Agaroz Jel Elektroforezi

Parisa Vadiei

Tıbbi biyoloji ve genetik(Yüksek Lisans)

Moleküler teknikler ve uygulama alanları

 Elektro: Elektriğe karşılık gelir
Elektroforez
Forez: Taşımak/karşıya geçirmek

Jel elektroforez nedir? Jel elektroforez ile DNA,RNA ve proteinleri kontrol edebiliriz. Bu yöntemin amacı jel
yardımı ile PCR ürününün doğruluğunu ve kalitesini kontrol etmektir.
Agaroz Jel Elektroforez: Bu yöntem makromolekülleri iki değişken,yük ve kütle ile ayırır.
Agaroz Jel Elektroforez DNA`yı kontrol etmek ve ayırmak için en uygun bir yöntemdir çünkü Agaroz
Jel büyük porlar çapına sahiptir ve DNA zincirleri kolayca bu porlarda hareket edebilir.
Agaroz nedir ve nasıl Jel Elektroforez için hazırlanır?

1.Bir polisakkarittir,bazi kırmıza alglardan alınır.

2.Fiziksel özelliğe sahiptir.
3.Üç boyutlu bir matrikstir.
4.Agaroz molekülleri birbirine bağlandıktan sonra bir porlu yapı oluşur bunedenle makromoleküller jelde hareket edebilir.
5. 35-42 °C sıcaklığında katı ve yarı katı halinde ve 85-95 °C erime noktasıdır.
6. Agaroz yüzdesi %1-2` ye kadar Agaroz Jel Elektroforez için uygundur.
7.Porların küçük ya da büyük olması agaroz yüzdesine bağlıdır mesela:

Düşük agaroz yüzdesi: Büyük porlar,uzun iplikleri ayırmasını sağlar

Yüksek agaroz yüzdesi: Küçük porlar,kısa iplikleri ayırmasını sağlar

Agaroz Jelini hazırlamak adımlar:(%1 yüzdesi)

1. 1gr agaroz kuru tuzu,100ml sıvı buffer ile çözuyoruz.

2. Berraklanana kadar ısıtıyoruz.(kaynamaması önemlidir)
3. Soğuduktan sonra jelin içine DNA zincilerini boyamak için bir boya ekliyoruz bu boya zincirlerin uv ışığı ile
görunmelerine ve tespit etmeklerine yardımcı olur.
4. Hazırlanan jel kasete dükülür ve kuyular için bir jel tarağı kullanırız.
Jel ile ilgili iki önemli konu:

1.Kullandığımız buffer: İki tür baffer kullanabiliriz,TBE(Tris-Broate-EDTA) ve TAE(Tris-Astat-EDTA).

Bu bufferler agaroz jelin PH`ni 8 - 8.5 `ta korur. Bufferlerin içindeki EDTA, DNAse enzimini sınırlıyıp
kontrol altına alır.
TAE ve TBE avantajları ve dezavantajları:
TAE TBE
iyonik gücü düşüktür iyonik gücü yüksektir
iyon kapasitesi düşüktür iyon kapasitesi yüksektir
uzun zincirler için uygundur kısa zincirler için uygundur

DNA coloning yapmak istersek bu bufferi kullanmak daha uygundur Borat DNA’nın şeker yapısını bozabilir o yüzden
(TAE,DNAse enziminin işlemini etkilir ve dna zincirlerin korur) coloning yapmak istersek kullanmamamız lazım

---------- İyon kapasitesine göre uzun süreli yürütmelerde uygundur

2.Zincirleri boyamak için kullandığımız boya:
Zincirleri detect ve tespit edebilmemiz için onları boyamamız gerekiyor.Boya nükleik asit zincirlerin
bazlarıyla bağlanır ve bazların arasında yerleşir, zincirlerin dansitesi biraz düşüp zincirler biraz uzun
ve geniş olup boyanın ışık absorbansı ile UV ışığıyla zincirleri tespit edebiliyiruz.

Boya türleri:

 Ethidium bromide: Eski zamanlarda kullanılırmış ama toksik ve mutajen olduğuna göre şimdi pek çok
kullanılmıyor.

 Syber Green: Düşük mutajenik özelliliği vardır ama pahalıdır.

 Jel Green: Mutajenik özelliliği yoktur.

 Jel Red: Düşük mutajenik özelliliği ve uygun fiyatlı ürün olduğuna göre çok kullanılan boyadır.
Örnek hazırlama aşaması:
Agaroz Jel Elektroforez yapmak istediğimiz örneği tüpte loading buffer ile karıştırıyoruz.

Loading buffer nedir ve neden eklenir: Loading buffer 3 kısmlı bir malzemedir.

1.Endo nucleases enzimi: DNA iplikleri uzun olduklarına göre jel üzerinde hareket etmeleri çok zor olur bu nedenle
bu enzimi kullanıyoruz ki iplikler daha küçük ve kısa olsunlar.

2.Glycerol: Bu malzeme örneğimizin dansite seviyesini yükseltir ve örnek ağırlaşıp buffer ile karışmadan kuyularımızın
dibinde doğru iner ve depolanılır.

