeldir.

Ayrıca polimerizasyonu başlatmak için mutlaka amonyumpersülfat /TEMED gerekir.

APS aracıdır. TEMED katalizördür.

TEMED/ amonyumpersulfatın derişimini arttırsak polimerizasyon hızlanır.

Burada kafes yapısı oluşur.

Protein ayrıştırılmasında genellikle %7,5 akrilamid kullanılır.

Akrilamid ve bisakrilsmidin yüzdesiyle oynayarak çeşitli por çapındaki jeller yapılır.

Oksijen polimerizasyonu inhibe eder bu sebepten kullanmadan önce jel karışımının havası alınmalıdır.

APS her defasında taze hazırlanmalıdır.

Akrilamid ve bisakrilamid tamponda karıştırılarak çözüldükten sonra filtreden geçirilerek süzülmelidir.

Akrilamid ve bisakrilamid polimerleşinceye dek nörotoksiktir.

Amonyum persülfat
PAGE’de örnekteki bileşenler daha iyi ayrışır.

Çünkü ayırım hem moleküler elekleme + elektroforetik harekete dayanır.

Yani separasyon moleküllerin büyüklüğüne + yüküne bağlıdır.

En önemli avantajı, jel konsantrasyonunun kesin olarak belirlenip , değiştirilebilmesi ve

böylece gözenek büyüklüğünün istenen şekilde saptanmasına olanak vermesidir.

Jelin ayrıştırma gücü akrilamid ve bisakrilamid konsantrasyonuna bağlıdır.

Bu iki maddenin polimerizasyonu ile jelde porlar olusur.

Jel konsantrasyonunun artırılması, gözenek çaplarının küçülmesiyle sonuçlanır.

Böylece jel, bir moleküler elek görevi yaparak ayrıştırmayı sağlar.

Düşük konsantrasyonda daha büyük porlar oluşur.

Yüksek molekül ağırlıklı biyolojik moleküllerin analizi yapılabilir.

Yüksek konsantrasyonlarda küçük porlar oluşur.

Düşük molekül ağırlıklı moleküllerin ayrılması yapılır.

Proteinler izoelektrik noktalarının üzerindeki pH değerlerinde () yüklüdürler.

Elektriksel alanda anoda göç ederler.

Proteinler izoelektrik noktanın altındaki pH değerlerinde ise (+) yüklüdürler.

Elektriksel alanda katoda göç ederler.

PAGE, farklı şekillerde sınıflandırılabilir:

1.Jelin biçimine göre:

a)Tüp jel elektroforezi

b)Tabaka jel elektroforezi

2.Jelin konumuna göre:

a)Dik jel elektroforezi

b)Horizontal jel elektroforezi

3.Jelin gözenek dağılımına göre:

a)Homojen (düz) jel elektroforezi: İki elektrod arasındaki mesafe boyunca jel konsantrasyonu sabittir.

Dolayısıyla, gözenek çapı homojendir.

b)Gradyent jel elektroforezi: İki elektrod arasında jel konsantrasyonu giderek artar, gözenek çapı da

giderek küçülür. Başlangıçtaki büyük porlardan tüm moleküller geçerken gittikçe geçirgenlik azalır. Böylece

moleküller, kendi büyüklüklerine uyan gözeneklerde takılarak molekül ağırlıklarına göre ayrışırlar. Jel

konsantrasyonunda aynı gradyenti sağlamak zor olduğundan tekrarlanabilirliği düşüktür.

Gradient jelin üst kısmındaki (başlangıç) porlar alt kısmındakilerden daha büyüktür.
4.Jelin türüne göre:
a)Continious (devamlı) jel elektroforezi:

Aynı konsantrasyon ve pH'da jel hazırlanır. Tek bir ayırıcı jel vardır; tanklarda ve jelde aynı
tampon kullanılır

b)Discontinious jel elektroforezi:

Farklı konsantrasyon ve pH'da jel bölgeleri hazırlanarak yapılır.

Jel farklı tamponlarla hazırlanmış iki kısımdan oluşur:

*Büyük porlu yükleme (“stacking”) jeli

* Küçük porlu ayırma (“separating”) jeli.

Kullanılan tank tamponları da jel tamponlarından farklıdır.

Bu farklılık jel boyunca bir pH ve voltaj gradientinin oluşumuna yol açar.

Böylece daha seyreltik örneklerle çalışılabilir ve daha iyi bir ayrışım elde edilir.
5.Jelin bileşimine göre:
a)Native (doğal) jel elektroforezi

Proteinlerin doğal (intakt) yapılarını bozucu ajanlar kullanmadan yapılan PAGE yontemidir.

Kullanılan tamponlar, deterjan ve diğer denatüre edici maddeleri içermediği için prosedür

doğal koşullarda ilerler.

Denature edici ajanlar kullanılmadığı için proteinlerin kuarterner yapısı bozulamaz.

Proteinler biyolojik aktivitelerini korurlar.

Bazı proteinler native elektroforezden sonra enzimatik aktivitelerini yitirmezler yani

böylece saflaştırılmış aktif proteinleri elde ederiz.

