REKOMBİNANT DNA TEKNİKLERİ

Günümüzde bu teknolojiler yardımıyla bir organizmanın yaşamı için

Gerekli bütün bilgilerin toplandığı ve kodlandığı, bir merkez kütüphane
fonksiyonuna sahip olan DNA üzerinde çalışılarak:

1. DNA ve RNA baz sıralarını belirlemek,

2. İstenilen baz sıralarını çıkarmak,
3. Aynı veya farklı türlere ait organizmalar arasında DNA dizi veya gen
transferi,
4. Genlerin konumlarını saptamak ve gen haritalarını hazırlamak,
5. Embriyolarda genetik düzeyde manipülasyonlar yaparak transgenik
hayvanlar, mikroorganizmalar veya bitkiler elde etmek,
6. Yeni fenotipte ve genotipte canlılar oluşturmak (hibrid hücreler elde etmek)

http://lifeofplant.blogspot.com/2011/04/recombinant-dna-technology.html
http://warnantp.edublogs.org/files/2008/05/gm_strawberries.jpg

http://1.bp.blogspot.com/_C7IwPeYck2o/SMoepYNX8xI/AAAAAAAAC0U/XsNkpyxHbsw/s400/
2
MouseEar.jpg
7. Prenatal tanı (embriyolarda cinsiyet ve kalıtsal hastalık
belirlenmesi),
8. Gen tedavisi,
9. Biyoteknolojik aşılar, proteinler, enzimler, antibiyotikler,
hormonlar, sitokinler, monoklonal antikorlar ve tıbbi amaçlara
yönelik diyagnostik maddeler üretmek mümkündür.

3
• Öte yandan, gerek prokaryot gerekse
ökaryot organizmaların genetik
materyallerinde ve embriyolarında yapılan
manipülasyonlar ve modifikasyonlar
sonucunda oluşan yeni genotipteki
mutantların kontrol edilememesi
durumunda insanlara, hayvanlara,
bitkilere ve doğaya zarar verebilecek
zararların türleri ve boyutları henüz
bilinmemektedir.

4
• Biyoteknolojik metodların sınırsız
uygulama alanına sahip olması
muhtemel tehlikeler yaratmakta
birlikte insan, hayvan ve bitkiler için
pek çok fayda da sağlamaktadır.
Biyoteknolojinin bir çok alana hitap
etmesi tek bir disipline ait
olamayacağının bir göstergesidir.

Bu nedenle Biyoteknoloji disiplinler arası

bir özelliğe sahiptir. İnsan ve
veteriner hekimlik başta olmak üzere,
ziraat, gıda, çevre, endüstri ve diğer
sahalarda biyoteknolojik
yöntemlerden fazlaca
yararlanılmaktadır.

5
 Rekombinant DNA teknolojisi’nin genetik temelini
rekombinasyon olayı oluşturmaktadır.

Rekombinasyon, eşeyli üreme gösteren organizmalarda

mayoz sırasında homolog kromozomlar arasında crossing-
over sonucu yeni gen bileşimlerinin oluşmasıdır.

Moleküler düzeyde, rekombinasyon farklı nükleotid dizilerine

sahip iki DNA molekülünün homoloji gösteren bölgeleri
arasındaki parça alış verişi sonucunda meydana gelen yeni
gruplanmalar olarak tanımlanır.

6
• Bunun için DNA molekülleri arasında
kırılmalar meydana gelir ve kırılma
bölgelerinde DNA molekülleri arasında
parça alış-verişi oluşur.
• Sonuçta orijinal durumdaki DNA
moleküllerine tam olarak benzemeyen ve
onlara ait nükleotid dizilerini kısmen
taşıyan rekombinant DNA molekülleri
oluşur.

7
• Homolog rekombinasyon, eşeyli
üreme gösteren organizmalarda
(ökaryotlarda) genelde mayoz
bölünmedeki krosingover olayı
sonucunda;
bakterilerde ise, transformasyon,
konjugasyon ve transdüksiyon
sonucu meydana gelir.

8
• Rekombinasyon doğal olarak ortaya çıkabildiği
gibi, laboratuvar koşullarında da meydana
getirilebilmektedir.

Sonuç olarak, ister doğal olarak meydana gelsin

isterse laboratuvarda kontrollü olarak
gerçekleştirilsin rekombinasyon orijinal DNA
molekülündeki mevcut genlerin yeniden
düzenlenmesine neden olarak farklı fenotiplerin
ortaya çıkmasını sağlar.

