1

Cc phuong php tch chit nucleic acid

Cc phuong php d|nh tnh v d|nh lung co ban
1. Cac phuong phap tach chit nucleic acid
Phuong phap tach chit DNA
Phuong phap tach chit RNA toan phn va mRNA
Ly tm
Phuong phap sc ky
2. Cac phuong phap dinh tinh va dinh luong th
nucleic acid
Phuong phap do bng quang ph k
Phuong phap din di
Tach chit DNA
D thu nhn DNA tinh sach cn loai bo nhung thanh phn tap
nhim, ma quan trong nht la protein.
Su tach chit DNA dua trn nguyn tc hoa tan khac nhau cua cac
phn tu khac nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha khng hoa
tan (phenol, chloroIorm/nuoc).
Muc dich la thu duoc cac phn tu nucleic acid o trang thai nguyn
ven ti da, khng bi phn huy boi cac tac nhn co hoc hay hoa hoc.
Cac nucleic acid cn duoc tach chit trong diu kin nhit d thp
d uc ch hoat dng cua cac enzyme ni bao (DNase va RNase).
Sau cng doan tach chit, nucleic acid tinh sach nm trong mt th
tich dung dich lon. Su tua kt hop voi ly tm cho phep thu nhn
nucleic acid duoi dang cn tua d bao quan va khi cn co th hoa lai
trong nuoc theo nng d mong mun.
Tach chit DNA
Buoc 1: pha mang t bao, mang nhn
Buoc 2: loai protein
Buoc 3: thu hi nucleic acid
Pha mang t bao, mang nhn: nghin t bao, m trong mt hn hop
cht ty (SDS) va proteinase d pha v mang t bao, mang nhn,
giai phong DNA ra mi truong dng thoi phn huy cac protein lin
kt voi DNA.
Cht ty la phn tu lung cuc, s kt hop voi protein mang va cac phn
tu phospholipid lam pha v cu truc mang.
Cht ty ion hoa co tac dung pha mang manh, cht ty khng ion hoa
co tac dung pha mang nhe hon.
Loai protein: lc mu trong dung dich phenol:chloroIorm d bin
tinh protein dng thoi khng hoa tan nucleic acid. Protein bi bin
tinh khng hoa tan trong pha nuoc co chua nucleic acid va sau khi li
tm s tua thanh mt lop nm giua pha nuoc va pha
phenol:chloroIorm. Thu hi nucleic acid trong pha nuoc.
Tua nucleic acid: nhm thu nhn nucleic acid duoi dang c dc d
bao v chung khoi su phn huy cua cac enzyme va khi cn co th
hoa lai trong nuoc theo nng d mong mun. Co th tua trong
ethanol hoc isopropanol. Sau do li tm d thu nhn lai nucleic acid.
Cn tua duoc rua trong ethanol 70 d loai bo cac mui hoc cac
du vt cua isopropanol.
Ly tm phn doan
(a) va phn doan
vung (b) phn
tach cac trinh tu
trong hn hop dua
trn khi luong
cua chung.
Thoi gian va luc
ly tm duoc xac
dinh cho tung
nhom phn tu.
Dung dich ly tm
co ty trong thp
hon cac phn tu
cn phn tach.
Ly tm dng ty trong (isopycnic)
phn tach cac phn tu trong hn
hop dua trn ty trong cua chung.
Thoi gian va luc ly tm la chung
cho cac nhom phn tu. Dung dich
ly tm co ty trong voi gia tri di tu
thp dn cao hon ty trong cua cac
phn tu cn phn tach.
Ly tm trn gradient lin tuc CsCl:
trong qua trinh ly tm, dung dich
CsCl s tu dng hinh thanh mt
gradient dng ti trong voi ti trong
tng dn tu ming ng xung day
ng. Duoi tac dng cua luc ly tm,
cac nucleic acid di chuyn trong
ng va dn vi tri co ti trong bng
voi ti trong cua chinh no s ngung
lai va hinh thanh mt lop c dinh
trong ng. Lop nay duoc thu nhn
lai sau ly tm.
