Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) (Polymerase Chain Reaction (PCR) )

2006-07 Hayrnisa Ba Sermenli

Bilim dnyasna sunulduundan itibaren polimeraz zincir reaksiyonu (PCR); hem aratrmada hem de klinik

laboratuarlarda tanda yeni bir r amtr. Metot basite

tpteki nkleik asitlerin uygun koullarda oaltlmas

esasna dayanr. Bu buluundan dolay K.Mullis, 1993 yl

Nobel Kimya dlne hak kazanmtr.

Hcrelerde DNA doal olarak, replikasyon ile oalr. DNA ift sarmalnda birbirinden ayrlan ipliklerin

tamamlayclar sentezlenerek bir DNA moleklnden onunla ayn olan iki yavru molekl meydana gelir. Buna gre hcre blnmesiyle yeni oluan hcrelere tm genler aynen geer. Her yeni hcre jenerasyonunda genlerin kopya saylarnn iki

katna kmas nedeniyle jenerasyonlar boyunca DNA miktar

balangca gre ssel olarak artar.

Her Bir Is Dngsnde Oluan Kopya Says

Say 1

16

32

64

0 1 Dng

PCRn Teorik Verimlilii

Teorik verim = 2n x y

y = balangtaki kopya says

n = Is dngs says

PCR, DNA moleklleri topluluunda, zgl hedef DNA

dizilerinin dorudan oaltlmasna dayanr ve bu yntemin

uygulanabilmesi iin yok denecek kadar az DNA bile yeterlidir.

PCR reaksiyonunda 3 temel basamak vardr. Bunlar;

1- lk admda, oaltlacak DNA denatre edilerek tek zincirli hale getirilir. Bu DNA temiz olmak zorunda deildir ve genomik DNA kurumu kan yada semen gibi adli tp

rnekleri, uzun sre saklanm tbbi rnekler, tek bir sa teli,

mumya kalntlar ve fosil gibi deiik kaynaklardan elde edilebilir. ift zincirli DNA tek zincirli hale gelene kadar stlr.( 90-95C de yaklak 5 dk)

2- Scaklk 50 ile 70 C arasnda bir deere drlr ve primerlerin tek zincirli hale getirilmi DNA ya balanmas salanr. Bu primerler yapay oligonkleotitlerdir.(15-30

nkleotitlik) Bunlar oaltlacak DNA ksmnn ularndaki tamamlayc dizilere zgl olarak balanr. Bu primerler, kalp

DNA nn sentezi iin, balang noktas olarak grev yaparlar.

3- DNA polimerazn sya dayankl bir ekli (scak su

kaynaklarnda yaayan bir bakteriden elde edilen enzim,

Taq polimeraz) reaksiyon karmna elde edilir ve DNA

sentezi 70-75 C deki scaklklarda gerekleir. Polimeraz enzimi nkleotitleri 5den 3 ynne doru ekleyerek, primerlerin uzamasn salar ve hedef DNA nn iki zincirli kopyasn oluturur.

Bu basamaktan oluan reaksiyon seti ift zincirli rnn tek zincirli hale getirilmesi (denatrasyon), primerlerin

balanmas(annealing), polimeraz enzimi ile zincirin uzamas

(extension)

bir dng olarak ifade edilir. DNA zincirlerinin

says her dngde 2 katna kar ve bir dng yaklak 4-5 dk ka srer.

Scaklk

100

Ayrlma 94 oC

PCR

50

Zaman

3 5

5 3

Scaklk

100

Ayrlma 94 oC

PCR

50

Zaman
3 5

Is
5 3

Scaklk

100

Ayrlma 94 oC

PCR
Primer oalma o balanmas 72 C 50 oC

Ayrlma 94 oC

50

Zaman
3 5 5

5 5 3

Scaklk

100

Ayrlma 94 oC

PCR
Primer oalma o balanmas 72 C 50 oC

Ayrlma 94 oC

30x

50

Zaman
3 5

Is
5 5

Is
5 5 3

Scaklk

100

Ayrlma 94 oC

PCR
Primer oalma o balanmas 72 C 50 oC

Ayrlma 94 oC

30x

50

Zaman
3

5 5 3

Scaklk

100

Ayrlma 94 oC

PCR
Primer oalma o balanmas 72 C 50 oC

Ayrlma 94 oC

30x

50

0
3 5 5

Zaman
5

5
5 3

Is
5 5

Is
5

Scaklk

100

Ayrlma 94 oC

PCR
Primer oalma o balanmas 72 C 50 oC

Ayrlma 94 oC

30x

50

0
3 5 5

Zaman
5

5
5 3

Scaklk

100

Ayrlma 94 oC

PCR
Primer oalma o balanmas 72 C 50 oC

Ayrlma 94 oC

30x

50

0
3 5 5

Zaman
5

5
5 3

Tannan uzunluklarn paralar

PCR Teknolojisi Temel Bileenleri : Kalp olarak kullanlan DNA molekl( DNA rnei) oaltlacak olan blgeyi sadan ve soldan evreleyen bir ift sentetik primer,