9
• Doğal rekombinasyon yalnızca yakın akraba olan
organizmalar arasında gen aktarımına izin
verirken,
• rekombinant DNA teknolojisi ile birbiriyle hiç
yakınlığı olmayan türlerin bireyleri arasında gen
transferi mümkündür.

10
• Rekombinant DNA teknolojisinde izlenen olayların sırası
şu şekilde özetlenebilir;
1-Bir canlıdan istenilen özellikteki DNA parçalarının izole edilmesi,

(restriksiyon enzimleri veya PCR gibi yöntemler kullanılarak)

2-İzole edilen DNA parçalarının taşıyıcı özellikteki bir DNA

molekülüne (vektöre) bağlanması ve rekombinant DNA eldesi,

3-Rekombinant DNA moleküllerinin uygun bir konak hücreye

sokulması, (transformasyon, transdüksiyon veya konjugasyon ile)

4-Rekombinant DNA'nın konak hücrede çoğaltılması ve hücre

bölünmesi,

5-Yavru hücrelerde yeni genin ifadesi ve ürünün eldesi.

11
 12
http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi?key=gene%20library
http://bio1151.nicerweb.com/Locked/media/ch20/cloning.html 13
• Rekombinant DNA teknolojisinde, ilk basamak, bir canlıdan istenilen
özellikteki DNA parçalarının izole edilmesidir. Bu yöntemle ilgilenilen
geni taşıyan DNA parçaları elde edilir. İlgilenilen genin izolasyonu için
değişik yollar kullanılabilir:

a) kesim enzimleri(restriksiyon endonükleazlar) kullanılarak,

b) cDNA eldesi,

c) Son yıllarda çok başarılı sonuçlar sağlayan başka bir yöntem de,
Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ile gen izolasyonudur.

14
• DNA molekülü üzerinde modifikasyon yapan
enzimler, katalizledikleri reaksiyonların tipine
göre 5 e ayrılabilirler:
• 1) Nükleazlar
• 2) Ligazlar
• 3) Polimerazlar
• 4) Modifiye edici enzimler
• 5) Topoizomerazlar
15
• Restriksiyon ve Ligaz enzimi kullanarak Rekombinant DNA hazırlama

16
 ARACI / TAŞIYICI MOLEKÜLLER
(VEKTÖRLER)

• Hedef DNA molekülünün yerleştirildiği

(klonlama), kopyalama ve izolasyon amaçlarına
hizmet eden aracı DNA molekülleridir.
Vektörler
* özel restriksiyon bölgesine/lerine sahip
olmalı
* kendini replike edebilmeli(replikasyon
orijin noktası)
* rekombinant ve non-rekombinant hücre
tiplerinin birbirinden ayırt edilebilmesini
sağlayacak özellikler taşımalı
17
•Plazmitler
• Bakteriyofajlar
• Kozmitler
• Bakteri Yapay Kromozomları (BAC)
• Maya Yapay Kromozomları (YAC)
• Memeli Yapay Kromozomları (MAC)
• İnsan Yapay Kromozomları (HAC)
• İfade Vektörleri

18
 Plazmitler

Bakteri sitoplazmasında onun DNA’sından ayrı olarak

kendi kendine replike olabilen, çift zincirli, halkasal
ekstrakromozomal DNA molekülleridir.
19
Doğal olarak bulunan plazmitler büyük ve kullanışsız
olduklarından, bunların yerine in vitro ortamda amacına
yönelik olarak hazırlanan yapay plazmid vektörler
kullanılmaktadır.
Üzerlerinde çeşitli antibiyotiklere (ampisilin, tetrasiklin,
kanamisin) gibi karşı direnç genleri taşırlar.
Bunların rekombinant hücrelerin tespit edilmesinde
önemli fonksiyonları vardır.

20
Plazmit vektörler;
Aracı moleküllerden en çok tercih
edilenidir. Üzerlerinde Replikasyon
orjini (ori),
Antibiyotik direnç genleri (marker
gen),
Restriksiyon enzimlerinin tanıma
dizilerini içeren bir
polilinker bölge bulunmalıdır.
21
22
• Plazmid vektör üzerine 10 kb
büyüklüğünde yabancı DNA alabilir.
• Kullanılan ilk plazmid vektör pBR322
olarak adlandırılmıştır.

• Bu vektör 4361 bç büyüklüğündedir.

23
 Virüs vektörler

• Vektörlerin ikinci kaynağı ise Virüs DNA sıdır.