2
Phuong phap sc ky
Sc ky ai luc: trn poly U-Sepharose hay oligodT-
cellulose, dung d tinh sach mRNA.
Sc ky loc gel dung trong phn tach cac nucleic acid
va nucleotic tu do sau qua trinh tao mu do (probe)
danh du.
Sc ky trao di ion trn vi ct d thu hi nhung luong
rt nho DNA.
Sc ky long hiu sut cao: co d phn giai rt cao,
duoc dung trong tinh sach cac oligonucleotide tng
hop, plasmid, phn tach cac doan DNA.
2. Cac phuong phap dinh tinh va dinh
luong th nucleic acid
Din di:
- Gel agarose
- Gel polyacrylamide
Quang ph k: do mt d quang (OD Optical
density)
Phuong phap din di
Muc tiu:
Dinh tinh: su hin din, cu hinh phn tu, kich thuoc
Dinh luong: ham luong tuong di so voi thang ham luong
Chun bi: thu hi doan DNA (dung tao dong, .)
Nguyn tc: dua vao dc tinh cu truc cua cac nucleic acid:
tich din m dng du trn khp b mt cua mt din truong
nn s di chuyn v cuc duong cua din truong.
Tinh linh dng cua phn tu khi di chuyn trong din truong
phu thuc vao khi luong phn tu va nng d cac cht cu
thanh gel.
Kiu din di: Agarose, polyacrylamide, din di trong truong
xung(PFGE - Pulse Field Gel Electrophoresis)
Din di trn gel agarose
Gel agarose la loai gel thng
dung nht, thuong dung d
phn tach nhung doan co kich
thuoc 0,5-20 kb.
Din di theo phuong nm ngang
D phn giai thay di khi nng
d agarose hay loai agarose
thay di.
Phat hin bng phong xa tu ghi,
nhum ethidium bromide. Cht
nay co kha nng gn xen vao
giua cac base cua nucleic acid
va s phat huynh quang duoi tia
tu ngoai.
Ung dung: phat hin 1 trinh tu
DNA, phn tich hn hop cac
trinh tu DNA (Southern blot),
chun bi nguyn liu
Din di trn gel polyacrylamide
Duoc dung d tach cac doan co kich
thuoc nho, duoi 1000 cp base.
Din di theo phuong thng dung
D phn giai cao, phn bit duoc
nhung trinh tu chi cach nhau 1
nucleotide.
Phuong phap phat hin: DNA phong
xa tu ghi, xanh methylene, ethidium
bromide, protein xanh Coomassie,
nhum nitrate bac.
Ung dung: tinh sach cac oligonucleotic
tng hop, xac dinh trinh tu DNA, tach
cac trinh tu DNA co kich thuoc gn
bng nhau, SDS-PAGE (phn tich
protein)
Phuong phap dinh luong bng quang ph k
Cho phep dinh luong tuong di nng d nucleic acid co trong
mu.
Nguyn tc: dua vao su hp thu manh anh sang tu ngoai o
buoc song 260 nm cua cac base.
Gia tri mt d quang o buoc song 260 nm cua cac mu do cho
phep xac dinh nng d nucleic acid trong mu dua vao mi
tuong quan:
Mt don vi OD
260nm
tuong ung voi nng d:
50g/ml cho mt dung dich DNA soi di
40 g/ml cho mt dung dich DNA hay RNA soi don
Dinh tinh: d sach dua trn ti s OD
260
/OD
280
, tinh cht cua
nucleic acid (mach di/don) (280 nm la buoc song o do cac
protein co muc d hp thu cao nht.
3
Cc phuong php lai phn tu
Co so cua su lai phn tu
Khai nim v lai phn tu:
Khi mt phn tu DNA mach di duoc dun ln mt nhit d
vuot qua nhit d nong chay (Tm) thi hai mach s tach roi
nhau do su pha v cac lin kt H giua hai mach.
Sau khi hai mach tach roi, nu nhit d phan ung duoc lam
giam tu tu cng voi diu kin thi nghim thich hop, chung s
bt cp tro lai. Hin tuong nay duoc goi la su lai phn tu.
Dc dim cua su lai phn tu:
Dc hiu tuyt di: su tai bt cp chi xay ra giua hai trinh tu hoan toan
b sung voi nhau.