Göç proteinin net yüküne , şekline , boyutuna diğer moleküllerle olan kompleksine

bağlıdır.
Elektroforezden sonra proteinleri jelden passive diffüzyon /elektroelüsyon ile alabiliriz.

Kullanılan cihaz ve aletler soğukta muhafaza edilmelidir.

Proteolizis ve denatürasyona sebep olacak ortamlardan ve işlemlerden kaçınılmalıdır.

Ekstrem pH’lar dan kaçınılmalıdır.Çünkü bu proteinlere geri dönüşşüz olarak zarar verir.

Örneğin ;bir tetramer(4 parçalı ) bir protein SDS PAGE de 1 band (denatürasyon

olduğu için )verirken native PAGE de 1 banddan daha fazla band verebilir.
SDS'li elektroforezde native’den farklı olarak, örnek hazırlama tamponuna SDS eklenir.

SDS, örnekteki protein moleküllerinin etrafında boşluk kalmayacak şekilde bir katman

oluşturur. Sonuçta, bütün moleküller (-) yükle kaplanmış olur.

Yani SDS ( Sodyum dodesil sulfat) proteinlere bağlanınca , protein doğal yapısını

kaybeder.

Bütün proteinler, aynı sekil ve yük/kütle oranına sahip olurlar.

Yani ayrışma, moleküllerin kendi yükünden bağımsız olup , doğrudan doğruya molekül

ağırlıklarına göre olur.

Yani elektriksel alan içinde proteinlerin hareketi, net yük /şekillerine bağlı değil, sadece

molekül büyüklüklerine bağlıdır.

Küçük olanlar, daha hızlı sürüklenir.

Genellikle proteinlerin molekül ağırlığı ve proteinlerin saflık tayininde kullanılır.

β-mercaptoethanol+SDS örnekle 5dakika kaynatılır.

β-mercaptoethanol: Disulfid köprülerini indirger. Örneklere

mercaptoethanol / dithiothreitol indirgeyici ajan olarak konulur.
Böylece disülfid bağları indirgenmiş olur ve proteinler “random coil”
konfigürasyonlarını koruyarak moleküler ağırlıklarına göre yürürler.

SDS: Kuvvetli anyonik deterjan dır.Proteinleri denatüre eder.

Oligomerik proteinlerie bağlanıp altbirimlerini birbirinden ayırır.Bu

deterjan polipeptidlere bağlanarak bir kompleks oluşturur ve yuksek

oranda (–) yük taşıdığı için peptidlere de yüksek oranda (– ) yük

kazandırır. Bu oluşan kompleks polipeptidlerin negatif yüklü

kalmalarını sağlar.
SDS proteinlerin yüzeyini kaplar ve proteinlerin hidrofobik bölgelerine bağlanır .
Agaroz jel elektroforezi PAGE
Porlu matriks
Kafes matriks

Yatay uygulanır. Dikey uygulanır.

Polimereşmesi için kimyasala gerek yoktur. Polimerleşmesi için TEMED+APS gereklidir.

Az dayanıklıdır. Dayanıklıdır.

Ucuzdur. Pahalıdır.

Etdidin bromür ile boyanır. Gümüş nitratla boyanır.

SDS-PAGE HAZIRLANIŞI
NOT: Proteinlerin ayrılması için kullanılan standart bir jel genelde % 7.5 poliakrilamid içerir.

Cam tabakalar önce %70 etanol ve sonra saf su ile temizlenir ve oda sıcaklığında kurutulur.
Cam plakalar arasına 0.75 mm kalınlığında spacer adı verilen boşluk oluşturucular konulur .
Plakalar dik bir vaziyette plaka tutucuya yerleştirilir.
Burada dikkat edilmesi gereken şey kısa cam plakanın bize doğru bakmasıdır.
Plaka tutucusu içerisine kilitlenen jelsiz cam plaka sistemi jellerin döküleceği tutucu üzerine
dikkatle oturtulur.
Bir 50-mL hacimli tüp içerisinde önce ayırım yapılacak jel tabakası hazırlanır.
%12’lik seperasyon jeli
• Tris.HCl (1.5 M pH 8.8 2.5 mL)
• Distile su (3.5 mL)
• SDS (%10 0.1 mL)
• Akrilamid (%30 4 mL )
TEMED (0.005 mL (cam şişede saklanmalıdır, en son eklenmeli ve daha sonra hafifçe karıştırılmalı,
zaman kaybetmeden plakalara yüklenmelidir) ) 1 mL’lik otomatik pipet aracılığı ile jel karışımı cam
plakalar arasına yukarıdan 2 cm boşluk bırakacak şekilde dökülür.

Jelin üst kısmının düz olması için jel daha polimerize olmadan üzerine distile su ilave edilir.
( Burada amaç jelin pürüzsüz düz bir şekilde polimerizasyonunu sağlamaktır.)

Jel en az 15 dk kadar oda sıcaklığında polimerize olması için bırakılır.