• Virüsler canlı hücrelere girebilirler ve çoğalabilirler.
Şayet bir kromozomal gen viral genom içerisine
sokulacak olursa, gen virüs DNA sı ile birlikte
replikasyona uğrayacak ve çoğalacaktır.

24
Faj’lar bakteriyi enfekte eden virüslerdir.

Fajların bazıları, kendi konakçılarında lizis

meydana getirmelerine karşın, bir kısmı
da bakteri içinde bulunduğu halde
herhangi bir zararlı etkide bulunmazlar
(Örn: E.coli ’ye ait lambda fajı).

25
Bu tür fajlar bakterinin genomu ile
birleşir, onun bir devamı haline gelir,
onunla birlikte eş zamanlı olarak replike
olur ve her hücre bölünmesi sırasında da,
bakteri DNA’sı ile birlikte kardeş hücreye
aktarılır.

26
• Fajın orta bölgesi restriksiyon endonükleaz
enzimi ile iki yerinden kesilerek orta segment
çıkarılır, buraya yaklaşık aynı boyda, yabancı gen
taşıyan segment (aynı RE ile kesilmiş) fajın orta
kısmına yerleştirilir.
• Sonra, paketleme enzimi yardımı ile faj başlığı
içine paketlenir ve buradan da başka bir E. coli
’ye transfer edilir. Böylece, yabancı bir gen, faj
vektör yardımı ile bakteriye aktarılmış olur.

27
Bakteriofajlar plasmidler gibi antibiyotiğe
karşı direnç geni taşımazlar.

Lambda bakteriyofajı 50 kb
uzunluğundadır ve 20 kb yabancı DNA bu
vektörlere sokulabilmektedir.

28
 Kozmit vektörler
• Bu tip vektörle fajların ve vektörlerin
hibritleriyle oluşturulmuştur.
• Fajların paketlenebilme ve plazmitlerin
replike olabilme özelliklerini taşırlar.
• Ayrıca antibiyotik direnç genleri içerirler
• Bu vektörler aracılığı ile 25-50kb lık
DNA parçaları klonlanabilir.

29
• Bakteriyofaj vektörler 10-15 kb,
• Plasmid vektörler 5-10 kb büyüklüğünde
DNA
parçaları taşırken,
• ikisinin birleşmesiyle oluşan kozmitler,
50 kb büyüklüğünde DNA parçaları
taşıyabilirler.

30
Bakteri Yapay Kromozomları (BAC)
• İnsan DNA’sı gibi büyük genlerin klonlanması
için çok büyük klonlama kapasitesi olan vektörlere
gereksinim vardır.
BAC’lar, bakterinin üreme plasmidi olan
F faktörü ile oluşturulur.
F faktörleri, bakteri konjugasyonu sırasında
genetik bilgiyi transfer eden, bağımsız olarak
kendini eşleyebilen plasmidlerdir.
31
• F faktörleri 1Mb uzunluğuna kadar olan
bakteri kromozomlarını
taşıyabildiklerinden,
ökaryotik DNA parçaları için vektör olarak
kullanılmaktadırlar ve yaklaşık 300 kb
uzunluğundaki bir parçayı taşıyabilirler.

32
• BAC vektörler yapılarında;
• Replikasyon genleri
• F faktör genleri
• Antibiyotik direnç marker geni
• Promotor bölgesi
• Klonlanacak DNA’nın gireceği polilinker
bölgesi taşırlar.
33
http://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/DNA_recombinant_techniques/
34
Artificial_Chromosomes/Bacterial_Artificial_Chromosomes_(BAC)
• YAC Vektörler
• Çok büyük miktarlarda DNA parçalarını klonlamak için
kullanılabilirler.
YAC vektörler, 100 ile 1000kb arasındaki büyüklükte olan
DNA parçalarının klonlanması için kullanılabilmektedir.
YAC vektörlerinin bu özelliği, onları İnsan Genom Projesinde
2000kb a kadar parçaları kabul edebilmeleri açısından
çok önemli araçlardır.
Bu vektörler S. cerevisiae hücrelerinde çoğalırlar.

