İstinye Üniversitesi

Tıbbi bioloji ve genetik (Yüksek lisans)

Sanger sekans
Mehrshad Zahedi Rad
Moleküler teknikler ve uygulama alanları
Giriş:DNA dizileme nedir?
• DNA dizileme bir DNA ipliğindeki bazların (Adenin,Timin,Guanin,Sitozin)
sıralamasını çözme işlemidir.
• 1977 yılında Frederick Sanger DNA dizileme yöntemini keşf etmiş ve o zamandan
beri bu yöntem bir temel yöntem olduğuna göre
kullanılır.

Jel Elektroforez
Sanger Sekans iki
farklı şekilde yapılır
Kapiler Elektroforez
Bir hastada sanger dizileme yapmak istersek aşamaları nedir?
1.DNA izolasyon: Hastanın DNA zincirlerini,bozulmadan ve saf şekilde hucresel yapıdan ortaya
çıkarmak.
2.PCR: DNA zincirlerini çoğaltmak için yapıyoruz.
3.Agaroz jel: PCR ürününün doğruluğunu ve kalitesine kontrol etmek için yapıyoruz.
4.Egzosap prifikasyonu: PCR reaksiyonu sırasında kullanmayan primerler ve nükleotidleri
uzaklaştırmamız gerekiyor.
5.Sequencing PCR: DNA dizileme işlemini yapmak.(bazların sırasını bulmak)
6.Prifikasyon: kullandığımız işaretlenmiş ddNTP’leri uzaklaştırmak için yapıyoruz. Çünkü
kapilari yönteminde sinyalları karıştırır.
7.Kapilari elektroforeze yüklemek: İşaretlenmiş DNA zincirleri bu cihaz ile detect edilir,ve bir
bilgisayara data’lar gönderilir.
8.DATA analiz: DATA’larımız ile bilgisayarda bir electropherogram oluşuyor. Graflar üzerinden
DNA dizisini bulup okuyoruz.
Kapiler Elektroforezi:
• İlk başta bu yöntem için örneğimizi hazırlamamız lazım:
Bir tüp içine örnek DNA,primer,DNA polimeraz,dNTPs(dATP, dGTP, dCTP ve dTTP),
ve ddNTPs(ddATP, ddGTP, ddCTP ve ddTTP) ekliyoruz.

• Primer:Primerler DNA ve ya RNA’nın tek iplikçileridir. Yaklaşık 15 ila 25 baz

uzunluğundadır.İki tür primerimiz var:Forward ve Reverse. Sanger sekans
yönteminde sadece bir tür primer kullanıyoruz. Primer,DNA polimerazın şablon
DNA ipliğine bağlanmasını kolaylaştırır.
• DNA Polimeraz:Tamamlayıcı DNA zincirini oluşturur.
dNTP ve ddNTP arasındaki temel farkı nedir?
• dNTP:Bir deoksinükleotiddir,şeker yapısında 3’ karbonunda bir OH faktörü var.
dNTP dört bazın (A,T,C,G) karışımıdır.
• ddNTP:Bir dideoksinükleotiddir,şeker yapısında 3’ karbonunda bir H var.
İşaretlenmiş dideoksinükleotidlere sahiptir.(Floresan boyasıyla)
ddNTP nasıl replikasyonun bitmesine neden
olur?
• ddNTP’lerin O atomu olmadığına göre,yeni nükleotidler fosfodiester bağı
oluşturamazlar,bunedenle yeni nükleotidler yapıya katılmaz ve replikasyonun
devamını engelliyor. Bu sanger yönteminin en önemli noktasıdır.
• Denatürasyon:Karşımı termosikler cihazına koyuyoruz. İlk olarak,sıcaklık yaklaşık 95°C
kadar artırıyoruz.Bu yüzden DNA iplikleri birbirinden ayrılır.

• Bağlanma:Bu aşamada sıcaklığı yaklaşık 50°C kadar düşürüyoruz,bunedenle primer

kolayca DNA ipliğine bağlanır.