dNTP'ler (A,T,C,G),
Isya dayankl DNA-Polimeraz enzimi, Uygun pH ve iyon koullarn (Mg+2) salayan tampon karm gereklidir.

Kalp DNA: PCRda genomik DNAlar, plazmid ve faj DNAlar, eitli genler ve hatta herhangi bir DNA paras kalp olarak kullanlabilir.

Polimerazlar:

DNA

polimeraz

enzimleri,

kalp

iplie

tamamlayc bir DNA iplii meydana getirmek zere, orijinal

kalp

iplikteki

baz

bilgisini

kullanarak

drt

eit

deoksiribonkleozid trifosfattan uzun polinkleotid zincirin

sentezini kataliz ederler. Bu enzimler sentezi balatmak iin

kalp molekldeki tamamlayc diziye balanan ksa DNA

paralarna (primerlere) gerek duyarlar.

Primerler: Gen oaltlmas dahil PCRn birok uygulamas iin kalp DNAya tamamen tamamlayc olan primerlere

gereksinim vardr. Genel olarak kullanlan kalp ile yksek

oranda balanma salamak zere primerler 20-30 nkleotid

uzunluundadr. Primer tasarm yaplrken oaltlmas

istenen DNA dizisinin iki ucundaki dizisi bilinen ksmlar dikkate alnr. Bu blgelere tamamlayc olan primerler tasarlanr.

dNTP

Karm: deoksiribonkleozid trifosfatlar ( dATP,

dGTP, dTTP, dCTP) yksek saflkta ya tek ya da drtl

karm halinde ticari olarak salanr. Ayrca optimal dNTP

konsantrasyonu: (1) MgCl2 konsantrasyonuna, (2) reaksiyon koullarna, (3) primer konsantrasyonuna, (4) oaltlm rnn boyuna, (5) PCR dngs saysna baldr. Yaplacak PCR iin en uygun dNTP konsantrasyonu deneysel olarak belirlenmelidir.

Tamponlar ve MgCl2 : PCRde kullanlan eitli tamponlar arasnda en ok kullanlan Taq/Amplitaq enzimlerine zg olan tampondur.

Mg+2 iyonlar dNTPler ile znebilir kompleksler olutururlar, polimeraz aktivitesi iin gerekli kofaktrdr. ift iplikli DNAnn Tm deerini arttrrlar, ayrca primer/kalp etkileimini salarlar.

Bu nedenle MgCl2n PCRnn zgll (spesifite) ve

rn verimi zerinde ok nemli etkisi vardr. Optimum Mg+2 konsantrasyonu, olarak 1.0-1.5 mMlk

deerler seilir.
Dk Mg+2 konsantrasyonu, rn oluumunda azalmaya, yksek Mg+2 konsantrasyonu ise zgn olmayan

rn birikimine yol aar.

PCR ETLER 1-Yuvalanm (Nested) PCR Yuvalanm (nested) PCR zgn olmayan rnlerin oluumunu engelleyen, yksek zgnlkte bir PCR yntemidir. Bu yntemde ardarda iki PCR yaplr. lk PCR zgn olmayan rnlerin oluumuyla sonulanr. kinci PCR ise ilk PCR sonucu oaltlm DNAnn i ksmlarna ait

dizileri ieren nested primerler ile yaplr. lk PCR rnleri

ikinci PCR iin kalp olarak kullanlr ve istenilen hedef blge oaltlarak zgn rnler elde edilir. Bylece nested PCR

doru rnlerin oaltlmas iin kullanlr.

2-Demirlenmi (Anchore) PCR Demirlenmi (anchored) PCR oaltlacak olan DNAnn sadece bir blgesinin (yani bir primer blgesinin) bilindii

durumda uygulanr. Ama bilinen blgeden yararlanlarak

ilgilenilen DNA parasnn oaltlmasdr.