35
• Bir YAC vektörü;
Replikasyon orjini (ORI)
Telomer bölgeleri (TEL): Linear hale getirilmiş olan yapının
stabilitesini sağlar ve nükleazlar tarafından kesilmesini
engeller.
Sentromer bölgesi (CEN): Sentromer dizilerini içerir.
Hücre bölünmesi sırasında vektörün kardeş hücrelere
ayrılmasını sağlar.
Polilinker bölge: Restriksiyon enzimi kesim bölgeleri içerir.
 A yeast artificial
chromosome (YAC)
cloning system. The
YAC vector contains
telomeric ends that are
denoted by black arrow
heads. The vector also
contains a unique SmaI
cloning site flanked by
SfiI and NotI 8-base-
pair restriction sites.
The vector can be used
to clone 50 to 500 kb
restriction fragments

http://www.swan.ac.uk/genetics/big322/Yeast%20Book/14.html
37
 38
• http://www.cnb.csic.es/~montoliu/resint.html
 Memeli yapay kromozomları
Kromozomların fonksiyonel bölgelerini
taşıyan ve hücreden bağımsız olarak
çoğalabilen moleküllerdir.
• MAC yüzlerce kb büyüklüğünde genomik
DNA taşıyabilir.

39
Klonlama Vektörleri için Konaklar
• Yüksek miktarda klonlanmış DNA elde etmek için, ideal
bir konağın taşıması gereken özellikler;
• Pahalı olmayan kültür ortamlarında kolayca
üreyebilmelidir.
• Konak patojen olmamalıdır.
• Aktarılacak DNA parçasını vektörle birlikte içine
alabilmelidir.
• Özel genotiplere sahip olmalıdır.
• Kültür sırasında genetik olarak kararlı olmalı ve vektörün
replikasyonu için gerekli enzimlere sahip olmalıdır.

40
• Ve kullanılacak konak hakkında önceden
yeterli bilgi mevcutsa ve kolay
çoğalabiliyorsa uygun bir konak olduğu
düşünülebilir.
• E. coli , B. subtilis ve S. cerevisiae
yaygın olarak kullanılan konaklardır.
• Klonlama için kullanılan konakları:

41
 a) Prokaryotik konaklar
• Bu alandaki ilk klonlama çalışmalarının çoğu her ne
kadar E. coli bakterisine yapılmış olsa da, bu
konağın bazı dezavantajları bulunmaktadır.
• Çünkü E. coli insan barsak sisteminde
yaşamaktadır ve yabani-tip tip suşları potansiyel
patojendir.
• Hatta patojen olmayan ırkları bile ürettikleri
endotoksinlerin diğer ürünler ile birleşmesi
nedeniyle zararlı olabilmektedirler.
42
 • Yine E. coli periplazmik
bölgesinde proteinler
içermekte ve bu da
rekombinant proteinlerin
izolasyonu ve
saflaştırılmasını
zorlaştırabilmektedir.
www.psmicrographs.co.uk

43
• Gram+ bir bakteri olan B.
subtilis de konak olarak
kullanılmaktadır. Bu
bakteri olası patojen
değildir, endotoksin
salgılamaz, spor üretir,
periplazmik boşluğu yoktur
ve proteinleri ortama http://www.allposters.com.tr/-sp/Bacillus-Subtilis-is-a-Rod-Shaped-Gram-Positive-Bacteria-SEM-
Posterler_i9006275_.htm

doğal olarak salgılar.

44
• Ancak bu bakteride de plazmit
kararsızlığı mevcuttur.
• Aktarılan DNA molekülü bu bakteri
içerisinde iyi korunamamakta ve
klonlanan DNA sıklıkla kaybolmaktadır.

45
 b) Ökaryotik Konaklar
• Bitki ve memeli hücreleri konak olarak
kullanılabilirler.
• S. cervisiae yaygın olarak kullanılan ökaryotik bir
konaktır. Ökaryotik hücrelerin konak olarak
kullanılmalarının en önemli avantajları;
• Bunların yüksek yapılı organizmalardaki gen
ürünlerinin sentezi için gerekli RNA ya ve
translasyon sonrası değişiklikleri içeren
sistemlere sahip olmalarıdır.
46
• Bazı çalışmalar için memeli hücreleri konak olarak
kullanılması gerekmektedir. İnsan genetiği, kanser
ve fizyoloji alanındaki çalışmalarda kullanılmaktadır.
• Ancak memeli hücrelerinin:
• pahalı olması,
• Büyük ölçekte üretilmelerinin zor olması
• Klonlanan genlerin ekspresyon düzeylerinin düşük
olması dezavantajlarıdır.

