REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ

GİRİŞ
Rekombinant DNA teknolojisi, bir organizmadan herhangi bir yolla izole edilen bir genin
(DNA parçasının) uygun bir konağın içerisine sokularak orada çoğalmasını ve bazen de
anlatım yapmasını amaçlayan çalışmalardır.

Bu teknoloji, belli bir amaca yönelik olarak doğrudan genetik materyal üzerinde yapılan
çalışmaları kapsar.

Moleküler düzeyde rekombinasyon, farklı nükleotid dizilerine sahip iki DNA molekülünün
homoloji (benzerlik) gösteren bölgeleri arasındaki parça alışverişi sonucunda meydana gelen
yeni gruplanmalardır.

REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİNİN TEMEL BASAMAKLARI

1. Klonlanacak DNA doku ya da hücrelerden izole edilir.

2. Özgül DNA parçalarının oluşturulması için restriksiyon enzimleri denilen proteinler

kullanılır. Bu enzimler DNA moleküllerini özgül nükleotit dizilerinden tanır ve keser.

3. Restriksiyon enzimleri ile oluşturulan DNA parçaları, vektör ya da taşıyıcı molekül adı
verilen diğer DNA molekülleri ile birleştirilir. Bir DNA parçasıyla birleşmiş olan vektör, bir
rekombinant DNA molekülüdür.

4. Rekombinant DNA molekülü, bir konak hücreye aktarılır. Konak içerisinde rekombinant
molekül kendini eşler ve rekombinant molekülün birbirine özdeş düzinelerce kopyası ya da
klonları oluşur.

5. Konak hücre kendisini eşlerken, rekombinant DNA molekülleri de tüm yavru hücrelere
geçer. Her biri klonlanmış DNA dizisinin kopyalarını taşıyan konak hücre topluluğu oluşur.

6. Klonlanmış DNA konak hücrelerden izole edilebilir ve incelenebilir.

7. Klonlanmış DNA daha sonra transkripsiyona uğratılabilir. mRNA’sı translasyona sokulabilir.

Kodlanan gen ürünü izole edilerek araştırma için ya da ticari amaçlarla satılmak için
kullanılabilir.
RESTRİKSİYON ENZİMLERİNİN AVANTAJLARI
Bu durum, araştırmacılara;

-Gen organizasyonunu,

-Fonksiyonunu,

- Gen ifadesini düzenleyen faktörleri,

- Genler tarafından şifrelenen proteinlerin işlevlerini ve doğasını araştırmalarına olanak

sağlar.

VEKTÖRLER
Kopyalanacak olan DNA restriksiyon parçaları konak hücresine doğrudan giremezler. Ancak
bir restriksiyon parçası, vektör adı verilen başka bir DNA molekülü ile birleşirse konak
hücreye girebilir. Vektörler, kendilerine takılan DNA parçasını nakleden ve replike eden
taşıyıcı DNA molekülleridir.

Birçok farklı klonlama vektörü vardır;

-Konak özgüllüğü,

- Taşıyabildikleri parçanın büyüklüğü,

-Oluştukları kopya sayıları,

- Klonlama için sahip oldukları tanıma dizilerinin sayıları ve

- Marker genlerinin tipi ve sayıları gibi bir takım özellikleri açısından değişiklik gösteren birçok
farklı klonlama vektörü vardır.

Bir DNA parçasını vektöre takmak için;

Vektör, restriksiyon enzimi ile kesilir ve aynı enzimle kesilerek oluşturulmuş DNA parçaları ile
karıştırılır. Araya eklenen fragmenti taşıyan vektörler rekombinant vektör olarak adlandırılır.
Bu yapı, her biri farklı iki kaynaktan gelen DNA’ların birleşmesi ile oluşmuş rekombinant DNA
molekülüne bir örnektir.

PLAZMİT VEKTÖRLER
İlk geliştirilen vektörler, genetik olarak değişikliğe uğratılmış plazmitlerdir. Hala klonlama için
yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu plazmit vektörler,

-Küçük ve kolay işlenebilen,

- Bakteri hücreleri içinde doğal olarak bulunan,

-Bağımsız olarak replike olabilen,

-Bakteri kromozomunun dışında, çift zincirli DNA molekülleridir.