50-mL hacimli deney tüpü içerisinde stacking jel hazırlanır.

% 4 lük stacking jeli

Tris.HCl,( 0.5 M pH6.8 1.25 mL)
Distile su (3.05 mL)
SDS (%10 0.05 mL )
Akrilamid(%30 0.65 mL)
TEMED (0,005 mL)

Hazırlanan karışım ayırım jeli üzerine dökülür .

Kuyucukları oluşturmak için jelin üzerine tarak takılır.
Bu tarak 12 adet diş içerir ve bu dişlerin bulunduğu kısımlar polimerizasyondan sonra
kuyucuk olarak kalırlar.
Jelin polimerleşmesi için 15 dk beklenmelidir.
PROTEİN ÖRNEKLERİNİN YÜKLENMESİ
Protein örnekleri 4x ‘lik bir yükleme tamponu ile karıştırılıp 95 C ’ta 4 dk ısıtılarak hazırlanırlar.
4x Yükleme Tamponu
Tris.HCl, (0.5 M pH6.8 )
distile su (4 mL)
SDS (1.6 mL %10 )
Gliserol (0.80mL )
BFB ((bromophenolblue) 0.2 mL )

NOT:Örnekler ısıtıldıktan hemen sonra buz üzerine alınmalı ve deney süresince buz üzerinde

tutulmalıdır.
JELİN YÜRÜTÜLMESİ

Cam tabakalar içerisinde polimerize olmuş jel tank içerisine özenle yerleştirilir.
Jeli bulunduran tank yaklaşık 3 cm yüksekliğe kadar yürütme tamponu ile
doldurulur.
4x yürütme tamponu (pH 8.3)
Tris (9 gr )

Glisin (48.3 gr )
SDS (3 gr)
Hazırlanan protein örnekleri pipet kullanılarak yürütme tankının içinde bulunan
jelin içine yüklenir.

Hacim su ile 600 mL’ye tamamlanır.

Jel 150 ile 180 volt arasında bir voltajda yürütülür.

JELİN BOYANMASI
Protein elektroforezi bittikten sonra jel sistem üzerinden çıkartılır.
Bu işlemin çok dikkatli bir biçimde jeli kırmadan zarar vermeden yapılmalıdır.
(Bunun için en uygun metot cam tabakaların taziksiz akan su altında jelden
ayrıştırılmasıdır.)

Jel üzerindeki proteinler boyanmadan önce jel üzerine sabitlenmelidir.(fiksasyon)

Bunun için jel 30 dk kadar fiksatifte tutulmalıdır. (%40 metanol+%10acetik asit içeren çözelti).
Fiksatiften geçirilen jel hafif distile su ile yıkandıktan sonra boyama işlemine alınır.

Coomassie Brilliant Blue (CBB) ile Boyama

En sık kullanılan boyama metodudur.
CBB’nin % 0.25’lik çözeltisi fiksatif içerisinde hazırlanır.
En az 4 saatlik bir boyama gereklidir.

Boyama Solüsyonu
coomassie brillant blue(0,25 g)
methanol (125 ml )
asetik asit (25 ml )
d H20 (100 ml)
Boya jelin yüzeyini tamamen boyadığı için protein olmayan bölgelerden uzaklaştırılması

şarttır.Bu amaçla jel birkaç kez %7’lik asetik asit çözeltisi ile yıkanmalıdır.

Boyanan jelin uzaklaştırılması için alternatif olarak kaynatma yöntemi kullanılabilir.

Boyama solüsyonunda bekletilmiş jel içinde distile su bulunan kaba konularak mikrodalga

fırında, kabın içindeki su kaynamaya başladıktan sonra 3-5 dakika daha bekletilir.

Bu işlem kabın içindeki su değiştirilerek birkaç kez tekrarlanır.

Kaynatma yöntemi ile uzaklaştırma solüsyonu kullanmaya gerek yoktur.

Kısa zamanda boyama solüsyonunun uzaklaşmasını sağlar.

JEL GÖRÜNTÜLEME SİSTEMİ
JELLERİN KURUTULMASI

Jel, kurutularak da saklanabilir.

Otoradyografi yapılacaksa mutlaka kurutulmalıdır.

Ancak bu işlem oda sıcaklığında filtre kağıdı üzerinde bekletme şeklinde

yapılamaz, çünkü jel büzülür ve kırılır.

Bu amaçla geliştirilmiş aletler vardır.

NOT:Duyarlılık yüksek olduğu için TEMİZLİK çok önemlidir.

oCam eşyalar çok temiz olmalıdır.

oTüm çözeltiler filtre edilmelidir.

oDaima eldiven giyilmelidir.(Üzerinde pudra kalmamalıdır.),

oHer adım için ayrı bir kap kullanılmalıdır.

NOT:Özellikle gümüş boyamada en iyi bant görüntüsünün ne zaman

oluşacağı belirsizdir. Bu sebepten boyamanın son aşamalarında 3-4 dakika

aralıklarla birkaç kez fotoğraf çekilir.