47
• Yüksek yapılı bitkilere gen aktarmak için
plasmid vektörler kullanılır.
Toprak bakterisi Agrobacterium tumifaciens,
bitki hücrelerini enfekte eder ve birçok farklı
bitki türlerinde “gal” adı verilen tümörler
oluşturur.
Tümör oluşumu, bakterinin taşıdığı tümör-
indükleyici (Ti) plasmidi sayesinde olur.
48
• Ti plasmidi taşıyan bakteriler bitki hücrelerini
enfekte ettiğinde, Ti plasmidinin T-DNA kısmı,
konak bitki hücresinin genomuna aktarılır.
• T-DNA’sındaki genler, tümör oluşumunu ve
bakterinin büyümesi için gerekli olan
bileşenlerinin sentezini kontrol eder.
• Yabancı genler, T-DNA parçasının içine aktarılır
ve A. tumifaciens’in bitkiyi enfekte etmesiyle,
rekombinant plasmid bitki hücrelerine aktarılır.
• T-DNA konak hücre kromozomuna katıldığında, yabancı DNA’da bitki
genomuna girmiş olur.

49
 DNA TRANSFER (AKTARIM)
METODLARI
1- Transformasyon
Plazmit vektöre yerleştirilen DNA’nın bakteri hücrelerine
transferinde kullanılan oldukça basit bir yöntemdir.

• Normalde plazmit geçişine izin vermeyen bakteri hücreleri

kimyasal uygulamalarla (Örneğin; CaCl2 ortamında üretme)
geçirgen hale getirilir ve bu tip hücrelere kompetan hücre denir.

• Rekombinant plazmit’in (rekombinant DNA’nın) bakteri

hücresine geçişi için ısı şoku uygulanır.

50
• 10 dk. 4˚C

• 5 dk. 42˚C

• 10 dk 4˚C

• 1 saat 37˚C de sıvı besi yerinde üretim

• Gece boyu 37˚C de katı seçici besiyerinde üretim

51
 CaCl2
pAmp/Kan
E. coli E. coli +
Soğuk!!!
Kompetan hücre yapımı

42oC

37oC de E. coli
1 saat
LB Amp+Kan
Tüm gece
37oC’de inkübe
edilir

LB Amp+Kan 52
Biyoteknoloji Ders Notları-2009 53
2- Elekro-transfer

Bu yöntemde ısı şoku yerine kompetan hücrelere düşük dozda

elektrik akımı uygulanarak rekombinant plazmit DNAsının
porlardan hücreye girişi sağlanır. Elektroporatör adı verilen bir
cihaz gerekir.

54
http://www.btxonline.com/pages/FAQ.html

55
• Ökaryotik hücrelere DNA parçalarının
aktarılması elektroporasyon adı verilen ve
hücrelerin değişken elektriksel alanda
bırakılmasıyla hücre zarlarında DNA nın
girebileceği delikler açılmasıyla
gerçekleştirilebilmektedir.
• Elektroporasyon ile açılan küçük delikler
hücreye herhangi bir zarar vermez ve klonlanmış
DNA nın hücre içine girmesine imkan sağlar

56
Elektroporatör

Elektroporasyon küvetleri

57
 Electroporation
DC

Cell Membrane Cell Membrane Cell Membrane

Before Pulse During Pulse After Pulse
(Cell returns to original state)

58
3- Mikroenjeksiyon
Hücrelerden daha küçük çapa sahip, kılcal cam pipet kullanılarak DNA
molekülleri çeşitli hücrelere enjekte edilebilir. BU işleme uygun mikroskop
ve mikro manipülatör düzeneği gereklidir.

59
60
• Mikroenjeksiyon adı verilen bir diğer
aktarım metodu ile de DNA
mikropipetler aracılığı ile hayvan
hücrelerinde çekirdek içerisine
aktarılabilmektedir.

http://library.thinkquest.org/C004033F/gmprocess_transa.htm

61
http://www.wuxiapptec.com/bio_research_materials_generation.html

62
4- Gen Bombardımanı (partikül bombardımanı):
Özellikle bitki hücrelerine uygulanan bu yöntemde; altın tozlarına
tutturulan DNA, özel tasarlanmış bir cihazla hücreler bombardıman
edilerek gen aktarımı gerçekleştirilir.

Bu yöntemde klonlanmış gen öncelikle antibiyotik dirençlilik geni

taşıyan bir plazmit içerisine yerleştirilir. Daha sonra bu plazmitler çok
küçük saf altın veya tungsten parçacıkları üzerine kaplanır ve çok
sayıdaki olgunlaşmamış bitki embriyolarına veya kallus hücrelerine
büyük bir basınçla fırlatılırlar.