3-Geri (Revers) Trankripsiyon PCRS ( RT-PCR) RNA PCR olarak da adlandrlan RT-PCR iki aamal olup RNAdan tamamlayc DNA sentezi (geri transkripsiyon) ve tamamlayc DNAnn standart PCR yoluyla oaltlmas

aamalarn kapsar.

4-Asimetrik PCR Bu PCR eidinde kullanlan iki eit primerden biri miktarca dierinden ok daha fazla kullanlr. Bu nedenle asimetrik PCR sonucu ipliklerden biri dierinden ok daha fazla miktarda oaltlr.

5-Ters (Inverse) PCR (IPCR)

Ters (inverse) PCR bilinen bir DNA dizisinden

yararlanlarak bu DNAnn her iki ucundaki bilinmeyen blgelerin oaltlmas iin kullanlr.

6-In situ PCR

Lam zerindeki hcre, doku ya da doku paralar iindeki

kalp DNAnn PCR ile oaltlmas ilemine in situ PCR ad verilir. Bu yntem viral DNAnn tek kopyal genlerin saptanmasnda veya RT-PCR ile birlikte viral RNA ve traskriptlerin belirlenmesinde kullanlr.

7-oklu (Multipleks) PCR Bir PCR ile birden fazla hedef dizinin birlikte oaltlmas oklu (multipleks) PCR olarak adlandrlr. Multipleks PCR

birden fazla blgeye balanan multipleks primerler ile

gerekletirilir. Bu PCR gen delesyonlarnn haritalanmas, kk delesyonlarn, ereve kaymas ve bir nokta yntem

mutasyonlarnn

analizinde

kullanlan

olduundan kistik fibrozis gibi genetik hastalklarn tansnda kullanlmaktadr.

8-Rastgele oaltlm Polimorfik DNA (RAPD) RAPD nkleotid dizilimi rasgele seilmi primerler kullanlarak yaplan polimeraz zincir reaksiyonu olup, nkleotid dizi bilgisine sahip olmakszn polimorfizimin

belirlenmesini salar. Polimorfizimin belirlenmesi genetik

iaretlerin
yapmnda

(marker) elde edilmesinde ve genetik harita

kullanlr. RAPD nin temeli yaklak 10

nkleotidlik ve nkleotid dizilimi rasgele seilmi tek eit primerlerin kullanma dayanr.

9-mmuno PCR Polimeraz zincir reaksiyonu ile bir antijen saptama sistemi

olan immuno PCR, zgl olarak antijen-antikor kompleksine

balanm bir iaret DNA parasnn oaltlmas iin kullanlr.

PCR YAPILIRKEN LABORATUARDA DIKKAT EDLMES GEREKENLER PCR, tek bir molekl DNA'yi dahi oaltabileceinden; reaksiyon karmlarnn DNA moleklleri ile kontamine

olmasnn engellenmesi gerekmektedir. Bu kontaminasyon;

daha nceki PCR reaksionu (product carryover) veya dier

hcresel materyelden kaynaklanabilir

1.PCR reaksiyonuna balarken, temiz bir eldiven giyilir. Mmknse eldivenler sk sk deitirilir. 2. Mmkn olursa bir pozitif kontrol, deneyde olmaldr. Bu pozitif kontrole laboratuarn uzak bir ksesinde de DNA rnei eklenmelidir. 3. DNA dnda tm PCR komponentlerini tayan negatif kontrol, deneyde olmaldr. Bu negatif kontrol tm PCR reaksiyonu yapldktan sonra yaplmaldr.

PCR KULLANIM ALANLARI 1. Kaltsal hastalklarda taycnn ve hastann tans, 2. Prenatal tanda, 3. Klinik rneklerde patojen organizmalarn saptanmas, 4. Adli tpta, 5. Onkogenesisin aratrlmasnda, 6. Probe'larn oluturulmasnda/klonlamada/gen expresyon

aratrmalarnda,
7. DNA dizi analizinde, byk miktarda DNA rneklerinin oluturulmasnda, 8. Bilinmeyen dizilerin tayininde,

9. Gemi DNA'nn incelenmesi ve evrimin aydnlanmasnda, 10. Invitro fertilizasyon yaplan tek hcrede, implantasyon ncesi genetik testlerin yaplmas ve sonra implantasyon gerekletirilmesi salanmas, 11.DNA protein interaksiyonunun aratrlmasnda ile bebein normal domasnn

(footprinting) 12. Tarmda (tohum saflnn belirlenmesinde) kullanlabilir.