Cac trinh tu b sung co th la DNA hay RNA, dn dn su hinh thanh
cac phn tu DNA-DNA, RNA-RNA hay cac phn tu lai DNA-RNA
Cac kiu lai phn tu
Lai trn pha long
Lai trn pha rn
Lai tai ch
Lai trong pha long:
Cac trinh tu cn lai nm trong pha long, la mt dung dich dm. Su lai
phn tu xay ra khi cac trinh tu nay gp nhau do chuyn dng nhit va khi
nhit d mi truong thp hon Tm. Phuong phap nay duoc su dung d
phat hin cac trinh tu tuong dng (giua cac loai hay trong mt ca th).
Lai trong pha rn:
Mt trong hai trinh tu cn
lai duoc c dinh trn gia th
rn (mang lai). Phat hin
phn tu lai thng qua mu
do (probe) co danh du dng
vi phong xa.
Ba ki thut lai trn pha rn
thng dung la Southern blot,
Northern blot, Dot blot.
Lai tai ch:
Trinh tu nucleic acid cn tim khng duoc tach chit ra khoi m
hay t bao. Qua trinh lai voi mu do d duoc danh du va phat
hin cac phn tu lai duoc thuc hin ngay trn nhim sc th, t bao
hay lat ct m.
4
Southern blot
Nguyn tc cua Southern blot la mang lai nitrocellulose co kha
nng tip nhn DNA d duoc bit tu lu va d duoc su dung
trong cac nghin cuu lai axit nucleic khac nhau vao nhung
thp nin 1950 va 1960.
Du thp nin 1970, su ra doi cua phuong phap din di trn
gel d cho phep cac doan DNA duoc ct boi enzyme han ch
co th duoc phn tach dua trn co so kich thuoc cua chung.
Tu do buoc phat trin tip theo cua phuong phap la chuyn cac
doan DNA phn tach tu gel ln mang lai nitrocellulose.
Phuong phap nay duoc E. M. Southern m ta tai Dai hoc
Edingburgh vao nm 1975.
Southern blot bao gm cac buoc co ban sau:
Ct DNA bng enzyme han ch thich hop.
Din di san phm ct trn gel agarose.
Lam bin tinh DNA ngay trn gel, DNA soi kep s duoc tach thanh DNA
soi don. Chi DNA soi don moi co th chuyn ln mang lai.
Chuyn DNA d bin tinh ln mang lai (mang nitrocellulose hay mang
nylon). Vic chuyn DNA thuong duoc tin hanh bng hoat tinh mao dn
trong khoang vai ting hoc co th dung mt thit bi thm chn khng.
Trong qua trinh chuyn, vi tri cac doan DNA vn duoc giu nguyn khng
thay di.
Lai DNA d duoc c dinh trn mang voi mu do (probe) DNA co danh
du. Qua trinh nay dua trn nguyn tc b sung giua DNA trn mang lai
voi mu do. D danh du nguoi ta thuong su dung P32, biotin/streptavidin
hoc mt mu do phat quang sinh hoc.
Dinh vi cac phn tu lai DNA-mu do. Nu su dung mu do danh du phong
xa thi dung phuong phap phong xa tu ghi (autoradiograph) d xac dinh, nu
su dung biotin/streptavidin thi dung phuong phap so mau hoc nu su
dung mu do phat quang sinh hoc thi phat hin bng su phat quang.
So d m ta phuong php Southern blot
Northern blot
Sau khi E. M. Southern m ta phuong phap Southern blot vao nm
1975, nguoi ta d dung mt phuong phap tuong tu d xac dinh cac
doan RNA dc bit goi la Northern blot.
Northern blot bao gm cac buoc co ban sau:
RNA (RNA tng s hoc chi mRNA) duoc phn tach bng din di
trn gel agarose.
RNA sau khi d phn tach duoc chuyn ln mang lai (cac phn tu
RNA giu nguyn vi tri nhu o trn gel).