3.Coloring dye: Bromophenol ya da Xylene cyanol diye bir boyadır.Bu boya iplikleri jel üzerinde hareket
etmesini,takip etmemize yardımcı olur.(Bazen iplikler jelde kaybolur yada jelde depolanır ve hareketsiz kalabilir)
Elektroforezin tank cihazi:
Jel tank diye bir cihaz var,bir tarafda Anot(+)elektrodu ve diğer tarfda katot(-) elektrodu bulunur.İkisi de bir güç
kaynağına bağlıdır.Jeli kaseti ile jel tankın içine koyuyoruz.Kuyularımız katot elektrodu tarafında olması gerekıyor.
Jeli tankın içine koyduktan sonra tankı sıvı buffer ile dolduruyoruz.Bufferin jelin üzerine 1mm kadar geçmesi yeterlidir.
Tankı doldurduğumuz baffer,yaptığımız jelin bafferi ile bir olması lazım çünkü elektrik akışında jel ve tankın bafferiyle
bir iyonik gücü oluşur ve DNA iplikleri hareket etmeye başlır.Eğer bufferler aynı olmazsa bu denge bozulur.
DNA zincirleri jelin porlarınad geçerek Anot elekrtoduna doğru hareket ederler çünkü DNA zincirleri negatif yüklüdür
ayrıca bu sürede küçük zincirli DNA hızlıca hareket edip karşıya geçıp uzun zincirli DNA`lar yavaşça hareket
etmeklerıne göre daha geride kalırlar.
Agaroz Jel Elektroforez işlemi yaklaşık 30-45 dakika sürer.İşlem tamamlandıktan sonra jel doc cihazi ile
UV ışığı yardımıyla bandları görüntüleme yapabiliriz.

LADDER(marker):Bandları jel doc ile tespit edikten ve görüntüleme yaptıktan sonra onları ölçmek için bir refrans
kullanıyoruz. LADDER çeşitli boyda ve ölçümde bandlara sahiptir ve bandların ölçümü belli olduğuna göre
Örneklerimizin bandlarınıda ölçebiliriz.Mesela bir LADDER 100-1200 bp arasında farklı ölçü bandlarıyla örnek
bandlarının ölçmesine yardımcı olur.(kütle/çift baz)
Agaroz jel elektroforez avantajları:

1.Ucuz bir yöntemdir.

2.Agaroz jelin hazırlaması kollaydır.

3.Yüksek berraklığı vardır oyüzden bandları(zincirleri)daha iyi takip edebiliyoruz.

4.Hızlı yöntemdir.

5.Toksik yöntem olmadığına göre çevreye ve teknisyene zararlı değil.

6.İplikleri bozulmadan ve kırılmadan ve yapısı degişmeden geri alabiliriz.

Sorular:

1.Agaroz jel yönteminde TBE buffer ve TAE buffer arasındaki farklarlar nedir?

2.Jel Elektroforez yönteminin amacı nedir?

3.Agaroz jeli hazırladığımızda hangi boyalari ekleyebiliriz?boyaların özellikleri nedir ve bu boyamanın

amacı nedır?

4.Agaroz jel elektroforez yönteminde ladder ve ya marker nedir ve neden kullanılır?

5.Agaroz jel elektroforez yönteminde hangi aşamada loading buffer(loading dye) kullanırız bu malzemenin amacı nedir?
Cevaplar :
1.TAE : iyonk gücü düşüktür- iyon kapasitesi düşüktür- uzun zincirler için uygundur- colonlama yapmak
istersek kullanıyoruz çünkü DNA zincirlerine zarar vermıyor.
TBE : iyonik gücü yüksektir - iyon kapasitesi yüksektir – kısa zincirler için uygundur – jel elektroforezde uzun süreli
yürütmelerde kullanıyoruz(iyon kapasitesinden dolayı).
2.Jel elektroforezde pcr ürünlerimzin doğruluğunu ve kalitesini kontrol etmektir.
3. Ethidium bromide: Eski zamanlarda kullanılırmış ama toksik ve mutajen olduğuna göre şimdi pek çok
kullanılmıyor - Syber Green: Düşük mutajenik özelliliği vardır ama pahalıdır - Jel Green: Mutajenik
özelliliği yoktur - Jel Red: Düşük mutajenik özelliliği ve uygun fiyatlı üründür. Boyaların amacı: DNA
zincirlerinin arasına bağlanıp DNA görüntüleme yapdığımızda uv ışığıyla zincirleri detect ediyoruz.
4.DNA ladder çeşitli çiftbaz ve kütle zincirlerine sahiptir bu nedenle örnek DNA zincirlerini ladder ile
ölçüyoruz.
5.Örneğimizi yükleme yampak için kullanıyoruz(yükleme aşamasında).DNA’nın kolayca kuyunun içine
çökmesini sağlıyor – DNA’nın jel üzerindeki hareketini kontrol etmemizi sağlıyor – yüklemede hangi sırada
yükleme yapdığımızı anlamamızı sağlıyor.