HAL NVERSTES MOLEKLER BYOLOJ VE GENETK BLM BIY 471 MOLEKLER BYOLOJ UYGULAMALARI1 YRD. DO. DR. M.

BAK YOKE ASSTANLAR SEMN MERVE ALOLU ENTRK KUTLUHAN NCEKARA DENEY2 POLMERAZ ZNCR REAKSYONU DENEY TARH: 21.10.2008 RAPOR TESLM TARH: 28.10.2008

Raporu Hazrlayan rencinin; Ad-Soyad: Blm: Molekler Biyoloji ve Genetik Blm Numaras ve Snf:

Grup1 Hande Glin ZER, Tlin TACIOLU, Zeynep YILMAZ, Elif ERDEM, Adile KIVRAK,, Pnar KESKN

AMA: Etanol presipitasyonu yntemi kullanlarak izole edilen epitel hcresinden elde edilmi DNA rnei ile PCR gerekletirmek ve elde edilen sonular optimize etmek. GR: POLMERAZ ZNCR REAKSYONU PCR, spesifik bir DNA parasnn kopyalarnn primerler tarafndan ynlendirilerek enzimatik olarak sentezlenmesi ilemidir. PCR ile istenen gen parasnn klonlanmas birka saat iinde tamamlanr. PCR ile belli bir blgeyi oaltabilmek iin hedef DNAnn nkleotit dizisi bilinmelidir. Bu bilgi, ssDNAya balanacak primerlerin sentezi iin kullanlr. PCR mekanizmas: ift iplikli bir DNA moleklnde iki oligonkleotit primerin balanmas ve dizinin kopyalarnn sentezlenmesi. PCR dngs: Denatrasyon: DNA moleklnn yksek scaklkta denatre edilmesi Primerlerin DNAya balanmas (annealing): primerlerin spesifik olarak hedef dizilere balanmas Uzama (extension): DNA polimerazn uygun tampon ve 4 dNTP varlnda primerin 3 OH ucundan DNA zincirinin uzamasn salamas Art arda tekrarlanan denatrasyon, primerlerin balanmas ve dizinin sentezlenmesi evreleriyle DNA paralar ssel olarak artar. ssel artn nedeni, bir dng sonunda sentezlenen rnn ardk dngde primerler iin kalp grevi yapmasdr. Bylece her dng DNA molekl zerinde istenen blgenin 2 katna karlmas ile sonulanr. PCRn temel bileenleri: DNA: Kalp grevi grr. Primerler: Hedef DNAya zgndr. Nkleotitler: Yeni DNA ipliklerini sentezler. Tampon ve MgCl2: DNA polimerazn aktivitesi iin gerekli iyonlar (Mg+2) ve uygun pH salar. DNANIN AGAROZ JEL ELEKTROFOREZ Elektroforez teknii molekllerin sahip olduklar net elektrik yklerinin bu molekllerin bir elekriksel alan iindeki hareketlerini etkilemesi prensibine dayanr. DNA ve RNA moleklleri fosfat omurgas sebebiyle negatif ykldr (anyon) ve anoda doru hareket ederler. Molekl arlklarna ve tadklar elektrik yklerine gre molekller jel zerinde bantlar halinde ilerlerler ve bu ilerleme jel hazrlanrken iine katlan floresan zellikli EtBrn DNAnn bazlarnn arasna girmesi ve ykleme esnasnda rneklere eklenen BPB gibi bir boyann jel zerinde renk (mavi) oluturmasyla takip edilir. Ykleme tamponundaki BPB rnein jel zerinde yrrken gzlenmesini, gliserol ise rnein kuyucuklara kmesini salar. YAPILAN DENEYDE KULLANILAN TEKNK VEYA MALZEME, YAPILAN ARATIRMA GB KONULARLA LGL AIKLAYICI BLGLER YER ALMALI. TIMES NEW ROMAN, 12 PUNTO LE K YANA YASLANARAK HAZIRLANMALI. EKL VE TABLOLARA NUMARA VE AIKLAMA YAZILMALI.

ekil 1: PCRn bir dngs

ekil 2: Bir dng 3-5 dk srer ve pek ok kez tekrar edilir. 25-30 dng sonunda DNA miktarnda ~106 kez artma olur.

MATERYAL: Laboratuar Gereleri Mikro pipet ve pipet ucu (sar ve beyaz) Ependorf, Falkon tp ve 0,2 mllik PCR tpleri Portp, Eldiven, Kt havlu Agaroz Jel Elektroforez Tank ve Elektrotlar Metal ubuk, tartm taba, erlen ve plastik tabaklar Cihazlar G kayna UV Cihaz Minisantrifj Agaroz Jel Elektroforezi, Hassas Terazi Kimyasal Malzemeler PCR iin; o o o o o o o o o DNA template (biyolojik materyal) 10x PCR buffer (100 mM Tris-HCl (pH=8,3), 500 mM KCl) MgCl2 dNTP mix 16S-H primer 16S-L primer DMSO Taq polimeraz dH2O

%0,7lik Agaroz jel 10X DNA Ykleme Tamponu (25 mg BPB, %1 SDS, 2 ml gliserol) EtBr 100 bp DNA marker

Biyolojik Materyaller Etanol presipitasyonu ile izole edilen insan yanak ii epitel hcre DNAs MATERYAL, BURADA GRLD GB SINIFLANDIRILARAK YAZILMALI. ARADA OK UZUN BOLUKLAR OLMAYACAKSA AAIDA OLDUU GB YEN BALIK YEN SAYFA BAINDAN BALAMALI. METOT, MADDELER HALNDE VE GEN ZAMAN KULLANILARAK YAZILMALI. SAYFA NUMARASI EKLENMEL.