Plazmitler, klonlama vektörü olarak kullanılabilmeleri için genetik mühendisliği ile çok fazla
değişikliğe uğratılmıştır. Genellikle tek bir plazmit bakteri konak hücresine girmesine rağmen,
bir kere girince, bazı plazmitler kopya sayılarını binlerce kopya olacak şekilde artırırlar.
Vektör olarak bu plazmitler, klonlanmış DNA’nın birçok kopyasının oluşmasına da olanak
verir.

BAKTERİYEL VEKTÖRLER
Klonlama vektörlerinin büyük çoğunluğu E. coli için geliştirilmiştir. Bunun yanı sıra, Bacillus
subtilis gibi bakteriler, maya, mantar, hayvanlar ve bitkiler için de vektörler mevcuttur.

BAKTERİYOFAJLAR /LAMBDA FAJI

Bakterileri enfekte eden virüslere bakteriyofaj adı verilir. Viral DNA, klonlama vektörü olarak
kullanılmak üzere tasarlanabilir. Litik döngüde, faj oluşumu sonrası konak hücre lizise uğrar,
virüs soyları serbest kalır. Litik fajlar, ilgilenilen DNA’yı çoğaltmak ve klon oluşturmak için
kullanılır.

KOZMİDLER
Plazmid ve bakteriyofaj gibi vektörlerin en önemli dezavantajı, nispeten küçük bir DNA
parçasını taşıyabiliyor olmalarıdır. Daha büyük DNA fragmanları, faj DNA’sı ve plazmitlerin
hibritleri olan kozmid’ler kullanılarak klonlanabilir. Kosmid vektör, bakteriyofajlarda olduğu
gibi, protein bir kılıf içerisine paketlenir. Paketlenmiş DNA, E. coli konak hücrelerini enfekte
eder. Bakteri hücresine giren DNA, plazmid gibi replike olur. Hücreleri lizise uğratmaz.

KLONLAMA
Gen klonlama pek çok amaçla kullanılabilir. Bunlardan birkaçı;

-DNA daha ileri çalışmalarda birçok kopya elde etmek için konak hücrelerde çoğaltılabilir,

-Önemli protein ürünlerin elde edilmesi için ilgili gen ifade edilebilir,

-Herhangi bir gen ve onun ifadesi canlı hücrede incelenebilir.

Gen Klonlanma Aşamaları ve Kullanılan Temel Yöntemler

1. Saf DNA örneklerinin hazırlanması

2. DNA örneklerinin kesilmesi (Restriksiyon endonükleazlar)

3. DNA parça boylarının incelenmesi

4. DNA moleküllerinin bir araya getirilmesi

5. DNA’nın konak hücreye girişi (Transfeksiyon, Transformasyon,Transdüksiyon)

6. Rekombinant DNA moleküllerinin belirlenmesi (Genetik, İmmünokimyasal)

DNA’NIN KESİLMESİ VE BİRLEŞTİRİLMESİ

Enzimlerin iki büyük sınıfı rekombinant DNA hazırlanmasında ve izolasyonunda önemli
araçlardır.

-Restriksiyon endonükleaz

-DNA ligaz

Restriksiyon endonükleazlar makas gibi davranarak DNAʼyı spesifik bölgelerinden keserler.

Restriksiyon endonükleaz DNA’daki şeker fosfat omurgayı her iki iplikten keser. Her bir
restriksiyon enzim spesifik DNA dizilerini tanır ve bu dizinin içindeki belli bir yerden keser.
Enzim, bir deoksiribonükleotidin fosfat grubu ve komşu deoksiribonükleotidin şeker grubu
arasındaki kovalent bağların kırılmasıyla DNAʼyı çift ipliğinden keser. Restriksiyon
endonükleaz şeker-fosfat omurgayı ayırarak küt ya da yapışkan uçlu, çift iplikli DNA
fragmenti oluşturabilir. Küt uçta; molekülün her iki ipliği aynı yerden kesilmiştir yani uçlar
düz ve nükleotidlerin her biri eşlenmiş şekildedir. Yapışkan uçta; molekülün her ipliği farklı
pozisyonlardan kesilmiştir. İplikteki birkaç nükleotit çıkıntı oluşturur, bu tek iplikli uçlar
kendiliğinden birbirleri ile baz çifti oluşturabilirler.