RNA c dinh trn mang duoc lai voi mu do DNA soi don (hoc
RNA) co danh du phong xa hoc duoc gn voi mt enzyme
(alkalin phosphatase hoc horseradish peroxidase) tao thanh phn tu
lai RNA-DNA (hoc RNA-RNA) soi kep.
Vi tri cua mu do duoc phat hin nho k thut phong xa tu ghi nu
no duoc danh du phong xa. Trong truong hop mu do duoc gn voi
enzyme thi dem u voi mt co cht khng mau. Enzyme lin kt voi
no s bin di thanh mt san phm mau co th nhin thy hoc phat
ra anh sang ma s duoc phat hin bng phim X quang mt cach truc
tip.
So d m ta phuong php Northern blot
Phuong php PCR
PCR (polymerase chain reaction-phan ung tng hop dy chuyn nho
polymease) la mt trong nhung phuong phap duoc su dung rng ri
nht trong linh vuc Sinh hoc phn tu. Phuong phap nay do Kary
Mullis phat minh vao nm 1985; duoc gioi thiu ln du tin tai Hi
thao ln thu 51 o Cold Spring Harbor vao nm 1986 va ng d nhn
duoc giai thuong Nobel Hoa sinh hoc vao nm 1993.
Nguyn tc cua phuong phap PCR: dua vao dc tinh hoat dng cua
DNA polymerase: cn su hin din cua nhung mi chuyn bit d
hoat dng tng hop mt mach DNA moi tu mach khun. Nhu vy,
nu ta cung cp hai mi chuyn bit bt cp b sung voi hai du cua
mt trinh tu DNA, ta s chi tng hop doan DNA nm giua hai mi.
Phuong phap PCR cho phep tng hop rt nhanh va chinh xac tung
doan DNA ring bit. Dy thuc su la phuong phap hin dai va thun
tin cho vic xac dinh su co mt cua mt gen nao do trong t bao voi
d chinh xac cao.
5
Ba giai doan trong mt chu ky cua phan ung PCR
Giai doan bin tinh (denaturation)
Trong giai doan nay phn tu DNA
mu bi bin tinh o nhit d cao
(thuong la tu 94-95
0
C, lon hon nhit
d nong chay cua phn tu) trong
vong 30 giy dn 1 phut, tt ca cac
lin kt hydro giua hai mach cua
phn tu bi be gy va tao thanh cac
DNA soi don.
Giai doan keo dai (elongation)
Nhit d duoc tng ln dn 72
0
C giup cho DNA polymerase xuc tac tng hop DNA tt nht.
Cng vic cua DNA polymerase la di chuyn doc theo DNA soi don va su dung no lam
khun d tng hop soi DNA moi b sung voi DNA mu bng cach keo dai cac phn d
duoc danh du boi cac mi. Thoi gian cua giai doan nay phu thuc vao kich thuoc cua DNA
mu, thuong keo dai tu 30 giy dn nhiu phut.
Giai doan lai (hybridization)
Nhit d duoc ha thp ( thuong tu 40-70
0
C, thp hon nhit d nong chay cua mi duoc su dung
khoang tu 3-5
0
C) cho phep cac mi bam vao cac phn tu DNA soi don, danh du phn DNA cn
duoc khuych dai. Giai doan nay keo dai tu 30 giy dn mt phut.
D th| biu din mi quan h gia thi gian v nhit
d trong mt chu ky cua phan ng PCR
Sau mi chu ky, s ban sao cua DNA mu lai duoc tng gp di. Dy la su
nhn ban theo cp s nhn. Nhu vy cu 1 phn tu DNA mu, sau phan ung
PCR voi n chu ky s tao thanh 2
n
ban sao phn tu DNA.
Cac thanh phn cua phan ung PCR
1. Primer (mi):
Mi la nhung doan DNA soi don ngn va cn thit cho vic xuc tin phan
ung dy chuyn tng hop DNA. Chung bt cp b sung voi mt du cua
DNA mu va tao ra vi tri bt du tai ban. Cac mi nay co chiu nguoc
nhau, bao gm mt mi xui (Iorward primer) va mt mi nguoc (reverse
primer).