• Uzama:Bu aşamada sıcaklığı yaklaşık 60°C kadar yükseltiyoruz,böylece DNA polimeraz

polimerizasyon işlemini gerçeklıştiriyor.
• En önemli konu bu 3 aşamada,ddNTP’lerin roludur. ddNTP’ler random şekilde
DNA polimeraz tarafından kullanılıyorlar ve yapıda yeni nükleotid
bağlanmamasına göre replikasyon bitip oyüzden farklı farklı boyda iplikler
oluşulur.
Kapiler Elektroforezi:
• Bu aşamalardan sonra elektroforez yapıyoruz ve diziyi detect ediyoruz.
Karışımımızdan katot tarafındaki kuyuya ekliyoruz. Sonra güç kaynağının
oluşturan elektrik akışına göre,DNA iplikleri anot elektroda doğru hareket eder.
İşaretlediğimiz ddNTP’ler anot kutpuna doğru gittikleri zaman bir detector ile
floresan ışığını bir sinyallara dönüştürüp bilgisayara ileştirip (transfer) ve DNA
dizisi belli olur.
• Kapilari elekroforez yönteminin sonuçları bilgisayar üzerinde:

• Bu görüntüde görünen çeşitli renk graflar her biri,bir bazı anlatıyor. Graflar
nekadar uzun olursa sonuçlarımız da okadar dikkatlı ve kesin olur. Eğer dizileme
iyi yapılmazsa graflarmızın pikleri pek çok belli olmaz.
Jel Elektroforezi
• Bu yöntemde de ilk başta DNA ipliklerinin sıcaklığı arttığımızda birbirinden
ayırıyoruz. Sonra primer ekliyoruz. Bu karışımımızı dört tüpe eşit olarak bölüyoruz.
• Sonra her birine eşit miktarda DNA polimeraz ve dNTP ekliyoruz. Sonra her tüpün
içine sadece bir tür ddNTP ekliyoruz.
• Bu yöntemde kullandığımız elektroforezin jeli poliakrilamiddir.(Bu jel daha küçük
porlara sahip olduğu için küçük DNA ipliklerini birbirinden daha iyi ayırabilir)
• Jelimizde dört tane kuyu seçiyoruz,her birine eşit miktarda karışımımızdan ekliyoruz.
• Elektrik akışı başladıktan sonra DNA iplikleri anota doğru hareket ederler,ve jelin
üzerinde farklı farklı bandlar görünür.
• Diziyi bulmak için jelin aşağı kısımından okumaya başlıyoruz. Ortaya çıkan dizi,şablon
DNA’nın tamamlayıcısıdır.
Avantajlar ve dezavantajlar:
Avantajlar:
Bilim adamlara genomun sıralamasına
yardımcı olur.
Genetik hastalıklara neden olan
genlerin tanımlanmasını sağlıyor.
DNA parmak izileme için uygun bir
yöntemdir.
Dezavantajlar:
Sadece kısa DNA parçalarını (yaklaşık
300-1000bp) dizileyebiliyor.
Dizilerin kalitesi ilk 15-40bp’de ve
700-900bp’de düşüyor.
Sorular
 DNA dizilemesi nedir?
DNA dizileme bir DNA ipliğindeki bazların (Adenin,Timin,Guanin,Sitozin) sıralamasını çözme
işlemidir.
 dNTP ve ddNTP arasındaki farkı nedir?
dNTP bir deoksinükleotiddir,şeker yapısında 3’ karbonunda bir OH faktörü var.
ddNTP:Bir dideoksinükleotiddir,şeker yapısında 3’ karbonunda bir H var.
 ddNTP nasıl replikasyonun bitmesine neden olur?
ddNTP’lerin O atomu olmadığına göre,yeni nükleotidler fosfodiester bağı oluşturamazlar,
bunedenle yeni nükleotidler yapıya katılmaz ve replikasyonun devamını engelliyor.
 Sanger sekans’da,jel elektroforez yönteminde hangi jelden kullanıyoruz?Neden?
Poliakrilamid. Bu jel daha küçük porlara sahip olduğu için küçük DNA ipliklerini birbirinden daha
iyi ayırabilir.
 Sanger sekans’da hangi primeri kullanıyoruz?
Sadece bir primer kullanabiliriz,forward ya reverse.