Restriksiyon fragmentlerinin ayrılması ve DNA’nın görüntülenmesi

Restriksiyon enzim kesimini ve diğer manipülasyonların sonuçlarını doğrudan görmek
mümkündür. Agaroz jel elektroforezi, DNA fragmentlerini büyüklüğüne ve boyama sonrası
görünürlüğüne göre ayırmak için kullanılan bir tekniktir.
Rekombinant DNA Moleküllerinin Konak Hücrelere Sokulması

Taşıyıcı DNA plazmit ise ‘Transformasyon’

Virüs ise ‘Transfeksiyon’

Mikroenjeksiyon

Biyolistik

Elektroporasyon

POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU(PCR)

PCR, hücreden arındırılmış bir yöntem olarak, DNA klonlamasını kolaylaştırarak, rekombinant
DNA araştırmalarının güçlü bir tekniği olmuştur. PCR, DNA moleküllerinde özgül hedef DNA
dizilerinin doğrudan çoğaltılmasına esasına dayanır ve yöntem için yok denecek az miktardaki
DNA bile yeterlidir. PCR reaksiyonunda 3 temel basamak vardır ve çoğaltılmış ürünün miktarı,
teorik olarak, bu 3 adımın tekrarlanma sayısına bağlıdır.

1. İlk adımda, çoğaltılacak DNA denatüre edilerek tek zincirli hale getirilir. Bunun için çift
zincirli DNA, tek zincirli hale gelene kadar ısıtılır ( 90-95 C,~5 dk).

2. Sıcaklık 50-70 0C arasında bir değere düşürülür ve primerlerin tek zincirli hale gelmiş
DNA’ya bağlanması sağlanır. Bu primerler yapay oligonükleotitlerdir ve çoğaltılacak DNA
kısımın uçlarındaki tamamlayıcı dizilere özgül olarak bağlanır. Bu primerler, kalıp DNA’nın
sentezi için, başlangınç noktası olarak görev yaparlar.

3. DNA polimeraz (Taq polimeraz) reaksiyon ortamına ilave edilir ge DNA sentezi 70-75 0C
gerçekleştirilir. Polimeraz enzimi, nükleotitleri 5’ den 3’ ne doğru ekleyerek, primerlerin
uzamasını sağlar ve hedef DNA’nın iki zincirli kopyasını oluşturur.

PCR’NİN BASAMAKLARI
Pratikte, PCR’da üç adım vardır.

1. Klonlanacak DNA denatüre edilerek tek zincirli hale getirilir.

2. Sıcaklık 50 ᵒC ila 70 ᵒC arasında bir değere düşürülür.
3. DNA polimeraz’ın ısıya dayanıklı bir formu (Taq polimeraz) reaksiyon karışımına ilave
edilir.
PCR’NİN DİĞER UYGULAMALARI
PCR ile DNA klonlaması moleküler biyoloji ve genetikte en çok kullanılan tekniklerden birisidir.

PCR yöntemi ile gen haritalaması çalışmalarında genetik belirteç (marker) olarak kullanılan ardışık
tekrarlanan DNA dizi varyasyonları ve restriksiyon enzimi tanıma dizisi değişiklikleri kolayca
saptanabilir.

Gene-özgül primerler, genomik DNA’daki mutasyonların taranması ve buna bağlı olarak da

mutasyonun doğasının kolaylıkla saptanmasını sağlar.

DNA DİZİLEME
İşlevi bilinmeyen DNA dizileri ve homolog proteinler için hızlıca veri tabanlarını araştırmak (örn; EMBI
ve GenBank), protein dizilerini tahmin etmek ve kodlayıcı dizileri bulmak için rutin bir şekilde
bilgisayarlar kullanılmaktadır.