METOT: 8 tane 25 llik PCR reaksiyonu hazrlanmtr: 1. PCR tplerinin kapaklar marker kalem ile 1A, 1B, , 1H olarak kodland. 2. Her tpe tablolarda verilen miktarlarda titrasyonu yaplacak kimyasallar kondu: B) 1A, 1B, 1C, 1D tpleri iin; Master mix: Master mixler pipetleme srasnda oluabilecek kayplara kar 4 yerine 4,5 kat artrlmtr. 10x buffer : 2,5 l x 4,5 = 11,25 l 16S-H primer : 1,0 l x 4,5 = 4,5 l 16S-L primer : 1,0 l x 4,5 = 4,5 l dNTP mix : 1,0 l x 4,5 = 4,5 l Taq polimeraz : 0,2 l x 4,5 = 0,9 l dH2O : 15,3 l x 4,5 = 68,85 l Tablo 1: 1A, 1B, 1C, 1D tpleri iin PCR reaksiyon ierii DNA (l) MgCl2 (l) 1A 1,0 0,5 1B 1,0 1,0 1C 1,0 2,0 1D 1,0 3,0 B) 1E, 1F, 1G, 1H tpleri iin; Master mix: 10x buffer : 2,5 l x 4,5 = 11,25 l 16S-H primer : 2,0 l x 4,5 = 9,0 l 16S-L primer : 2,0 l x 4,5 = 9,0 l dNTP mix : 1,0 l x 4,5 = 9,0 l Taq polimeraz : 0,2 l x 4,5 = 0,9 l dH2O : 13,3 l x 4,5 = 59,85 l Tablo 2: 1E, 1F, 1G, 1H tpleri iin PCR reaksiyon ierii DNA (l) MgCl2 (l) 1E 1,0 0,5 1F 1,0 1,0 1G 1,0 2,0 1H 1,0 3,0 dH2O (l) 2,5 2,0 1,0 0 Master mix (l) 21 21 21 21 dH2O (l) 2,5 2,0 1,0 0 Master mix (l) 21 21 21 21

3. Her tpe tablolarda verilen miktarlarda master mix eklendi. 4. Tpler PCR cihazna yerletirilerek PCR program uyguland. PCR program: 2 sa 10 dk 94Cde 2 dk 94Cde 30 sn 50Cde 30 sn 72Cde 1 dk 72Cde 5 dk 5. Reaksiyon tamamlandktan sonra PCR rnlerinin 5 lsi 1 l ykleme boyas ile kartrlarak %0,7lik agaroz jele yklendi,250Vta 15 dk yrtld ve UV cihaznda incelendi. 40 evrim

SONULAR:

ekil 3: Grup 1 iin agaroz jelde PCR sonu grnts Marker 100 bplik olup yaklak 1000 bpe kadar alarak ilerlemitir. A, B, C, E, F ve G rneklerinde 800 bp civarnda birer bant gzlenmitir. D ve H rneklerinde bant gzlenmemektedir. B, E, F ve G rneklerinde smear gzlenmitir. En altta tm kuyucuklarda ykleme boyasnn ilerledii son nokta gzlenmektedir. YALNIZCA GZLENEN SONUCA DAR BLGLER YER ALMALI. YORUMLAR TARTIMAYA YAZILMALI. TARTIMA: YAPILAN DENEY SONUNDA BEKLENMEYEN BR DURUM GRLMSE NYE OLABLECE, HATANIN NEREDEN KAYNAKLANABLECE, BEKLENEN SONU ALINMISA BUNUN NEY FADE ETT DZGN CMLELERLE YAZILMALI. KSEL YORUMLAR YERNE BLMSEL SEBEPLERDEN BAHSEDLMEL. KMYA RAPORLARINDA SONU VE TARTIMA BLMLER BR ARADA OLUP SONULAR BALII ALTINDA VERLECEKTR. REFERANSLAR: Tfeki, MA (2008). Biyoloji I Laboratuar Fy, Hali niversitesi. Campbell, NA, Riece, JB (2009). Biyoloji (8.bask). San Francisco: Benjamin Cummings Press. Cummings, MR, Klug, WS (2003). Genetik Kavramlar C. ner (ev) Genetik ve Evrim (6.bask) iinde (713-733). Ankara: Palme Yaynclk. http://www.altanlab.com/mikroskop_eliza.htm (Eriim tarihi: 20 Ekim 2011)