63
• Yine mikroprojektil tabancası kullanılarak
DNA yı hücre içerisine aktarmak mümkün
olabilmektedir. Bu partikül tabancasının
çalışması bir av tüfeğine benzemektedir.
Ateşlenen nükleik asit kaplı tanecikler
hücre zarında hücreyi öldürmeyen delikler
açarak nükleik asitlerin hücre içine
aktarılmasını sağlamaktadır.
64
http://www.nepadbiosafety.net/subjects/
biotechnology/plant-transformation-
bombardment

65
• Hücre içerisine aktarılan DNA parçası daha
sonra konak DNA sı ile rekombine olmaktadır.
• Bu yöntemle maya, deniz yosunu ve çeşitli
bitki hücrelerinin transfeksiyonunda sıklıkla
kullanılmaktadır.
• Yine elektroporasyondan farklı olarak
korunmuş dokuların içerisine de(tohum) DNA
aktarımı için kullanılabilmektedir.

66
5- Lipozomlar aracılığıyla gen aktarımı

Lipozomlar; yapay olarak üretilen çift tabakalı fosfolipid kürecikleridir

• Fosfolipid molekülleri sulu ortamda kendiliğinden lipozomları oluşturur.

Lipozomların farklı materyalleri kapsüle etme yetenekleri ve lipozom

teknolojisindeki gelişmeler, aktif ajanların hücre içerisine
alınımında lipozomların kullanılmasında bir artışa yol açmıştır
(antikanser ilaçları, aşı adjuvanı, antienfektif ajanlar; gen
aktarımı)

67
68
6- Hücre reseptörleri aracılığı ile gen aktarımı

7- Viral vektörlerle aktarım

Viral yöntemlerde viruslar modifiye edilerek kullanılır. Bu
modifikasyon, aktarılmasi istenilen gen virusa monte edilirken;
istenmeyen viral gen bölgelerinin virusdan çıkarılması şeklinde
olmaktadır. Bu ilk kez fare retroviruslariyla gerçeklestirilmistir.
En çok kullanılan viral vektörler, retrovirüsler, adenovirüsler,
herpesvirüslerdir(uçuk virüsü).

69
REKOMBİNANT DNA TAŞIYAN KLONUN SEÇİMİ

• Genin kendisi veya ürünü olan protein aranabilir.

• Genin doğrudan aranmasına dönük tüm metotlar,
nükleik asit hibridizasyonu adı verilen, gen ve diğer
nükleik asit deki komplementer dizi arasındaki baz
eşleşmesine dayanır.
İstenilen genin bu diziye komplementer bir probu
sentezlenir.
• Prob, radyoaktif bir izotopla veya floresan bir
etiketle işaretlenerek izlenir

70
• Hedef geni taşıyan bir klon
• Radyoaktif etiketlenmiş bir nükleik asit
probu kullanılarak teşhis edilebilir. Bu
prob, hedef gene komplementer olan bir
DNA dizisidir.
• Bu sürece nükleik asit hibridizasyonu adı
verilir

71
• İstenen geni taşıyan bir hücre klonu teşhis
edildiğinde, hücreler büyük bir tankta sıvı
besiyerinde üretilebilir ve izole edilebilir.
• Eğer istenen geni taşıyan hücreler bu geni
protein şeklinde ifade ederse, tüm kolonileri
protein yönünden tarayarak ayırmak mümkündür.
• Proteinin tespiti, aktivitesine ya da özgül olarak
bağlanan antikorların kullanılmasıyla incelenen
yapısına dayanır.
72
REKOMBİNANT DNA TAŞIYAN KLONUN
SEÇİMİ

Bu işlem bakterilerde iki aşamada gerçekleştirilir.

1- Koloni seleksiyonu
2-Hibridizasyon ile hedef genin tesbiti

1- KOLONİ SELEKSİYONU
Transformasyon işlemi sonunda sıvı besiyerinde üretilen
bakteriler arasında

*plazmit ihtiva etmeyen bakteriler

*non-rekombinant bakteriler
*Rekombinant plazmit içeren bakteriler bulunabilir.

73
Biyoteknoloji Ders Notları-2009 74
Koloni seleksiyonu yöntemi ile rekombinant plazmit içeren
bakterilerin seleksiyonu gerçekleştirilir.
Bu amaçla, plazmit DNA’sında “antibiyotik direnç genleri
bulunmalıdır.

75
76
 2- KOLONİ HİBRİDİZASYONU

Bu yöntem ile hedef gen dizisi taşıyan rekombinant plazmit’i

içeren bakteri kolonisi saptanır.

77
78
Biyoteknoloji Ders Notları-2009 79
80