Mi la mt chi tiu quan trong cua phan ung PCR d quyt dinh tinh dc
trung va hiu qua cua phan ung. Do do vic thit k mi cn duoc tun thu
mt s nguyn tc nht dinh: dai khoang 18-24 base; Tm cua 2 mi gn
nhau; thanh phn nucleotic cua cac mi cn bng tranh cac cp GC lp di
lp lai nhiu ln; mi phai dc trung cho trinh tu DNA cn khuych dai;
khng hinh thanh primer dimer, khng phai la trinh tu lp lai.
2. DNA ban mu (DNA template): ham luong du nhung khng qua cao, tinh
sach khng chua cac cht uc ch phan ung (SDS, cht uc ch tu mu
(hemoglobin, sc t, heparin, .). PCR vn cho kt qua tt voi DNA thu
nhn truc tip tu t bao hay nhung mu DNA khng duoc bao quan tt.
3. Nng d MgCl
2
: cn cho hoat dng cua Taq polymerase, ham luong qua cao
s tao nhiu san phm ky sinh, qua thp thi lam giam hiu qua nhn ban
cua enzyme. Nng d ti uu phai duoc xac dinh cho tung phan ung qua
nhiu thu nghim.
4. dNTP: thanh phn 4 loai dNTP phai cn bng, su mt cn bng lam tng cac li
sao chep cua polymerase; ham luong thuong khng di nhung co th thay di
tuy diu kin thuc t.
5. Enzyme polymerase chiu nhit
Tag-polymerase la DNA polymerase chiu nhit su dung cho phan ung
PCR ln du tin duoc ban trn thi truong. Tag-polymerase duoc nha Vi sinh
vt hoc Thomas Brock phat hin o Thermus aquaticus mt loai vi khun phat
trin manh o nhit d cao. Enzyme chiu nhit nay giup giai quyt vn d cua
enzyme bin tinh sau mi chu ky.
Tu do dn nay, mt s vi sinh vt chiu nhit khac d duoc kham pha va
nguoi ta d tach chit thm duoc cac DNA polymerase chiu nhit d su dung
cho phan ung PCR nhu Vent/DeepVent DNA polymerase (Thermococcus
litoralis), PIu DNA polymerase (Pyrococcus Iuriosus), Tth DNA polymerase
(Thermus thermophilus), UlTma DNA polymerase (Thermotoga maritima)...
6. S luong chu ky phan ung tuy thuc vao s luong ban mu ban du, thng
thuong s luong chu ky nho hon 40 cho mt phan ung PCR. Thoi gian cua tung
chu ky phu thuc thit bi va kich thuoc san phm.
7. Thit bi va dung cu cho phan ung PCR: cn dap ung duoc nhu cu thay di
nhit d tht nhanh va chinh xac. Nhung cai tin may lun nhit quan tm dn
microtiler plate 96 ging, cac block nhit ring bit trong 1 may, block dung
cho lam kinh d tin hanh in situ PCR.
Cac thanh phn cua phan ung PCR
Cac ung dung cua phuong phap PCR
Hin nay thanh tuu cua PCR mo ra nhiu trin vong cho sinh hoc
phn tu, voi nhiu ung dung trong sinh hoc, trong y khoa, trong nng
nghip, .
Mt s ung dung co tinh tng quat:
San xut mu do: PCR giup san xut nhanh mt luong lon mu do danh
du khi thuc hin cac phan ung voi cp mi chuyn bit va cac nucleotide
danh du.
Khuych dai s luong cac RNA: su dung ki thut phi hop RT-PCR (kt
hop enzyme phin m nguoc va Taq polymerase; hoc su dung Tth
polymerase). RT-PCR cho phep nghin cuu cac mRNA thng tin tn tai
voi ham luong rt thp, khng th phat hin bng phuong phap c din nhu
Northern blot, .
Ki thut in situ RT-PCR cho phep khuych dai cac RNA ngay trn m va
t bao.
Dinh luong bng phuong phap PCR: dung d nghin cuu cac trinh tu RNA
hay DNA co s luong ban sao rt thp. Trinh tu dich duoc khuych dai
dng thoi voi mt trinh tu chung co nng d d bit, sau phan ung so sanh
ham luong san phm, va suy ra s luong ban mu ban du.